DE102010009445A1 - Expression vector comprising promoter, interfaces to insert use-specific gene sequence and genetic information expressing enzyme, useful to express peptide-inhibited small interfering RNA cleaving enzyme, preferably protease or peptidase - Google Patents

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Abstract

Expression vector (1) comprising at least a promoter (2), interfaces for inserting use-specific gene (3) sequences, and a genetic information (4) expressing a peptide-inhibited small interfering RNA (siRNA) cleaving enzyme to activate peptide-inhibited siRNA, is claimed. An independent claim is included for a method of using the expression vector comprising bringing the expression vector into cells grown in a culture vessel, bringing peptide-inhibited siRNA into the cells and activating the peptide-inhibited siRNA in the cells by the expression of the enzymes that are encoded and expressed on the expression vector.

Description

Die Erfindung betrifft ein spezielles Vektorkonstrukt zur Enzym-Expression sowie ein Verfahren, um mit diesem Vektorkonstrukt transfizierte Zellen in einer Zellkultur schnell, mit geringem Aufwand und mit hoher Spezifität – insbesondere zum Zweck ihrer Isolation – beeinflussen zu können.The invention relates to a specific vector construct for enzyme expression and to a method for influencing cells transfected with this vector construct in a cell culture rapidly, with little effort and with high specificity, in particular for the purpose of their isolation.

Das erfindungsgemäße Vektorkonstrukt und das vorgeschlagene Verfahren können insbesondere in der Molekularbiologie zur schnellen und einfachen Selektion von Zellklonen nach Transfektionen Anwendung finden.The vector construct according to the invention and the proposed method can be used in particular in molecular biology for the rapid and simple selection of cell clones after transfections.

Die Übertragung von Genen ist ein in der Grundlagenwissenschaft weit verbreitetes Verfahren, mit dem die Funktion verschiedener Gene bzw. Proteinen in Zellen untersucht werden kann. Perspektivisch könnte es auch dazu genutzt werden, Erbkrankheiten zu behandeln. Mit dieser Methode können vollständige oder Teile von Genen bzw. DNA-Abschnitte in Zellen eingebracht, sowie durch die Einbringung von shRNA die Expression von Genen gezielt vermindert werden. Eine große Anzahl von auf Viren basierenden Systemen für den Transfer von Genen wurde bereits beschrieben. Gegenwärtig sind vor Allem Retrovirale Vektorsysteme am weitesten verbreitet (beispielsweise US 5,219,740 A. D. Miller und G. J. Rosman: Improved Retroviral Vectors for Gene Transfer and Expression, BioTechniques 7, 1989, 980–990 ; A. D. Miller: Retrovirus Packaging Cells, Human Gene Therapy 1, 1990, 5–14 ; J. C. Burns et al.: Proceedings of the National Academy of Sciences, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, 8033–8037 sowie K. Boris-Lawrie und H. M. Temin: Recent advances in retrovirus vector technology, Curt. Opin. Genet. Dev. 3, 1993, 102–109 ).The transmission of genes is a widely used method in basic science that can be used to study the function of different genes or proteins in cells. Perspectively, it could also be used to treat hereditary diseases. With this method, whole or parts of genes or DNA sections can be introduced into cells, as well as the introduction of shRNA specifically reduces the expression of genes. A large number of virus-based systems for the transfer of genes have already been described. At present, retroviral vector systems are the most prevalent (for example US 5,219,740 AD Miller and GJ Rosman: Improved Retroviral Vectors for Gene Transfer and Expression, BioTechniques 7, 1989, 980-990 ; AD Miller: Retrovirus Packaging Cells, Human Gene Therapy 1, 1990, 5-14 ; JC Burns et al .: Proceedings of the National Academy of Sciences, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, 8033-8037 such as K. Boris-Lawrie and HM Temin: Recent advances in retrovirus vector technology, Curt. Opin. Genet. Dev. 3, 1993, 102-109 ).

Verwendete Vektorsysteme enthalten dabei oft die vollständige virale Erbinformation, oder es wurden Teile der viralen Gene eliminiert, beispielsweise die genetischen Informationen über Hüllproteine, Enzyme zur Prozessierung von Proteinen oder zur Verpackung des genetischen Materials in die Virushüllen.In this case, vector systems used often contain complete viral genetic information, or parts of the viral genes have been eliminated, for example the genetic information about envelope proteins, enzymes for processing proteins or for packaging the genetic material into the virus envelopes.

Vektoren können beispielsweise 5'LTR(H1-, sowie CMV-)Regionen besitzen, die als Promotoren dienen. Des Weiteren enthalten Vektoren oft Schnittstellen für Restriktionsenzyme, an denen die Vektoren aufgeschnitten und DNA-Segmente ausgeschnitten oder eingesetzt werden können. Außerdem werden oftmals Resistenzen für spezifische Antibiotika oder Chemotherapeutika (Ampicillin, Neomycin, Amphotheracin, u. a.) verwendet, um Zellklone nach dem Einbringen der Vektoren selektieren zu können ( WO 2008/077545 ).For example, vectors can have 5'LTR (H1, as well as CMV) regions that act as promoters. Furthermore, vectors often contain restriction enzyme sites at which the vectors can be cut open and DNA segments excised or deployed. In addition, resistance to specific antibiotics or chemotherapeutics (ampicillin, neomycin, amphoteracin, etc.) is often used to select cell clones after introduction of the vectors ( WO 2008/077545 ).

Als Reportergene werden oftmals Grün-fluoreszierende Proteine (GFP, EGFP) oder Luciferase verwendet; dies dient dazu die erfolgreiche Transfektion in Zellen und die Expression der Plasmid-Gene nachzuweisen. ( US 5,625,048 ; US 5,777,079 ; US 6,054,321 ).As reporter genes often green fluorescent proteins (GFP, EGFP) or luciferase are used; this serves to detect the successful transfection into cells and the expression of the plasmid genes. ( US 5,625,048 ; US 5,777,079 ; US 6,054,321 ).

Die beschriebenen Reportergene und die Antibiotikaresistenzgene können dazu verwendet werden, die Zellen, welche die viralen oder synthetischen Vektoren enthalten, zu selektieren. Die Selektion mittels ”Cell Sorting” über die Expression des GFP führt allerdings aufgrund der Methodik zu Zellstress; die Selektion mittels Antibiotikaresistenz ist langwierig und führt oft zu keiner reinen Zellpopulation nach der Selektion. Deshalb muss oft der Selektionsprozess wiederholt werden, oder es ist erforderlich, ständig Antibiotika zuzugeben.The described reporter genes and the antibiotic resistance genes can be used to select the cells containing the viral or synthetic vectors. The selection by means of "cell sorting" on the expression of GFP, however, leads to cell stress due to the methodology; selection by antibiotic resistance is tedious and often does not result in a pure cell population after selection. Therefore, often the selection process must be repeated or it is necessary to constantly add antibiotics.

Des Weiteren wurde beschrieben ( US 6,589,526 ), dass die genetische Information von Rezeptoren (beispielsweise CD3) in Vektoren eingebracht wurde. Diese Rezeptoren wurden dann als Reporter exprimiert und die Zellen können durch Bindung von Antikörpern (beispielsweise magnetisch) selektiert werden. Auch dieses Verfahren führt nicht zu einer vollständigen Selektion; die Expression dieser Rezeptoren kann ebenfalls nachteilig für die Zellen, beispielsweise für Immunzellen, sein.Furthermore, it has been described ( US 6,589,526 ) that the genetic information of receptors (for example CD3) has been introduced into vectors. These receptors were then expressed as reporters and the cells can be selected by binding of antibodies (for example, magnetically). Also this method does not lead to a complete selection; the expression of these receptors may also be detrimental to the cells, for example immune cells.

Adhärent wachsende Zellen werden in der Regel in Kulturflaschen oder Kulturschalen kultiviert und in diesen Gefäßen beispielsweise mittels Viren oder Transfektionsreagenzien oder in Küvetten mittels Elektroporation transfiziert. Nach der Transfektion erfolgen eine erneute Kultivierung in besagten Gefäßen und die anschließende Selektion ( Beatrice Riteau, Catherine Menier, Iman Khalil-Daher, Silvia Martinozzi, Marika Pla, Jean Dausset, Edgardo D. Carosella and Nathalie Rouas-Freiss: HLA-G1 co-expression boosts the HLA class I-mediated NK lysis inhibition. International Immunology, Vol. 13, No. 2, 193–201, February 2001 ).Adherently growing cells are usually cultured in culture bottles or culture dishes and transfected in these vessels, for example by means of viruses or transfection reagents or in cuvettes by means of electroporation. After transfection, a renewed cultivation in said vessels and the subsequent selection ( Beatrice Riteau, Catherine Menier, Iman Khalil-Thus, Silvia Martinozzi, Marika Pla, Jean Dausset, Edgardo D. Carosella and Nathalie Rouas-Freiss: HLA-G1 co-expression boosts the HLA class I-mediated NK lysis inhibition. International Immunology, Vol. 13, no. 2, 193-201, February 2001 ).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, Vektor-transfizierte Zellen schnell und auf möglichst einfache Weise gezielt zu beeinflussen, beispielsweise um diese mit hoher Reinheit zu selektieren.The invention is based on the object to influence vector-transfected cells quickly and in the simplest possible way, for example, to select them with high purity.

Es wird ein Expressionsvektor vorgeschlagen, der neben zumindest einem bekannten Promotor sowie Schnittstellen zum Einfügen von verwendungsspezifischen Gensequenzen erfindungsgemäß zum Zweck der Aktivierung einer Peptid-inhibierten siRNA die genetische Information zur Expression eines (die besagte Peptid-inhibierte siRNA spaltenden) Enzyms enthält, welches von den Expressionsvektor-transfizierten Zellen sonst nicht generiert werden kann. Dieses Enzym ist in der Lage, die kovalente Bindung der besagten Peptid-inhibierten siRNA, welche ebenfalls in die Zellen eingebracht wird, aufzubrechen und somit die siRNA zu aktivieren, welche danach die Expression zellulärer Gene beeinflusst.An expression vector is proposed which, in addition to at least one known promoter and also interfaces for inserting use-specific gene sequences according to the invention for the purpose of activating a peptide-inhibited siRNA, contains the genetic information for expressing an enzyme (which cleaves said peptide-inhibited siRNA) which is derived from the Otherwise expression vectors-transfected cells can not be generated. This enzyme is capable of inhibiting the covalent binding of said peptide-inhibited siRNA, which is also introduced into the cells, break open and thus activate the siRNA, which then influences the expression of cellular genes.

Zur Aktivierung der Peptid-inhibierten siRNA werden der Expressionsvektor, welcher die spezielle genetische Information zur Expression eines spezifischen Enzyms zur Aktivierung der Peptid-inhibierten siRNA aufweist, und die Peptid-inhibierte siRNA ( WO 002008098569 ) gleichzeitig oder zeitlich versetzt, zweckmäßig mittels Transfektionsreagenz, in die zu beeinflussenden Zellen eingebracht. Die Sequenz der Peptid-inhibierten siRNA, welche erfindungsgemäß durch den Expressionsvektor bzw. durch die in diesem enthaltenen genetischen Information zur Enzymexpression aktiviert wird, ist gegen die mRNA eines Gens der Wirtszelle, beispielsweise gegen die mRNA eines Adhäsionsmoleküls, gerichtet.To activate the peptide-inhibited siRNA, the expression vector which has the specific genetic information for expressing a specific enzyme for activating the peptide-inhibited siRNA and the peptide-inhibited siRNA ( WO 002008098569 ) at the same time or at different times, expediently by means of transfection reagent, introduced into the cells to be influenced. The sequence of the peptide-inhibited siRNA, which according to the invention is activated by the expression vector or by the genetic information contained therein for enzyme expression, is directed against the mRNA of a gene of the host cell, for example against the mRNA of an adhesion molecule.

Das exprimierte Enzym, beispielsweise eine Protease oder Peptidase, kann dabei zur verlässlichen Selektion dieser enzymexprimierenden Zellen gegenüber anderen (nicht enzymexprimierenden) Zellen der Zellkultur verwendet werden. So ist insbesondere eine verfahrenstechnisch vorteilhafte und aufwandgeringe Isolation der auf vorgenannte Weise selektierten Zellen möglich, wenn in den Expressionsvektor-transfizierten Zellen einer Zellkultur, die gewöhnlich in einem Kulturgefäß gewachsen sind und in diesem Wachstumsprozess an demselben anhaften (was durch die Expression von speziellen Adhäsionsmolekülen bewirkt wird), diese besagte Adhäsions-Molekülexpression gehemmt wird. Durch die Expression der Protease oder Peptidase in den Expressionsvektortransfizierten Zellen kann eine spezielle Peptid-inhibierte siRNA aktiviert werden, welche nach deren Aktivierung beispielsweise die Expression des genannten Adhäsionsmoleküls unterbindet. Infolge der Hemmung der Expression dieses oder dieser Adhäsionsmoleküle lösen sich die Expressionsvektor-transfizierten Zellen vom Kulturgefäß, so dass diese von den übrigen nicht enzymexprimierten Zellen, beispielsweise zu ihrer Isolation, leicht separiert werden können.The expressed enzyme, for example a protease or peptidase, can be used for the reliable selection of these enzyme-expressing cells over other (non-enzyme-expressing) cells of the cell culture. Thus, in particular, a technically advantageous and low-cost isolation of the above-selected cells is possible when in the expression vector-transfected cells of a cell culture, which are usually grown in a culture vessel and in this growth process attached to the same (which is caused by the expression of specific adhesion molecules becomes), said adhesion-molecule-depression is inhibited. By the expression of the protease or peptidase in the expression vector transfected cells, a special peptide-inhibited siRNA can be activated, which after activation, for example, prevents the expression of said adhesion molecule. Due to the inhibition of the expression of this or these adhesion molecules, the expression vector-transfected cells from the culture vessel, so that they can be easily separated from the other non-enzyme-expressed cells, for example, for their isolation.

Nicht mit dem Expressionsvektor-transfizierte Zellen sind nicht in der Lage, die Peptidinhibierte siRNA zu aktivieren; es kommt zu keiner RNA-Interferenz und zu keiner Zellenablösung von Kulturgefäß. Auf diese Weise können die Expressionsvektortransfizierten Zellen mit dem Überstand abgenommen und erneut kultiviert werden. Der Gehalt der siRNA in den Zellen nimmt nach einigen Stunden bzw. Tagen ab, und es kommt wieder zu einer Expression der Zell-Adhäsionsmoleküle und somit zu einer erneuten Adhäsion der Zellen an dem Kulturgefäß. Somit ist die physiologische in vitro Wachstumssituation wieder gegeben, und die Expressionsvektor-transfizierten Zellen wurden selektiert. Für den Fall, dass die Reinheit der transfizierten Zellen nicht ausreichend groß ist, kann der beschriebene Selektionsschritt mittels Einbringung von Peptid-inhibierter siRNA wiederholt werden.Non-expression vector transfected cells are unable to activate the peptide-inhibited siRNA; there is no RNA interference and no cell detachment of culture vessel. In this way, the expression vector transfected cells can be removed with the supernatant and cultured again. The content of the siRNA in the cells decreases after a few hours or days, and there is again an expression of the cell adhesion molecules and thus a re-adhesion of the cells to the culture vessel. Thus, the physiological in vitro growth situation is restored and the expression vector-transfected cells were selected. In the event that the purity of the transfected cells is not sufficiently high, the described selection step can be repeated by introducing peptide-inhibited siRNA.

Sollten Zellen während dieser Prozesse abgestorben sein, schwimmen diese ebenfalls im Zellkultur-Überstand und werden zusammen mit den Expressionsvektor-transfizierten Zellen in das beschriebene neue Kulturgefäß übernommen. Diese toten Zellen werden aber nicht wieder adhärieren und können somit im Rahmen der Routine-Zellkultur abgenommen werden.Should cells have died during these processes, they also float in the cell culture supernatant and are taken together with the expression vector-transfected cells in the described new culture vessel. However, these dead cells will not adhere again and can therefore be removed in the context of routine cell culture.

Die Verwendung des vorgeschlagenen Expressionsvektors zur Aktivierung einer Peptidinhibierten siRNA ist allerdings nicht auf die vorgenannte Selektion/Isolation der enzymexprimierenden Zellen beschränkt. Anwendung kann die Erfindung beispielsweise auch zur gerichteten Abtötung Expressionsvektor- Zellen finden. Dies ist vor Allem in der Stammzellforschung interessant, bei welcher Stammzellen in vivo eingebracht werden und möglicherweise nicht die gewünschten Effekte zeigen bzw. Terratome bilden. Werden diese Zellen vor deren Einbringung mit einem Expressionsvektor vorgeschlagener Art transfiziert, kann eine Peptid-inhibierte siRNA in vivo eingebracht und ausschließlich in diesen Zellen aktiviert werden. Das Zielgen der siRNA könnte hierbei ein für die Zelle überlebenswichtiges Gen sein, was zum Absterben der Zelle führen würde. Dadurch könnten Nebenwirkungen von in vivo eingebrachten Stammzellen verringert werden, wobei die beispielhaft genannte Anwendung nicht auf Stammzellen beschränkt ist.However, the use of the proposed expression vector to activate a peptide-inhibited siRNA is not limited to the aforementioned selection / isolation of the enzyme-expressing cells. For example, the invention can also find application for the targeted killing of expression vector cells. This is of particular interest in stem cell research in which stem cells are introduced in vivo and may not show the desired effects or form terratomas. If these cells are transfected prior to their introduction with an expression vector of a proposed type, a peptide-inhibited siRNA can be introduced in vivo and activated exclusively in these cells. The target gene of the siRNA could be a cell vital for the survival of the cell, which would lead to the death of the cell. This could reduce side effects of in vivo-introduced stem cells, with the exemplified application not being limited to stem cells.

Des Weiteren kann der beschriebene Mechanismus für diagnostische oder physiologische Betrachtungen verwendet werden.Furthermore, the described mechanism can be used for diagnostic or physiological considerations.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The invention will be explained below with reference to exemplary embodiments illustrated in the drawing.

Es zeigen:Show it:

1: Schematische Darstellung eines Expressionsvektors mit einem Promotor, einem anwendungsspezifischen Beispielgen und einer genetischen Information zur Expression eines (eine Peptid-inhibierte siRNA spaltenden) Enzyms 1 : Schematic representation of an expression vector with a promoter, an application-specific example gene and genetic information for the expression of an enzyme (a peptide-inhibited siRNA cleaving)

2: Schematische Darstellung eines Expressionsvektors mit zwei unabhängigen Promotoren für ein anwendungsspezifisches Beispielgen und ein die besagte Peptid-inhibierte siRNA spaltendes Enzym 2 : Schematic representation of an expression vector with two independent promoters for an application specific example gene and an enzyme cleaving said peptide-inhibited siRNA

3: Konkretes Beispiel zur Ausführung des Expressionsvektors gemäß 2 mit einer Region zum Einfügen mehrerer Beispielgene, wobei der Expressionsvektor zur Replikation in E.coli eine spezifische Apmicillin-Resistenz aufweist 3 Concrete example for the execution of the expression vector according to 2 with a region for inserting several example genes, the Expression vector for replication in E. coli has a specific Apmicillin resistance

4: Verfahren zur Verwendung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors für die Selektion von Zellen in einem Kulturgefäß 4 : Method of using the expression vector according to the invention for the selection of cells in a culture vessel

In 1 ist in übersichtlicher schematischer Darstellung ein Expressionsvektor 1 abgebildet, der nacheinander angeordnet einen Promotor 2, ein Beispiel-Gen 3, welches durch den Promotor 2 exprimiert wird, sowie (weiter nachfolgend) eine genetische Information 4 zur Expression eines Enzyms enthält, welches zur Spaltung einer in 1 nicht dargestellten an sich bekannten Peptid-inhibierten siRNA vorgesehen ist.In 1 is a clear schematic representation of an expression vector 1 imaged, which successively arranged a promoter 2 , an example gene 3 which by the promoter 2 is expressed as well as (hereafter) genetic information 4 for the expression of an enzyme which is suitable for the cleavage of an in 1 not shown in the known peptide-inhibited siRNA is provided.

In diesem Ausführungsbeispiel sind der Promotor 2, das Beispiel-Gen 3 und die genetische Information 4 zur Expression des besagten Enzyms in der genannten Reihenfolge hintereinander auf dem Expressionsvektor 1 angeordnet. Da sich die genetische Information 4 hinter dem Beispiel-Gen 3 befindet, wird das besagte Enzym nur dann exprimiert, wenn auch das eingebrachte Beispiel-Gen 3 exprimiert wird. Der Promotor 2 ist somit für beide genannten Wirkungen (sowohl für die Expression des Beispiel-Gens 3 als auch für die Enzymexpression aus der genetischen Information 4) vorgesehen. Die Wirkungsrichtung des Promotors 2 ist durch einen Pfeil 5 symbolisiert.In this embodiment, the promoter 2 , the example gene 3 and the genetic information 4 for expression of said enzyme in said order one behind the other on the expression vector 1 arranged. Because the genetic information 4 behind the example gene 3 is located, said enzyme is expressed only if the introduced example gene 3 is expressed. The promoter 2 is thus for both of these effects (both for the expression of the example gene 3 as well as for the enzyme expression from the genetic information 4 ) intended. The direction of action of the promoter 2 is by an arrow 5 symbolizes.

2 zeigt ebenfalls in übersichtlicher schematischer Darstellung einen Expressionsvektor 6, der jedoch im Unterschied zum Expressionsvektor 1 von 1 zwei Promotoren 7, 8, zur separaten Expression des Beispiel-Gens 3 und einer Enzymexpression aus einer am anderen Ende dieser Anordnungskette angesiedelten genetischen Information 9 enthält. Das Enzym dient wiederum zur Spaltung einer in 2 ebenfalls nicht dargestellten an sich bekannten Peptid-inhibierten siRNA. Der Promotor 7 ist somit zur Expression des diesem unmittelbar benachbarten Beispiel-Gens 3 vorgesehen (siehe auch Pfeil 10), während der Promotor 8 die Expression der diesem benachbarten genetische Information 8 bewirkt (vgl. Pfeil 11). Das besagte Enzym und das eingebrachte Beispiel-Gen 3 werden somit unabhängig von einander exprimiert. 2 also shows a clear schematic representation of an expression vector 6 , however, unlike the expression vector 1 from 1 two promoters 7 . 8th for separate expression of the example gene 3 and an enzyme expression from genetic information located at the other end of this ordering chain 9 contains. The enzyme in turn serves to cleave a 2 also not shown per se known peptide-inhibited siRNA. The promoter 7 is thus for the expression of this immediately adjacent example gene 3 provided (see also arrow 10 ) while the promoter 8th the expression of this neighboring genetic information 8th causes (see arrow 11 ). The said enzyme and the introduced example gene 3 are thus expressed independently of each other.

Als beispielhafte spezielle Ausführung des in 2 dargestellten Expressionsvektors 6 mit den zwei separaten Promotoren 7, 8 zeigt 3 einen Expressionsvektor 12, der als ersten Promotor (entsprechend Promotor 7 in 2) einen H1-Promotor 13 für Beispiel-Gene oder für shRNA aufweist, die in einer dem H1-Promotor 13 benachbarten DNA-Region 14 eingefügt werden können. Hierzu sind beispielhaft Schnittstellen (HindIII, BamHI, NotI, SexAl, BglII, MunI) zur Aufspaltung der DNA des Expressionsvektors 12 und Einfügung der besagten Gensequenzen bzw. shRNA dargestellt. Eine LTR-Region 15 trägt zur erhöhten Expression dieser Sequenzen bei.As an exemplary specific embodiment of the in 2 represented expression vector 6 with the two separate promoters 7 . 8th shows 3 an expression vector 12 which is the first promoter (corresponding to promoter 7 in 2 ) an H1 promoter 13 for example genes or for shRNA that belongs to the H1 promoter 13 adjacent DNA region 14 can be inserted. Exemplary are interfaces (HindIII, BamHI, NotI, SexAl, BglII, MunI) for cleaving the DNA of the expression vector 12 and insertion of the said gene sequences or shRNA. An LTR region 15 contributes to the increased expression of these sequences.

Als zweiten Promotor (entsprechend Promotor 8 in 2) weist der Expressionsvektor 12 einen PGK-Promotor 16 auf zur Expression des besagten Enzyms aus der dem PGK-Promotor 16 benachbarten genetischen Information 9 sowie zur Expression eines Reportergens EGFP aus einer genetischen Information 17, welche hinter der genetischen Information 9 auf dem Expressionsvektor 12 angeordnet ist. Damit erfolgt die Expression des Reportergens EGFP nur, wenn das Enzym aus der genetischen Information 9 exprimiert wird. Durch die separaten Promotoren (H1-Promotor 13 und PGK-Promotor 16) erfolgen die Expressionen des Enzyms aus der genetischen Information 9 sowie der in der DNA-Region 14 eingefügten Beispiel-Gene bzw. shRNA jedoch unabhängig voneinander (vgl. wiederum die Wirkungsrichtungen der Promotoren durch symbolische Darstellungen mit den Pfeilen 7, 8).As second promoter (corresponding to promoter 8th in 2 ) indicates the expression vector 12 a PGK promoter 16 for expression of said enzyme from the PGK promoter 16 neighboring genetic information 9 and for expression of a reporter gene EGFP from genetic information 17 which is behind the genetic information 9 on the expression vector 12 is arranged. Thus, the expression of the reporter EGFP occurs only when the enzyme from the genetic information 9 is expressed. Due to the separate promoters (H1 promoter 13 and PGK promoter 16 ), the expression of the enzyme takes place from the genetic information 9 as well as in the DNA region 14 However, inserted example genes or shRNA independently of each other (see, again, the directions of action of the promoters by symbolic representations with the arrows 7 . 8th ).

Ferner ist eine genetische Information 18 (Amp) vorhanden, durch welche der Expressionsvektor 12 zur Replikation in E.coli eine Ampicillin-Resistenz aufweist.Further, genetic information 18 (Amp), through which the expression vector 12 has an ampicillin resistance for replication in E. coli.

4 zeigt schematisch ein Verfahren zur Verwendung des beispielhaften Expressionsvektors 1 für die Selektion von in einem Kulturgefäß 19 gewachsenen Zellen 20. Aus einem Gefäß 21 werden die Expressionsvektoren 1 durch Pipettierung (in 4a symbolisiert durch Pfeildarstellung) in das Kulturgefäß 19 gegeben, in welchem die Zellen 20 in einem Nährmedium 22 gewachsen sind und am Boden anhaften. 4 schematically shows a method of using the exemplary expression vector 1 for the selection of in a culture vessel 19 grown cells 20 , From a vessel 21 become the expression vectors 1 by pipetting (in 4a symbolized by arrow depiction) in the culture vessel 19 given in which the cells 20 in a nutrient medium 22 have grown and cling to the ground.

Wie in 4b dargestellt, werden die in das Kulturgefäß 19 pipettierten Expressionsvektoren 1 in einige der Zellen 20 eingebracht (symbolisiert durch die Zellen 20a). Die übrigen Zellen bleiben von den Expressionsvektoren 1 unberührt. Im Übrigen sterben auch einige der Zellen 20 bei dieser Transfektion ab (nicht explizit dargestellt).As in 4b shown in the culture vessel 19 pipetted expression vectors 1 in some of the cells 20 introduced (symbolized by the cells 20a ). The remaining cells remain from the expression vectors 1 unaffected. Incidentally, some of the cells are also dying 20 in this transfection (not explicitly shown).

Aus einem Gefäß 23 werden jetzt zusätzlich Peptid-inhibierte siRNA-Moleküle 24 (in 4b symbolisiert durch Pfeildarstellung) in das Kulturgefäß 19 gegeben, die ebenfalls in die darin befindlichen und am Boden des Kulturgefäßes anhaftenden Zellen 20 transfiziert. In denjenigen Zellen, in die bereits der Expressionsvektor 1 eingedrungen ist (symbolisiert durch die Zellen 20a in 4a) wird durch das exprimierte Enzym desselben die Peptidbindung der Peptid-inhibierten siRNA-Moleküle 24 aufgebrochen, wodurch die siRNA dieser Moleküle 24 aktiviert wird. In diesem Beispiel ist diese siRNA-Sequenz gegen die mRNA eines oder mehrerer Adhäsionsmoleküle der Zellen gerichtet, so dass die Zelladhäsion aufgehoben wird und sich die Zellen (dargestellt als Zellen 20b in 4c vom Boden des Kulturgefäßes 19 ablösen sowie unter Änderung ihrer Zellform im Nährmedium 22 nach oben schweben.From a vessel 23 are now additionally peptide-inhibited siRNA molecules 24 (in 4b symbolized by arrow depiction) in the culture vessel 19 which are also in the cells therein and adhering to the bottom of the culture vessel 20 transfected. In those cells that already contain the expression vector 1 has penetrated (symbolized by the cells 20a in 4a ) becomes the peptide bond of the peptide-inhibited siRNA molecules by the expressed enzyme thereof 24 broken up, causing the siRNA of these molecules 24 is activated. In this example, this siRNA sequence is directed against the mRNA of one or more adhesion molecules of the cells, such that cell adhesion is lifted and the cells (represented as cells 20b in 4c from the bottom of the culture vessel 19 replace and change their cell shape in the nutrient medium 22 float up.

In die anderen Zellen 20 (vgl. Zellen 20b in 4c) können zwar auch, wie dargestellt, die Peptid-inhibierten siRNA-Moleküle 24 eingedrungen sein, jedoch wird, sofern in diese kein Expressionsvektor 1 transfiziert ist, deren Peptidbindung nicht aufgebrochen, so dass die Peptid-inhibierten siRNA-Moleküle 24 weiterhin in ihrer siRNA-Wirkung inaktiviert bleiben und somit nicht gegen die mRNA des besagten Zell-Adhäsionsmoleküls wirken können. Die Zellen bleiben weiterhin am Boden anhaften (vgl. Zellen 20c in 4c).In the other cells 20 (cf cells 20b in 4c ) may also, as shown, the peptide-inhibited siRNA molecules 24 However, if this is not an expression vector 1 is transfected, whose peptide bond is not broken, leaving the peptide-inhibited siRNA molecules 24 continue to remain inactivated in their siRNA activity and thus can not act against the mRNA of said cell adhesion molecule. The cells continue to adhere to the floor (see cells 20c in 4c ).

Auf diese Weise ist eine räumliche Selektion der Zellen 20 in die am Boden haften bleibenden Zellen 20c und die im Nährmedium 22 nach oben schwebenden Zellen 20b (siehe 4c) gegeben, so dass die im Überstand des Nährmediums 22 schwimmenden bzw. schwebenden Zellen 20b mit einer Pipette abgenommen werden und entsprechend 4d (separiert von den Zellen 20c in 4c) in ein anderes Kulturgefäß 25 mit einem Nährmedium 26 überführt werden können.In this way is a spatial selection of the cells 20 into the cells that adhere to the floor 20c and in the nutrient medium 22 floating cells 20b (please refer 4c ), so that in the supernatant of the nutrient medium 22 floating or floating cells 20b be removed with a pipette and accordingly 4d (separated from the cells 20c in 4c ) in another culture vessel 25 with a nutrient medium 26 can be transferred.

Durch Zellteilung und Degradierung der siRNA-Moleküle nimmt deren Konzentration innerhalb der Zellen 20b ab und es kommt wieder zu einer Expression des vorher gehemmten Gens bzw. Proteins, so dass im vorliegenden Beispiel die Wirkung gegen die mRNA des besagten Zell-Adhäsionsmoleküls nachlässt und das besagte Adhäsionsmolekül der Zellen 20b in dessen Expression nicht mehr gehemmt wird, wodurch diese Zellen (vgl. 4e), insbesondere für eine erneute bzw. weitere Kultivierung wieder am Boden nunmehr des neuen Kulturgefäßes 25 anwachsen. Bei dieser Methode abgestorbene Zellen, die ebenfalls mit in das neue Kulturgefäß 25 überführt wurden, können im Rahmen der normalen Zellkultur im Überstand des Nährmediums 26 abgenommen werden.By cell division and degradation of siRNA molecules, their concentration decreases within the cells 20b and again an expression of the previously inhibited gene or protein, so that in the present example, the action against the mRNA of said cell adhesion molecule decreases and the said adhesion molecule of the cells 20b in whose expression is no longer inhibited, causing these cells (see. 4e ), especially for a renewed or further cultivation back on the ground now the new culture vessel 25 grow. In this method dead cells, which are also in the new culture vessel 25 can be transferred, in the context of normal cell culture in the supernatant of the nutrient medium 26 be removed.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

1, 6, 121, 6, 12
Expressionsvektorexpression vector
2, 7, 82, 7, 8
Promotorpromoter
33
Beispiel-GenExample gene
4, 94, 9
genetische Information zur Enzymexpressiongenetic information on enzyme expression
5, 10, 115, 10, 11
Pfeilarrow
1313
H1-PromotorH1 promoter
1414
DMA-RegionDMA region
1515
LTR-RegionLTR region
1616
PGK-PromotorPGK promoter
1717
genetische Information für Reportergen EGFPgenetic information for reporter gene EGFP
1818
genetische Information für Amicillin-Resistenzgenetic information for amicillin resistance
19, 2519, 25
Kulturgefäßculture vessel
2020
Zellencell
20a20a
Zellen mit transferiertem Expressionsvektor 1 Cells with transferred expression vector 1
20b20b
Zellen mit zusätzlich transferierter Peptid-inhibierter siRNACells with additionally transferred peptide-inhibited siRNA
20c20c
Zellen mit nicht transferierter Peptid-inhibierter siRNACells with untransferred peptide-inhibited siRNA
21, 2321, 23
Gefäßvessel
22, 2622, 26
Nährmediumbroth
2424
Peptid-inhibierte siRNA-MolekülePeptide-inhibited siRNA molecules
HindIIIHind
DNA-Schnittstellen des Expressionsvektors 12 DNA interfaces of the expression vector 12
BamHIBam
DNA-Schnittstellen des Expressionsvektors 12 DNA interfaces of the expression vector 12
NotINotI
DNA-Schnittstellen des Expressionsvektors 12 DNA interfaces of the expression vector 12
SexAlSexAI
DNA-Schnittstellen des Expressionsvektors 12 DNA interfaces of the expression vector 12
BglIIBglII
DNA-Schnittstellen des Expressionsvektors 12 DNA interfaces of the expression vector 12
MunIMun
DNA-Schnittstellen des Expressionsvektors 12 DNA interfaces of the expression vector 12

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

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Claims (9)

Expressionsvektor, enthaltend mindestens einen Promotor und Schnittstellen zum Einfügen von verwendungsspezifischen Gensequenzen, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor (1, 6, 9) für den Zweck der Aktivierung einer Peptid-inhibierten siRNA die genetische Information (4, 9) zur Expression eines eine Peptid-inhibierte siRNA (24) spaltenden Enzyms enthält.Expression vector containing at least one promoter and interfaces for inserting use-specific gene sequences, characterized in that the expression vector ( 1 . 6 . 9 ) for the purpose of activating a peptide-inhibited siRNA the genetic information ( 4 . 9 ) for the expression of a peptide-inhibited siRNA ( 24 ) cleaving enzyme. Expressionsvektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Protease als die Peptidinhibierte siRNA (24) spaltendes Enzym.Expression vector according to claim 1, characterized by a protease as the peptide-inhibited siRNA ( 24 ) cleaving enzyme. Expressionsvektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Peptidase als die Peptid-inhibierte siRNA (24) spaltendes Enzym.Expression vector according to claim 1, characterized by a peptidase as the peptide-inhibited siRNA ( 24 ) cleaving enzyme. Expressionsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem zumindest einem Promotor (2) und der genetischen Information (4) zur Expression des die Peptid-inhibierte siRNA (24) spaltenden Enzyms weitere verwendungsspezifische genetische Informationen (3, 14) vorhanden sind.Expression vector according to claim 1, characterized in that between the at least one promoter ( 2 ) and the genetic information ( 4 ) for the expression of the peptide-inhibited siRNA ( 24 ) cleaving enzyme further use-specific genetic information ( 3 . 14 ) available. Expressionsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für die Expression der genetischen Information (4, 9) des Enzyms und weiterer Gene (3, 14) unterschiedliche Promotoren (7, 8) vorhanden sind.Expression vector according to Claim 1, characterized in that for the expression of the genetic information ( 4 . 9 ) of the enzyme and other genes ( 3 . 14 ) different promoters ( 7 . 8th ) available. Expressionsvektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die weiteren Gene (3, 14) für die Expression von Proteinen vorgesehen sind.Expression vector according to claim 5, characterized in that the further genes ( 3 . 14 ) are intended for the expression of proteins. Expressionsvektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die weiteren Gene (3, 14) für die Expression von shRNA vorgesehen sind.Expression vector according to claim 5, characterized in that the further genes ( 3 . 14 ) are intended for the expression of shRNA. Verfahren zur Verwendung des Expressionsvektors gemäß einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche 1–7, bei dem der Expressionsvektor in in einem Kulturgefäß gewachsene Zellen eingebracht wird, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zum Expressionsvektor eine Peptid-inhibierte siRNA in die Zellen eingebracht wird und diese in den Zellen durch die Expression des auf dem Expressionsvektor kodierten und exprimierten Enzyms aktiviert wird.A method for using the expression vector according to one or more of the preceding claims 1-7, wherein the expression vector is introduced into cells grown in a culture vessel, characterized in that in addition to the expression vector, a peptide-inhibited siRNA is introduced into the cells and these in the Cells is activated by the expression of the encoded and expressed on the expression vector enzyme. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Aktivierung der Peptid-inhibierten siRNA zum Zweck der Ablösung der im Kulturgefäß gewachsenen und Expressionsvektor-transfizierten Zellen von demselben die Expression eines Adhäsionsmoleküls der Zellen vermindert wird und auf diese Weise die Expressionsvektortransfizierten Zellen selektiert werden.A method according to claim 8, characterized in that the activation of the peptide-inhibited siRNA for the purpose of detachment of grown in the culture vessel and expression vector-transfected cells thereof, the expression of an adhesion molecule of the cells is reduced and in this way the expression vector transfected cells are selected.
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