DE10222858A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Feinchemikalien - Google Patents

Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Feinchemikalien

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DE10222858A1
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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur fermentativen Herstellung von schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin, unter Verwendung von Bakterien, in denen eine für ein S-Adenosylmethionin-Synthase(metK)-Gen kodierende Nukleotidsequenz exprimiert wird.

Description

  • Gegenstand der Erfindung ist neues Verfahren zur fermentativen Herstellung von schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin und L-Cystein, bei dem Bakterien genutzt werden, in denen Nukleotidsequenzen exprimiert werden, die für Mutanten der S-Adenosylmethionin-Synthase (metK) (E.C.2.5.1.6) kodieren; Nukleotidsequenzen, welche für diese Mutanten kodieren, sowie die damit transformierten, rekombinanten Mikroorganismen sowie neuartige metK-Mutanten mit veränderter Enzymaktivität.
  • Stand der Technik
  • Schwefelhaltige Feinchemikalien, wie zum Beispiel Methionin, Homocystein, S-Adenosyl- Methionin, Glutathion, Cystein, Biotin, Thiamin, Liponsäure werden über natürliche Stoffwechselprozesse in Zellen hergestellt und werden in vielen Industriezweigen verwendet, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie. Diese Substanzen, die zusammen als "schwefelhaltige Feinchemikalien" bezeichnet werden, umfassen organische Säuren, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Vitamine und Cofaktoren. Ihre Produktion erfolgt am zweckmäßigsten im Großmaßstab mittels Anzucht von Bakterien, die entwickelt wurden, um große Mengen der jeweils gewünschten Substanz zu produzieren und sezernieren. Für diesen Zweck besonders geeignete Organismen sind die gram-positiven, nicht-pathogenen coryneformen Bakterien.
  • Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zum Produkt, beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
  • Über Stammselektion sind eine Reihe von Mutantenstämmen entwickelt worden, die ein Sortiment wünschenswerter Verbindungen aus der Reihe der schwefelhaltigen Feinchemikalien produzieren. Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen hinsichtlich der Produktion eines bestimmten Moleküls werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Dies ist jedoch ein zeitaufwendiges und schwieriges Verfahren. Auf diese Weise erhält man z. B. Stämme, die resistent gegen Antimetabolite, wie z. B. die Methionin-Analoga α-Methyl-Methionin, Ethionin, Norleucin, N-Acetylnorleucin, S-Trifluoromethylhomocystein, 2-Amino-5- heprenoitsäure, Seleno-Methionin, Methioninsulfoximin, Methoxin, 1-Aminocyclopentan- Carboxylsäure oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und schwefelhaltige Feinchemikalien, wie z. B. L-Methionin, produzieren.
  • Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht.
  • Aus der JP-A-06-020809 ist eine Nukleotidsequenz für ein S-Adenosylmethionin kodierendes Gen aus Brevibacterium flavum MJ-233, einem coryneformen Bakterium, bekannt. Die korrespondierende Aminosäuresequenz umfasst 412 Aminosäuren. Das Protein weist unter anderem in den Positionen 24 und 94 jeweils einen Cysteinrest auf, welche in den entsprechenden Enzymen zahlreicher anderer coryneformer Bakterien konserviert sind. Die offenbarte Aminosäuresequenz besitzt einen charakteristischen Sequenzabschnitt zwischen den Resten 137 und 154. Die Herstellung von Mutanten und deren Verwendung bei der fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Feinchemikalien ist darin nicht beschrieben
  • Aus der WO-A-01/00843 ist ein metK-Gen aus C. glutamicum bekannt, welches für ein Protein mit 407 Aminosäuren kodiert und eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 16 aufweist.
  • Verbesserungen der fermentativen Herstellung von Feinchemikalien korrelieren in der Regel mit Verbesserungen von Stoffflüssen und Ausbeuten. Wichtig dabei ist es, Zwischen- oder Endprodukthemmungen wichtiger Syntheseenzyme zu verhindern oder zu verringern. Ebenso ist es von Vorteil, Abflüsse des Kohlenstoffflusses in ungewünschte Produkte oder Seitenprodukte zu verhindern oder zu verringern.
  • Der Einfluss von Stoffwechselmetaboliten auf die enzymatischen Aktivitäten von Stoffwechselenzymen kann untersucht werden. Beispiele für solche Enzyme können metA, metB, metC, MetY, metH, metE, metF und weitere Enzyme im Stoffwechsel von Mikroorgamismen sein. Ein wichtiges Stoffwechselprodukt des Methionins und damit ein wesentlicher Abfluß ist S-Adenosylmethionin.
  • Gleichzeitig ist S-Adenosylmethionin aber auch ein entscheidender Regulator der Methioninbiosynthese. Es ist zum Beispiel bekannt, dass die Biosynthese von L-Methion in E. coli durch S-Adenosylmethionin inhibiert wird. S-Adenosylmethionin wirkt dort als ein Co- Repressor des Repressors metJ (Weissbach, H. Brot, N. (1991) "Mol. Microbiol.", 5 (7), 1593-1597).
  • Die Synthese des S-Adenosylmethionins ist gleichzeitig ein wesentlicher Abfluß des gewünschten Wertproduktes L-Methionin. Deshalb ist es aus mehreren Gründen wünschenswert, die Menge des gebildeten S-Adenosylmethionins zu verringern:
    • a) die Menge des gebildeten L-Methionins würde erhöht,
    • b) die Repression von Genen der Methionin-Biosynthese verringert und
    • c) die Feedback-Inhibition von Enzymen der Methionin-Biosynthese würde verringert.
  • Die Deletion des metK-Gens wäre der einfachste Weg, die Bildung des S-Adenosylmethionins zu verhindern. In Wei, Y. und Newman, E. B. (2002), "Mol. Microbiol.", 43 (6), 1651-1656 wird metK aber als ein essentielles Gen beschrieben und scheint somit für den Fachmann als Ansatzpunkt für eine verbesserte, fermentative Herstellung von schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesondere von L-Methionin, auszuscheiden.
    • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur verbesserten, fermentativen Herstellung von schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin, und die dafür erforderlichen Mittel bereitzustellen.
  • Gelöst wird obige Aufgabe überraschenderweise durch Bereitstellung eines Verfahrens zur fermentativen Herstellung einer schwefelhaltigen Feinchemikalie, umfassend die Expression einer metK-Nukleotidsequenz in einem coryneformen Bakterium, wobei die Nukleotidsequenz für eine S-Adenosylmethionin-Synthase-Mutante kodiert, deren Aktivität gegenüber dem Wildtyp-Enzym verändert, vorzugsweise verringert, ist. Beispielsweise ist die Mutante von der S-Adenosylmethionin-Synthase aus Corynebacterium glutamicum abgeleitet und zeigt, gemessen in Corynebacterium glutamicum, eine geringere Aktivität als das Wildtyp-Enzym.
  • Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung wenigstens einer schwefelhaltigen Feinchemikalie, welches folgende Schritte umfasst:
    • a) Fermentation einer die gewünschte schwefelhaltige Feinchemikalie produzierenden, coryneformen Bakterienkultur, wobei in den coryneformen Bakterien zumindest eine Nukleotidsequenz exprimiert wird, welche für ein Protein mit veränderter S- Adenosylmethionin-Synthase(metK)-Aktivität kodiert;
    • b) Anreicherung der schwefelhaltigen Feinchemikalie im Medium und/oder in den Zellen der Bakterien und
    • c) Isolieren der schwefelhaltigen Feinchemikalie, welche vorzugsweise L-Methionin umfasst.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das mutierte, coryneforme Bakterium außerdem eine im Vergleich zum nichtmutierten Wildtyp verbesserte metY-Aktivität und/oder eine gesteigerte L-Methionin-Menge (z. B. in g/l, Fermentationsbrühe).
  • Im erfindungsgemäßen Verfahren wird als metK-kodierende Sequenz insbesondere eine kodierende Nukleotidsequenz verwendet?, welche für ein Protein mit verringerter metK- Aktivität kodiert, in welchem wenigstens ein Cysteinrest des Wildtyp-Proteins substituiert ist.
  • Vorzugsweise ist die metK-kodierende Sequenz eine kodierende Nukleotidsequenz, die für ein Protein mit metK-Aktivität kodiert, welches folgende Aminosäureteilsequenz gemäß SEQ ID NO: 23 aufweist:

    G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V,

    worin
    X1 und X2 unabhängig voneinander für eine beliebige Aminosäure stehen;
    und
    X3 für eine von Cys verschiedene Aminosäure steht.
  • Besonders bevorzugt ist ein Verfahren gemäß obiger Definition, bei welchem die metK- kodierende Sequenz für ein Protein mit metK-Aktivität kodiert, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz von Val1 bis Ala407 gemäß SEQ ID NO: 22 oder eine dazu homologe Aminosäuresequenz, welche für ein Protein mit funktionaler Äquivalenz steht, umfasst.
  • Die erfindungsgemäß eingesetzte, metK-kodierende Sequenz umfasst vorzugsweise eine kodierende Sequenz gemäß SEQ ID NO: 21 oder eine dazu homologe Nukleotidsequenz, welche für ein Protein mit metK-Aktivität kodiert.
  • Die kodierende metK-Sequenz ist vorzugsweise eine in coryneformen Bakterien replizierbare oder eine stabil in das Chromosom intregrierte DNA oder eine RNA.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt, indem man:
    • a) einen mit einem Plasmidvektor transformierten Bakterienstamm einsetzt, der wenigstens eine Kopie der kodierenden metK-Sequenz unter der Kontrolle regulativer Sequenzen trägt, oder
    • b) einen Stamm einsetzt, in dem die kodierende metK-Sequenz in das Chromosom des Bakteriums integriert wurde.
  • Besonders bevorzugt sind Stämme obiger Definition, in denen zusätzlich die Aktivität des metK-Wildtyp-Enzyms vollständig oder teilweise entfernt wurde, wie z. B. durch Deletion der kodierenden Sequenz des Wildtyp-Enzyms.
  • Außerdem kann es wünschenswert sein, Bakterien zu fermentieren, in denen zusätzlich wenigstens ein weiteres Gen des Biosyntheseweges der gewünschten, schwefelhaltigen Feinchemikalie verstärkt ist, und/oder in denen wenigstens ein Stoffwechselweg zumindest teilweise ausgeschaltet sind, der die Bildung der gewünschten, schwefelhaltigen Feinchemikalie verringert.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden deshalb coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig wenigstens eines der Gene, ausgewählt unter:
    • 1. dem für eine Aspartat-Kinase kodierenden Gen lysC,
    • 2. dem für eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase kodierenden Gen asd
    • 3. dem für die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierenden Gen gap,
    • 4. dem für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierenden Gen pgk,
    • 5. dem für die Pyruvat-Carboxylase kodierenden Gen pyc,
    • 6. dem für die Triosephosphat-Isomerase kodierenden Gen tpi,
    • 7. dem für die Homoserin-O-Acetyltransferase kodierenden Gen metA,
    • 8. dem für die Cystahionin-gamma-Synthase kodierenden Gen metB,
    • 9. dem für die Cystahionin-gamma-Lyase kodierenden Gen metC,
    • 10. dem für die Methionin-Synthase kodierenden Gen metH,
    • 11. dem für die Serin-Hydroxymethyltransferase kodierenden Gen glyA,
    • 12. dem für die O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase kodierenden Gen metY,
    • 13. dem für die Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase kodieren Gen, metF
    • 14. dem für die Phosphoserin-Aminotransferase kodieren Gen serC
    • 15. dem für die Phosphoserin-Phosphatase kodieren Gen serB,
    • 16. dem für die Serine-Acetyl-Transferase kodieren Gen cysE,
    • 17. dem für die Cystein-Synthase kodierenden gen cysK,
    • 18. dem für die Homoserin-Dehydrogenase kodieren Gen hom,
    überexprimiert ist.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig wenigstens eines der Gene, ausgewählt unter Genen der oben genannten Gruppe 1) bis 18), so mutiert ist, dass die korrespondierenden Proteine, verglichen mit nicht mutierten Proteinen, in geringerem Maße oder nicht durch Stoffwechselmetabolite in ihrer Aktivität beeinflusst werden und dass insbesondere die erfindungsgemäße Produktion der Feinchemikalie nicht beeinträchtigt wird, oder so dass ihre spezifische, enzymatische Aktivität gesteigert wird:
    Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig wenigstens eines der Gene, ausgewählt unter:
    • 1. dem für die Homoserine-Kinase kodierenden Gen thrB,
    • 2. dem für die Threonin-Dehydratase kodierenden Gen ilvA,
    • 3. dem für die Threonin-Synthase kodierenden Gen thrC
    • 4. dem für die Meso-Diaminopimelat-D-Dehydrogenase kodierenden Gen ddh
    • 5. dem für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierenden Gen pck,
    • 6. dem für die Glucose-6-Phosphat-6-Isomerase kodierenden Gen pgi,
    • 7. dem für die Pyruvat-Oxidase kodierenden Gen poxB,
    • 8. dem für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierenden Gen dapA,
    • 9. dem für die Dihydrodipicolinat-Reduktase kodierenden Gen dapB; oder
    • 10. dem für die Diaminopicolinat-Decarboxylase kodierenden Gen lysA
    abschwächt ist, insbesondere durch Verringerung der Expressionsrate des korrespondierenden Gens.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig wenigstens eines der Gene der obigen Gruppen 19) bis 28) mutiert ist, so dass die enzymatische Aktivität des korrespondierenden Proteins teilweise oder vollständig verringert wird.
  • Vorzugsweise werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum eingesetzt.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines L- Methionin-haltigen Tierfuttermittel-Additivs aus Fermentationsbrühen, welches folgende Schritte umfasst:
    • a) Kultivierung und Fermentation eines L-Methionin produzierenden Mikroorganismus, vorzugsweise mit verringerter metK-Aktivität gemäß obiger Definition, in einem Fermentationsmedium;
    • b) Entfernung von Wasser aus der L-Methionin-haltigen Fermentationsbrühe;
    • c) Entfernung der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von 0 bis 100 Gew.-%, und
    • d) Trocknung der gemäß b) und/oder c) erhaltenen Fermentationsbrühe, um das Tierfuttermittel-Additiv in der gewünschten Pulver- oder Granulatform zu erhalten.
  • Die Erfindung betrifft außerdem isolierte Polynukleotide, die für ein Polypeptid mit verringerter metK-Aktivität gemäß obiger Definition kodieren, sowie metK-Mutanten mit verringerter Aktivität, welche von diesen Polynukleotiden kodiert werden.
  • Gegenstand der Erfindung sind außerdem rekombinante, coryneforme Bakterien, die ein mutiertes metK-Gen gemäß obige Definition exprimieren und insbesondere solche rekombinanten, coryneformen Bakterien, welche das metK-Wildtyp-Enzym nicht mehr exprimieren.
  • Bevorzugte rekombinante, coryneforme Bakterien zeigen im Vergleich zum korrespondierenden Wildtyp-Stamm wenigstens eines der folgenden Merkmale:
    • a) geringeren, intrazellulären S-Adenosylmethionin-Titer
    • b) geringere, intrazelluläre S-Adenosylmethionin-Synthase-Konzentration oder
    • c) geringere Aktivität der S-Adenosylmethionin-Synthase, bestimmt anhand der S-Adenosylmethionin-Bildungsrate
    und zusätzlich gegebenenfalls wenigstens eines der folgenden Merkmale:
    • a) verbesserte metY-Aktivität oder
    • b) gesteigerte L-Methionin-Menge.
    Detaillierte Beschreibung der Erfindung a) Allgemeine Begriffe
  • Als Proteine mit der biologischen Aktivität der "S-Adenosylmethionin-Synthase", kurz auch metK genannt (E.C.2.5.1.6), werden solche Proteine bezeichnet, die in der Lage sind, L- Methionin und ATP zu S-Adenosyl-Methionin umzusetzen. Dem Fachmann sind weitere Details des metK-Proteins bekannt. Die enzymatische Aktivität von metK kann durch Enzymtests nachgewiesen werden, Vorschriften dafür finden sich in: Markham, G. D. et al. (1983), "Methods in Enzymology", 94: 219-222.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff "schwefelhaltige Feinchemikalie" jegliche chemische Verbindung, die wenigstens ein Schwefelatom kovalent gebunden enthält und durch ein erfindungsgemäßes Fermentationsverfahrens zugänglich ist. Nichtlimitierende Beispiele dafür sind Methionin, Homocystein, S-Adenosyl-Methionin, Cystein und insbesondere Methionin und S-Adenosyl-Methionin.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfassen die Begriffe "L-Methionin", "Methionin", "Homocystein" und "S-Adenosylmethionin" auch die korrespondierenden Salze, wie z. B. Methionin-Hydrochlorid oder Methionin-Sulfat.
  • "Polynukleotide" bezeichnet im allgemeinen Polyribonukleotide (RNA) und Polydeoxyribonukleotide (DNA), wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann.
  • Unter "Polypeptiden" versteht man erfindungsgemäß Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren enthalten.
  • Der Begriff "Stoffwechselmetabolit" bezeichnet chemische Verbindungen, die im Stoffwechsel von Organismen als Zwischen- oder auch Endprodukte vorkommen und die neben ihrer Eigenschaft als chemische Bausteine auch modulierende Wirkung auf Enzyme und ihre katalytische Aktivität haben können. Dabei ist aus der Literatur bekannt, dass solche Stoffwechselmetabolite sowohl hemmend als auch stimulierend auf die Aktivität von Enzymen wirken können ("Biochemistry", Stryer, Lubert, 1995 W. H. Freeman & Company, New York, New York.). In der Literatur ist auch beschrieben, dass es möglich ist, durch Maßnahmen, wie Mutation der genomischen DNA durch UV-Strahlung, ionisierender Strahlung oder mutagene Substanzen und nachfolgender Selektion auf bestimmte Phänotypen, in Organismen solche Enzyme zu produzieren, in denen die Beeinflussung durch Stoffwechselmetabolite verändert wurde (Sahm H., Eggeling L., de Graaf A. A., "Biological Chemistry", 381 (9-10): 899-910, 2000; Eikmanns BJ., Eggeling L., Sahm H. Antonie von Leeuwenhoek. 64: 145-63, 1993-94). Diese veränderten Eigenschaften können auch durch gezielte Maßnahmen erreicht werden. Dabei ist dem Fachmann bekannt, in Genen für Enzyme auch gezielt bestimmte Nukleotide der für das Protein kodierenden DNA so zu verändern, dass das aus der exprimierten DNA-Sequenz resultierende Protein bestimmte neue Eigenschaften aufweist. So kann zum Beispiel erreicht werden, dass die modulierende Wirkung von Stoffwechselmetaboliten gegenüber dem nicht veränderten Protein verändert ist. Enzyme können auch derart in ihrer Aktivität beeinflusst werden, dass es zu einer Verringerung der Reaktionsgeschwindigkeit oder zu einer Veränderung der Affinität gegenüber dem Substrat kommt.
  • Die Begriffe "exprimieren" bzw. "Verstärkung" oder "Überexpression" beschreiben im Kontext der Erfindung die Produktion bzw. Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden. Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einen Organismus einbringen, ein vorhandenes Gen durch ein anderes Gen ersetzen, die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöhen, einen starken Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und man kann gegebenenfalls diese Maßnahmen kombinieren.
  • Die Begriffe "abschwächen" und "verringern" beschreiben im Kontext der Erfindung die Abschwächung oder Verringerung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden. Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einem Organismus deletieren, ein vorhandenes Gen durch ein anderes Gen ersetzen, die Kopienzahl eines Transkriptes des Gens bzw. der Gene erniedrigen, einen schwachen Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigeren Aktivität kodiert und man kann gegebenenfalls diese Maßnahmen kombinieren.
  • Die "verringerte Aktivität" einer erfindungsgemäßen S-Adenosylmethionin-Synthase-Mutante oder eines funktionelle Äquivalents kann durch den Vergleich mit der Aktivität der nativen S- Adenosylmethionin-Synthase, wie z. B. aus Corynebacterium-glutamicum-Wildtyp, ATCC 13032, bestimmt werden. Geeigneterweise bringt man dazu Plasmide, die in Corynebacterium glutamicum replizieren und die die Gene für S-Adenosylmethionin- Synthase-Mutanten tragen, durch Transformation z. B. in Corynebacterium-glutamicum- Wildtyp, ATCC 13032 ein. Außerdem bringt man entsprechende Plasmide in Corynebacterium-glutamicum-Wildtyp, ATCC 13032 ein, die das Wildtyp-Enzym S- Adenosylmethionin-Synthase exprimieren. Solchermaßen erhaltene Corynebacterium- glutamicum-Transformanten werden in geeigneten Medien kultiviert und in der logarithmischen Phase des Wachstums bei gleicher OD600 geerntet. Danach werden aus den geernteten Zellen beider Transformanten nach bekannten Protokollen Proteinextrakte hergestellt. Gleiche Mengen dieser Proteinextrakte (nach Proteinbestimmung) werden dann in einen S-Adenosylmethionin-Synthase-Assay nach Markham Markham, G. D. et al. (1983), "Methods in Enzymology", 94: 219-222 eingesetzt. Die Radioaktivität des gebildeten S- Adenosylmethionins wird in einem Szintillationszähler bestimmt. Unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivität des radioaktiven L-Methionins sowie der eingesetzten Proteinmenge läßt sich die Rate der S-Adenosylmethionin-Bildung aus der Zunahme der eingebauten Radioaktivität pro Zeiteinheit bestimmen. Ihre Einheit lautet µmol S- Adenosylmethionin/min.mg Protein. Diese Rate kann zwischen Wildtypenzym und Mutantenenzym verglichen werden. Nach dem gleichen Prinzip sind, ausgehend von anderen Wildtyp-Enzymen, mit S-Adenosylmethionin-Synthase-Aktivität erfindungsgemäß brauchbare Mutanten herstellbar.
  • Eine "verringerte Aktivität" erfindungsgemäß ist insbesondere dann gegeben, wenn die spezifische Aktivität der Mutante auf eine Restaktivität von etwa 1 bis 90%, vorzugsweise bis 70%, wie z. B. 5 bis 10% der Wildtyp-Aktivität verringert ist.
    • b) Erfindungsgemäße metK-Proteine
  • Die erfindungsgemäßen Polynukleotidsequenzen kodieren für Proteine mit veränderter, insbesondere verringerter S-Adenosylmethionin-Synthase-Aktivität gemäß obiger Definition.
  • Vorzugsweise sind die erfindungsgemäß brauchbaren Mutanten durch Substitution eines oder mehrerer konservierter Cysteinreste innerhalb der metK-Aminosäuresequenz grampositiver und/oder gramnegativer, oder insbesondere coryneformer Bakterien zugänglich. Konservierte Cysteinreste sind anhand von Sequenzalignments leicht feststellbar. Als nichtlimitierendes Beispiele für konservierte Cys-Reste in S- Adenosylmethionin-Synthasen aus Bakterien sind Cys24 und Cys94 des Enzyms aus C. glutamicum zu nennen, welche in einer Vielzahl von Bakterien zu finden sind.
  • In einer bevorzugten Gruppe von erfindungsgemäßen Mutanten sind Cys24 und oder Cys94 (gemäß metK aus C. glutamicum ATCC 13032) durch eine von Cys verschiedene Aminosäure, vorzugsweise Alanin, substituiert, wodurch die Enzymaktivität in obiger Weise verringert wird.
  • "Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Polypeptide sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z. B. Substratspezifität, besitzen.
  • Unter "funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere Mutanten, welche in wenigstens einer der oben genannten Sequenzpositionen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten, biologische Aktivität besitzen. "Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, -Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d. h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden.
  • "Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.
  • "Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z. B. die gewünschte, biologische Funktion aufweisen.
  • "Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete, funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C- terminaler Verknüpfung (d. h. ohne gegenseitige, wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitiernde Beispiele für derartige, heterologe Sequenzen sind z. B. Signalpeptide, Enzyme, Immunoglobuline, Oberflächenantigene, Rezeptoren oder Rezeptorliganden.
  • Erfindungsgemäß mit umfasste "funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 20%, 30% oder etwa 40%, 50%, vorzugsweise wenigstens etwa 60%, 65%, 70% oder 75%, insbesondere wenigstens 85%, wie z. B. 90%, 95% oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Sequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, "Proc. Natl. Acad, Sci." (USA) 85(8), 1988, 2444-2448.
  • Insbesondere sind Mutanten und funktionale Analoga bevorzugt, welche die charakteristische Teilsequenz:

    G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V

    gemäß obiger Definition enthalten, wobei X3 eine von Cys verschiedene, durch Mutation eingeführte Aminosäure, insbesondere Alanin, darstellt. X3 entspricht Cys94 der metK- Wildtyp-Sequenz von C. glutamicum (SEQ ID NO: 16). X2 steht vorzugsweise für Ala, Glu, Asp, Asn oder Arg, und X1 steht vorzugsweise für Gly, Cys, Ser oder Ala.
  • Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutagenese erzeugt werden, z. B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins. Der Begriff "Homolog", wie er hier verwendet wird, betrifft eine variante Form des Proteins, die als Agonist oder Antagonist der Protein-Aktivität wirkt.
  • Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z. B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z. B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen codieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z. B. Narang, S. A. (1983) "Tetrahedron", 39: 3; Itakura et al. (1984) "Annu. Rev. Biochem.", 53: 323; Itakura et al., (1984) "Science", 198: 1056; Ike et al. (1983), "Nucleic Acids Res.", 11: 477).
  • Zusätzlich können Banken von Fragmenten des Protein-Codons verwendet werden, um eine variegierte Population von Protein-Fragmenten zum Screening und zur anschließenden Selektion von Homologen eines erfindungsgemäßen Proteins zu erzeugen. Bei einer Ausführungsform kann eine Bank von kodierenden Sequenzfragmenten durch Behandeln eines doppelsträngigen PCR-Fragmentes einer kodierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, unter denen ein Nicking nur etwa einmal pro Molekül erfolgt, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA unter Bildung doppelsträngiger DNA, die Sense-/Antisense-Paare von verschiedenen, genickten Produkten umfassen kann, Entfernen einzelsträngiger Abschnitte aus neu gebildeten Duplices durch Behandlung mit S1-Nuclease und Ligieren der resultierenden Fragmentbank in einen Expressionsvektor erzeugt werden. Durch dieses Verfahren kann eine Expressionsbank hergeleitet werden, die N-terminale, C-terminale und interne Fragmente mit verschiedenen Größen des erfindungsgemäßen Proteins kodiert.
  • Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zur Mutagenese von Genen bekannt: Coco, WM et al. 2001. "DNA shuffling method for generating highly recombined genes and evolved enzymes". "Nature Biotechnol.", 19: 354-359; DE 199 53 854; Leung DW et al. 1989. "A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction". "Technique" 1: 11-15; Stemmer WPC 1994. "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution". "Proc. Natl. Acad. Sci." USA 91: 10747-10751; und US 5811238. Diese Verfahren sind zur Herstellung erfindungsgemäß brauchbarer Mutanten einsetzbar.
  • Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese von erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen codiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive- Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992), "PNAS", 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993), "Protein Engineering", 6(3): 327-331.
    • c) Erfindungsgemäße Polynukleotide
  • Gegenstand der Erfindung sind ebenso Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z. B. cDNA und mRNA), kodierend für ein erfindungsgemäßes metK-Enzym und deren funktionale Äquivalente, welche z. B. auch unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind.
  • Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, sowie Nukleinsäurefragmente, die z. B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßen, kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten
  • Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulärem Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
  • Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequenzen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologer Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z. B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.
  • Weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen sind abgeleitet von SEQ ID NO: 21 und unterscheiden sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide, kodieren aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil. Dies können Polynukleotide sein, die zu obigen Sequenzen in mindestens etwa 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80% oder 90%, vorzugsweise in mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der Sequenzpositionen identisch sind.
  • Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eines speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z. B. Allelvarianten, davon. Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d. h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.
  • Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5% in der Nukleotidsequenz eines Gens.
  • Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben genannten, kodierenden Sequenzen hybridisieren oder dazu komplementär sind. Diese Polynukleotide lassen sich bei Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Eine weitere Möglichkeit bietet die Transformation geeigneter Mikroorganismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Vektoren, die Vermehrung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide und deren anschließende Isolierung. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden.
  • Unter der Eigenschaft, an Polynukleotide "hybridisieren" zu können, versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100%, vorzugsweise zu 90-100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot-Technik die Verwendung einer 50-70°C, vorzugsweise 60-65°C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1 × SSC-Puffer mit 0,1% SDS (20 × SSC: 3 M NaCl, 0,3 M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z. B. in Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
    • d) Isolierung der kodierenden metK-Gene und anderer Gene
  • Die für das Enzym S-Adenosylmethionin-Synthase (EC 2.5.1.6) kodierenden metK-Gene sind in an sich bekannter Weise isolierbar.
  • Zur Isolierung der metK-Gene oder auch anderer Gene anderer Organismen wird zunächst eine Genbank dieses Organsimus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern ausführlich beschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: "Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie" (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) oder das Handbuch von Sambrook et al.: "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E.-coli-K- 12-Stammes W3110, die von Kohara et al. ("Cell", 50, 495-508 (198)) in λ-Vektoren angelegt wurde.
  • Zur Herstellung einer Genbank in E. coli können Cosmide, wie der Cosmidvektor SuperCos I (Wahl et al. (1987), "Proceedings of the National Academy of Sciences", USA 84: 2160-2164), aber auch Plasmide, wie pBR322 (Bolivar; "Life Sciences", 25, 807-818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, "Gene", 19: 259-268), verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E.-coli-Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. ("Proceedings of the National Academy of Sciences", USA, 87 (1990) 4645-4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten, langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige, für die Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. ("Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America", 74: 5463-5467, 1977) beschrieben ist.
  • Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen, wie z. B. dem von Staden ("Nucleic Acids Research" (1986) 14, 217-232), dem von Marck ("Nucleic Acids Research" (1988) 16, 1829-1836) oder dem GCG-Programm von Butler ("Methods of Biochemical Analysis" (1998) 39, 74-97), untersucht werden.
  • Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide für Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. ("International Journal of Systematic Bacteriology" (1991) 41: 255-260). Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: "Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: "PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
  • Weiterhin ist bekannt, dass Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (1987), "Journal of Bacteriology", 169: 751-757, bei O'Regan et al. (1989) "Gene", 77: 237-251, bei Sahin-Toth et al. (1994), "Protein Sciences" 3: 240-247, bei Hochuli et al. (1988), "Biotechnology" 6: 1321-1325 und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
    • e) Erfindungsgemäß verwendete Wirtszellen
  • Für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet man vorzugsweise coryneforme Bakterien, deren verringerte metK-Aktivität über wenigstens eine der folgenden Eigenschaften nachweisbar ist:
    • a) einen im Vergleich zum Wildtyp-Stamm geringeren, intrazellulären S- Adenosylmethionin-Titer;
    • b) eine geringere, intrazelluläre S-Adenosylmethionin-Synthase-Konzentration (weniger S-Adenosylmethionin-Synthase, bezogen auf Gesamtprotein); oder
    • c) eine geringere, intrazelluläre S-Adenosylmethionin-Synthase-Aktivität (weniger S- Adenosylmethionin-Synthase-Enzymaktivität, bezogen auf S-Adenosylmethionin- Synthase-Proteingehalt.
  • Sämliche dieser Eigenschaften sind in einfacher Weise vom Fachmann, gegebenenfalls unter Heranziehung der vorliegenden Beschreibung, bestimmbar.
  • Weitere Gegenstände der Erfindung betreffen insbesondere als Wirtszelle dienende Mikroorganismen, insbesondere coryneforme Bakterien, die einen Vektor, insbesondere Pendelvektor oder Plasmidvektor, der wenigstens ein metK-Gen erfindungsgemäßer Definition trägt, enthalten, oder in denen ein erfindungsgemäßes metK-Gen mit verringerter Aktivität exprimiert ist.
  • Diese Mikroorganismen können schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin, aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Vorzugsweise sind dies coryneforme Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium. Aus der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
  • Als Beispiele für geeignete Stämme coryneformer Bakterien sind solche der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), wie:
    Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,
    Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806,
    Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870,
    Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539,
    Corynebacterium melassecola ATCC 17965
    oder der Gattung Brevibacterium, wie:
    Brevibacterium flavum ATCC 14067
    Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und
    Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
    zu nennen
    oder davon abgeleitete Stämme, wie:
    Corynebacterium glutamicum KFCC10065
    Corynebacterium glutamicum ATCC21608
    welche ebenfalls die gewünschte Feinchemikalie oder deren Vorstufe(n) produzieren, aufgeführt. (KFCC = Korean Federation of Culture Collection; ATCC = American Type Culture Collection).
    • f) Durchführung der erfindungsgemäßen Fermentation
  • Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass coryneforme Bakterien nach Expression eines erfindungsgemäßen metK-Gens in vorteilhafter Weise schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin, produzieren.
  • Um die Aktivität oder Menge eines Enzyms, z. B. der S-Adenosylmethionin-Synthase, metK, zu verringern, kann der Fachmann unterschiedliche Maßnahmen einzeln oder in Kombinationen ausführen. Durch Reduktion der Transkriptionshäufigkeit des Gens, das für das erfindungsgemäße Protein kodiert, kann die Konzentration des betreffenden Proteins gesenkt werden. Dies kann der Fachmann durch Veränderung oder Austausch der Promotor- oder Regulationsregion sowie der Ribosomenbindungsstelle des kodierenden Gens erreichen. Stromab der kodierenden Region kann der Fachmann Terminatoren verändern oder Sequenzen einfügen, die zu einer verringerten Stabilität des Transkriptes führen. Diese, die Lebensdauer der mRNA verringernden Maßnahmen ermöglichen, die Expression des zugehörigen Proteins und damit seine Konzentration abzusenken.
  • Auf der Ebene des exprimierten Enzyms können fusionierte Sequenzen zu einer erhöhten Abbaurate und damit ebenfalls zu einer Absenkung der Konzentration des Proteins führen. Außerdem kann der Fachmann durch gezielte oder ungerichtete Mutagenese des kodierenden Gens die Aktivität, die Substrataffinität und die Substratspezifität verändern. Enzyme können durch Mutationen in den korrespondierenden Genen derart in ihrer Aktivität beeinflußt werden, dass es zu einer teilweisen oder vollständigen Verringerung der Reaktionsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion kommt. Beispiele für solche Mutationen sind dem Fachmann bekannt (Motoyama H. Yano H. Terasaki Y. Anazawa H. "Applied & Environmental Microbiology", 67: 3064-70, 2001, Eikmanns BJ. Eggeling L. Sahm H. Antonie von Leeuwenhoek. 64: 145-63, 1993-94) Mutanten des Proteins können auch zu verringerter oder verhinderter Homo- oder Heteromultimerisierung von Enzymkomplexen und damit ebenfalls zu einer Verschlechterung der enzymatischen Eigenschaften führen.
  • Solchermaßen veränderte Gene können entweder in Plasmiden oder bevorzugt im Chromosom integriert vorliegen. Dabei kann das ursprüngliche, nicht auf diese Art veränderte Gen noch zusätzlich vorhanden sein, bevorzugt aber gegen das veränderte Gen ausgetauscht sein.
  • Um die Aktivität eines Enzyms, z. B. der S-Adenosylmethionin-Synthase (metK), gemessen in einem coryneformen Bakterium, zu verringern, kann es ausreichend sein, Gene, die für funktionale Äquivalente, wie künstlich hergestellte Mutanten oder natürliche Homologe aus anderen Organsimen kodieren, zu exprimieren. Dabei kann das ursprüngliche Gen noch zusätzlich vorhanden sein, bevorzugt aber gegen das veränderte oder homologe Gen ausgetauscht sein.
  • Zusätzlich kann es für die Produktion von schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L- Methionin, durch Fermentation in coryneformen Bakterien, vorteilhaft sein, neben einer Expression eines erfindungsgemäßen metK-Gens eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, des Cystein-Stoffwechselwegs, der Aspartatsemialdehyd-Synthese, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Pentose-Phosphat-Stoffwechsels, des Zitronensäure-Zyklus oder des Aminosäure-Exports zu verstärken.
  • So kann für die Herstellung von schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin, eines oder mehrere der folgenden Gene verstärkt sein:
    • - das für eine Aspartatkinase kodierende Gen lysC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 281),
    • - das für eine Aspartat-Semialdehyd kodierende Gen asd (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 282),
    • - das für die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992), "Journal of Bacteriology", 174: 6076-6086),
    • - das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), "Journal of Bacteriology", 174: 6076-6086),
    • - das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc (Eikmanns (1992), "Journal of Bacteriology", 174: 6076-6086),
    • - das für die Triosephosphat-Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), "Journal of Bacteriology", 174: 6076-6086),
    • - das für die Homoserin-O-Acetyltransferase kodierende Gen metA (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 725),
    • - das für die Cystahionin-gamma-Synthase kodierende Gen metB (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 3491),
    • - das für die Cystahionin-gamma-Lyase kodierende Gen metC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3061),
    • - das für die Methionin-Synthase kodierende Gen metH (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1663),
    • - das für die Serin-Hydroxymethyltransferase kodierende Gen glyA (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 1110),
    • - das für die O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase kodierende Gen metY (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 726),
    • - das für die Methylentetrahydrofolat-Reduktase kodierende Gen metF (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2379),
    • - das für die Phosphoserin-Aminotransferase kodierende Gen serC (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 928)
    • - ein für die Phosphoserin-Phosphatase kodierendes Gen serB (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 334, DNA-SEQ NO. 467, DNA-SEQ NO. 2767)
    • - das für die Serine-Acetyl-Transferase kodierende Gen cysE (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2818)
    • - das für die Cystein-Synthase kodierende Gen cysK (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2817),
    • - das für eine Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 1306)
  • So kann für die Herstellung von schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin in coryneformen Bakterien, vorteilhaft sein, gleichzeitig wenigstens eines der nachfolgenden Gene zu mutieren, so dass die korrespondierenden Proteine, verglichen mit nicht mutierten Proteinen, in geringerem Maße oder nicht durch einen Stoffwechselmetaboliten in ihrer Aktivität beeinflusst werden oder so, dass ihre spezifische Aktivität gesteigert wird:
    • - das für eine Aspartatkinase kodierende Gen lysC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 281),
    • - das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc (Eikmanns (1992), "Journal of Bacteriology", 174: 6076-6086),
    • - das für die Homoserin-O-Acetyltransferase kodierende Gen metA (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 725),
    • - das für die Cystahionin-gamma-Synthase kodierende Gen metB (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 3491),
    • - das für die Cystahionin-gamma-Lyase kodierende Gen metC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3061),
    • - das für die Methionin-Synthase kodierende Gen metH (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1663),
    • - das für die Serin-Hydroxymethyltransferase kodierende Gen glyA (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 1110),
    • - das für die O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase kodierende Gen metY (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 726),
    • - das für die Methylentetrahydrofolat-Reduktase kodierende Gen metF (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2379),
    • - das für die Phosphoserin-Aminotransferase kodierende Gen serC (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 928)
    • - ein für die Phosphoserin-Phosphatase kodierendes Gen serB (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 334, DNA-SEQ NO. 467, DNA-SEQ NO. 2767)
    • - das für die Serine-Acetyl-Transferase kodierende Gen cysE (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2818)
    • - das für die Cystein-Synthase kodierende Gen cysK (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2817),
    • - das für eine Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 1306)
  • Weiterhin kann es für die Produktion von schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L- Methionin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Expression eines der erfindungsgemäßen metK- Gene eines oder mehrere der folgenden Gene abzuschwächen, insbesondere deren Expression zu verringern, oder auszuschalten:
    • - das für die Homoserine-Kinase kodierende Gen thrB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3453)
    • - das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2328)
    • - das für die Threonin-Synthase kodierende Gen thrC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3486)
    • - das für die Meso-Diaminopimelat-D-Dehydrogenase kodierende Gen ddh (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3494)
    • - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3157)
    • - das für die Glucose-6-Phosphat-6-Isomerase kodierende Gen pgi (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 950)
    • - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2873)
    • - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3476)
    • - das für die Dihydrodipicolinat-Reduktase kodierende Gen dapB (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 3477)
    • - das für die Diaminopicolinat-Decarboxylase kodierende Gen lysA (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 3451)
  • Weiterhin kann es für die Produktion von schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L- Methionin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Expression eines der erfindungsgemäßen metK- Gene in coryneformen Bakterien gleichzeitig wenigstens eines der folgenden Gene so zu mutieren, dass die enzymatische Aktivität des korrespondierenden Proteins teilweise oder vollständig verringert wird:
    • - das für die Homoserine-Kinase kodierende Gen thrB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3453)
    • - das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2328)
    • - das für die Threonin-Synthase kodierende Gen thrC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3486)
    • - das für die Meso-Diaminopimelat-D-Dehydrogenase kodierende Gen ddh (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3494)
    • - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3157)
    • - das für die Glucose-6-Phosphat-6-Isomerase kodierende Gen pgi (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 950)
    • - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2873)
    • - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3476)
    • - das für die Dihydrodipicolinat-Reduktase kodierende Gen dapB (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 3477)
    • - das für die Diaminopicolinat-Decarboxylase kodierende Gen lysA (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 3451)
  • Weiterhin kann es für die Produktion von schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L- Methionin, vorteilhaft sein, neben der Expression eines erfindungsgemäßen metK-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: "Overproduction of Microbial Products", Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
  • Zur Erzielung einer Überexpression kann der Fachmann unterschiedliche Maßnahmen einzeln oder in Kombination ergreifen. So kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlauf der fermentativen L-Methionin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
  • Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. ("Biotechnology", 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. ("Gene", 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga ("Bio/Technology", 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. ("Gene", 102, 93-98 (1991)), in der EP 0472869, in US 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler ("Biotechnology", 9, 84-87 (1991), bei Remscheid et al. ("Applied and Environmental Microbiology", 60, 126-132 (1994), bei LaBarre et al. ("Journal of Bacteriology", 175, 1001-1007 (1993)), in der WO 96/15246, bei Malumbres et al. ("Gene", 134, 15-24 (1993)), in der JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer ("Biotechnology and Bioengineering", 58,. 191-195 (1998)), bei Makrides ("Microbiological Reviews", 60: 512-538 (1996) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
  • Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte. Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen, kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'- stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche, regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz. Unter einer "operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Aktivierungssequenzen sowie Enhancer und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete, regulatorische Sequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel, "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology", 185, Academic Press, San Diego, CA. (1990).
  • Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürliche Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt, es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert, und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Statt dessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
  • Beispiele für brauchbare Promotoren sind: die Promotoren, ddh, amy, lysC, dapA, lysA aus Corynebacterium glutamicum, aber auch gram-positiven Promotoren SPO2, wie sie in "Bacillus Subtilis and Its Closest Relatives", Sonenshein, Abraham L.,Hoch, James A., Losick, Richard; ASM Press, District of Columbia, Washington und Patek M. Eikmanns BJ. Patek J. Sahm H. "Microbiology", 142, 1297-309, 1996 beschrieben sind, oder aber auch cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, I-PR- oder im I-PL- Promotor, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Bevorzugt ist auch die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z. B. licht- und insbesondere temperaturinduzierbarer Promotoren, wie der PrPl-Promotor. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
  • Die genannten, regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
  • Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression negativ beeinflussen und dadurch verringern. So kann eine Abschwächung auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem schwache Transkriptionssignale, wie Promotoren und/oder "Enhancer", verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Abschwächung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verringert wird.
  • Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale, wie Promotoren und/oder "Enhancer", verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
  • Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors, einer geeigneten Shine-Dalgarnow-Sequenz mit einer metK-Nukleotidsequenz sowie einem geeigneten Terminationssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in "Current Protocols in Molecular Biology", 1993, John Wiley & Sons, Incorporated, New York, New York, "PCR Methods", Gelfand, David H., Innis, Michael A., Sinsky, John J. 1999, Academic Press, Incorporated, California, San Diego,., "PCR Cloning Protocols, Methods in Molecular Biology Ser.", Vol. 192, 2nd ed., Humana Press, New Jersey, Totowa. T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, "Experiments with Gene Fusions", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) und in Ausubel, F. M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
  • Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam - New York - Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.
  • Erfindungsgemäße metK-Gene werden beispielhaft mit Hilfe von episomalen Plasmiden exprimiert. Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie z. B. pZ1 (Menkel et al., "Applied and Environmental Microbiology" (1989), 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., "Gene" 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., "Gene" 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren, wie z. B. pCLiK5MCS, SEQ ID NO: 9, oder solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160) oder pNG2 (Serwold-Davis et al., "FEMS Microbiology Letters", 66, 119-124 (1990)) oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.
  • Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren, mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Remscheid et al. ("Applied and Environmental Microbiology", 60, 126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., "Bio/Technology", 1,784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., "Gene", 145,69-73 (1994)), Bernard et al., "Journal of Molecular Biology", 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al. 1991, "Journal of Bacteriology", 173: 4510-4516) oder pBGS8 (Spratt et al., 1986, "Gene", 41: 337-342) in Frage. Andere Plasmidvektoren, wie z. B. pCLiK5MCS integrativ sacB, SEQ ID NO: 12, können in gleicher Weise verwendet werden.
  • Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. ("Applied Microbiology and Biotechnology", 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan ("Biotechnology", 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. ("FEMS Microbiological Letters", 123, 343-347 (1994)) beschrieben.
  • Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch(Zulaufverfahren)oder repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zur Produktion von schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin, kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel ("Bioprozeßtechnik, 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav-Fischer-Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas ("Bioreaktoren und periphere Einrichtungen" (Vieweg-Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.
  • Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods für General Bacteriology" der American Society für Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
  • Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente.
  • Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette, wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett; Fettsäuren, wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure oder Linolsäure; Alkohole, wie z. B. Glycerin, Methanol oder Ethanol, und organische Säuren, wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure.
  • Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
  • Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen.
  • Als Schwefelquelle für die Herstellung von schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesondere von Methionin, können anorganische, schwefelhaltige Verbindungen, wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide, aber auch organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.
  • Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.
  • Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure.
  • Die erfindungsgemäß eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietem beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.
  • Sämtliche Medienkomponenten werden entweder durch Hitze (20 min bei 1,5 bar und 121°C) oder durch Sterilfiltration sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.
  • Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise bei 25°C bis 40°C und kann während des Experiments konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH-Wert für die Anzucht läßt sich während der Anzucht durch Zugabe von basischen Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder sauren Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete, selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
  • Die so erhaltenen, insbesondere L-Methionin enthaltenden Fermentationsbrühen haben üblicherweise eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.-%.
  • Vorteilhaft ist außerdem auch, wenn die Fermentation zumindest am Ende, insbesondere jedoch über mindestens 30% der Fermentationsdauer zuckerlimitiert gefahren wird. Das heißt, dass während dieser Zeit die Konzentration an verwertbarem Zucker im Fermentationsmedium auf ≥ 0 bis 3 g/l, gehalten, beziehungsweise abgesenkt wird.
  • Die Fermentationsbrühe wird anschließend weiterverarbeitet. Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie z. B. Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden.
  • Anschließend kann die Fermentationsbrühe mit bekannten Methoden, wie z. B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, oder durch Nanofiltration, eingedickt beziehungsweise aufkonzentriert werden. Diese aufkonzentrierte Fermentationsbrühe kann anschließend durch Gefriertrocknung, Sprühtrocknung, Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfahren aufgearbeitet werden.
  • Es ist aber auch möglich, die schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesonder L-Methionin, weiter aufzureinigen. Hierzu wird die produkthaltige Brühe nach dem Abtrennen der Biomasse einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Produkt oder die Verunreinigungen ganz oder teilweise auf dem Chromatographieharz zurückgehalten werden. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.
  • Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindung(en) kann durch Techniken des Standes der Technik bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, Enzymtests oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefaßt in: Patek et al. (1994) "Appl. Environ. Microbiol.", 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) "Biotekhnologiya" 11 27-32; und Schmidt et al. (1998), "Bioprocess Engineer.", 19: 67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566, 575-581 und S. 581-587; Michal, G. (1999), "Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology", John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987), "Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Bd. 17.
  • Die Erfindung wird nun anhand der folgenden, nicht-limitierenden Beispiele näher beschrieben:
    Fig. 1 zeigt die Ergebnisse eines radioaktiven metK-Assays, durchgeführt mit Wildtyp-Enzym bzw. C94A-Mutante.
    • Beispiel 1 Herstellung des Vektors pCLiK5MCS
  • Zunächst wurden Ampicillinresistenz und Replikationsursprung des Vektors pBR322 mit den Oligonukleotidprimern SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 mit Hilfe der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. SEQ ID NO: 1 5'-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3' SEQ ID NO: 2 5'-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3'
  • Neben den zu pBR322 komplementären Sequenzen enthält der Oligonukleotidprimer SEQ ID NO: 1 in 5'-3'-Richtung die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Smal, BamHl, Nhel und Ascl und der Oligonukleotidprimer SEQ ID NO: 2 in 5'-3'-Richtung die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Xbal, Xhol, Notl und Dral. Die PCR- Reaktion wurde nach Standardmethode, wie Innis et al. ("PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications", Academic Press (1990)) mit PfuTurbo-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 2,1 kb wurde mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Die stumpfen Enden des DNA- Fragmentes wurden mit dem Rapid-DNA-Ligation-Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers miteinander ligiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden, wie in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Ampicillin(50 µg/ml)-haltigen LB-Agar (Lennox, 1955, "Virology", 1: 190) erreicht.
  • Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep-Spin-Miniprep-Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK1.
  • Ausgehend vom Plasmid pWLT1 (Liebl et al., 1992) als Template für eine PCR-Reaktion wurde mit den Oligonukleotidprimern SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 eine Kanamycin- Resistenzcassette amplifiziert. SEQ ID NO: 3 GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3' SEQ ID NO: 4 GAGAGGCGCGGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCCAGGCA-3'
  • Neben den zu pWLT1 komplementären Sequenzen enthält der Oligonukleotidprimer SEQ ID NO: 3 in 5'-3'-Richtung die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Xbal, Smal, BamHl, Nhel und der Oligonukleotidprimer SEQ ID NO: 4 in 5'-3'-Richtung die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Ascl und Nhel. Die PCR-Reaktion wurde nach Standardmethode, wie Innis et al. ("PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications", Academic Press (1990)) mit PfuTurbo-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 1,3 kb wurde mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Das DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen Xbal und Ascl (New England Biolabs, Beverly, USA) geschnitten und im Anschluß daran erneut mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Der Vektor pCLiK1 wurde ebenfalls mit den Restriktionsendonukleasen Xbal und Ascl geschnitten und mit alkalischer Phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert. Nach Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel wurde der linearisierte Vektor (ca. 2,1 kb) mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers isoliert. Dieses Vektor- Fragment wurde mit Hilfe des Rapid-DNA-Ligation-Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers mit dem geschnittenen PCR-Fragment ligiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden, wie in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Ampicillin (50 µg/ml) und Kanamycin (20 µg/ml) haltigen LB-Agar (Lennox, 1955, "Virology", 1: 190) erreicht.
  • Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK2.
  • Der Vektor pCLiK2 wurde mit der Restriktionsendonuklease Dral (New England Biolabs, Beverly, USA) geschnitten. Nach Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel wurde ein ca. 2,3 kb großes Vektorfragment mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers isoliert. Dieses Vektor- Fragment wurde mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers religiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden, wie in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, beschrieben(1989)), in kompetente E. coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (20 µg/ml) haltigen LB Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) erreicht.
  • Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK3.
  • Ausgehend vom Plasmid pWLQ2 (Liebl et al., 1992) als Template für eine PCR-Reaktion wurde mit den Oligonukleotidprimern SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 der Replikationsursprung pHM1519 amplifiziert. SEQ ID NO: 5 GAGAGGGCGGCCGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3' SEQ ID NO: 6 5'-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3'
  • Neben den zu pWLQ2 komplementären Sequenzen enthalten die Oligonukleotidprimer SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 Schnittstellen für die Restriktionsendonuklease Notl. Die PCR- Reaktion wurde nach Standardmethode, wie Innis et al. ("PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications", Academic Press (1990)) mit PfuTurbo-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 2,7 kb wurde mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Das DNA-Fragment wurde mit der Restriktionsendonuklease Notl (New England Biolabs, Beverly, USA) geschnitten und im Anschluß daran erneut mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Der Vektor pCLiK3 wurde ebenfalls mit der Restriktionsendonuklease Notl geschnitten und mit alkalischer Phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert. Nach Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel wurde der linearisierte Vektor (ca. 2,3 kb) mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers isoliert. Dieses Vektor- Fragment wurde mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers mit dem geschnittenen PCR-Fragment ligiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden, wie in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (20 µg/ml) haltigen LB-Agar (Lennox, 1955, "Virology", 1: 190) erreicht.
  • Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK5.
  • Für die Erweiterung von pCLiK5 um eine "multiple cloning site" (MCS) wurden die beide synthetischen, weitestgehend komplementären Oligonukleotide SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8, die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Swal, Xhol, Aatl, Apal, Asp718, MluI, NdeI, SpeI, EcoRV, SalI, ClaI, BamHI, XbaI und SmaI enthalten, durch gemeinsames Erhitzen auf 95°C und langsames Abkühlen zu einem doppelsträngigen DNA-Fragment vereinigt. SEQ ID NO: 7

    SEQ ID NO: 8

  • Der Vektor pCLiK5 wurde mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und BamHI (New England Biolabs, Beverly, USA) geschnitten und mit alkalischer Phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert. Nach Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel wurde der linearisierte Vektor (ca. 5,0 kb) mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers isoliert. Dieses Vektor-Fragment wurde mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers mit dem synthetischen, Doppelsträngigen DNA-Fragment ligiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden, wie in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (20 µg/ml) haltigen LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) erreicht.
  • Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK5MCS.
  • Sequenzierungsreaktionen wurden nach Sanger et al. (1977), "Proceedings of the National Academy of Sciences", USA 74: 5463-5467 durchgeführt. Die Sequenzierreaktionen wurden mittels ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) aufgetrennt und ausgewertet.
  • Das entstandene Plasmid pCLiK5MCS ist als SEQ ID NO: 9 aufgeführt.
    • Beispiel 2 Herstellung des Vektors pCLiK5MCS integrativ sacB
  • Ausgehend vom Plasmid pK19mob (Schäfer et al., "Gene", 145,69-73(1994)) als Template für eine PCR-Reaktion wurde mit den Oligonukleotidprimern SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 das Bacillus-subtilis-sacB-Gen amplifiziert. SEQ ID NO: 10 5'-GAGAGCGGCCGCCGATCCTTTTTAACCCATCAC-3' SEQ ID NO: 11 5'-AGGAGGCGGCCGCCATCGGCATTTTCTTTTGCG-3'
  • Neben den zu pK19mobsac komplementären Sequenzen enthalten die Oligonukleotidprimer SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 Schnittstellen für die Restriktionsendonuklease Notl. Die PCR-Reaktion wurde nach Standardmethode, wie Innis et al. ("PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications", Academic Press (1990)) mit PfuTurbo-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 1,9 kb wurde mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Das DNA-Fragment wurde mit der Restriktionsendonuklease Notl (New England Biolabs, Beverly, USA) geschnitten und im Anschluß daran erneut mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Der Vektor pCLiK5MCS wurde ebenfalls mit der Restriktionsendonuklease Notl geschnitten und mit alkalischer Phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert. Nach Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel wurde ein ungefähr 2,4 kb großes Vektorfragment mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers isoliert. Dieses Vektor- Fragment wurde mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers mit dem geschnittenen PCR-Fragment ligiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden wie in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (20 µg/ml) haltigen LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) erreicht.
  • Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK5MCS integrativ sacB.
  • Sequenzierungsreaktionen wurden nach Sanger et al. (1977, "Proceedings of the National Academy of Sciences", USA 74: 5463-5467 durchgeführt. Die Sequenzierreaktionen wurden mittels ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) aufgetrennt und ausgewertet.
  • Das entstandene Plasmid pCLiK5MCS integrativ sacB ist als SEQ ID NO: 12 aufgeführt.
    • Beispiel 3 Isolierung und Klonierung des metK-Gens aus C. glutamicum
  • Chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde nach Tauch et al. (1995), "Plasmid", 33: 168-179 oder Eikmanns et al. (1994), "Microbiology", 140: 1817-1828 präpariert. Die folgenden Oligonukleotidprimer wurden, ausgehend von der metK-Sequenz, aus Großmann et al. (2000), "FEMS Microbiology Letters", 193: 99-103 synthetisiert: SEQ ID NO: 13 5'-GAGAGCCCGGGAAGAAGGGCTGCGGACCTCCTCAT-3'

    und SEQ ID NO: 14 5'-CTCTCACGCGTCATATGCAGGTGAGGGTAACCCCA-3'
  • Nach Standardmethoden, wie Innis et al. (1990), "PGR Protocols. A Guide to Methods and Applications", Academic Press, und unter Einsatz der aufgeführten Oligonukleotidprimer, sowie PfuTurbo-Polymerase (Fa. Stratagene) wurde ein DNA-Fragment von 1640 Basenpaaren aus der genomischen DNA von C. glutamicum amplifiziert.
  • Das Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen Mlu I und Sma I (Roche Diagnostics, Mannheim), die über die PCR-Oligonukleotidprimer eingebracht wurden, gespalten und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurde das DNA-Fragment mit GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) aus der Agarose aufgereinigt.
  • Der Vektor pCLiK5MCS, SEQ ID NO: 9 wurde ebenfalls mit den Restriktionsenzymen Sma I und Mlu I gespalten und mit alkalischer Phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert. Vektor und DNA-Fragment wurden mit T4- DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg) ligiert und nach Standardmethoden, wie in Sambrook et al. (1989), "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, beschrieben, in E. coli XL-1Blue (Fa. Stratagene) transformiert.
  • Die Präparation der Plasmid-DNA wurde nach Methoden und mit Materialien der Fa. Quiagen durchgeführt. Sequenzierungsreaktionen wurden nach Sanger et al. (1977), "Proceedings of the National Academy of Sciences", USA 74: 5463-5467 durchgeführt. Die Sequenzierreaktionen wurden mittels ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) aufgetrennt und ausgewertet.
  • Das entstandene Plasmid pCLiK5MCS/metKwt ist als SEQ ID NO: 15 aufgeführt.
    • Beispiel 4 Mutagenese des metK-Gens aus C. glutamicum
  • Die gerichtete Mutagenese des metK-Gens aus C. glutamicum wurde mit dem QuickChange Kit (Fa. Stratagene) und nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Mutagenese wurde im Plasmid pCLiK5MCS/metKwt, SEQ ID NO: 15 durchgeführt. Für den Austausch von Cystein 94 aus SEQ ID NO: 16 nach Alanin 94 wurden folgende Oligonukleotidprimer synthetisiert: SEQ ID NO: 17 5'-GATTCGACGGACGCACCGCTGGCGTCTCAGTATCCATC-3'

    und SEQ ID NO: 18 5'-GATGGATACTGAGACGCCAGCGGTGCGTCCGTCGAATC-3'
  • Der Einsatz dieser Oligonukleotidprimer führt in SEQ ID NO: 15 zu einem Austausch der Nukleotide in Position 1056 (von C nach G) und 1057 (von A nach C). Der resultierende Aminosäureaustausch Cys94Ala im metK-Gen wurde nach Transformation und Plasmidpräparation durch Sequenzierungsreaktionen bestätigt. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pCLiK5MCS/metKC94A und ist als SEQ ID NO: 19 aufgeführt.
    • Beispiel 5 SAM-Synthetase(metK)-Assay
  • C.-glutamicum-Stämme, die entweder mit dem Plasmid pCLiK5MCS/metKwt, SEQ ID NO: 15, oder mit dem Plasmid pCLiK5MCS/metKC94A, SEQ ID NO: 19 transformiert wurden, wurden in BHI/Glucose-Medium (37 g/l, Brain Heart Infusion Fertigmedium, Fa. Difco, 10 mM (NH4)2SO4, 4% Glucose) bei 30°C bis zu einer OD600 von 20 angezogen. Die Zellen wurden bei 4°C abzentrifugiert, und das Pellet wurde mit kalter, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wurden 0,25 g feuchtes Zellpellet mit 1 mL Aufschlußpuffer (50 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1 mM DTT) bei 4°C resuspendiert. In einem Ribolyser der Fa. Hybaid und in blauen Ribolyserröhrchen der Fa. Hybaid und bei einer Rotationseinstellung von 6,0 wurde die Bakteriensuspension dreimal für jeweils 30 Sekunden lysiert. Das Lysat wurde durch 45minütige Zentrifugation bei 13.000 rpm in einer Eppendorfzentrifuge geklärt und der Überstand 1 : 10 mit Wasser verdünnt. Der Proteingehalt wurde nach Bradford, M. M. (1976), "Anal. Biochem.", 72: 248-254 bestimmt.
  • Die enzymatische Aktivität der SAM-Synthase wurde nach Markham, G. D. et al. (1983), "Methods in Enzymology", 94: 219-222, mit folgenden Modifikationen bestimmt.
  • Reaktionsansätze von 100 µl mit 100 mM Tris pH 8.0, 100 mM KCl, 20 mM MgCl2, 1,2 mM L- Methionin, 10 mM ATP, 1 µl 35S-L-Methionin, entsprechend 15,15 µCi (Amersham SJ204, spez. Aktivität 1 Ci/µmol) und H2O ad 100 µl wurden mit 100 µg der jeweiligen Proteinlysate gestartet und bei 37°C inkubiert. Zu den Zeitpunkten 0, 5, 10, 20, 30 und 60 Minuten wurden 10 µl Aliquots des Reaktionsansatzes entnommen und auf Eis mit 20 µl 50 mM EDTA gestoppt.
  • 30 µl der abgestoppten Reaktion wurden auf Phosphocellulose-Filtereinheiten (Fa. Pierce, Nr. 29520) gegeben und bei 6.000 rpm in einer Eppendorf-Zentrifuge für 1 Minute abzentrifugiert. Der Filter wurde zweimal mit 500 µl 75 mM Phosphorsäure gewaschen und dann in ein Zählröhrchen mit Szintillationsflüssigkeit gegeben. Die Radioaktivität des gebildeten S-Adenosylmethionins wird in einem Szintillationszähler (Fa. Beckman) bestimmt.
  • Die Messergebnisse sind in beiliegender Fig. 1 dargestellt.
  • Unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivität des radioaktiven L-Methionins sowie der eingesetzten Proteinmenge läßt sich die Rate der S-Adenosylmethionin-Bildung aus der Zunahme der eingebauten Radioaktivität pro Zeiteinheit bestimmen. Ihre Einheit lautet µmol S-Adenosylmethionin/min.mg Protein. Diese Rate kann zwischen Wildtyp-Enzym und Mutanten-Enzym verglichen werden.
    • Beispiel 6 Bestimmung des zellulären S-Adenosylmethionin-Titers in C. glutamicum
  • Zur Bestimmung der zellulären Titer von S-Adenosylmethionin in C.-glutamicum-Stämmen, die entweder mit pCLiK5MCS/metKwt (SEQ ID NO: 15) oder pCLiK5MCS/metKC94A (SEQ ID NO: 19) transformiert wurden, wurde wie folgt verfahren. Ein wie in Beispiel 5 erhaltenes Zellpellet, das mit eiskalter, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen wurde, wurde mit Trichloressigsäure (200 µl TCA pro 0,1 g feuchtes Pellet) resuspendiert. Nach 5 Minuten auf Eis wurde die Suspension bei 4°C und 13.000 rpm für 5 min in einer Eppendorf-Zentrifuge geklärt. Der S-Adenosylmethionin-Gehalt im Überstand wurde mittels HPLC bestimmt (Ionospher-5C-Kationenaustauschersäule, 10 µl Injektionsvolumen; Laufmittel: 70% vol/vol 0,2 M Ammoniumformiat pH 4,0 30% vol/vol Methanol; UV-Detektion 260 nm; 40°C; Retentionszeit 8,5 Min.). Tabelle 1 S-Adenosylmethionin-Titer

    • Beispiel 7 Austausch des metK-wt-Gens in C. glutamicum durch metK C94A
  • Für den allelischen Austausch des metK-Wildtyp-Gens in C. glutamicum KFCC10065 durch die Mutante metK C94A wurde zunächst die metK-C94A-Sequenz aus SEQ ID NO: 19 in pCLiK5MCS integrativ sacB (SEQ ID NO: 12) kloniert. Dazu wurde das Plasmid pCLiK5MCS/metKC94A (SEQ ID NO: 19) mit den Restriktionsendonukleasen Bgl II und Xho I (Fa. NEB, Schwalbach) gespalten. Das erhaltene Fragment der Größe 1962 Basenpaare wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, gereinigt. Der Vektor pCLiK5MCS integrativ sacB wurde ebenfalls mit Bgl II und Xhol gespalten und, wie in Beispiel 3 beschrieben, aufgereinigt. Vektor und Fragment wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, ligiert, in E. coli XL- 1Blue transformiert. Das Plasmid wurde gereinigt und nach Sequenzierung bestätigt. Das erhaltene Plasmid pCLiK5MCS integrativ sacB/metKC94A ist als SEQ ID NO: 20 aufgeführt. Das Plasmid pCLiK5MCS integrativ sacB/metKC94A wurde in C. glutamicum KFCC10065 mittels Elektroporation, wie bei Liebl, et al. (1989), "FEMS Microbiology Letters", 53: 299-303 beschrieben, transformiert. Modifikationen des Protokolls sind in DE 100 46 870 beschrieben. Die chromosomale Anordnung des metK-Lokus einzelner Transformanten wurde mit Standardmethoden durch Southern-Blot und Hybridisierung, wie in Sambrook et al. (1989), "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, beschrieben, überprüft. Dadurch wurde sichergestellt, daß es sich bei den Transformanten um solche handelt, die das transformierte Plasmid durch homologe Rekombination am metK-Lokus integriert haben. Nach Wachstum solcher Kolonien über Nacht in Medien, die kein Antibiotikum enthalten, werden solche Transformanten dann auf ein Saccharose-CM-Agarmedium (10% Saccharose) ausplattiert und bei 30°C für 24 Stunden inkubiert.
  • Da das im Vektor pCLiK5MCS integrativ sacB/metKC94A enthaltende sacB-Gen Saccharose in ein toxisches Produkt umwandelt, können nur solche Kolonien anwachsen, die das sacB- Gen durch einen zweiten homologen Rekombinationsschritt zwischen dem Wildtyp-metK- Gen und dem mutierten metKC94A-Gen deletiert haben. Während der homologen Rekombination kann entweder das Wildtyp-Gen, oder das mutierte Gen zusammen mit dem sacB-Gen deletiert werden. Wenn das sacB-Gen zusammen mit dem Wildtyp-Gen entfernt wird, resultiert eine mutierte Transformante.
  • Anwachsende Kolonien wurden gepickt, ihre genomische DNA präpariert und das metK-Gen mit zwei Methoden analysiert. Zum einen wurde der Austausch von zwei Nukleotiden, wie in Beispiel 4 beschrieben, genutzt. Mit Hilfe eines spezifischen PCR-Oligonukleotidprimers, der an seinem 3'-Ende zwischen beiden Allelen differenzieren kann und eines zweiten metK- spezifischen Oligonukleotidprimers konnten diagnostische PCR-Fragmente generiert werden. Zum anderen wurden bei etwa 100 Transformanten der metK-Lokus nach PCR- Amplifikation mit PCR-Oligonukleotidprimern, die stromauf, bzw. stromab der Mutation binden, sequenziert. Es wurden mehrere mutierte metK-Klone erhalten. Ein solcher Klon wurde mit KFCC1006SmetKC94A bezeichnet. Die Aminosäuresequenz der Mutante C94A entspricht SEQ ID NO: 22.
    • Beispiel 8
  • Herstellung von Methionin mit dem Stamm KFCC10065metKC94A
  • Der in Beispiel 6 hergestellte Stamm KFCC10065metKC94A wurde auf einer Agar-Platte mit BHI-Medium (Difco) für 2 Tage bei 30°C angezogen. Die aufgewachsenen Zellen wurden in Saline von der Agarplatte suspendiert und mit einer OD 600 nm von 1,5 in das Medium II überführt. Das Medium II wurde wie folgt zusammengesetzt. Medium IIA 0.6 g/l KH2PO4
    0.4 g/l MgSO4.7H2O
    25 g/l (NH4)2SO4
    40 g/l Rohzucker
    60 g/l Melasse
  • Das so angesetzte Medium wurde mit NH4OH auf pH 7,8 eingestellt und bei 120°C für 30 min sterilisiert. Medium IIB 0.3 mg/l Thiamin.HCl
    1 mg/l Biotin
    2 mg/l FeSO4
    2 mg/l MnSO4
    0.1 mg/l Vit.B12
  • Medium IIB wurde separat angesetzt, durch Filtration sterilisiert und dem Medium IIA zugefügt. Beide Bestandteile IIa und IIB ergeben zusammen das Medium II.
  • Vom Medium II (= IIA + B) wurden 10 ml in einem 100-ml-Erlenmyerkolben mit 0,5 g sterilisiertem CaCO3 mit Zellen des oben genannten Stamms versetzt, für 72 h auf einem Orbitalschüttler mit 200 Upm bei 30°C inkubiert.
  • Gebildetes Methionin in der Kulturbrühe wurde mit Hilfe der Aminosäuresäure- Bestimmungsmethode von Agilent auf einer Agilent 1100 Series LC System HPLC. Eine Vorsäulenderivatisierung mit Ortho-Phthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäuren; die Auftrennung des Aminosäuregemischs findet auf einer Hypersil-AA-Säule (Agilent) statt. SEQUENCE LISTING























































Claims (21)

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung wenigstens einer schwefelhaltigen Feinchemikalie, welches folgende Schritte umfasst:
a) Fermentation einer die gewünschte, schwefelhaltige Feinchemikalie produzierenden, coryneformen Bakterienkultur, wobei in den coryneformen Bakterien zumindest eine Nukleotidsequenz exprimiert wird, welche für ein Protein mit veränderter S-Adenosylmethionin-Synthase(metK)-Aktivität kodiert;
b) Anreicherung der schwefelhaltigen Feinchemikalie im Medium und/oder in den Zellen der Bakterien und
c) Isolieren der schwefelhaltigen Feinchemikalie.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die schwefelhaltige Feinchemikalie L-Methionin umfasst.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man mutierte, coryneforme Bakterien mit im Vergleich zum nichtmutierten Wildtyp verringerter metK-Aktivität einsetzt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mutierte, coryneforme Bakterium außerdem eine im Vergleich zum nichtmutierten Wildtyp verbesserte metY-Aktivität und/oder eine gesteigerte L-Methionin-Menge aufweist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die metK-kodierende Sequenz eine kodierende Nukleotidsequenz ist, welche für ein Protein mit verringerter metK-Aktivität kodiert, in welchem wenigstens ein Cysteinrest des Wildtyp-Proteins substituiert ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die metK-kodierende Sequenz eine kodierende Nukleotidsequenz ist, die für ein Protein mit metK-Aktivität kodiert, welches folgende Aminosäureteilsequenz aufweist:

G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V,

worin
X1 und X2 unabhängig voneinander für eine beliebige Aminosäure stehen;
und
X3 für eine von Cys verschiedene Aminosäure steht.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die metK-kodierende Sequenz für ein Protein mit metK-Aktivität kodiert, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz von Val1 bis Ala407 gemäß SEQ ID NO: 22 oder eine dazu homologe Aminosäuresequenz, welche für ein Protein mit funktionaler Äquivalenz steht, umfasst.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die kodierende metK- Sequenz eine in coryneformen Bakterien replizierbare oder eine stabil in das Chromosom integrierte DNA oder eine RNA ist.
9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man:
a) einen mit einem Plasmidvektor transformierten Bakterienstamm einsetzt, der wenigstens eine Kopie der mutierten metK-Sequenz unter der Kontrolle regulativer Sequenzen trägt, oder
b) einen Stamm einsetzt, in dem die mutierte metK-Sequenz in das Chromosom des Bakteriums integriert wurde.
10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man Bakterien fermentiert, in denen zusätzlich wenigstens ein weiteres Gen des Biosyntheseweges der gewünschten, schwefelhaltigen Feinchemikalie verstärkt ist.
11. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man Bakterien fermentiert, in denen wenigstens ein Stoffwechselweg zumindest teilweise ausgeschaltet ist, der die Bildung der gewünschten, schwefelhaltigen Feinchemikalie verringert.
12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig wenigstens eines der Gene, ausgewählt unter:
a) dem für eine Aspartatkinase kodierenden Gen lysC,
b) dem für eine Aspartat-Semialdehyd-Dehdrogenase kodierenden Gen asd
c) dem für die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierenden Gen gap,
d) dem für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierenden Gen pgk,
e) dem für die Pyruvat-Carboxylase kodierenden Gen pyc,
f) dem für die Triosephosphat-Isomerase kodierenden Gen tpi,
g) dem für die Homoserin-O-Acetyltransferase kodierenden Gen metA,
h) dem für die Cystahionin-gamma-Synthase kodierenden Gen metB,
i) dem für die Cystahionin-gamma-Lyase kodierenden Gen metC,
j) dem für die Methionin-Synthase kodierenden Gen metH,
k) dem für dis Serin-Hydroxymethyltransferase kodierenden Gen glyA,
l) dem für die O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase kodierenden Gen metY,
m) dem für die Methylentetrahydrofolat-Reduktase kodierenden Gen metF Gen,
n) dem für die Phosphoserin-Aminotransferase kodierenden Gen serC Gen, das für die kodiert,
o) dem für die Phosphoserin-Phosphatase kodierenden Gen serB,
p) dem für die Serin-Acetyl-Transferase kodierenden Gen cysE,
q) dem für die Cystein-Synthase kodierenden Gen cysK, und
r) dem für die Homoserin-Dehydrogenase kodierenden Gen hom überexprimiert ist, und/oder
in denen gleichzeitig wenigstens eines dieser Gene so mutiert ist, dass das korrespondierende Protein verglichen mit dem nicht mutierten Protein in geringerem Maße oder nicht mehr durch einen Stoffwechselmetaboliten in seiner Aktivität beeinflusst wird, oder dass dessen spezifische Aktivität gesteigert wird
13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig wenigstens eines der Gene, ausgewählt unter:
a) dem für die Homoserine-Kinase kodierenden Gen thrB,
b) dem für die Threonin-Dehydratase kodierenden Gen ilvA,
c) dem für die Threonin-Synthase kodierenden Gen thrC
d) dem für die Meso-Diaminopimelat-D-Dehydrogenase kodierenden Gen ddh
e) dem für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierenden Gen pck,
f) dem für die Glucose-6-Phosphat-6-Isomerase kodierenden Gen pgi,
g) dem für die Pyruvat-Oxidase kodierenden Gen poxB,
h) dem für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierenden Gen dapA,
i) dem für die Dihydrodipicolinat-Reduktase kodierenden Gen dapB; oder
j) dem für die Diaminopicolinat-Decarboxylase kodierenden Gen lysA abschwächt ist, und /oder
wobei man coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig wenigstens eines dieser Gene so mutiert ist, so dass die enzymatische Aktivivät des korrespondierenden Proteins teilweise oder vollständig verringert wird.
14. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.
15. Verfahren zur Herstellung eines L-Methionin-haltigen Tierfuttermittel-Additivs aus Fermentationsbrühen, welches folgende Schritte umfasst:
a) Kultivierung und Fermentation eines L-Methionin produzierenden Mikroorganismus gemäß der Definition in einem der vorhergehenden Ansprüche in einem Fermentationsmedium;
b) Entfernung von Wasser aus der L-Methionin-haltigen Fermentationsbrühe;
c) Entfernung der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von 0 bis 100 Gew.-% und
d) Trocknung der gemäß b) und/oder c) erhaltenen Fermentationsbrühe, um das Tierfuttermittel-Additiv in der gewünschten Pulver- oder Granulatform zu erhalten.
16. Isoliertes Polynukleotid gemäß der Definition in einem der Ansprüche 5 bis 7, das für ein Polypeptid mit verringerter metK-Aktivität kodiert.
17. MetK-Mutante mit verringerter Aktivität, welches von einem Polynukleotid nach Anspruch 16 kodiert wird.
18. Rekombinante, coryneforme Bakterien, die ein mutiertes metK-Gen, umfassend eine Polynukleotidsequenz gemäß der Definition in einem der Ansprüche 5 bis 7, exprimieren.
19. Rekombinante, coryneforme Bakterien nach Anspruch 18, welche das metK- Wildtyp-Enzym nicht mehr exprimieren.
20. Rekombinante, coryneforme Bakterien gemäß Anspruch 19, welche im Vergleich zum korrespondierenden Wildtyp-Stamm wenigstens eines der folgenden Merkmale:
a) geringeren, intrazellulären S-Adenosylmethionin-Titer
b) geringere, intrazelluläre S-Adenosylmethionin-Synthase-Konzentration oder
c) geringere Aktivität der S-Adenosylmethionin-Synthase, bestimmt anhand der S- Adenosylmethionin-Bildungsrate,
und zusätzlich gegebenenfalls wenigstens eines der folgenden Merkmale:
d) verbesserte metY-Aktivität oder
e) gesteigerte L-Methionin-Menge.
aufweisen.
21. Expressionskonstrukt, enthaltend unter der Kontrolle einer regulativen Nukleotidsequenz die kodierende Sequenz für eine metK-Mutante gemäß der Definition in einem der Ansprüche 5 bis 7.
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