DE10237284A1

DE10237284A1 - nucleic acid detection

Info

Publication number: DE10237284A1
Application number: DE2002137284
Authority: DE
Inventors: Kerstin Dr. Mann; Roland Kirchner
Original assignee: Advalytix AG
Current assignee: Advalytix AG
Priority date: 2002-08-14
Filing date: 2002-08-14
Publication date: 2004-03-04
Also published as: AU2003255402A1; WO2004022781A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, bei dem die Reassoziation von Nukleinsäuren auf einfache Art und Weise gehemmt wird. DOLLAR A Ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in einem Reaktionsgemisch weist folgende Schritte auf: DOLLAR A a) dem Reaktionsgemisch werden Blocker-Moleküle hinzugefügt, DOLLAR A b) doppelsträngiges Nukleinsäurematerial wird zu zwei Typen von komplementären Nukleinsäure-Einzelsträngen denaturiert, DOLLAR A c) die Blocker-Moleküle hybridisieren mit zumindest einem Abschnitt von zumindest einem der beiden Typen von aus der Denaturierrung resultierenden Nukleinsäure-Einzelsträngen, DOLLAR A d) das Reaktionsgemisch wird mit Fänger-Molekülen in Verbindung gebracht, DOLLAR A e) die Fänger-Moleküle reagieren jeweils mit einem Abschnitt einer detektierbaren Nukleinsäure zu Fänger-Zielsequenz-Hybriden, und DOLLAR A f) gebildete Fänger-Zielsequenz-Hybride werden durch Detektion nachgewiesen.The present invention relates to a method for the detection of nucleic acids, in which the reassociation of nucleic acids is inhibited in a simple manner. DOLLAR A A method according to the invention for the detection of nucleic acids in a reaction mixture has the following steps: DOLLAR A a) blocker molecules are added to the reaction mixture, DOLLAR A b) double-stranded nucleic acid material is denatured into two types of complementary nucleic acid single strands, DOLLAR A c) the blocker molecules hybridize to at least a portion of at least one of the two types of single-stranded nucleic acid resulting from the denaturation, DOLLAR A d) the reaction mixture is brought into association with capture molecules, DOLLAR A e) the capture molecules react with each a portion of a detectable nucleic acid to capture target sequence hybrids, and DOLLAR A f) formed capture target sequence hybrids are detected by detection.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Nukleinsäure-Nachweis, der die Identifikation von Nukleinsäuren erleichtert.The present invention relates to nucleic acid detection, which facilitates the identification of nucleic acids.

Nukleinsäuren liegen normalerweise in Form doppelsträngiger Moleküle vor, die auch als Heteroduplexe bezeichnet werden und aus zwei Nukleinsäure-Molekülen zusammengesetzt sind. Setzt man Heteroduplexe einer Temperaturerhöhung aus, dissoziieren sie in zwei einzelsträngige Nukleinsäure-Moleküle. Bei einer Erniedrigung der Temperatur können diese zu einem Heteroduplex reassoziieren. Unter bestimmten Umständen können einzelsträngige Nukleinsäure-Moleküle auch mit sich selbst zu sogenannten Homoduplex-Molekülen reagieren. Die Hinreaktion zu Hetero- oder Homo-Duplexen bezeichnet man als Hybridisierung oder Rehybridisierung, bei Homoduplexen auch als Selbsthybridisierung. Hetero- und Homoduplexe werden auch als Hybride bezeichnet.Nucleic acids are usually in Double-stranded shape molecules before, which are also called heteroduplexes and composed of two nucleic acid molecules are. Exposing heteroduplexes to an increase in temperature dissociate them into two single-stranded nucleic acid molecules. at Lowering the temperature can result in a heteroduplex anneal. Under certain circumstances, single-stranded nucleic acid molecules can also react with themselves to form so-called homoduplex molecules. The outward reaction to hetero- or homo-duplexes is called hybridization or re-hybridization, with homoduplexes also as self-hybridization. Hetero and homoduplexes are also called hybrids.

Die Dissoziation von Nukleinsäure-Doppelsträngen und ihre Reassoziation stellt ein chemisches Gleichgewichtssystem dar, das sich bei einer bestimmten Kenngröße, die als Schmelztemperatur T_m bezeichnet wird, in einem chemischen Gleichgewicht befindet bei dem die Hälfte aller Nukleinsäure-Moleküle in einer Lösung in doppelsträngiger Form, die andere Hälfte in Form von Einzelstrang-Molekülen vorliegt.The dissociation of nucleic acid double strands and their reassociation represents a chemical equilibrium system which is in a chemical equilibrium at a certain parameter, which is referred to as the melting temperature T _m , in which half of all nucleic acid molecules are in a solution in double-stranded form, the other half is in the form of single-stranded molecules.

Nukleinsäuren sind Polymere der Nukleotide Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil, Inosin (a, c, g, t, u, i), künstlicher oder modifizierter Nukleotide, die in dem Polymer wie Perlen an einer Perlenkette aneinandergereiht sind. Die Abfolge der Nukleotide in einem Nukleinsäure-Molekül ist für das jeweilige Nukleinsäure-Molekül spezifisch. Die Bildung von Doppelsträngen erfolgt über Wasserstoff-Brückenbindungen, die z. B. zwischen Einzelnukleotiden a und t, sowie c und g entstehen können, wenn auf einem Einzelstrang genügend Nukleotide aufeinander folgen, die auf ein jeweiliges Gegennukleotid auf einem anderen Einzelstrang – und dort in der entsprechenden Reihenfolge – treffen. In der Natur liegen Nukleinsäuren in Form solcher zueinander komplementärer Einzelstränge als Doppelstrang vor. Die jeweilige Zusammensetzung der Nukleinsäuren hat Einfluss auf das chemische Gleichgewicht, das zwischen Reassoziation und Dissoziation von Nukleinsäure-Doppelsträngen besteht. Prinzipiell kann man sagen, dass die Dissoziation von Nukleinsäure-Doppelsträngen primär nach einer Kinetik erster Ordnung erfolgt, während die Rückreaktion primär nach einer Kinetik zweiter Ordnung erfolgt, wobei sich das Gleichgewicht in Lösung sehr schnell einstellt, Hin- und Rückreaktion in Lösung also verhältnismäßig schnell erfolgen.Nucleic acids are polymers of the nucleotides Adenine, cytosine, guanine, thymine, uracil, inosine (a, c, g, t, u, i), more artificial or modified nucleotides that appear in the polymer like beads a string of pearls are strung together. The sequence of the nucleotides in a nucleic acid molecule is for that particular one Nucleic acid molecule specific. The formation of double strands takes place via Hydrogen bonds, the z. B. between individual nucleotides a and t, and c and g arise can, if there are enough nucleotides on a single strand consecutive to a respective counter nucleotide on a other single strand - and there in the appropriate order - meet. Lying in nature nucleic acids in the form of such mutually complementary single strands as Double strand before. Has the respective composition of the nucleic acids Influence on the chemical equilibrium between reassociation and dissociation of nucleic acid duplexes. In principle, one can say that the dissociation of nucleic acid double strands primarily after one First order kinetics occur, while the back reaction primarily after one Second order kinetics occur, with the equilibrium in solution sets very quickly, back and forth reaction in solution relatively quickly respectively.

Häufig steht man vor dem Problem, dass das Vorhandensein einer bestimmten Nukleinsäure in einem Reaktionsgemisch oder einer biologischen Probe (im folgenden unter dem Begriff „Reaktionsgemisch" zusammengefasst) nachgewiesen werden soll. Dies geschieht in der Regel durch den Einsatz von Fänger-Molekülen, die einzelsträngige Nukleinsäuren aufweisen, die mit einem einzelsträngigen oder partiell einzelsträngigen Nukleinsäure-Molekül, im folgenden Zielstrang, hybridisieren und der Nachweis des Hybrids erlaubt eine Aussage über das Vorhandensein des Zielstrangs. Da auf Nukleinsäuren bestimmte Sequenzen mehrmals vorkommen können bzw. mehrmals vorkommen, wird das Fänger-Molekül so ausgewählt, dass es vorzugsweise mit einer Zielsequenz reagiert, die einen Abschnitt der Gesamtsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt und für diese möglichst spezifisch ist. Dabei versucht man in der Regel eine größtmögliche Stringenz der Fänger-Zielsequenz-Hybride und eine größtmögliche Spezifität beziehungsweise Einzigartigkeit der Zielsequenz für die betreffende Nukleinsäure zu gewährleisten.Frequently one faces the problem that the presence of a certain nucleic acid in a reaction mixture or a biological sample (hereinafter under the term "reaction mixture" summarized) should be demonstrated. This happens in the Usually through the use of scavenger molecules that single nucleic acids have with a single-stranded or partially single-stranded nucleic acid molecule, in the following Target strand, hybridize and the detection of the hybrid allows one Statement about the presence of the target strand. Because determined on nucleic acids Sequences can occur several times or occur several times, the capture molecule is selected so that it is preferably with a target sequence that responds to a portion of the overall sequence the nucleic acid to be detected represents and for this if possible is specific. As a rule, you try to achieve the greatest possible stringency the catcher target sequence hybrid and the greatest possible specificity respectively To ensure uniqueness of the target sequence for the nucleic acid in question.

Das Nachweisen von Nukleinsäuren mittels Fänger-Zielsequenz-Hybriden ist seit langem bekannt. Es hat sich aus dem sogenannten Southern Blot über viele Varianten bis hin zu Oligonukleotid-Chips entwickelt, bei denen auf wenigen Quadratzentimetern Tausende von Oligonukleotid-Sequenzen als Spots räumlich separiert an einer festen Phase vorgesehen sind und als Fänger-Moleküle fungieren. Viele dieser Spots ermöglichen zeitlich parallel eine qualitative und im begrenzten Umfang quantitative Antwort auf An- oder Abwesenheit bestimmter Sequenzen. Es gibt darüber hinaus eine Vielzahl von Variationen des Fänger-Zielsequenz-Hybrid-Nachweisprinzips, die der Fachwelt allgemein bekannt sind.Detecting nucleic acids using Catcher-target sequence hybrids has been known for a long time. It has emerged from the so-called Southern Blot over developed many variants down to oligonucleotide chips those on a few square centimeters thousands of oligonucleotide sequences as spots spatially are provided separately on a solid phase and act as capture molecules. Enable many of these spots at the same time a qualitative and to a limited extent quantitative Response to the presence or absence of certain sequences. There is beyond that a variety of variations of the catcher target sequence hybrid detection principle, that are generally known to the experts.

Um einen Nachweis eines Fänger-Zielsequenz-Hybrides zu ermöglichen, braucht man hierfür eine hinreichende Menge nachweisbarer Hybride.To provide evidence of a catcher-target sequence hybrid to allow you need for this a sufficient amount of detectable hybrids.

Häufig ist man mit geringen Probenmengen konfrontiert, die mittels einer PCR-Reaktion in mehreren Zyklen amplifiziert werden müssen. Jeder Zyklus einer PCR-Reaktion gleicht einem Kopiervorgang, wobei die Anzahl der Kopien mit jedem Schritt exponentiell zunimmt. Jeder Schritt kostet Zeit und Material, und je weiter der Kopiervorgang fortgeschritten ist, desto fehlerhafter können die Kopien ausfallen.Frequently one is confronted with small amounts of samples, which can be measured using a PCR reaction in need to be amplified several cycles. Every cycle of a PCR reaction is the same a copying process, the number of copies with each step increases exponentially. Every step costs time and material, and the further the copying process has progressed, the more faulty can the copies fail.

Dadurch, dass nachweisbare Zielstränge einerseits mit Fänger-Molekülen hybridisieren können, aber andrerseits auch zu Doppelsträngen reassoziieren können, befinden sich die Reassoziation und die Ausbildung von Fänger-Zielsequenz-Hybriden in direkter Konkurrenz zueinander. Man kann daher in aller Regel nur einen Teil der eigentlich vorhandenen Nukleinsäure-Moleküle mittels Fänger-Zielsequenz-Hybriden nachweisen.Because on the one hand, demonstrable target strands hybridize with capture molecules can, but can also reassociate to double strands the reassociation and formation of catcher-target sequence hybrids direct competition to each other. You can therefore usually only one Part of the nucleic acid molecules actually present using capture-target sequence hybrids prove.

Wenn man Fänger-Zielsequenz-Hybride an fester Phase erzeugt, wie z.B. bei Nachweisen mittels DNA-Arrays, kommt erschwerend hinzu, dass die Bildung von Fänger-Zielsequenz-Hybriden in Lösung schneller abläuft als an einer festen Phase.When generating capture target sequence hybrids on a solid phase, such as, for example, when using DNA arrays, it is aggravated that the formation of capture target sequence hybrids in solution is rapid It runs as on a solid phase.

Es bestehen somit erhebliche Nachteile in Bezug auf die Sensitivität und die Spezifität herkömmlicher Nachweisverfahren von Nukleinsäuren.There are therefore considerable disadvantages in terms of sensitivity and the specificity conventional detection methods of nucleic acids.

Um den Nachweis von Nukleinsäuremolekülen sensitiver zu machen, sind mehrere Verfahren bekannt, mit deren Hilfe die Reassoziation von Einzelsträngen zu Doppelsträngen verhindert wird.To make the detection of nucleic acid molecules more sensitive To make several methods are known by means of which the reassociation of single strands to double strands is prevented.

Ein bekanntes Verfahren zur Verhinderung der Reassoziation ist der Strangabbau mit Hilfe eines Enzyms. Dabei hydrolysiert ein Enzym einen der beiden Einzelstränge, und es bleibt lediglich ein Einzelstrang zurück. Das Verfahren hat den Nachteil, umständlich und auch fehleranfällig zu sein, z.B. wenn das Enzym nicht zuverlässig arbeitet oder aber wenn das Enzym auch nachzuweisendes Material aus einem Reaktionsgemisch entfernt.A known method of prevention the reassociation is strand degradation with the help of an enzyme. there an enzyme hydrolyzes one of the two single strands, and only a single strand remains. The process has the disadvantage laborious and also prone to errors to be, e.g. if the enzyme does not work reliably or if the enzyme also material to be detected from a reaction mixture away.

Ein anderes bekanntes Verfahren zur Erhöhung der Sensitivität besteht darin, dass einer der Einzelstränge der doppelsträngigen Nukleinsäure mit einer Markierung versehen wird, die eine Bindung der markierten Nukleinsäure an eine feste Phase ermöglicht. Auf diese Weise findet ein „Herausfiltern" der markierten Nukleinsäure aus der Lösung statt. Derartige Verfahren können zum Beispiel mit Hilfe von Magnetpartikeln durchgeführt werden, die an den markierten Strang binden und mit denen der markierte Strang mit Hilfe eines Magneten aus einem Reaktionsgemisch entfernt werden kann. Übrig bleibt dann der nicht markierte Einzelstrang, der nicht mehr zu einem Heteroduplex reassoziieren kann und entfernt wird. Auch dieses und ähnlich gestaltete Verfahren haben den Nachteil, umständlich zu sein.Another known method for increase of sensitivity is that one of the single strands of the double-stranded nucleic acid a marking is provided which binds the marked nucleic acid to a fixed phase. In this way, a "filtering out" the labeled nucleic acid from the solution instead of. Such methods can for example with the help of magnetic particles, which bind to the marked strand and with which the marked Strand removed from a reaction mixture using a magnet can be. Left then remains the unmarked single strand, which is no longer closed can reassociate with a heteroduplex and is removed. This too and similar Processes designed have the disadvantage of being cumbersome.

Ein weiteres bekanntes Verfahren ist die zyklische Denaturierung reassoziierter Stränge in einem externen Denaturierungsschritt. Hier wird mit jedem Zyklus Gelegenheit gegeben, noch freie Fänger-Moleküle zu besetzen. Die Reassoziation zu Heteroduplexen ist in solchen Verfahren allerdings nicht verhindert.Another known method is the cyclical denaturation of reassociated strands in one external denaturation step. There is an opportunity here with every cycle given to still occupy free capture molecules. The reassociation to heteroduplexes is however in such procedures not prevented.

Ein weiteres bekanntes Verfahren ist die asymmetrische PCR, bei der durch stark unterschiedliche Konzentrationen der PCR-Edukte immer eine nicht mehr exponentielle Amplifikation vorgenommen wird, sondern eine lineare Vervielfältigung des auf Fänger-Moleküle zu hybridisierenden Zielstranges. Die Reassoziationskinetik wird hierbei zu Ungunsten dieses Stranges beeinflusst, weil der Zielstrang nach ca. 15 Zyklen allein linear vervielfältigt wird.Another known method is the asymmetric PCR, in which by very different concentrations of the PCR starting materials is no longer an exponential amplification is made, but a linear duplication of the hybridized on capture molecules Target strand. The kinetics of association become disadvantageous this strand affects because the target strand after about 15 cycles reproduced linearly alone becomes.

Alle bekannten Verfahren sind experimentell aufwändig wegen der erforderlichen zusätzlichen Reaktionsschritte, teuer durch die Einführung von Markierungen oder nur mit aufwändigen Maschinen zu betreiben.All known methods are experimental costly because of the required additional Reaction steps, expensive through the introduction of markings or only with elaborate To operate machines.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren zu schaffen, bei dem die Reassoziation von Nukleinsäuren auf einfache Art und Weise gehemmt wird.The object of the invention is therefore to create a method for the detection of nucleic acids in which the Reassociation of nucleic acids is inhibited in a simple manner.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1.The task is solved by a method according to claim 1.

Weitere, vorteilhafte Ausgestaltungen eines erfindungsgemässen Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen.Further advantageous configurations one according to the invention Procedures result from the subclaims.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in einem Reaktionsgemisch mit folgenden Schritten:

a) dem Reaktionsgemisch werden Blocker-Moleküle hinzugefügt,
b) doppelsträngiges Nukleinsäurematerial wird zu zwei Typen von komplementären Nukleinsäure-Einzelsträngen denaturiert,
c) die Blocker-Moleküle hybridisieren mit zumindest einem Abschnitt von zumindest einem der beiden Typen von aus der Denaturierung resultierenden Nukleinsäure-Einzelsträngen,
d) das Reaktionsgemisch wird mit Fänger-Molekülen in Verbindung gebracht,
e) die Fänger-Moleküle reagieren jeweils mit einem Abschnitt einer detektierbaren Nukleinsäure zu Fänger-Zielsequenz-Hybriden, und
f) gebildete Fänger-Zielsequenz-Hybride werden durch Detektion nachgewiesen.

The object is achieved by a method for the detection of nucleic acids in a reaction mixture with the following steps:

a) blocker molecules are added to the reaction mixture,
b) double-stranded nucleic acid material is denatured into two types of complementary nucleic acid single strands,
c) the blocker molecules hybridize with at least a section of at least one of the two types of single-stranded nucleic acids resulting from the denaturation,
d) the reaction mixture is associated with scavenger molecules,
e) the capture molecules each react with a portion of a detectable nucleic acid to capture target sequence hybrids, and
f) Formed target-target sequence hybrids are detected by detection.

Durch das erfindungsgemässe Verfahren entstehen Hybride aus Blocker-Molekülen und Nukleinsäure-Einzelsträngen, wodurch diese daran gehindert werden, zu Hetero- oder Homo-Duplexen zu reassoziieren und in hohem Umfang für die Bildung von Fänger-Zielsequenz-Hybriden zur Verfügung stehen. Die Sensitivität von Nukleinsäurenachweisen wird durch das erfindungsgemässe Verfahren so auf einfache und günstige Weise erheblich verbessert, so dass z.B. weniger Probenmaterial benötigt oder Nachweise spezifischer Sequenzen überhaupt möglich sind.By the method according to the invention hybrids arise from blocker molecules and nucleic acid single strands, whereby these are prevented from reassociating to hetero- or homo-duplexes and to a large extent for the formation of catcher target sequence hybrids to disposal stand. The sensitivity of nucleic acid tests is by the inventive Procedure so simple and cheap Significantly improved, so that e.g. less sample material needed or evidence of specific sequences are possible at all.

Nach einer weiteren Ausbildung des erfindungsgemässen Verfahrens, sind die Fänger-Moleküle auf einem DNA-Array angeordnet. Dabei können gleichzeitig viele erfindungsgemässe und hoch sensitive Nukleinsäurenachweise stattfinden.After further training in invention Process, the capture molecules are on one Arranged DNA array. You can at the same time many according to the invention and highly sensitive nucleic acid detection occur.

Vorzugsweise werden in einem erfindungsgemässen Verfahren die Blocker-Moleküle im molaren Überschuss, vorzugsweise in einem 10–100-fachen molaren Überschuss, eingesetzt. Hierdurch wird eine mögliche Reassoziation von Einzelsträngen zu Heteroduplexen fast vollständig ausgeschlossen.Preferably in a method according to the invention the blocker molecules in molar excess, preferably in a 10-100 times molar excess, used. This will result in a possible reassociation of single strands Heteroduplexes almost completely locked out.

In einer weiteren Abwandlung eines erfindungsgemässen Verfahrens bilden die Blocker-Moleküle mit Nukleinsäure-Einzelsträngen Hybride aus, deren Bildung in Konkurrenz zu einer etwaigen Bildung von Sekundärstrukturen steht. Hierdurch wird die Bildung von Sekundärstrukturen verhindert, die sonst eine Bildung von Fänger-Zielsequenz-Hybriden behindern könnten. Stattdessen können sogar Strukturen ausgebildet werden, die vorteilhaft für eine Detektion sind.In a further modification of a method according to the invention, the blocker molecules form hybrids with single-stranded nucleic acids, the formation of which competes with any formation of secondary structures. This prevents the formation of secondary structures that would otherwise form Catcher target sequence hybrids. Instead, structures can be formed that are advantageous for detection.

Beim erfindungsgemässen Verfahren können ein oder mehrere unterschiedliche Blocker-Moleküle eingesetzt werden.In the method according to the invention can one or more different blocker molecules are used.

Durch das Vorsehen mehrerer unterschiedlicher Blocker-Moleküle können die Blocker-Moleküle nach bestimmten Anforderungen ausgewählt werden und zusammen wirken. Zum Beispiel können vorgesehen sein und zusammenwirken: Blocker-Moleküle, die zur Verhinderung der Bildung von Homoduplexen ausgewählt sind, und Blocker-Moleküle, die zur Verhinderung der Ausbildung unerwünschter Sekundärstrukturen ausgewählt sind.By providing several different ones Blocker molecules can the blocker molecules can be selected according to specific requirements and work together. For example, you can be provided and work together: blocker molecules that help prevent Formation of homoduplexes are selected, and blocker molecules, to prevent the formation of undesirable secondary structures selected are.

Nach einer weiteren Ausbildung des erfindungsgemässen Verfahrens bestehen die Blocker-Moleküle aus synthetischen Oligonukleotiden. Diese können in beliebiger Zusammensetzung und Länge in hoher Reinheit zur Verfügung gestellt, wodurch erfindungsgemässe Verfahren besonders effektiv wirken.After further training in invention The blocker molecules consist of synthetic oligonucleotides. these can provided in any composition and length in high purity, whereby according to the invention Process work particularly effectively.

In einer weiteren Ausbildung des erfindungsgemässen Verfahren werden in die Nukleinsäure-Einzelstränge, die die Zielsequenz enthalten, Markierungsmittel eingebaut.In a further training of the invention Procedures are made in the nucleic acid single strands that contain the target sequence, add marker.

Auf diese Weise wird eine Detektion gebildeter Hybride erleichtert.In this way, detection formed hybrid relieved.

Vorzugsweise werden in erfindungsgemässen Verfahren Blocker-Moleküle verwendet, die im wesentlichen keine Bindungen mit Fänger-Molekülen eingehen können, damit die Fänger-Moleküle nicht durch Blocker-Moleküle blockiert werden.Preferably in methods according to the invention Blocker molecules used, which form essentially no bonds with capture molecules can, so the catcher molecules don't through blocker molecules be blocked.

Vorzugsweise werden in erfindungsgemässen Verfahren Blocker-Moleküle verwendet, die im wesentlichen keine Bindungen mit Abschnitten eines Nukleinsäure-Einzelstranges eingehen können, die mit Fänger-Molekülen reagieren können, damit diese Abschnitte nicht durch Blocker-Moleküle blockiert werden.Preferably in methods according to the invention Blocker molecules used that have essentially no ties with sections of a Single nucleic acid can, that react with capture molecules can, so that these sections are not blocked by blocker molecules.

Dem besseren Verständnis der Erfindung dienen die 1–2, in denenFor a better understanding of the invention 1 - 2 , in which

1 ein Gleichgewichtssystem gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt, 1 represents an equilibrium system according to the present invention,

2 Draufsichten auf fluoreszenzangeregte Oberflächen von DNA-Chips darstellt. 2 Top views of fluorescence excited surfaces of DNA chips.

Zum besseren Verständnis der Erfindung werden zunächst Begriffe im Sinne der Erfindung definiert.To better understand the Invention first Terms defined in the sense of the invention.

PCR-Primer sind Oligonukleotide, die eine Amplifikation von Nukleinsäurematerial mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion ermöglichen.PCR primers are oligonucleotides an amplification of nucleic acid material by means of the polymerase chain reaction enable.

Nukleinsäure-Einzelstränge entstehen durch Dissoziation von Nukleinsäure-Doppelsträngen. Ein zu eliminierender Nukleinsäurestrang ist ein Nukleinsäure-Einzelstrang, der keine Hybride mit Fänger-Molekülen ausbilden soll. Ein detektierbarer Zielstrang ist ein Nukleinsäure-Einzelstrang, der Hybride mit Fänger-Molekülen ausbilden kann. Hierzu weist der detektierbare Zielstrang einen zum Fängermolekül komplementären Abschnitt auf, der als Zielsequenz bezeichnet wird.Single nucleic acid strands are formed by dissociation of nucleic acid double strands. On strand of nucleic acid to be eliminated is a single strand of nucleic acid that do not form hybrids with capture molecules should. A detectable target strand is a single nucleic acid strand the hybrid with capture molecules can. For this purpose, the detectable target strand has a section that is complementary to the capture molecule which is called the target sequence.

Beide oder einer der aus einem Nukleinsäuredoppelstrang resultierenden Nukleinsäure-Einzelstränge können detektierbare Zielstränge 3 sein.Both or one of the nucleic acid single strands resulting from a nucleic acid double strand can be detectable target strands 3 his.

Fänger-Moleküle sind Moleküle, die dazu geeignet sind, mit bestimmten Molekülen so in Wechselwirkung zu treten, dass diese an die Fänger-Moleküle gebunden sind, z.B. mittels Hybridisierung. Dabei passen die Fänger-Moleküle zu diesen Molekülen wie ein Schlüssel zu einem Schloss, das heißt, dass man mit Hilfe der Fänger-Moleküle die Moleküle, die zu den jeweiligen Fängern passen, aus einer Vielzahl von Molekülen „einfangen kann". Die Fänger-Moleküle können an eine feste Phase gebunden sein, zum Beispiel an Oberflächen. Sie können sich aber auch in Lösung befinden und sie können auch an sogenannte magnetic beads gebunden sein.Catcher molecules are molecules which are capable of interacting with certain molecules occur that these are bound to the capture molecules are, e.g. using hybridization. The catcher molecules match these molecules like a key to a castle, that is, that with the help of the catcher molecules, the molecules that to the respective catchers can "capture" from a large number of molecules. The capture molecules can attach a solid phase, for example on surfaces. she can but also in solution and they can also be bound to so-called magnetic beads.

Blocker-Moleküle sind Moleküle, die mit einem Nukleinsäureeinzelstrang eine Bindung derart eingehen können, dass der Nukleinsäureeinzelstrang nicht mit einem zu diesem komplementären Nukleinsäureeinzelstrang zu einem Doppelstrang hybridisieren kann. Blocker-Moleküle können bestehen aus: DNA, cDNA, RNA, tRNA, mRNA, LNA, PNA, aRNA oder Kombinationen daraus . Blocker-Moleküle sind insbesondere Oligonukleotide mit einer vorbestimmten Länge die komplementär zu Bereichen von Nukleinsäuresträngen sind. Vorzugsweise weisen Blocker-Moleküle Längen von 10-30 Nukleotiden auf.Blocker molecules are molecules that with a single nucleic acid strand can form a bond that the nucleic acid single strand not with a single strand of nucleic acid complementary to this can hybridize to a double strand. Blocker molecules can exist from: DNA, cDNA, RNA, tRNA, mRNA, LNA, PNA, aRNA or combinations from it. Blocker molecules are in particular oligonucleotides with a predetermined length complementary to areas of nucleic acid strands. Preferably have blocker molecules lengths of 10-30 nucleotides on.

Ein Eliminationsblocker ist ein Blocker-Molekül, das mit einem zu eliminierenden Nukleinsäurestrang Hybride ausbilden kann. Ein Detektionsentblocker ist ein Blocker-Molekül, das mit dem zu detektierenden Zielstrang Hybride ausbilden kann. Gleiche oder unterschiedliche Blocker-Moleküle können als Eliminationsblocker oder Detektionsentblocker fungieren.An elimination blocker is a blocker molecule that works with a nucleic acid strand to be eliminated hybrid can train. A detection deblocker is a blocker molecule that works with the target strand to be detected can form hybrids. Same or different blocker molecules can act as elimination blockers or detection deblockers act.

Ein Reaktionsgemisch ist ein Gemisch, in dem sich nachweisbares Nukleinsäurematerial befindet, das mit Fänger-Molekülen in Verbindung gebracht werden soll oder bereits mit diesen in Verbindung gebracht wurde, und dem Blocker-Moleküle zugesetzt werden können oder bereits zugesetzt wurden.A reaction mixture is a mixture in which there is detectable nucleic acid material with Catcher molecules in connection to be brought or already associated with them and the blocker molecules can be added or have already been added.

Erfindungsgemäß werden einem Reaktionsgemisch Blocker-Moleküle hinzugefügt. Hierdurch entsteht ein Gleichgewichtssystem (1), das vier chemische Gleichgewichtsreaktionen (I)–(IV) umfasst.According to the invention, blocker molecules are added to a reaction mixture. This creates a balance system ( 1 ), the four chemical equilibrium reactions ( I ) - (IV).

Die Gleichgewichtsreaktion (I) beschreibt die Dissoziation von Heteroduplexen bzw. Nukleinsäuredoppelsträngen 1 zu Nukleinsäureeinzelsträngen 2, 3 (Hinreaktion) und deren Reassoziation zu Nukleinsäuredoppelsträngen 1 (Rückreaktion). Bei der Schmelztemperatur T_m befindet sich diese Reaktion in einem chemischen Gleichgewicht, bei dem jede der Komponenten Nukleinsäuredoppelstränge 1 und Nukleinsäureeinzelstränge 2, 3 jeweils in gleicher Konzentration vorliegt. Bei einer Temperaturerhöhung verschiebt sich das Gleichgewicht hin zu höheren Konzentrationen an Nukleinsäureeinzelsträngen 2, 3 (Denaturierung durch Erhitzen). Eine Temperaturerniedrigung verschiebt das Gleichgewicht hin zu höheren Konzentrationen an Nukleinsäure-Doppelsträngen (Renaturierung). Die Nukleinsäureeinzelstränge können zu eliminierende Nukleinsäurestränge 2 und/oder die detektierbaren Zielstränge 3 sein. Zielstränge 3 sind detektierbare Moleküle, da sie eine spezifische Zielsequenz 4 aufweisen. Die Nukleinsäureeinzelstränge 2, 3 können auch in lediglich partiellen Bereichen einzelsträngig und in den übrigen Bereichen doppelsträngig vorliegen, was insbesondere bei langen Nukleinsäuremolekülen der Fall ist. Ein Gleichgewicht besteht dann zwischen partiell einzelsträngigen Nukleinsäureeinzelsträngen 2, 3 und (ggf. ebenso partiell) doppelsträngigen Nukleinsäuren 1.The equilibrium reaction ( I ) describes the dissociation of heteroduplexes or nucleic acid double strands 1 to single nucleic acid strands 2 . 3 (Forward reaction) and their reassociation to nucleic acid double strands 1 (Reverse reaction). At the melting temperature T _m , this reaction is in a chemical equilibrium in which each of the components has double nucleic acid strands 1 and nucleic acid single strands 2 . 3 is always in the same concentration. When the temperature rises, the equilibrium shifts towards higher concentrations of single nucleic acid strands 2 . 3 (Denaturation by heating). A lowering of the temperature shifts the equilibrium towards higher concentrations of nucleic acid double strands (renaturation). The single nucleic acid strands can be eliminated nucleic acid strands 2 and / or the detectable target strands 3 his. target strands 3 are detectable molecules because they have a specific target sequence 4 exhibit. The single nucleic acid strands 2 . 3 can also be single-stranded in only partial regions and double-stranded in the remaining regions, which is particularly the case with long nucleic acid molecules. There is then an equilibrium between partially single-stranded nucleic acid single strands 2 . 3 and (possibly also partially) double-stranded nucleic acids 1 ,

Die Gleichgewichtsreaktion (II) beschreibt die Reaktion von vollständig oder partiell disoziierten Nukleinsäuresträngen 2 oder 3 zu Sekundärstrukturen 5 dieser Nukleinsäurestränge und die korrespondierende Rückreaktion. Bei Sekundärstrukturen kann die räumliche Ausrichtung der Zielsequenz 4 diese schwer zugänglich machen, wie inThe equilibrium reaction ( II ) describes the reaction of completely or partially disassociated strands of nucleic acid 2 or 3 to secondary structures 5 this nucleic acid strands and the corresponding back reaction. With secondary structures, the spatial alignment of the target sequence 4 make it difficult to access, as in

1 anhand eines schematisierten Homoduplexes 5 dargestellt. Blocker-Moleküle 6, die als Detektionsentblocker 6d fungieren, können so ausgewählt sein, dass sie Sensitivität von Nukleinsäurenachweisen erhöhen. Es wird angenommen, dass mittels der Detektionsentblocker die Ausbildung von Sekundärstrukturen 5 ver- oder behindert wird, die ihrerseits die Ausbildung von Fänger-Zielsequenz-Hybriden 11 ver- oder behindern würden. Derartige ungünstige Sekundärstrukturen sind z.B. Faltungen oder Homoduplexe des detektierbaren Zielstranges. Es wird ferner angenommen, dass Detektionsentblocker dazu geeignet sind, die Sekundärstruktur des detektierbaren Einzelstrangs dahingehend zu beeinflussen, dass die Zielsequenz besonders leicht mit einem dazu passenden Fänger-Molekül hybridisieren kann, zum Beispiel indem die Detektionsentblocker eine gestreckte und darum leicht mit einem Fänger-Molekül hybridisierbare Sekundärstruktur im Bereich der Zielsequenz bewirken. 1 based on a schematic homoduplex 5 shown. Blocker molecules 6 acting as a detection deblocker 6d function can be selected so that they increase the sensitivity of nucleic acid detections. It is assumed that the formation of secondary structures by means of the detection deblocker 5 is prevented or hindered, which in turn the formation of catcher-target sequence hybrids 11 would prevent or hinder. Such unfavorable secondary structures are, for example, folds or homoduplexes of the detectable target strand. It is also assumed that detection blockers are suitable for influencing the secondary structure of the detectable single strand in such a way that the target sequence can hybridize particularly easily with a matching catcher molecule, for example by the detection blockers having a stretched and therefore easily with a catcher molecule cause hybridizable secondary structure in the area of the target sequence.

Die Gleichgewichtsreaktion (III) beschreibt die Reaktion von vollständig oder partiell denaturierten bzw. disoziierten Nukleinsäureeinzelsträngen 2, 3 mit Blocker-Molekülen 6 zu Hybridmolekülen 7, 8 und die korrespondierende Rückreaktion. Hybridmoleküle 8 sind Moleküle, die eine Zielsequenz 4 aufweisen.The equilibrium reaction (III) describes the reaction of completely or partially denatured or disassociated single nucleic acid strands 2 . 3 with blocker molecules 6 to hybrid molecules 7 . 8th and the corresponding reverse reaction. hybrid molecules 8th are molecules that have a target sequence 4 exhibit.

Bringt man Nukleinsäureeinzelstränge 3 oder Hybridmoleküle 8, die jeweils eine Zielsequenz 4 umfassen, mit Fänger-Molekülen in Verbindung, die eine Sequenz aufweisen, die zur Zielsequenz 4 komplementär ist, so bilden sich in beiden Fällen detektierbare Hybride zwischen den Fänger-Molekülen und den jeweiligen Zielsequenzen 4.Bring single strands of nucleic acid 3 or hybrid molecules 8th , each a target sequence 4 comprise, with capture molecules in connection, which have a sequence that to the target sequence 4 is complementary, detectable hybrids are formed in both cases between the capture molecules and the respective target sequences 4 ,

Die Gleichgewichtsreaktion (IV) beschreibt diese Reaktion zu detektierbaren Fänger-Zielsequenz-Hybriden 11 für Hybridmoleküle 8 mit an einer festen Phase 9 befindlichen Fänger-Molekülen 10.The equilibrium reaction (IV) describes this reaction to detectable catcher-target sequence hybrids 11 for hybrid molecules 8th with a fixed phase 9 capture molecules 10 ,

Die in 1 gezeigten Gleichgewichtsreaktionen befinden sich im Gleichgewicht, wenn die Konzentrationen der jeweils vorhandenen Komponenten konstant sind. Unter konstanten Bedingungen stellt sich ein solches Gleichgewicht nach einer bestimmten Zeit immer ein. Gleichgewichtsreaktionen gehorchen dem von Le Chatelier formulierten Prinzip des kleinsten Zwangs, wonach ein im Gleichgewicht befindliches System einem Zwang ausweicht, und sich ein neues Gleichgewicht einstellt. Jede Änderung der Bedingungen ist ein solcher Zwang.In the 1 The equilibrium reactions shown are in equilibrium if the concentrations of the components present are constant. Under constant conditions, such a balance always arises after a certain time. Equilibrium reactions obey the principle of least coercion formulated by Le Chatelier, according to which a system in equilibrium evades compulsion and a new equilibrium is established. Any change in conditions is such a constraint.

Durch hinzufügen von Blocker-Molekülen 6 zu einem Reaktionsgemisch, in dem ein Gleichgewicht (I) vorliegt, reagieren Blocker-Moleküle 6 mit disoziierten Nukleinsäure-Einzelsträngen 2 und/oder 3 zu Hybriden 7 und/oder 8, wodurch dem Gleichgewichtsystem Nukleinsäuren 2 und/oder 3 entzogen werden und das Gleichgewicht (I) sich infolgedessen hin auf die Seite der vereinzelten Nukleinsäurestränge 2, 3 verschiebt, und weniger Doppelstränge 1 vorliegen.By adding blocker molecules 6 to a reaction mixture in which an equilibrium ( I ) is present, blocker molecules react 6 with disassociated nucleic acid single strands 2 and or 3 to hybrids 7 and or 8th , which makes the equilibrium system nucleic acids 2 and or 3 be deprived and the balance ( I ) consequently to the side of the isolated nucleic acid strands 2 . 3 moves, and fewer double strands 1 available.

Da sowohl Zielstränge 3 als auch die Hybridmoleküle 8 hybridisieren können, ist die Konzentration an detektierbaren Molekülen höher als vor Hinzufügen der Blocker-Moleküle 6, und es können demzufolge mehr Hybride zwischen Fänger-Molekülen 10 und Zielsequenzen 4 – in Form von Nukleinsäureeinzelsträngen 3 oder Hybridmolekülen 8 – ausgebildet werden, als dies ohne den Einsatz von Blocker-Molekülen bei ansonsten gleichen Bedingungen möglich wäre. So wird mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens die Sensitivität von Nukleinsäure-Nachweisen auf einfache Weise erhöht.Because both strands 3 as well as the hybrid molecules 8th can hybridize, the concentration of detectable molecules is higher than before adding the blocker molecules 6 , and consequently there can be more hybrids between capture molecules 10 and target sequences 4 - in the form of single nucleic acid strands 3 or hybrid molecules 8th - Be trained than would be possible without the use of blocker molecules under otherwise identical conditions. The method according to the invention thus increases the sensitivity of nucleic acid detections in a simple manner.

Nukleinsäure-Moleküle bestehen überwiegend aus einer bestimmten Abfolge der Nukleotide a, c, t und g, bzw. a, c, u und g. Andere Basen, wie z.B. Inosin oder modifizierte Nukleotide können auch darin vorkommen. Je kürzere Abschnitte eines Nukleinsäure-Moleküls verwendet werden, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass andere Abschnitte mit identischer Basenabfolge bzw. komplementärer Basenfolge innerhalb dieses oder anderer Nukleinsäure-Moleküle vorkommen. Es werden deshalb die Blocker-Moleküle 6 so gewählt, dass sie eine Mindestlänge aufweisen, damit sie nicht an beliebigen Stellen mit Nukleinsäuren hybridisieren. Die Mindestlänge liegt typischerweise im Bereich von 6 bis 10 Nukleotiden.Nucleic acid molecules mainly consist of a certain sequence of nucleotides a, c, t and g, or a, c, u and g. Other bases, such as inosine or modified nucleotides, can also be found therein. The shorter sections of a nucleic acid molecule are used, the greater the probability that other sections with an identical base sequence or complementary base sequence occur within this or other nucleic acid molecules. It is therefore the blocker molecules 6 chosen so that they have a minimum length so that they do not hybridize with nucleic acids at any point. The minimum length is typically in the range of 6 to 10 nucleotides.

Die Schmelztemperatur T_m von Hybriden steigt mit der Länge der jeweiligen Hybride und ist ausserdem abhängig von der jeweiligen Zusammensetzung – so schmelzen gc-reiche Hybride bei anderen Temperaturen als gc-arme Hybride. Die Blocker-Moleküle 6 werden daher so gewählt, dass Hybride 7, 8 eine Schmelztemperatur T_m aufweisen, die im wesentlichen identisch mit oder höher als die Schmelztemperatur T_m der jeweiligen Fänger-Zielsequenz-Hybride 11 ist.The melting temperature T _m of hybrids increases with the length of the respective hybrid and is also dependent on the respective composition - this means that gc-rich hybrids melt at different temperatures than low-gc hybrids. The blocker molecules 6 are therefore chosen to be hybrids 7 . 8th have a melting temperature T _m which is substantially identical to or higher than the melting temperature T _m of the respective catcher-target sequence hybrid 11 is.

Ein an sich detektierbarer Nukleinsäureeinzelstrang 3 kann eine ungünstige Sekundärstruktur 5 aufweisen, so dass es nicht mit einem Fänger-Molekül hybridisieren kann. Eine solche Sekundärstruktur ist beispielsweise eine Verdrillung der Zielsequenz 4. Ein Blocker-Molekül 6, das in der Nachbarschaft einer Zielsequenz 4 wirkt, kann die räumliche Ausrichtung der Zielsequenz 4 dahingehend beeinflussen, dass die Ausbildung detektierbarer Hybride 11 begünstigt wird, z.B. indem eine ursprünglich verdrillte Zielsequenz 4 nun in gestreckter, bzw. weniger verdrillter Form vorliegt. Ein Blocker-Molekül 6 ist dann so gewählt, dass es als Detektionsentblocker 6d ein Hybrid 8 ausbildet, dessen Schmelztemperatur T_m identisch mit oder vorzugsweise höher als die Schmelztemperatur eines möglichen benachbarten Hybrides 11 zwischen der Zielsequenz 4 und dem Fänger 10 ist. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass eine für einen Nachweis vorteilhaftere Sekundärstruktur – z.B. eine Streckung – der Zielsequenz 4 auch bei solchen Temperaturen tatsächlich vorliegt, die nur knapp um die oder über der Schmelztemperatur T_m der detektierbaren Hybride 11 liegt.A nucleic acid single strand that is detectable per se 3 can be an unfavorable secondary structure 5 have so that it cannot hybridize with a scavenger molecule. Such a secondary structure is, for example, a twisting of the target sequence 4 , A blocker molecule 6 that is in the neighborhood of a target sequence 4 affects the spatial alignment of the target sequence 4 to the extent that the formation of detectable hybrids 11 is favored, for example, by an originally twisted target sequence 4 is now in a stretched or less twisted form. A blocker molecule 6 is then chosen so that it acts as a detection deblocker 6d a hybrid 8th forms, the melting temperature T _m identical to or preferably higher than the melting temperature of a possible neighboring hybrid 11 between the target sequence 4 and the catcher 10 is. In this way it is ensured that a secondary structure, for example an extension, of the target sequence which is more advantageous for detection 4 even at temperatures that are just around or above the melting temperature T _{m of} the detectable hybrids 11 lies.

Durch Hinzufügen ausgewählter Blocker-Moleküle 6 lässt sich auch das Gleichgewicht (II) auf die Seite der vereinzelten Nukleinsäuren 3, die keine Sekundärstruktur 5 aufweisen, verschieben, was, wenn die Sekundärstruktur 5 für die Ausbildung detektierbarer Hybride 11 ungünstig ist, eine Erhöhung der Sensitivität eines erfindungsgemässen Verfahrens bewirkt.By adding selected blocker molecules 6 the balance ( II ) on the side of the isolated nucleic acids 3 that have no secondary structure 5 exhibit, shift what if the secondary structure 5 for the formation of detectable hybrids 11 it is disadvantageous to increase the sensitivity of a method according to the invention.

Die Einstellung eines solchen Gleichgewichtes wird durch das Vorsehen von ausgewählten Blockermolekülen 6 wesentlich beschleunigt, da diese eine Rehybridisierung von Nukleinsäure-Einzelsträngen im Bereich der Zielsequenz verhindern und ggf. eine für einen Nachweis räumlich vorteilhafte Sekundärstruktur induzieren. In Fällen, in denen eine Sekundärstruktur 5 eine Zielsequenz 4 für einen Nachweis mittels Fänger-Zielsequenz-Hybriden 11 unbrauchbar macht, haben die Blocker-Moleküle 6 darüber hinaus die Wirkung, die Sensitivität eines Nachweises erheblich zu erhöhen oder sogar erstmals einen Nachweis mittels Fänger-Zielsequenz-Hybriden zu ermöglichen.The establishment of such an equilibrium is achieved by the provision of selected blocker molecules 6 significantly accelerated, since these prevent re-hybridization of single nucleic acid strands in the region of the target sequence and possibly induce a secondary structure that is spatially advantageous for detection. In cases where a secondary structure 5 a target sequence 4 for detection using catcher target sequence hybrids 11 have made useless, the blocker molecules 6 in addition, the effect of significantly increasing the sensitivity of a detection or even enabling detection using a catcher-target sequence hybrid for the first time.

Wenn man einem Gleichgewichtssystem, das die Gleichgewichte (I), (II), (I)–(II), (II)-(III), oder (I)–(III) umfasst, einen molaren Überschuss, vorzugsweise einen 10–100-fachen molaren Überschuss an Blocker-Molekülen 6 hinzufügt, verschiebt sich dieses Gleichgewichtssystem hin zu höheren Konzentrationen an Hybridmolekülen 7 und/oder 8, und bei einem z.B. mehr als 100-fachen molaren Überschuss an Blocker-Molekülen 6 liegen nach Einstellung eines Gleichgewichts überwiegend oder fast ausschließlich Hybridmoleküle 7 und/oder 8 vor, und damit eine besonders hohe Konzentration an Molekülen die eine Zielsequenz 4 enthalten und die mit einem jeweiligen Fänger-Molekül 10 Fänger-Zielsequenz-Hybride 11 gemäss Gleichgewichtsreaktion (IV) ausbilden können.If you have an equilibrium system that balances ( I ), (II), (I) - (II), (II) - (III), or (I) - (III), a molar excess, preferably a 10-100-fold molar excess of blocker molecules 6 adds, this equilibrium system shifts towards higher concentrations of hybrid molecules 7 and / or 8, and with, for example, a more than 100-fold molar excess of blocker molecules 6 are predominantly or almost exclusively hybrid molecules after the establishment of an equilibrium 7 and or 8th before, and thus a particularly high concentration of molecules the one target sequence 4 contain and with a respective catcher molecule 10 Catcher-target sequence hybrids 11 can train according to equilibrium reaction (IV).

Durch eine hohe Spezifität der Fänger-Moleküle 10 und den Grad der Einzigartigkeit der Zielsequenzen 4 kann die Spezifität von Fänger-Zielsequenz-Hybriden 11 für den Nachweis bestimmter Nukleinsäuren in einem Reaktionsgemisch besonders gut gewährleistet werden.Due to the high specificity of the catcher molecules 10 and the degree of uniqueness of the target sequences 4 may be the specificity of catcher-target sequence hybrids 11 are particularly well guaranteed for the detection of certain nucleic acids in a reaction mixture.

Blocker-Moleküle 6, die nicht komplementär zu Fänger-Molekülen 10 sind, können im wesentlichen keine Bindungen mit Fänger-Molekülen 10 eingehen, und die Bindungsstellen der Fänger-Moleküle 10 bleiben im wesentlichen frei für die Bildung von Fänger-Zielsequenz-Hybriden 11.Blocker molecules 6 that are not complementary to scavenger molecules 10 are essentially unable to bind to scavenger molecules 10 and the binding sites of the capture molecules 10 remain essentially free for the formation of capture target sequence hybrids 11 ,

Blocker-Moleküle 6, die nicht komplementär zu Zielsequenzen 4 sind, können im wesentlichen keine Bindungen mit der Zielsequenz 4 auf einem detektierbaren Zielstrang 3 eingehen und sind nicht identisch mit Fänger-Molekülen, und die Bindungsstellen der Zielsequenzen 4 bleiben im wesentlichen frei für die Bildung von Fänger-Zielsequenz-Hybriden 11.Blocker molecules 6 that are not complementary to target sequences 4 are essentially unable to bind to the target sequence 4 on a detectable target strand 3 enter and are not identical to capture molecules, and the binding sites of the target sequences 4 remain essentially free for the formation of capture target sequence hybrids 11 ,

Im wesentlichen keine Bindungen ausbilden oder eingehen bedeutet im Rahmen der Erfindung, dass von einer Komplementarität zwischen den jeweiligen Sequenzen derart stark abgewichen wird, dass kein stabiles Hybrid möglich ist. Andererseits bedeutet komplementär nicht, dass eine perfekte Komplementarität vorliegen muss, so dass eine Komplementarität zwischen Sequenzen weitgehend nicht gegeben ist, dass aber dennoch eine teilweise Komplementarität vorliegen kann.Essentially form no bonds In the context of the invention, entering or entering means that there is a complementarity between the respective sequences are deviated so much that no stable hybrid possible is. On the other hand, complementary does not mean that a perfect one complementarity must be present, so that a complementarity between sequences largely it is not the case that there is still partial complementarity can.

Blocker-Moleküle 6, die mit detektierbaren Strängen 3 Hybridmoleküle 8 ausbilden, in denen die darin eingegangenen Blocker-Moleküle die Zielsequenz 4 in eine räumliche Ausrichtung zwingen, die eine Reaktion mit Fänger-Molekülen 10 erleichtern, sind besonders vorteilhaft im Rahmen der Erfindung.Blocker molecules 6 that with detectable strands 3 hybrid molecules 8th form in which the blocker molecules entered into the target sequence 4 in a spatial orientation, forcing a reaction with catcher molecules 10 facilitate, are particularly advantageous in the context of the invention.

Durch einzelne oder mehrere der oben genannten Maßnahmen kann das Gleichgewichtssystem im Sinne der Erfindung positiv beeinflusst werden.By one or more of the above measures mentioned can positively influence the equilibrium system in the sense of the invention become.

Die jeweiligen Blocker-Moleküle 6 können vor oder nach einer PCR-Reaktion einem Reaktionsgemisch hinzugefügt werden. Wenn Blocker-Moleküle 6 vor Durchführung einer PCR-Reaktion einem Reaktionsgemisch zugesetzt werden, sind die Blocker-Moleküle derart modifiziert, dass sie an der Reaktion nicht teilnehmen, zum Beispiel in dem als 3'-endige Base ein Didesoxynukleotid-Molekül vorgesehen ist, damit der Blocker nicht als Primer wirkt, und am 5'-Ende eine entsprechende Modifikation vorgesehen ist, die ein eventuelles Strang-Displacement verhindert.The respective blocker molecules 6 can be added to a reaction mixture before or after a PCR reaction. If blocker molecules 6 are added to a reaction mixture before carrying out a PCR reaction, the blocker molecules are modified such that they do not take part in the reaction, for example in which a dideoxynucleotide molecule is provided as the 3'-end base, so that the blocker is not used as a primer acts, and a corresponding modification is provided at the 5 'end, which prevents a possible strand displacement.

Weil in erfindungsgemässen Verfahren insgesamt weniger Probenmaterial ausreicht, um Nukleinsäuren nachzuweisen, werden bei vorgeschalteten PCR-Reaktionen weniger Zyklen benötigt, wodurch das zur Verfügung stehende, zu analysierende Material weniger fehlerbehaftet ist. Dies stellt eine Verbesserung der Spezifität, bzw. eine Verringerung der Fehleranfälligkeit solcher Nachweisreaktionen dar.Because less sample material is sufficient to detect nucleic acids in the method according to the invention, fewer cycles are required in the case of upstream PCR reactions, as a result of which the available material to be analyzed is less prone to errors. This represents an improvement in the Specificity, or a reduction in the susceptibility to errors of such detection reactions.

Darüber hinaus kann ein Waschen, wie es bei herkömmlichen Verfahren in der Regel unumgänglich ist, entfallen, wodurch Online-Messungen ermöglicht werden.In addition, a wash, like conventional ones Procedure is usually inevitable omitted, which enables online measurements.

Die gebildeten Fänger-Zielsequenz-Hybride 11 werden dann mittels allgemein üblicher Detektionsmethoden, z.B. spektroskopischer Methoden wie der Fluoreszenzspektroskopie, oder anderer Methoden wie der Radiometrie oder der Elektrophorese nachgewiesen. Zu Detektionszwecken können die Nukleinsäurestränge 2 und/oder 3 mit Markierungen versehen sein, die der jeweiligen Detektionsmethode dienlich ist. Dies kann durch Einbau entsprechend markierter Nukleotidbausteine während einer PCR-Amplifikation von Nukleinsäure-Einzelsträngen geschehen, oder durch Verwendung entsprechend markierter Primer und nicht markierter Primer im Rahmen einer PCR-Amplifikation der Nukleinsäure-Einzelstränge. An fester Phase ausgebildete Hybride lassen sich ferner grundsätzlich auch durch elektronische Impedanzmessungen nachweisen. Dem Fachmann steht hier eine Vielzahl von Verfahren und ggf. notwendigen Markierungen zur Verfügung.The catcher target sequence hybrids formed 11 are then detected using generally conventional detection methods, for example spectroscopic methods such as fluorescence spectroscopy, or other methods such as radiometry or electrophoresis. The nucleic acid strands can be used for detection purposes 2 and or 3 be provided with markings that are useful for the respective detection method. This can be done by incorporating appropriately labeled nucleotide building blocks during PCR amplification of single nucleic acid strands, or by using appropriately labeled primers and unlabeled primers as part of a PCR amplification of the single nucleic acid strands. Hybrids formed on a solid phase can also be fundamentally detected by means of electronic impedance measurements. A large number of methods and any necessary markings are available to the person skilled in the art.

Zum besseren Verständnis der Erfindung wird diese im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiel näher erläutert.To better understand the Invention is explained in more detail below using an exemplary embodiment.

Ausführungsbeispielembodiment

Im folgenden Ausführungsbeispiel wird Bezug auf das Sequenzprotokoll genommen, das Teil der Beschreibung ist, und in dem ein Abschnitt des Plasmids pGEM3-Zf, (Seq.-Nr. 1), zwei Primer (Seq.-Nr. 2 und 3), zwei Blocker-Moleküle (Seq.-Nr. 4 und 5) und eine Fänger-Molekülsequenz (Seq.-Nr. 6) angegeben sind.In the following embodiment, reference is made to taken the sequence listing which is part of the description, and in which a section of the plasmid pGEM3-Zf, (Seq.No. 1), two primers (Seq.No. 2 and 3), two blocker molecules (Seq.No. 4 and 5) and one Capture molecule sequence (Seq.No. 6).

Das Sequenzprotokoll enthält folgenden freien Text nach WIPO-Standard Nr. 25:

The sequence listing contains the following free text according to WIPO Standard No. 25:

Um einen Abschnitt aus der DNA des Plasmids pGEM3_Zf nachzuweisen, dessen einer Strang die Sequenz mit der Sequenzidentitätsnummer (Seq.-Nr.) 1 des Sequenzprotokolls hat, wird entsprechendes Nukleinsäurematerial aus dem Plasmid mit einem nicht modifizierten und einem modifizierten Primer umgesetzt.To extract a section from the DNA of the To detect plasmids pGEM3_Zf, one strand of which is the sequence with the sequence identity number (Seq.No.) 1 of the sequence listing has the corresponding nucleic acid material from the plasmid with an unmodified and a modified Primer implemented.

Der Primer mit der Seq.-Nr. 2 ist ein nicht modifizierter Primer. Er bindet an zu der ersten in Seq.-Nr. 1 (2901 ... 2921) gekennzeichneten Primerbindungsstelle komplementäre Stellen.The primer with Seq.No. 2 is an unmodified primer. It connects to the first in Seq.-Nr. 1 (2901 ... 2921) marked primer binding site complementary sites.

Der Primer mit der Seq.-Nr. 3 ist ein modifizierter Primer. Er bindet an zu der zweiten in Seq.-Nr. 1 (3109 ... 3131) gekennzeichneten Primerbindungsstelle identische Stellen. Der modifizierte Primer ist mit einer Cy-3-Markierung versehen.The primer with Seq.No. 3 is a modified primer. It connects to the second one in Seq.-Nr. 1 (3109 ... 3131) marked primer binding site identical Put. The modified primer is labeled with a Cy-3 label.

Es wird eine PCR-Reaktion durchgeführt, aus der ein markiertes und ein nicht markiertes Amplifikationsprodukt resultieren. Das markierte Amplifikationsprodukt weist eine Zielsequenz (3068 ... 3087) auf, die komplementär zu der im Sequenzprotokoll bezeichneten Stelle der Seq.-Nr. 1 ist. Beide Amplifikationsprodukte weisen Blocker-Molekül-Bindungsstellen auf, die identisch mit oder komplementär zu der im Sequenzprotokoll bezeichneten Stelle der Seq.-Nr. 1 (3037 ... 3066) sind.A PCR reaction is carried out which is a labeled and an unlabeled amplification product result. The labeled amplification product has a target sequence (3068 ... 3087), which are complementary to that in the sequence listing designated place of Seq.-Nr. 1 is. Both amplification products have Blocker molecule binding sites identical to or complementary to that designated in the sequence listing Digit of the seq.no. 1 (3037 ... 3066).

Die Amplifikationsprodukte werden in folgenden Konzentrationen mit Blocker-Molekülen mit den Sequenzen Seq.-Nr. 4 und Seq.-Nr. 5 versetzt, die aus synthetischen Oligonukleotiden bestehen:
Beispiel Nr.
1 250 ng PCR-Produkt/keine Blocker-Moleküle
2 250 ng PCR-Produkt/500 ng Blocker-Moleküle
3 500 ng PCR-Produkt/keine Blocker-Moleküle
4 500 ng PCR-Produkt/500 ng Blocker-Moleküle
5 500 ng PCR-Produkt/1000 ng Blocker-MoleküleThe amplification products are in the following concentrations with blocker molecules with the sequences Seq.-Nr. 4 and Seq.No. 5 offset, which consist of synthetic oligonucleotides:
Example No.
1 250 ng PCR product / no blocker molecules
2 250 ng PCR product / 500 ng blocker molecules
3 500 ng PCR product / no blocker molecules
4,500 ng PCR product / 500 ng blocker molecules
5 500 ng PCR product / 1000 ng blocker molecules

Die Reaktionsgemische 1–5 werden auf DNA-Arrays aufgetragen, wie sie in 2a-e dargestellt sind. Die DNA-Arrays enthalten in Spalten und Reihen angeordnete Spots. Die Spalten sind von links nach rechts von 1–3 und die Reihen von oben nach unten von 1–3 nummeriert. Auf die jeweiligen Spots wird unter der Angabe Kolonne/Reihe Bezug genommen. Der Spot in 3/1 jedes Arrays ist ein Kontrollspot, der bei entsprechender Anregung durch Licht immer fluoresziert. Er enthält fluoreszierendes Oligonukleotidmaterial, das bereits bei der Herstellung des jeweiligen Arrays aufgespottet wird. Die Spots 2/3 und 3/3 jedes Arrays enthalten Fänger-Moleküle in einer Menge, die größenordnungsmäßig der Menge an Material entspricht, wie sie in den Kontrollspots aufgetragen ist.Reaction mixtures 1-5 are applied to DNA arrays as described in 2a - e are shown. The DNA arrays contain spots arranged in columns and rows. The columns are numbered 1-3 from left to right and the rows are numbered 1-3 from top to bottom. The respective spots are referred to under the column / row specification. The spot in 3/1 of each array is a control spot that always fluoresces when stimulated by light. It contains fluorescent oligonucleotide material that is spotted during the manufacture of the respective array. Spots 2/3 and 3/3 of each array contain capture molecules in an amount that is on the order of the amount of material as shown in the control spots.

Die Fänger-Moleküle umfassen eine Fänger-Sequenz mit der Seq.-Nr. 6, die Hybride mit im Sequenzprotokoll unter der Seq.-Nr.1 als „complement to target sequence" komplementären Sequenzen ausbilden kann. Diese Sequenzen sind Zielsequenzen, die im markierten PCR-Produkt enthalten sind. Die Entstehung von Hybriden zwischen Fänger-Molekülen und Zielsequenzen lässt sich daher durch Fluoreszenzmessung nachweisen. Die Grössenordnung der Intensitätswerte der jeweiligen Fluores zenz in einem Spot lässt eine Aussage über die relative Quantität der gebildeten Hybride zu.The capture molecules comprise a capture sequence with the seq. no. 6, the hybrid with in the sequence listing under the Seq.-Nr.1 as "complement to target sequence "complementary Can train sequences. These sequences are target sequences that are contained in the marked PCR product. The emergence of hybrids between capture molecules and Leaves target sequences therefore prove themselves by fluorescence measurement. The order of magnitude of the intensity values the respective fluorescence in a spot gives a statement about the relative quantity of the hybrid formed.

Die Fluoreszenzintensitäten in den relevanten Spots betragen folgende Werte:

The fluorescence intensities in the relevant spots are as follows:

Die angegebenen Helligkeitswerte sind relative Größen, wie sie von der Messelektronik ausgegeben werden. Je größer der Wert ist, desto höher ist die jeweilige Intensität.The specified brightness values are relative sizes, like they are output by the measuring electronics. The bigger the Value is the higher is the respective intensity.

Wie anhand der Figuren und der dazugehörenden Messwerte ersichtlich ist, sind die Spots 2/3 und 3/3 in den Beispielen 2 und 5 relativ zu den Beispielen 1, 3 und 4 am hellsten. In den Beispielen 1 und 3 wurden keine Blocker-Moleküle eingesetzt, in Beispiel 4 wurde eine im Vergleich zu Beispiel 5 geringe Menge Blocker-Moleküle, jeweils bezogen auf eine bestimmte Menge PCR-Produkt, eingesetzt. Man erkennt deutlich, dass die Intensitäten und damit die Mengen an nachweisbaren Hybriden in den Beispielen 2 und 5 am höchsten sind. Dies sind die Beispiele, in denen das erfindungsgemässe Verfahren angewandt wurde, und zwar bei einer jeweils vorgegebenen Menge PCR-Produkt.As can be seen from the figures and the associated measured values, spots 2/3 and 3/3 are in the examples 2 and 5 relative to the examples 1 . 3 and 4 the brightest. In the examples 1 and 3 no blocker molecules were used, in example 4 became one compared to example 5 small amount of blocker molecules, each based on a certain amount of PCR product, used. One can clearly see that the intensities and thus the amounts of detectable hybrids in the examples 2 and 5 are highest. These are the examples in which the method according to the invention was used, specifically for a given amount of PCR product.

SEQUENCE LISTING

SEQUENCE LISTING

Claims

Method for the detection of nucleic acids in a reaction mixture in the a) the reaction mixture blocker molecules ( 6 ) are added, b) double-stranded nucleic acid material ( 1 ) denatured into two types of complementary single nucleic acid strands, c) the blocker molecules ( 6 ) hybridize with at least a portion of at least one of the two types of single-stranded nucleic acid resulting from the denaturation, d) the reaction mixture with capture molecules ( 10 ) is linked, e) the capture molecules ( 10 ) each with a section ( 4 ) a nucleic acid to be detected ( 3 ) to capture target sequence hybrids ( 11 ) react, and f) formed capture target sequence hybrids ( 11 ) can be detected by detection.

A method according to claim 1, characterized in that many different nucleic acids be proven at the same time.

Method according to one of claims 1-2, characterized in that the capture molecules ( 10 ) on a fixed phase ( 9 ) are bound.

A method according to claim 3, characterized in that the solid phase ( 9 ) and the capture molecules on it ( 10 ) form a DNA array.

Method according to one of claims 1-2, characterized in that the capture molecules ( 10 ) are in solution.

A method according to claim 5, characterized in that the capture molecules ( 10 ) are bound to magnetic beads.

Method according to one of claims 1-6, characterized in that the blocker molecules ( 6 ) are used in molar excess to the nucleic acid single strands.

A method according to claim 7, characterized in that the excess of blocker molecules ( 6 ) is so large that essentially no nucleic acid double strands ( 1 ) more in the reaction mixture.

A method according to claim 7, characterized in that the formation of hybrids ( 8th ) from blocker molecules ( 6 ) and detectable nucleic acid single strands ( 3 ) in competition with the formation of secondary structures ( 5 ) of the nucleic acid single strands ( 3 ) stands.

Method according to one of claims 1-9, characterized in that only the same blocker molecules are used.

Method according to one of claims 1-9, characterized in that several different blocker molecules are used in it become.

Method according to one of claims 1-11, characterized in that the blocker molecules ( 6 ) Blocker molecules ( 6e ) include the hybrid ( 7 ) with nucleic acid single strands to be eliminated ( 2 ) train.

Method according to one of claims 1-12, characterized in that the blocker molecules ( 6 ) Blocker molecules ( 6d ) include the hybrid ( 8th ) with detectable nucleic acid single strands ( 3 ) train.

Method according to one of claims 1-13, characterized in that the to carry out reaction mixture used in the method from a PCR reaction results.

Method according to one of claims 1-14, characterized in that the reaction mixture after step b) is subjected to a PCR reaction in which the double-stranded nucleic acid material ( 1 ) is amplified.

Method according to one of claims 1-15, characterized in that the blocker molecules ( 6 ) are formed from nucleic acid material.

A method according to claims 1-16, characterized in that the blocker molecules ( 6 ) are formed from synthetic oligonucleotides.

A method according to claims 1-17, characterized in that the blocker molecules ( 6 ) are formed from DNA, cDNA, RNA, tRNA, mRNA, LNA, aRNA or PNA.

Method according to one of claims 1-18, characterized in that the blocker molecules ( 6 ) are made up of amino acids.

A method according to claim 19, characterized in that the blocker molecules ( 6 ) also have nucleic acids.

Method according to one of claims 1-20, characterized in that in the nucleic acid single strands ( 2 . 3 ) Markers are installed.

Method according to one of claims 1-21, characterized in that in the nucleic acid single strands ( 3 ), the catcher target sequence hybrid ( 11 ) train, markers are installed.

Method according to one of claims 19 or 22, characterized in that that the marking agents are fluorescent agents, magnetic means, radioactive means, and / or by means of mass spectrometry Means provable means.

Method according to one of claims 19 or 22, characterized in that that the marking means by means of a corresponding method be detected.

Method according to one of claims 19 or 22, characterized in that that detection using fluorescence microscopy, magnetometry, Measurement or detection of radioactivity, or by means of mass spectrometry he follows.

Method according to one of claims 1-23, characterized in that that the detection takes place by means of electrical measurement.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the blocker molecules ( 6 ) essentially no bonds with capture molecules ( 10 ) can enter.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the blocker molecules ( 6 ) essentially no ties with sections ( 4 ) can enter into a single strand of nucleic acid, which with capture molecules ( 10 ) can react.