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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zum Aufbringen eines Probenfilms auf einen Probenträger für eine nachfolgende
spektroskopische Analyse, bei dem eine Probenmenge in flüssigem Zustand
auf eine Probenposition auf den Probenträger aufgebracht und anschließend zu
dem Probenfilm getrocknet wird.
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Ein solches Verfahren ist allgemein
durch seine Anwendung bekannt.
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Im Rahmen der spektroskopischen Probenanalyse,
insbesondere im Rahmen der Schwingungsspektroskopie, wie beispielsweise
der IR-, NIR-, Raman-Spektroskopie, dient das eingangs genannte Verfahren
zur Probenvorbereitung für
die nachfolgende spektroskopische Analyse.
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Die auf den Probenträger aufzubringenden Proben
können
beispielsweise biologische Flüssigkeiten
wie Serum, Urin, suspendierte Zellen, Zellkulturmedien usw. oder
in Wasser gelöste
Analyten sein, die nachfolgend IR-spektroskopisch analysiert und
insbesondere quantifiziert werden sollen.
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Aufgrund der hohen Eigenabsorption
von einigen Lösungsmitteln
im infraroten (IR) Spektralbereich wird die auf den Probenträger in flüssigem Zustand
aufgebrachte Probenmenge vor der spektroskopischen Messung zu einem
Probenfilm getrocknet. Im Idealfall bilden sich dabei homogene Probenfilme, d.h.
Probenfilme, die eine einheitliche Schichtdicke aufweisen, so daß das Gesetz
von Lambert-Beer gültig
ist. Dieses Verfahren des Aufbringens eines Probenfilms durch Trocknen
einer flüssig
aufgebrachten Probenmenge ist jedoch für viele Lösungsmittel, insbesondere Wasser,
ungeeignet, weil der durch Trocknung entstehende Probenfilm keine über die
Fläche der
Probenposition einheitliche Schichtdicke besitzt, sondern zum Rand
hin eine größere Schichtdicke
besitzt als im Zentrum. Dieses Phänomen wird nachfolgend mit
Bezug auf 3 und 4 erläutert.
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In 3 ist
ein Probenträger 1 dargestellt, der
eine Probenposition A aufweist, auf die eine Probenmenge 2 im
flüssigen
Zustand aufgebracht wurde. Die Probenmenge weist typischerweise
ein Volumen von 1–100 μl auf, während die
Probenposition A einen Durchmesser von etwa 1–20 mm aufweist. Die Probenposition
A ist derjenige Bereich des Probenträgers, der bei der nachfolgenden
spektroskopischen Analyse im Falle beispielsweise der IR-Spektroskopie
von dem Lichtstrahl ausgeleuchtet wird.
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Wird nun die Probenmenge, wie in 3 dargestellt, in einem
Tropfen auf die Probenposition A des Probenträgers 1 gleichmäßig verteilt
aufgebracht, bildet die flüssige
Probenmenge auf dem Probenträger 1 unabhängig davon,
ob das Aufbringen manuell mit der Pipette oder mit Hilfe eines Pipettierautomaten
durchgeführt
wird, auf der Probenposition im Schnitt in etwa die Form eines Halbovals.
Die Oberflächenspannung
der flüssigen
Probenmenge bestimmt dabei die genaue Form des Halbovals.
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Nach der Trocknung der Probenmenge 2 bleibt
ein Probenfilm 3 zurück,
der an den Rändern deutlich
dicker ist als im Zentrum, wie in 4 dargestellt
ist. Der Probenfilm 3 weist demnach ein kraterähnliches
Aussehen auf. Dieser Kraterbildungseffekt ist besonders ausgeprägt, wenn
als Lösungsmittel
für die
Probe Wasser verwendet wird. Die Schichtdicke des entstandenen Probenfilms 3 ist
somit über die
Probenposition A gesehen nicht homogen.
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Es hat sich herausgestellt, daß bei Mehrfachaustragung
derselben Probe und derselben Probenmenge auf mehrere Probenpositionen
die nach Trocknung entstandenen Probenfilme zudem oft unterschiedliche
Gestalt aufweisen. Das bekannte Verfahren zum Aufbringen eines Probenfilms
auf einen Probenträger
hat somit nicht nur eine Inhomogenität der Schichtdicke eines jeden
Probenfilms für
sich zur Folge, sondern auch, daß bei einer spektroskopischen
Analyse aus mehreren Probenfilmen, die von derselben Probe hergestellt
wurden, sehr unterschiedliche Spektren erhalten werden, die sich
insbesondere in der Signalintensität deutlich unterscheiden können. Das
bekannte Verfahren hat daher den Nachteil, daß die Probenfilme nicht eindeutig
reproduzierbar hergestellt werden können.
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe
zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art dahingehend weiterzubilden,
daß die
vorstehend genannten Nachteile vermieden werden, und daß insbesondere
Probenfilme derselben Probe so reproduzierbar hergestellt werden
können,
daß die
nachfolgende spektroskopische Analyse verläßliche Ergebnisse liefert.
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe hinsichtlich
des eingangs genannten Verfahrens dadurch gelöst, daß die flüssige Probenmenge in einer Vielzahl
von Teilmengen auf die Probenposition aufgebracht wird, derart,
daß sich
die einzelnen Teilmengen auf der Probenposition vor der Trocknung
gegenseitig nicht berühren.
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Anstatt nun wie bei der herkömmlichen
Vorgehensweise eine Probenmenge in einem Schritt gleichmäßig auf
die das spätere
Meßareal
der spektroskopischen Analyse bildende Probenposition zu verteilen,
ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen,
eine flüssige
Probenmenge in einer Vielzahl von Teilmengen, d.h. in kleinen Portionen, derart
auf die Probenposition des Probenträgers aufzubringen, daß sich die
einzelnen Teilmengen der Probenmenge gegenseitig nicht berühren. Auf
die Probenposition werden demnach eine Vielzahl kleiner disjunkter
Tröpfchen
der Probe aufgebracht, die dann zu dem Probenfilm trocknen, ohne
sich gegenseitig zu vermischen. Bei jeder dieser Teilmengen tritt zwar
nach ihrer Trocknung der zuvor beschriebene Kraterbildungseffekt
auf, da jedoch eine Vielzahl solcher Teilmengen auf der Probenposition
verteilt sind, mittelt sich dieser Kraterbildungseffekt über die
Fläche
der Probenposition gesehen aus, so daß der nach Trocknung der Teilmengen
auf der Probenposition entstehende Probenfilm über die Gesamtfläche der
Probenposition gesehen wesentlich homogener ist, als wenn die Probenmenge
als Ganzes in einem Schritt auf die Probenposition aufgetragen wird.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung
des Verfahrens werden die Teilmengen feinrasterartig mit maximaler
Belegungsdichte auf die Probenposition aufgebracht.
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Hierbei ist von Vorteil, daß der nach
Trocknung der Teilmengen entstehende Probenfilm durch die feinrasterartige
Anordnung der Teilmengen auf der Probenposition mit maximaler Belegungsdichte, ohne
daß sich
die Teilmengen miteinander vermischen, hinsichtlich seiner Schichtdicke
optimal homogen ist. Zur Aufbringung der Vielzahl der Teilmengen
in rasterartiger Anordnung können
handelsübliche
Pipettier-Roboter verwendet werden, die die vielen Teilmengen automatisiert
auf die Fläche
der Probenposition des Probenträgers
aufbringen, ohne daß diese
sich nach der Auftragung berühren
und miteinander verschmelzen.
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In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung betragen
die einzelnen Teilmengen im Bereich von 1/10.000 bis 1/10 der auf
die Probenposition aufzubringenden Probenmenge.
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Je kleiner die Teilmengen sind, desto
höher kann
die Belegungsdichte der Teilmengen auf der Probenposition sein und
desto homogener ist die Schichtdicke des nach Trocknung der Teilmengen entstehenden
Probenfilms.
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In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung wird
auf die Probenposition zunächst
eine erste Lage von Teilmengen aufgebracht, und nach dem Trocknen
der ersten Lage wird zumindest eine weitere Lage von Teilmengen
aufgebracht und getrocknet.
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Diese Maßnahme ist dann von Vorteil,
wenn die auf die Probenposition aufzubringende Probenmenge nicht
in einer Lage auf die Probenposition des Probenträgers aufgebracht
werden kann. Diese Maßnahme
hat darüber
hinaus den Vorteil, daß insgesamt
eine größere Probenmenge
auf die Probenposition des Probenträgers aufgebracht werden kann,
um die Sensitivität
der nachfolgenden spektroskopischen Untersuchung zu erhöhen.
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In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, wenn
die Teilmengen der zumindest einen weiteren Lage bezüglich der
Positionen der Teilmengen der ersten Lage versetzt auf die Probenposition
aufgebracht werden.
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Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß die Flächenbelegung
des Probenfilms auf der Probenposition des Probenträgers noch
weiter verbessert werden kann, d.h. daß auf der Probenposition keine
Areale verbleiben, auf denen kein Probenfilm vorhanden ist.
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Alternativ zu der vorstehend genannten
Ausgestaltung ist es auch bevorzugt, wenn die Teilmengen der zumindest
zweiten Lage auf die Position der Teilmengen der ersten Lage aufgebracht
werden.
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Diese Vorgehensweise hat den Vorteil,
daß es
beim Aufbringen der zweiten Lage von Teilmengen der Probenmenge
aufgrund der Anlösung
der bereits getrockneten ersten Lage nicht zu Verschmierungen bzw.
Vermischungen der Teilmengen der ersten Lage kommen kann, da sich
ein solches Anlösen und
Vermischen unter Umständen
als nicht kontrollierbar erweisen kann, wodurch die spektroskopische Analyse
beeinträchtigt
werden könnte.
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In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung wird
der Probenträger
vor, während
oder nach dem Aufbringen der Teilmengen erwärmt.
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Hierbei ist von Vorteil, daß das erfindungsgemäße Verfahren
insgesamt mit geringerem Zeitaufwand durchgeführt werden kann, insbesondere dann,
wenn die Probenmenge in mehreren Lagen von Teilmengen auf die Probenposition
des Probenträgers
aufgebracht wird. Durch das Erwärmen
des Probenträgers
kann die Trocknung der Teilmengen nämlich beschleunigt werden,
so daß insbesondere dann,
wenn mehrere Probenmengen auf verschiedene Probenpositionen eines
Probenträgers
aufgebracht werden, bereits mit dem Aufbringen der zweiten Lage
von Teilmengen auf der ersten Probenposition wieder fortgefahren
werden kann, nachdem gerade ei ne Lage von Teilmengen auf die letzte
Probenposition des Probenträgers
aufgebracht wurde.
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In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen wird
als Probenträger
eine Platte aus insbesondere IR-transparentem Material verwendet,
oder es wird als Probenträger
eine Platte vorzugsweise aus Metall oder mit metallischer Oberfläche verwendet,
deren Oberfläche
angerauht ist.
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Im ersteren Fall eignet sich das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Probenvorbereitung für
eine spektroskopische Analyse von Proben durch Messung in Transmission,
d.h. im Durchlicht durch den Probenträger, wobei für den Probenträger Materialien
wie Silizium, Zinkselenid, Calciumfluorid, Bariumfluorid, Talliumbromid
und Germanium verwendet werden können.
In dem zweiten Fall eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren
zur Probenvorbereitung für
eine spektroskopische Analyse vermittels Messung in diffuser Reflexion
an der aufgerauhten Oberfläche
des Probenträgers.
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Des weiteren eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren
insbesondere in Verwendung mit Mikrotiterplatten, die eine Vielzahl
von Probenpositionen aufweisen, beispielsweise 96, 384 oder 1536
Positionen.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
können
Probenfilme derselben Probe sehr homogen und reproduzierbar auf
den Probenträger
aufgebracht werden, so daß bei
Mehrfachaustragungen derselben Probe die in der nachfolgenden spektroskopischen
Untersuchung erhaltenen Spektren verläßliche und reproduzierbare
Ergebnisse liefern.
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Weitere Vorteile und Merkmale ergeben
sich aus der nachfolgenden Beschreibung und der beigefügten Zeichnung.
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Es versteht sich, daß die vorstehend
genannten und nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur
in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen
Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen
der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung
ist in der Zeichnung dargestellt und wird mit Bezug auf diese hiernach
näher beschrieben.
Es zeigen:
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1 eine
schematische Darstellung eines Probenträgers mit einer Vielzahl von
Probenpositionen in Draufsicht;
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2 eine
stark vergrößerte Darstellung
einer einzelnen Probenposition des Probenträgers in 1 in Draufsicht, an der das erfindungsgemäße Verfahren
veranschaulicht ist;
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3 eine
schematische Darstellung eines Probenträgers mit einer Probenposition,
bei der eine Probenmenge im flüssigen
Zustand nach der herkömmlichen
Methode aufgebracht wurde; und
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4 eine 3 vergleichbare Darstellung, nachdem
aus der flüssigen
Probenmenge in 3 ein
Probenfilm durch Trocknung nach dem herkömmlichen Verfahren entstanden
ist.
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In 1 ist
ein Probenträger 10 dargestellt, der
in Form einer Mikrotiterplatte mit insgesamt 96 Probenpositionen 12 ausgebildet
ist. Die Probenpositionen 12 sind in acht mit A bis H bezeichneten
Reihen und in zwölf
mit I bis XII bezeichneten Spalten angeordnet. Eine erste Probenposition "I A" ist mit dem Bezugszeichen 14,
und eine letzte Probenposition "XII
H" ist mit dem Bezugszeichen 16 versehen.
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Auf jeder der Probenpositionen 12 kann
ein Probenfilm in hiernach beschriebener Weise für eine nachfolgende spektroskopische
Analyse der Probe aufgebracht werden. Die nachfolgende spektroskopische
Analyse besteht dabei beispielsweise in einer Infrarot(IR)-, Nahinfrarot(NIR)-
oder Raman-spektroskopischen Analyse.
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Das hiernach beschriebene Verfahren
zum Aufbringen von Probenfilmen auf die Probenpositionen 12 des
Probenträgers 10 eignet
sich insbesondere für
Proben in wäßrigen Lösungen,
wie biologische Flüssigkeiten,
beispielsweise Serum, Urin, suspendierte Zellen, Zellkulturmedien
usw., oder in Wasser gelöste
Analyten, die nachfolgend beispielsweise durch IR-Spektroskopie
quantifiziert werden sollen.
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Je nachdem, ob die optische spektroskopische
Analyse in Transmission oder Reflexion, insbesondere diffuser Reflexion,
durchgeführt
werden soll, ist der Probenträger 10 zumindest
im Bereich der Probenpositionen 12 eine Platte aus insbesondere Infrarot-transparentem
Material oder weist eine angerauhte metallische Oberfläche auf.
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Um auf den Probenpositionen 12 Probenfilme
von nachfolgend spektroskopisch zu analysierenden Proben aufzubringen,
wird wie folgt am Beispiel der Probenposition 12 beschrieben
vorgegangen.
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Die auf die Probenposition 12 aufzubringende
Probenmenge wird im flüssigen
Zustand auf die Probenposition 12 aufgebracht, wobei diese
Probenmenge nicht auf einmal bzw. in einem Schritt, sondern in einer
Vielzahl von Teilmengen 18, wie in 2 dargestellt ist, auf die Probenposition 12 aufgebracht
wird, wobei sich die Teilmengen 18 gegenseitig nicht berühren und
somit nicht miteinander vermischen können. Diese Teilmengen 18 werden
dann auf der Probenposition 12 des Probenträgers 10 zu dem
Probenfilm getrocknet.
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Die einzelnen Teilmengen 18 stellen
kleine Portionen bzw. Tröpfchen
der auf die Probenposition 12 aufzubringenden Probenmenge
dar, die feinrasterartig angeordnet werden. Zum Aufbringen der einzelnen
Teilmengen 18 auf die Probenposition 12 kann ein
handelsüblicher
Pipettier-Roboter oder Mikro-Dispenser verwendet werden, der die
vielen Teilmengen 18 in Form kleiner Tröpfchen mit einem Einzelvolumen
von typischerweise 1 bis 500 nl automatisiert auf die gesamte Fläche der
Probenposition 12 des Probenträgers 10 aufbringt,
ohne daß sich
die Teilmengen 18 nach dem Aufbringen auf der Probenposition 12 berühren und
miteinander verschmelzen. Die sich aus den Teilmengen 18 ergebende
Probengesamtmenge beträgt
etwa 1 bis 100 μl.
Die Teilmengen 18 betragen einzeln etwa 1/10 bis 1/10.000
der Probengesamtmenge.
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Dabei werden die einzelnen Teilmengen
mit einer maximalen Belegungsdichte auf die Probenposition 12 aufgebracht.
Es sollte ein möglichst
großer Teil
der verfügbaren
Fläche
der Probenposition 12 von den Teilmengen 18 bedeckt
werden, die dann voneinander getrennt trocknen, d.h. ohne sich gegenseitig
zu berühren.
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Um eine maximale Beschickung der
Probenposition 12 mit der anschließend zu analysierenden Probe
zu erreichen, werden möglichst
kleine Volumina für
die Teilmengen 18 verwendet. Je kleiner die Teilmengen 18 bzw.
Volumina der Tröpfchen
sind, desto homogener wird die Schichtdicke des nach dem Trocknen
der Teilmengen 18 hergestellten Probenfilms.
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Sollte die auf die Probenposition 12 aufzubringende
Probenmenge nicht in einer Lage pipettierbar sein, kann zunächst eine
erste Lage von Teilmengen 18 auf die Probenposition 12 aufgebracht
und getrocknet werden, und nach dem Trocknen der ersten Lage dieser
Teilmengen 18 können
dann weitere Lagen von Teilmengen 18 aufgebracht und getrocknet
werden. Die eine oder mehreren weiteren Lagen an Teilmengen 18 werden
dabei möglichst
exakt auf die Positionen der Teilmengen 18 bzw. getrockneten Probenflecken
dieser Teilmengen 18 der ersten Lage aufgebracht, um eine
nicht kontrollierbare Vermischung von Teilmengen 18 der
ersten Lage zu bewirken, die sich durch eine Anlösung dieser Probenflecken durch
das Aufbringen der weiteren Lagen einstellen könnte.
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Auf diese Weise lassen sich sukzessive
beliebig dicke Schichtdicken erzeugen, wodurch die Empfindlichkeit
der nachfolgenden spektroskopischen Analyse gesteigert werden kann.
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Wieder mit Bezug auf 1 können
auf die vorstehend beschriebene Weise alle 96 Probenpositionen 12 des
Probenträgers 10 mit
Probenfilmen versehen werden. Dabei werden zunächst beginnend bei der Probenposition 14 oder
einer nachfolgenden Probenposition sukzessive alle Probenpositionen 12 bis
zur letzten Probenposition 16 mit einer ersten Lage von
Teilmengen 18 der jeweiligen Probenmenge der jeweiligen
zu untersuchenden Probe aufgebracht. Wenn die letzte Probenposition 16 in dieser
Weise erreicht ist, ist die erste Lage an Teilmengen 18 auf
der ersten Probenposition 14 bereits getrocknet, so daß bei der
Probenposition 14 direkt die zweite Lage an Teilmengen 18 der
jeweiligen Probenmenge der jeweiligen Probe aufgebracht werden kann.
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Dabei kann die Trocknungszeit für jede Aufbringung
optimal angepaßt
werden, indem der Probenträger 10 auf
eine bestimmte Temperatur erwärmt wird,
wodurch die Trocknung beschleunigt wird.