-
Die Erfindung betrifft die Nukleotid-
und Aminosäuresequenz,
sowie die Aktivität
und Verwendung des fluoreszierenden Proteins CGFP (fluorescence
protein of clytia gregaria).
-
Fluoreszierende Proteine
-
Eine Vielzahl an Coelenteraten sind
biolumineszent (Morin et al., 1974) und emittieren blaues oder grünes Licht.
Das 1962 als erstes Licht produzierendes Protein identifizierte
Aequorin aus Aequoria victoria (Shimomura et al., 1962) emittierte
als isoliertes Protein ein blaues Licht und nicht wie das phenotypisch
beobachtete grüne
Licht von Aequoria victoria. Später
konnte das grün
fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequoria victoria isoliert werden,
das Aufgrund der Anregung durch das Aequorin die Meduse phenotypisch
grün erscheinen
lässt (Johnson
et al, 1962; Hastings et al., 1969; Inouye et al, 1994).
-
Grün fluoreszierende Proteine
konnten aus unterschiedlichen Organismen isoliert werden. Hierzu
zählen
die Hydozoa (aquoria, halistaura obelia) und Anthropoden (acanthotilum,
sea cactus, cavernularia, renila, ptilosarcus, stylatula) (Morin
et al., 1971; Morin et al., 1971 II, Wampler et al., 1971, Wampler
et al., 1973, Cormier et al., 1973, Cormier et al., 1974, Levine
et al., 1982).
-
Eine Zusammenfassung einiger fluoreszierender
Proteine findet sich in Tabelle I:
-
Tabelle 1:
-
Übersicht über einige
fluoreszierende Proteine. Angegeben ist der Name, der Organismus
aus dem das Protein isoliert worden ist und die Identifikationsnummer
(Acc. No.) des Datenbankeintrages.
-
-
Die fluoreszierenden Proteine unterscheiden
sich nicht nur aufgrund ihrer Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sondern auch aufgrund
ihrer biochemischen und physikalischen Eigenschaften. Die spektralen Charakteristika
der fluoreszierenden Proteine können
sich sowohl auf der Exitations- als auch auf der Emmisionsseite
unterscheiden. Eine Übersicht
der Spektren der Fluoreszenz und der Anregungswellenlänge findet sich
in Tabelle 2.
-
Tabelle 2:
-
Übersicht über einige
fluoreszierende Proteine. Angegeben ist der Organismus aus dem das
Protein isoliert worden ist, die Anregungs- und Emissionswellenlängen, die
bei Spektralanalysen bestimmt worden sind.
-
Die Verwendung von fluoreszierenden
Proteinen wurde bereits zuvor beschrieben. Eine Übersicht findet sich in Tabelle
3:
-
Tabelle 3:
-
Übersicht über einige
fluoreszierende Proteine. Angegeben ist der Organismus aus dem das
Protein isoliert worden ist, der Name des fluoreszierenden Proteins
und eine Auswahl an Patenten bzw. Anmeldungen.
-
Es konnte gezeigt werden, dass durch
die Veränderung
der Aminosäuresequenz
von fluoreszierenden Proteinen die physikalischen und biochemischen
Eigenschaften verändert
werden können.
Beispiele von mutagenisierten fluoreszierenden Proteinen sind in
der Literatur beschrieben (Delagrave et al., 1995; Ehrig et al., 1995;
Heim et al., 1996).
-
Fluoreszierende Proteine finden bereits
in unterschiedlichsten Gebieten eine Anwendung. Die Verwendung von
fluoreszierende Proteinen beim 'Fluorescence
Resonance Energy Tranfer'(FRET), 'Bioluminescence Resonance
Energy Transfer (BRET) und anderen Energietransferverfahren wurde
bereits in der Literatur beschrieben (Mitra et al., 1996; Ward et
al., 1978; Cardullo et al, 1988; US patent no. 4,777,128; US patent no.
5,126,508; US patent no. 4,927,923; US patent no. 5,279,943). Weitere
Nicht-radioaktive Methoden zum Energietransfer mittels GFP wurden
in ebenfalls bereits beschrieben (PCT appl. WO 98/02571 and WO 97/28261)
-
Reportersysteme
-
Als Reporter- oder Indikatorgen bezeichnet
man generell Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer
oder histochemischer Methoden leicht nachweisen lassen. Man unterscheidet
mindestens 2 Typen von Reportergenen.
- 1. Resistenzgene.
Als Resistenzgene werden Gene bezeichnet, deren Expression einer
Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen verleiht,
deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt, wenn
das Resistenzgen fehlt.
- 2. Reportergen. Die Produkte von Reportergenen werden in der
Gentechnologie als fusionierte oder unfusionierte Indikatoren verwendet.
Zu den gebräuchlichsten
Reportergenen gehört
die beta-Galaktosidase (Alam et al., 1990), alkalische Phosphatase
(Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), Luciferasen und andere Photoproteine
(Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984).
-
Als Lumineszenz bezeichnet man die
Abstrahlung von Photonen im sichtbaren Spektralbereich, wobei diese
durch angeregte Emittermoleküle
erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie
nicht von Außen
in Form von Strahlung kürzerer
Wellenlänge
zugeführt.
-
Man unterscheidet Chemilumineszenz
und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz bezeichnet man eine chemische
Reaktion die zu einem angeregten Molekül führt, das selbst leuchtet, wenn
die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren.
Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von
Biolumineszenz. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell
als Luziferasen bezeichnet.
-
Einordung der Spezies Clytia gregaria Cnidaria→Leptomedusae→Campanulariidae→ Clytia
gregaria
-
Die Spezies Clytia gregaria gehört zu den
Cnidaria, speziell zu den Medusen. Der biolumineszente bzw. fluoreszente
Phänotyp
wurde bereits 1998 beschrieben (Ward et al., 1998).
-
Isolierung der cDNA
-
Zur Untersuchung der fluoreszenten
Aktivität
der Spezies Clytia gregaria wurden Exemplare im Friday Harbor in
Washington State (USA) gefangen und in flüssigem Stickstoff gelagert.
Zur Herstellung der cDNA-Bibliothek wurde ausschließlich der
biolumineszente Ring eines Medusenexemplars verwendet. Zur Erstellung der
cDNA-Bibliotheken von Clytia gregaria, wurde die RNA nach der Methode
von Krieg (Krieg et al., 1996) durch Isothiocyanat isoliert.
-
Zur Herstellung der cDNA wurde eine
RT-PCR durchgeführt.
Hierzu wurden 10 μg
RNA mit Reverser Transkriptase (Superscribt Gold II) nach folgendem
Schema inkubiert:
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Die Reaktionsprodukte wurden zur
Inaktivierung der Polymerase für
30 Minuten bei 37°C
mit Proteinase K inkubiert und die cDNA mit Ethanol präzipitiert.
Die cDNA wurde in Wasser gelöst
und mit SfiI für
eine Stunde bei 37°C
inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden zur Abtrennung kleiner Fragmente
gelfiltriert. Die fraktionierte cDNA wurde anschließend in
den SfiI geschnittenen und dephosphorilierten λTriplEx2 Vector ligiert. Zur
Herstellung einer λ-Phagen
Expressionsbank wurden die klonierten cDNA-Fragmente anschließend durch
das in vitro Verpackungssystem SMART cDNA Library Construction Kits
(Clontech) in λ-Phagen
verpackt.
-
Die Identifizierung der rekombinaten
Phagen, die eine cDNA Insertion mit potentieller Expression von fluoreszenten
Proteinen enthielten, wurde ein „library screening" durchgeführt.
-
Hierzu wurden Bakterienrasen aus
transformierten E. coli XL1-Blue auf 90 mm Kulturschalen plattiert und
für 12–15 Stunden
bei 31°C
inkubiert. Die Induktion der Proteinexpression durch die Zugabe
von 60 μl
einer 20 mM IPTG (Isopropythiogalactoside) Lösung auf die Platten gestartet.
Nach einer Inkubation 24 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Platten
für 72
Stunden bei 4 °C
gelagert. Anschliessend erfolgte die Messung der Fluoreszenz.
-
Hierzu wurden die Bakterien mit einem
Argon-Laser (LGN502) mit 100 mV bei 488 nm oder 366 nm (UVL21) bestrahlt.
Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines 510 nm ZSV Filters
gemessen.
-
Zur Isolierung der Klone und spektralen
Analyse wurde die Biomasse der Fluoreszenz positiven Klone von den
Kulturplatten entfernt und in PBS (phosphate buffed saline) resuspendiert.
Der Zellaufschluss erfolgte durch Ultraschall. Nach der Klärung des
Lysates durch Zentrifugation wurde die Fluoreszenz des Überstandes im
Fluorometer bestimmt.
-
Es wurde ein fluoreszierendes Protein
identifiziert. Das fluoreszierende Protein wurde als CGFP (fluorescence
protein of clytia gregaria) bezeichnet. Im Folgenden wird das fluoreszierende
Protein CGFP im einzelnen dargestellt.
-
CGFP
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
zeigt die höchste
Homologie auf Aminosäureebene
zu GFP aus Aequoria mit einer Identität von 44 % (gezeigt in Beispiel
8; 5). Auf Nukleinsäureebene
liegt die Identität unter
30 % (gezeigt in Beispiel 9;
-
6).
Zum Sequenzvergleich wurde das BLAST-Verfahren verwendet (Altschul
et al., 1997).
-
Die Erfindung betrifft auch funktionelle Äquivalente
von CGFP. Funktionelle Äquivalente
sind solche Proteine, die vergleichbare physikochemische Eigenschaften
haben und mindestens 70 % homolog sind. Bevorzugt ist eine Homologie
von 80 % oder 90 %. Besonders bevorzugt ist eine Homologie von 95
%.
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich als Reportergen für
zelluläre
Systeme speziell für
Rezeptoren, für
Ionenkanäle,
für Transporter,
für Transkriptionsfaktoren
oder für
induzierbare Systeme.
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich als Reportergen in bakteriellen und eukaryotischen Systemen
speziell in Säugerzellen,
in Bakterien, in Hefen, in Bakulo, in Pflanzen Das fluoreszierende
Protein CGFP eignet sich als Reportergene für zelluläre Systeme in Kombination mit
biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen speziell Systemen
mit Luziferasen, mit Oxygenasen, mit Phosphatasen.
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich als Markerprotein, speziell bei der FACS (Fluorescence activated
cell sorter) Sortierung.
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich als Fusionsprotein speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter,
für Transkriptionsfaktoren,
für Proteiasen,
für Kinasen,
für Phosphodiesterasen,
für Hydrolasen,
für Peptidasen,
für Transferasen,
für Membranproteine,
für Glykoproteine.
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich zur Immobilisierung speziell durch Antikörper, durch
Biotin, durch magnetische oder magnetisierbare Träger.
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich als Protein für
Systeme des Energietransfers speziell der FRET – (Fluorescence Resonance Energy
Transfer) ,BRET – (Bioluminescence
Resonance Energy Transfer), FET (field effect transistors), FP (fluorescence
polarization), HTRF (Homogeneous time-resolved fluorescence) Systemen.
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Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich als Markierung von Substraten oder Liganden speziell für Proteasen,
für Kinasen,
für Transferasen.
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Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich zur Expression in bakteriellen Sytemen speziell zur
Titerbestimmung, als Substrate für
biochemische Systeme speziell für
Proteinasen und Kinasen.
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich als Marker speziell gekoppelt an Antikörper, gekoppelt an
Enzyme, gekoppelt an Rezeptoren, gekoppelt an Ionenkanäle und andere
Proteine.
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich als Reportergen bei der pharmakologischen Wirkstoffsuche
speziell im HTS (High Throughput Screening).
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich als Komponente von Detektionssystemen speziell für ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assay), für Immunohistochemie, für Western-Blot,
für die
konfokale Mirkoskopie.
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Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich als Marker für
die Analyse von Wechselwirkungen speziell für Protein-Protein-Wechselwirkungen,
für DNA-Protein-Wechselwirkungen,
für DNA-RNA-Wechselwirkungen,
für RNA-RNA-Wechselwirkungen,
für RNA-Protein-Wechslewirkungen
(DNA: deoxyribonucleic acid; RNA: ribonucleic acid;).
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich als Marker oder Fusionsprotein für die Expression in transgenen
Organismen speziell in Mäusen,
in Ratten, in Hamstern und anderen Säugetieren, in Primaten, in Fischen,
in Würmern,
in Pflanzen.
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Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich als Marker oder Fusionsprotein zur Analyse der Embryonalentwicklung.
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich als Marker über
einen Kopplungsvermittler speziell über Biotin, über NHS
(N-hydroxysulfosuccimide), über
CN-Br.
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Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich als Reporter gekoppelt an Nukleinsäuren speziell an DNA, an RNA.
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Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich als Reporter gekoppelt an Proteine oder Peptide.
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Das an Nukleinsäuren oder Peptiden gekoppelte
fluoreszierende Protein CGFP eignet sich als Sonde speziell für Northern-Blots,
für Southern-Blots,
für Western-Blots,
für ELISA,
für Nukleinsäuresequenzierungen,
für Proteinanalysen,
Chip-Analysen.
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich Markierung von pharmakologischen Formulierungen speziell
von infektiösen
Agentien, von Antikörpern,
von „small
molecules".
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich für
geologische Untersuchungen speziell für Meeres-, Grundwasser- und
Flussströmungen.
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich zur Expression in Expressionssystemen speziell in in-vitro
Translationssystemen, in bakteriellen Systemen, in Hefen Systemen,
in Bakulo Systemen, in viralen Systemen, in eukaryotischen Systemen.
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich zur Visualisierung von Geweben oder Zellen bei chirurgischen
Eingriffen speziell bei invasiven, bei nicht-invasiven, bei minimal-invasiven.
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
eignet sich auch zur Markierung von Tumorgeweben und anderen phänotypisch
veränderten
Geweben speziell bei der histologischen Untersuchung, bei operativen
Eingriffen.
-
Die Erfindung betrifft auch die Reinigung
des fluoreszierenden Proteins CGFP speziell als wildtyp Protein,
als Fusionsprotein, als mutagenisiertes Protein.
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Die Erfindung betrifft auch die Verwendung
des fluoreszierenden Proteins CGFP auf dem Gebiet der Kosmetik speziell
von Badezusätzen,
von Lotionen, von Seifen, von Körperfarben,
von Zahncreme, von Körperpudern.
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Die Erfindung betrifft auch die Verwendung
des fluoreszierenden Proteins CGFP zur Färbung speziell von Nahrungsmitteln,
von Badezusätzen,
von Tinte, von Textilien, von Kunststoffen.
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Die Erfindung betrifft auch die Verwendung
des fluoreszierenden Proteins CGFP zur Färbung von Papier speziell von
Grußkarten,
von Papierprodukten, von Tapeten, von Bastelartikeln.
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Die Erfindung betrifft auch die Verwendung
des fluoreszierenden Proteins CGFP zur Färbung von Flüssigkeiten
speziell für
Wasserpistolen, für
Springbrunnen, für
Getränke,
für Eis.
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Die Erfindung betrifft auch die Verwendung
des fluoreszierenden Proteins CGFP zur Herstellung von Spielwaren
speziell von Fingerfarbe, von Schminke.
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Die Erfindung bezieht sich desweiteren
auf Nukleinsäuremoleküle, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus
- a) Nukleinsäuremolekülen, die
das Polypeptid offenbart durch SEQ ID NO: 2 kodieren;
- b) Nukleinsäuremolekülen, welche
die durch SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz enthalten;
- c) Nukleinsäuremolekülen, deren
komplementärer
Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a)
oder b) unter stringenten Bedingingen hybridisiert und welche die
biologische Funktion eines fluoreszierenden Proteins aufweisen;
- d) Nukleinsäuremolekülen, welche
sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c)
genannten unterscheiden;
- e) Nukleinsäuremolekülen, welche
eine Sequenzhomologie von mindestens 95% zu SEQ ID NO: 1 zeigen, und
welche die biologische Funktion eines fluoreszierenden Proteins
aufweisen; und
- f) Nukleinsäuremolekülen, welche
eine Sequenzhomologie von mindestens 65% zu SEQ ID NO: 1 zeigen, und
welche die biologische Funktion eines fluoreszierenden Proteins
aufweisen.
-
Die Erfindung betrifft die oben genannten
Nukleinsäuremoleküle, bei
denen die Sequenz einen funktionalen Promotor 5' zur Sequenz enthält.
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Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle wie vorhergehend
beschrieben, die Bestandteil von rekombinanten DNA oder RNA Vektoren
sind.
-
Die Erfindung betrifft Organismen,
die einen solchen Vektor enthalten.
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Die Erfindung bezieht sich auf Oligonukleotide
mit mehr als 10 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die identisch
oder komplementär
zur DNA oder RNA Sequenz der CGFP Moleküle sind.
-
Die Erfindung betrifft fluoreszierende
Proteine, die durch die vorhergehend beschriebenen Nukleotidsequenzen
kodiert sind.
-
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren
zur Expression der erfindungsgemässen
fluoreszierenden Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen
oder in in vitro Expressionssystemen.
-
Die Erfindung betrifft auch Verfahren
zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemässen fluoreszierenden Polypeptides.
-
Die Erfindung bezieht sich auf Peptide
mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch
Antikörper
gegen die erfindungsgemässen
fluoreszierende Proteine erkannt werden.
-
Die Erfindung betrifft die Verwendung
der erfindungsgemässen
fluoreszierenden Proteine als Marker- und Reportergene, insbesondere
für die
pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.
-
Expression der erfindungsgemässen fluoreszierenden
Proteine
-
Als Expression bezeichnet man die
Produktion eines Moleküls,
das nach dem Einbringen des Gens in eine geeignete Wirtszelle die
Transcription und Translation des in einen Expressionsvektor klonierte
Fremdgen erlaubt. Expressionsvektoren enthalten die für die Expression
von Genen in Zellen von Prokaryoten oder Eukaryonten erforderlichen
Kontrollsignale.
-
Expressionsvektoren können prinzipiell
auf zwei verschiedene Weisen konstruiert werden. Bei den sogenannten
Transcriptionsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte
Protein als authentisches, biologisch aktives Protein synthetisiert.
Der Expressionsvektor trägt
hierzu alle zur Expression benötigten
5'- und 3'-Kontrollsignale.
-
Bei den sogenannten Translationsfusionen
wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als Hybridprotein
zusammen mit einem anderen Protein exprimiert, das sich leicht nachweisen
lässt.
Die zur Expression benötigten
5'- und 3'-Kontrollsignale inklusive es Startcodons
und eventuell ein Teil der für
die N-terminalen
Bereiche des zu bildenden Hybridproteins codierenden Sequenzen stammen
vom Vektor. Der zusätzliche
eingeführte
Proteinteil stabilisiert nicht nur in vielen Fällen das vom einklonierten
Fremdgen codierte Protein vor dem Abbau durch zelluläre Proteasen,
sondern lässt
sich auch zum Nachweis und zur Isolierung des gebildeten Hybridproteins
einsetzen. Die Expression kann sowohl transient, als auch stabil
erfolgen. Als Wirtsorganismen eignen sich sowohl Bakterien, Hefen,
Viren als auch eukaryotische Systeme.
-
Reinigung der erfindungsgemäßen fluoreszierenden
Proteine
-
Die Isolierung von Proteinen (auch
nach Überexpression)
wird häufig
als Proteinreinigung bezeichnet. Zur Proteinreinigung steht eine
Vielzahl an etablierten Methoden und Verfahren zur Verfügung.
-
Die Fest-Flüssig-Trennung ist eine Grundoperation
bei Proteinisolierungen. Sowohl bei der Abtrennung der Zellen vom
Kulturmedium als auch bei der Klärung
des Rohextraktes nach Zellaufschluss und Entfernung der Zelltrümmer, bei
der Abtrennung von Niederschlägen
nach Fällungen
usw. ist der Verfahrensschritt erforderlich. Er erfolgt durch Zentrifugation
und Filtration.
-
Durch Gewinnung intrazellulärer Proteine
muss die Zellwand zerstört
bzw. durchlässig
gemacht werden. Je nach Maßstab
und Organismus werden dazu Hochdruckhomogenisatoren oder Rührwerkskugel-
bzw. Glasperlenmühlen
eingesetzt. Im Labormaßstab
kommen u.a. mechanische Zellintegrationen und Ultraschallbehandlung
zum Einsatz.
-
Sowohl für extrazelluläre als auch
intrazelluläre
Proteine (nach Zellaufschluss) sind verschiedene Fällungsverfahren
mit Salzen (insbesondere Ammoniumsulfat) oder organischen Lösungsmitteln
(Alkohole, Aceton) eine schnelle und defiziente Methode zur Konzentration
von Proteinen. Bei der Reinigung intrazellulärer Proteine ist die Entfernung
der löslichen
Nucleinsäuren
erstrebenswert (Fällung
z.B. mit Streptomycin- oder Protaminsulfat. Bei der Gewinnung extrazellulärer Proteine
werden häufig
Träger
(z.B. Stärke,
Kieselgur) vor Zugabe der Fällungsmittel
zugesetzt, um besser handhabbare Niederschläge zu erhalten.
-
Für
die Feinreinigung stehen zahlreiche chromatographische und Verteilungsverfahren
zur Verfügung (absorptions-
und Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie,
Elektrophoresen. Eine Säulenchromatographie
wird auch im technischen Maßstab
angewandt. Für
den Labormaßstab
ist vor allem die Affinitätschromatographie
von Bedeutung, die Reinigungsfaktoren bis zu mehreren 100 pro Schritt ermöglicht.
-
Extrazelluläre Proteine fallen in relativ
verdünnten
Lösungen
an. Sie müssen
ebenso wie extrazelluläre Proteine
vor ihrer weiteren Verwendung konzentriert werden. Neben den schon
erwähnten
Verfahren hat sich – auch
im industriellen Maßstab – die Ultrafiltration
bewährt.
-
Anorganische Salze als Begleitstoffe
von Proteinen sind für
spezifische Anwendungen häufig
unerwünscht.
Sie können
u.a. durch Gelfiltration, Dialyse und Diafiltration entfernt werden.
-
Zahkeiche Proteine kommen als Trockenpräparate zum
Einsatz. Als Trocknungsverfahren sind die Vakuum-, Gefrier- und
Sprühtrocknung
von Bedeutung.
-
Nukleotid- und Aminosäuresequenzen
-
Das fluoreszierende Protein CGFP
wird durch die folgende Nukleotidsequenz codiert (SEQ ID NO: 1):
-
Diese Sequenzen finden sich im Sequenzlisting
wieder.
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Beschreibung der Figuren
-
Die 1 zeigt
die Plasmidkarte des Vektors pTriplEX2-CGFP .
-
Die 2 zeigt
die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-CGFP .
-
Die 3 zeigt
die transiente Expression von CGFP in CHO-Zellen im Expressionsvector pcDNA3-CGFP.
Die Figur zeigt die mikroskopische Aufnahme der transient transfizierten
Zellen bei einer Anregung von 480 nm und einer Emission von 520
nm.
-
Die 4 zeigt
die Exitation des CGFP und des Kontrolllysates
-
Die 5 zeigt
die Exitation des CGFP und des Kontrolllysates
-
Die 6 zeigt
das Aligment von CFGP, GFP (Aquoria) und GFP (Renilla) auf Aminosäureebene.
CGFP_Cly:
CGFP aus Clytia gregaria
GFP_Ren: GFP aus Renilla
GFP_Aeq.
GFP aus Aequoria
-
Die 7 zeigt
das Aligment von CFGP, GFP (Aquoria) und GFP (Renilla) auf Nukleinsäureebene.
CGFP_Cly:
CGFP aus Clytia gregaria
GFP_Ren: GFP aus Renilla
GFP_Aeq.
GFP aus Aequoria
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Beispiele
-
Beispiel 1
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Als Vektor zur Herstellung des im
folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pTriplEx2 der
Firma Clontech verwendet. Das Derivat des Vektors wurde als pTriplEx2-CGFP
bezeichnet. Der Vektor pTriplEx2-CGFP wurde zur Expression von CGFP
in bakteriellen Systemen verwendet.
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Die 1 zeigt
die Plasmidkarte des Vektors pTriplEX2-CGFP.
-
Beispiel 2
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Als Vektor zur Herstellung des im
folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pcDNA3.1(+)
der Firma Clontech verwendet. Das Derivat des Vektors wurde als
pcDNA3-CGFP bezeichnet. Der Vektor pcDNA3-CGFP wurde zur Expression
von CGFP in eukaryotischen Systemen verwendet.
-
Die 2 zeigt
die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-CGFP.
-
Beispiel 3
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Bakterielle Expression
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Die bakterielle Expression erfolgte
im E. coli Stamm BL21(DE3) durch Transformation der Bakterien mit
den Expressionsplasmiden pTriplEX2-CGFP und pTriplEX2. Die transformierten
Bakterien wurden in LB-Medium bei 37°C für 3 Stunden inkubiert und die
Expression für
4 Stunden durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von
1 mM induziert. Die induzierten Bakterien wurden durch Zentrifugation
geerntet, in PBS resuspendiert und durch Ultraschall aufgeschlossen.
Die Fluoreszenz wurde mit Hilfe eines Fluorometers bestimmt.
-
Beispiel 4
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Eukaryotische Expression
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Die konstitutive eukaryotische Expression
erfolgte in CF Transfektion der Zellen mit den Expressionsplasmiden
pcD pcDNA3.1(+) in transienten Experimenten. Hierzu wurden 10000
DMEM-F12 Medium auf 96 Loch Mikrotiterplatten plattiert und 37°C inkubiert.
Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Fugene 6 l Herstellerangaben.
Die transfizierten Zellen wurden über Nacht bei F12 Medium inkubiert.
Die Messung der Fluoreszenz erfolgte im Raumtemperatur.
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Die 3 zeigt
die Expression von CGFP in CHO-Zellen.
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Beispiel 5
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Spektrum des fluoreszierenden
Proteins CGFP
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Zur Messung des Emissionsspektrums
wurden E. coli BL21(DE3) und pTriplEX2-CGFP und pTriplEX2 transformiert.
Die Induktion eine Zugabe von 1 mM IPTG und einer Inkubation von
4 Stur Anschließend
wurden die Bakterien geerntet und in PBS resusp erfolgte durch Ultraschall.
Anschließend
erfolgte die Messung der Fluorometer.
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Die 4 zeigt
die Exitation des CGFP und des Kontrolllysates Die 5 zeigt die Emission des CGFP und des
Kontrolllysates
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Beipiel 6
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BLAST
-
Ergebnis einer BLAST-Analyse von
CFGP auf der Aminosäureebene.
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Beispiel 7
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BLAST
-
Ergebnis einer BLAST-Analyse von
CFGP auf Nukleinsäureebene.
-
Beispiel 8
-
Die 6 zeigt
das Aligment von CFGP, GFP (Aquoria) und GFP (Renilla) auf Nukleinsäureebene.
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Beispiel 9
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Die 7 zeigt
das Aligment von CFGP, GFP (Aquoria) und GFP (Renilla) auf Aminosäureebene.
-
Literatur/Patente
-
- US patent no. 4,777,128
- US patent no. 4,927,923
- US patent no. 5,162,508
- US patent no. 5,279,943
- US patent no. 5,958,713
- US patent no. 6,172,188
- US patent no. 6,232,107
- US patent no. 6,436,682
- WO 199623898
- WO 99711094
- WO 199728261
- WO 1998/02571
- WO 199949019
- WO 200071565
- WO 200134824
- WO 200168824
- WO 200257451
- Alam J, Cook JL. Reporter genes: application to the study of
mammalian gene transcription. Anal Biochem. 1990 Aug 1;188(2): 245–54
- Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui
Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997); Gapped
BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs;
Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402
- Cardullo et al. (1988) Detection of nucleic acid hybridization
by nonradiative fluorescence resonance energy transfer.; Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 85: 8790–8794
- Cormier, M.J., Hori, K., Karkhanis, Y.D., Anderson, J.M., Wampler,
J.E., Morin, J.G., and Hastings, J.W. (1973) Evidence for similar
biochemical requirements for bioluminescence among the coelenterates.
J. Cell. Physiol. 81, 291–298.
- Cormier, M.J., Hori, K., and Anderson, J.M. (1974) Bioluminescence
in coelenterates. Biochim. Biophys. Acta 346, 137–164.
- Cullen Bryan R., Malim Michael H., Secreted placental alkaline
phosphatase as a eukaryotic reporter gene. Methods in Enzymology.
216: 362ff
- Davenport, D. and Nicol, J.A.C. (1955) Luminescence in Hydromedusae.
Proc. R. Soc. B 144, 399–411.
- Delagrave et al., Red-shifted excitation mutants of the green
fluorescent protein, Bio/Technology 13(2): 151–154 (1995)
- Ehrig et al., Green-fluorescent protein mutants with altered
fluorence excitationspectra, FEBS Letters 367: 163–166 (1995)
- Hastings, J.W. and Morin, J.G. (1969) Comparative biochemistry
of calciumactivated photoproteins from the ctenophore, Mnemiopsis
and the coelenterates Aequorea, Obelia, and Pelagia. Biol. Bull.
137, 402.
- Heim et al., (1996) Engineering green fluorescent protein for
improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance
energy transfer, Current Biology 6(2): 178–182 (1996).
- Inouye S, Tsuji FI. (1994) Aequorea green fluorescent protein.
Expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant
protein. FEBS Lett 1994 Mar 21; 341(2-3): 277–80
- Johnson, F.H., Shimomura, O., Saiga, Y., Gershman, L.C., Reynolds,
G.T., and Waters, J.R. (1962) Quantum efficiency of Cypridina luminescence,
with a note on that of Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 60, 85–103.
- Krieg, S., Castles, C., Allred, D., Benedix, M., Fuqua S., RNA
from air-dried frozen sections for RT-PCR and differential display.
Biotechniques. 1996 Sep; 21(3): 425–8.
- Levine, L.D. and Ward, W.W. (1982) Isolation and characterization
of a photoprotein, "phialidin", and a spectrally
unique green-fluorescent protein from the bioluminescent jellyfish
Phialidium gregarium. Comp. Biochem. Physiol. 72B, 77–85.
- Mitra et al., Fluorescence resonance energy tranfer between
blue-emitting and redshifted excitation derivatives of the green
fluorescent protein, Gene 73(1): 13–17 (1996).
- Morin, J.G. and Hastings, J.W. (1971) Biochemistry of the bioluminescence
of colonial hydroids and other coelenterates. J. Cell. Physiol.
77, 305–311.
- Morin, J.G. and Hastings, J.W. (1971) Energy transfer in bioluminescent
system. J. Cell. Physiol. 77, 313–318.
- Phillips GN. Structure and dynamics of green fluorescent protein.
Curr Opin Struct Biol. 1997 Dec; 7(6): 821–7
- Shimomura O., Bioluminescence in the sea: photoprotein systems.
Symp Soc Exp Biol. 1985; 39: 351–72.
- Snowdowne KW, Borle AB. Measurement of cytosolic free calcium
in mammalian cells with aequorin. Am JPhysiol. 1984 Nov; 247(5 Pt
1): C 396–408.
- Ward, W.W. (1998) Biochemical and physical properties of green
fluorescent protein. In: Green Fluorescent Protein: Properties,
Applications, and Protocols (Chalfie, M. and Kain, S., eds) pp.
45–70.
Wiley-Liss, Inc.
- Ward et al., Energy Transfer Via Protein-Protein Interation
in Renilla Bioluminescence Photochemistry and Photobiology 27: 389–396 (1978).
- Wampler, J.E., Hori, K., Lee, J.W., and Cormier, M.J. (1971)
Structured bioluminescence. Two emitters during both the in vitro
and the in vivo bioluminescence of the sea pansy, Renilla. Biochemistry
10, 2903–2909.
- Wampler, J.E., Karkhanis, Y.D., Morin, J.G., Cormier, M.J. (1973)
Similarities in the bioluminescence from the Pennatulacea. Biochim.
Biophys. Acta 314, 104–109.
- Yang Te-Tuan, Sinai Parisa, Kitts Paul A. Kain Seven R., Quantification
of gene expression with a secreted alkaline phosphatase reporter
system. Biotechnique. 1997 23(6) 1110ff
-
-
