DE10311315A1

DE10311315A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von Biomolekülen

Info

Publication number: DE10311315A1
Application number: DE10311315A
Authority: DE
Inventors: Bernard Mandrand; Agnès DUPONT-FILLIARD
Original assignee: Apibio SAS
Current assignee: Apibio SAS
Priority date: 2003-03-14
Filing date: 2003-03-14
Publication date: 2004-09-30
Also published as: WO2004081566A2; US20070037153A1; EP1604042A2; ATE382713T1; DE602004011028T2; JP4625547B2; ES2298730T3; US7879594B2; JP2006520469A; WO2004081566A3; EP1604042B1; DE602004011028D1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion eines Zielbiomoleküls in einer Probe, umfassend zahlreiche Biomoleküle, wobei das Zielbiomolekül mit einem Anhang versehen ist, wobei dieser Anhang eine katalytisch aktive Einheit umfasst, die eine Reaktion katalysiert, die ein unlösliches Reaktionsprodukt erzeugt, das sich auf beweglichen, elektrisch leitfähigen Polymerketten abscheidet. Die Abscheidung auf diesen elektrisch leitfähigen Polymerketten verursacht eine Veränderung in deren Elektroleitfähigkeit, die elektroanalytischen Verfahren zugänglich ist. Die Erfindung betrifft des Weiteren einen Biochip, umfassend einen festen Träger mit grundsätzlich elektrisch leitfähigen Polymerketten, die darauf befestigt sind, und Sondenmoleküle, die an allen oder zahlreichen dieser Ketten, die gleich oder unterschiedlich sind, befestigt sind, weiter ein Segment dieser Sondenmoleküle, das in der Lage ist, spezifisch mit einem Segment der Zielbiomoleküle wechselzuwirken.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Zielbiomolekülen und Substanzproben, die eine Mehrzahl von Biomolekülen umfassen, und ein System zur Detektion derartiger Biomoleküle.
Die Detektion von Biomolekülen, beispielsweise genetischem Material von Pathogenen, oder Nukleinsäuresequenzen zur Detektion von infektiösen Krankheiten, Gen- und Krebsscreening wurde in der heutigen Biochemie und medizinischen Forschung immer wichtiger.
Beispielsweise bieten Verfahren, die Sonden auf Nukleinsäurebasis verwenden, einige Vorteile hinsichtlich konventioneller mikrobiologischer oder immunologischer Verfahren zur Detektion von Organismen, wie es von Nakamura und Bulund beschrieben wurde (J. Clinical Laboratory Analysis, 6, 73 – 83, 1992).
Die meisten bisher bekannten Verfahren basieren auf der Detektion von Signalen, die nach der Hybridisierung von Nukleinsäuresonden, beispielsweise nach verschiedenen Verstärkungsanordnungen, wie Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), Ligase-Ketten-Reaktion (LCR), transkriptionsbasierter Verstärkung, zyklischen Sondenreaktionen etc. erzeugt werden.
Die Sonden- oder Hybridisierungsassays basieren häufig auf dem Befestigen einer Oligonukleotidsonde an einer Oberfläche um ein Zielnukleinsäuremolekül aus einer Probe einzufangen. Das Befestigen dieser Sonde an der Oberfläche wird durch die Bildung von kovalenten Bindungen oder durch eine Vielzahl passiver Absorptionsmechanismen erzielt.
Die immobilisierte Sonde ist in der Lage, spezifisch mit den Zielmolekülen wechselzuwirken, beispielsweise mit Nukleinsäuresequenzen in Lösung. Diese Wechselwirkung und nachfolgende Hybridisierung ermöglicht die Detektion der Zielsubstanz über unterschiedliche Verfahren.
Das US Patent No. 6,355,429 offenbart eine optische Vorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit einer ersten Nukleinsäure in einer Probe, umfassend eine zweite Nukleinsäure, die komplementär zu der ersten Nukleinsäure ist und in der Lage ist mit der ersten Nukleinsäure unter Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren, wobei die zweite Nukleinsäure auf einem festem Träger immobilisiert ist und der feste Träger mit einer lichtreflektierenden Oberfläche ausgestattet ist, wobei die Hybridisierung der Probe mit der Zielnukleinsäure zu einer Veränderung in den lichtreflektierenden Eigenschaften führt, die als Mittel zur Detektion der Anwesenheit der Zielnukleinsäuren in der Probe verwendet werden.
Der letzte Assayschritt, um die optischen Eigenschaften der Oberfläche zu verändern, wird durch Abscheiden eines Enzymsubstrats erreicht, das große Moleküle durch eine enzymabhängige Reaktion auf die Oberfläche ablagert. Die Abscheidung bedingt eine sichtbare Farbänderung von gold nach purpurrot, die durch optische Messmethoden detektiert werden kann.
Das US Patent No. 6,096,825 offenbart die Verwendung von elektrisch leitenden und elektroaktiv funktionalisierten, konjugierten Polypyrrolpolymeren, die an einem ersten biologisches Molekül befestigt werden können. Diese Polypyrrolpolymere sind elektrisch leitfähig und bilden eine Elektrode. Das so befestigte erste biologische Molekül kann als Assay zur Detektion und/oder Extraktion eines zweiten biologischen Moleküls verwendet werden, das in der Lage ist, spezifisch mit dem ersten biologischen Molekül wechselzuwirken, wodurch es die Gesamtleitfähigkeit der „Polymerelektrode" ändert. Ein großer Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Veränderung des elektrochemischen Verhaltens im Vergleich zu einem Referenzpolymer so groß sein muss, dass die Gesamtempfindlichkeit eines derartigen Biochips verringert wird. Die Empfindlichkeit dieses Biochips ist auf die Größenordnung von 10¹¹ Moleküle/mL beschränkt.
Die WO 02/20838 offenbart ein Verfahren und ein System zur Detektion von Nukleinsäuresequenzen in Proben, die eine Mischung von Nukleinsäuren enthalten. Auf einer festen Oberfläche ist eine Sonde befestigt, umfassend ein Oligonukleotid, das komplementär zu einem Segment der Zielnukleinsäure ist,
und eine Probe, die nachfolgend mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wird, an die das Oligonukleotid gebunden ist, wodurch es der Sonde ermöglicht wird, an die Zielnukleinsäure zu binden; gefolgt von einer Inkubation der gebundenen Zielnukleinsäure mit vier Nukleotidarten und einem Replikationsbiokatalysator, der eine vielsträngige Nukleinsäureanordnung bildet, wobei mindestens eine der Nukleotidarten durch einen Marker gebunden ist und der Marker auf der vielsträngigen Nukleinsäureanordnung detektiert wird, wodurch indirekt die Zielnukleinsäure detektiert wird. Die Detektion wird durch eine Enzymaktion mit Substraten erzielt, die als Redoxpaar agieren und sich auf der Oberfläche des festen Trägers abscheiden, der als Überträger agiert und deshalb die elektrische Leitfähigkeit auf der Oberfläche, die als Elektrode dient, verringert.
Ein großer Nachteil dieses Verfahrens ist die Inkubation der gebundenen Zielnukleinsäure mit vier verschiedenen Nukleotidarten, sowie mit dem Replikationsbiokatalysator, was zu einer unnötigen Verkomplizierung des Detektionsschrittes führt. Weitere Nachteile folgen aus der Beschränkung des Verfahrens auf ausschließlich Nukleinsäuren. Biopolymere, die sich von Nukleinsäuren unterscheiden, wie beispielsweise Proteine, Peptide, Antikörper und ähnliches können in diesem Verfahren nicht verwendet werden. Des Weiteren ist die Elektrode gemäß WO 02/20838 eine planare, „zweidimensionale" Elektrode.

Deshalb war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verlässliches und flexibles Verfahren, mit hoher Empfindlichkeit für die optimierte Detektion von Biomolekülen in Proben, bereitzustellen.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Detektion eines Zielbiomoleküls in einer Probe, die zahlreiche Biomoleküle umfasst, gelöst, wobei das Zielbiomolekül mit einem Anhang versehen ist, und wobei dieser Anhang eine katalytisch aktive Einheit umfasst, die eine Reaktion katalysiert, die zu einem unlöslichen Reaktionsprodukt führt, wobei dieses Verfahren folgende Schritte umfasst:

a) das Bereitstellen eines festen Trägers, wobei ein Teil von einer Oberfläche dieses festen Trägers zahlreiche flexible, elektrisch leitenden Polymerketten trägt,
b) das Befestigen der Sondenbiomoleküle an den Polymerketten,
c) das In-Kontakt-bringen zwischen der Probe und dem festen Träger, umfassend das Sondenbiomolekül, wodurch ein Erkennungskomplex zwischen Sondenbiomolekül und einem Zielbiomolekül gebildet wird,
d) das Zusetzen einer im wesentlichen löslichen Erkennungsspezies,
e) die Umwandlung der Erkennungsspezies durch eine katalytische Aktivität der katalytisch aktiven Einheit in eine unlösliche Erkennungsspezies, die sich auf den Polymerketten abscheidet,
f) der Messung des Niederschlags.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wird die Messung des Niederschlags durch die Messung der elektrischen Leitfähigkeit der elektrisch leitenden Polymerketten erreicht. Jede Polymerkette bildet für sich eine „Mikroelektrode". Die Leitfähigkeit der Polymerketten korrelliert mit deren Flexibilität. Die Länge der Polymerkette kann im Bereich von 20–300 nm variieren, bevorzugt zwischen 30–200 nm und besonders bevorzugt zwischen 90–180 nm. Überraschenderweise bietet das erfindungsgemäße Verfahren deshalb die Möglichkeit, die Flexibilität der Polymerketten mit deren Leitfähigkeit zu korrelieren. Deshalb führt die Abscheidung der unlöslichen Erkennungsspezies zu einer Veränderung der Leitfähigkeit der Polymermikroelektrode, bestätigt und verstärkt die Bildung eines Erkennungskomplexes zwischen den Sondenbiomolekülen und den Zielbiomolekülen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Detektion von Zielbiomolekülen mit einer Empfindlichkeit von < 10⁸ Molekülen/mL. In einer Ausführungsform erfolgt Schritt a) und b) zum gleichen Zeitpunkt (d. h. die Synthese der Polymerkette und dem Befestigen von Biomolekülen an spezifische Stellen darauf). Aber es versteht sich, dass die Polymersynthese und das Befestigen der Biomoleküle auch zu unterschiedlichen Zeitpunkten erfolgen kann.

In einer weiteren spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Niederschlag farbig. Der farbige Niederschlag ist deshalb durch optische Mittel wie Kolorimetrie, UV/VIS Absorptionsspektroskopie und ähnlichem detektierbar.

Der Niederschlag ist in der Lage, mit den Polymerketten elektrostatisch wechselzuwirken. Diese Wechselwirkung bedingt bevorzugt eine Abnahme der Flexibilität der Polymerketten. Diese Abnahme der Flexibilität der Polymerketten ist mit einer korrespondierenden Abnahme der Leitfähigkeit korreliert, die Messtechniken zugänglich ist, die dem Fachmann bekannt sind.

Bevorzugt wird die Veränderung der Leitfähigkeit der Polymerketten durch ein Verfahren detektiert, das aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus amperometrischen Messungen, Differentialpulsvoltammetrie, Impedanzspektroskopie und Chromoamperometrie besteht. Besonders bevorzugt ist die Cyclovoltammetrie, die die Verwendung einer Ausstattung ermöglicht, die kostengünstig und leicht handhabbar ist. Im Allgemeinen ist die Wahl des geeigneten Messverfahrens abhängig von der gewünschten Anwendung und Empfindlichkeit.

Cyclovoltammetrie und Chromoamperometrie sind beispielsweise bevorzugt, wenn eine Ausstattung erforderlich ist, die klein ist, kostengünstige Systembausteine hat und einfach zu handhaben ist. Die Cyclovoltammetrie ist bei leitfähigen Polymerketten bevorzugt, die zusätzliche Elektronendonoren umfassen. Die Impedanzspektroskopie ist das Verfahren der Wahl, wenn ein extrem empfindliches Verfahren erforderlich ist.

Die Impedanzspektroskopie liefert Informationen über die Leitfähigkeit des untersuchten Systems. Die Cyclovoltammetrie, oder die Voltammetrie im allgemeinen untersucht die beteiligten elektrochemischen Reaktionen.

Falls das zu untersuchende System die Leitfähigkeit ändert, wie beispielsweise durch Beeinflussung der Leitfähigkeit von elektrisch leitenden Polymerketten, dann ist die Impedanzspektroskopie bevorzugt.

Es ist besonders bevorzugt, dass die katalytisch aktive Einheit ein Biokatalysator ist. Biokatalysatoren sind bevorzugt Enzyme, die eine breite Variation hinsichtlich ihrer chemischen Natur, Struktur und den zu katalysierenden Reaktionen aufweisen. Daher können sie im Hinblick auf spezifischen Anforderungen angepasst und ausgewählt werden. Des Weiteren katalysieren Enzyme eine große Vielfalt an biochemischen und chemischen Reaktionen ohne dabei verbraucht zu werden.

Nicht einschränkenden Beispiele für geeignete Enzyme sind beispielsweise Proteasen, Oxidasen, Reduktasen und Dehydrogenasen. Bevorzugt sind Peroxidasen. Besonders bevorzugt sind Alkalische Phosphatase, Glukoseoxidase, Acetylcholinesterase und Meerrettichperoxidase.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Anhang des Weiteren einen Biotin/Streptavidin- oder Biotin/Avidin- Komplex. Dies beruht auf der Tatsache, dass das Bindungspaar Biotin/Avidin oder Streptavidin in sehr vielen Details untersucht worden ist (siehe beispielsweise Livnah, O.; Bayer, E. A.; Wilchek, M.; Sussman, J. L. Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 1993, 90, 5076–5080). Es zeigt sich, dass die Stärke der Bindungswechselwirkung hauptsächlich enthalpiegetrieben ist. Biotin kann leicht in Biomoleküle wie Oligonukleotide, Peptide oder ähnliches eingeführt werden. Ein Enzym kann auch leicht an das Peptidskelett von Avidin oder Streptavidin gekoppelt werden. Das Biotin/Avidin- oder Biotin/Streptavidin-Paar mit seiner starken Bindungskraft wird dann in einem viel vorteilhafteren Weg gebildet, als wenn das Enzym direkt in das Zielbiomolekül eingeführt wird. Das letztere ist oft langwierig, liefert schlechte Ausbeuten und bietet nicht die Möglichkeiten, aus einer großen Vielzahl von unterschiedlichen Enzymen auszuwählen. Dies wird wesentlich besser durch die vorliegende Erfindung erreicht.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein einziges Sondenbiomolekül an jeder Polymerkette befestigt. Diese Anordnung führt zu einer erhöhten Flexibilität der Polymerketten. Das Abscheiden der Erkennungsspezies führt deshalb zu einer signifikanten Erniedrigung ihrer Flexibilität, abhängig von der An des Polymers. Dies kann sogar zu einer vollständigen Immobilisierung der Polymerketten führen. Die signifikante Abnahme der Flexibilität führt deshalb zu einer korrespondierenden, deutlichen Abnahme in deren Leitfähigkeit. Diese Abnahme ist leicht zu detektieren und erlaubt eine genauere Messung mit erhöhter Empfindlichkeit.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind mindestens zwei Sondenbiomoleküle an jeder Polymerkette befestigt. Die Sondenbiomoleküle sind entweder gleich oder unterschiedlich zueinander. Es ist verständlich, dass ebenfalls zahlreiche, d.h. mehr als zwei gleiche oder unterschiedliche Sondenbiomoleküle an einer Polymerkette befestigt werden können. Wiederum in einer anderen Ausführungsform sind zahlreiche Sondenbiomoleküle befestigt. Je mehr Sondenbiomoleküle an einer Polymerkette befestigt sind, desto mehr Niederschlag wird gebildet. Die geringere Signifikanz der Abnahme, aufgrund der abnehmenden Flexibilität der Polymerketten durch die zahlreichen Sondenbiomoleküle, wird durch eine Erhöhung der Menge an detektierbarem Niederschlag ausgeglichen, wodurch die Empfindlichkeit erhöht wird.

Der Ausdruck „Biomolekül", so wie er hier verwendet wird, bezeichnet jedes biologische Molekül in Form eines Polymers, wie Oligonukleotide, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Kohlenhydrate, Antikörper usw. Der Ausdruck „Nukleosid", wie er hier verwendet wird, umfasst sowohl Desoxyribonukleoside als auch Ribonukleoside. Der Ausdruck „Oligonukleotid" bezieht sich auf ein Oligonukleotid, das Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotideinheiten besitzt. Der Ausdruck umfasst ebenfalls DNA, RNA, LNA, PNA und Chimären davon. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind Oligonukleotide, Polypeptide und Kohlenhydrate besonders bevorzugte Biomoleküle.

Es ist bevorzugt, dass die Sondenbiomoleküle des Weiteren eine Elektronendonorgruppe umfassen. Das Vorhandensein einer Elektronendonorgruppe erhöht die Elektroaktivität der elektrisch leitenden Polymere.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Elektronendonorgruppe einen Übergangsmetallsandwichkomplex, wie substituierte oder unsubstituierte Ferrocene, Ruthenocene, Nickelocene und ähnliche. Diese Komplexe sind einfach herzustellen und einfach zu Funktionalisieren, wodurch deren Einbringung in die Polymerketten erleichtert wird.

Es ist weiterhin bevorzugt, dass der feste Träger elektrisch leitfähig ist. In einer anderen Ausführungsform umfasst der Träger eine elektrisch isolierende Schicht oder besteht im Wesentlichen aus einem elektrisch isolierendem Material, das von einer elektrisch leitenden Schicht bedeckt wird. Der Träger ist in einer anderen Ausführungsform ein Halbleitermaterial, das eine elektrisch isolierenden Schicht umfasst, dadurch wird in allen Fällen dafür gesorgt, dass eine elektrische Verbindung mit der elektrochemischen Erkennungseinheit aufrechterhalten werden kann.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Zielbiomolekül ein Oligonukleotid (DNA oder RNA), das ein Segment umfasst, das partiell oder vollständig zu dem Sondenmolekül komplementär ist, das ebenfalls ein Oligonukleotid ist. Das Sondenoligonukleotid kann Alphanukleotide enthalten, die analog zu natürlichen Nukleotiden sind und die in automatisierten Synthesen hergestellt werden können. Die Zieloligonukleotide können doppelsträngige DNA, einsträngige DNA, ein DNA-RNA Hybrid oder RNA (ribosomal oder messenger) sein. Natürlich sollten sie, im Falle von doppelsträngigen oder hybriden Oligonukleotiden, denaturiert werden, bevor das erfindungsgemäße Detektionsverfahren unter der Verwendung von gut bekannten Sandwichhybridisierungstechniken durchgeführt wird.

In speziell bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Anhang des Weiteren eine erste Erkennungsspezies, die bevorzugt eine Oligonukleotidsequenz ist. Es ist noch weiter bevorzugt, dass das Oligonukleotid ein Segment umfasst, das partiell komplementär zu dem Biomolekül ist.

Deshalb können die Zielmoleküle, die nicht durch konventionelle oder brauchbare Techniken angehängt werden können, indirekt befestigt werden.

Es ist besonders bevorzugt, dass die lösliche Erkennungsspezies aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat (BCIP), 4-Nitrotetrazolium-Chloridblau (NBT), Dimethylbenzidin, Diaminobenzidin, 4-Chlor-naphtol, 3-Amino-3-ethyl-carbazol und Tetramethylbenzidin (TMB) besteht. Am stärksten bevorzugt ist eine Mischung aus BCIP/NBT, worin NBT als Farbverstärker dient. Daher eröffnet die Verwendung von BCIP/NBT die Möglichkeit von elektrochemischen und/oder optischen Messungen des Niederschlags.

Das der Erfindung zugrunde liegende Problem wird weiter durch einen Biochip gelöst, der einen festen Träger umfasst, mit im wesentlichen elektrisch leitfähigen Polymerketten, die an diesen befestigt sind und mit Sondenmolekülen, die entweder gleich oder unterschiedlich sind und die an alle oder an eine Mehrzahl dieser Ketten gebunden sind und wobei ein Segment dieser Sondenmoleküle in der Lage ist, mit einem Segment der Zielbiomoleküle spezifisch wechselzuwirken.

Der erfindungsgemäße Biochip ermöglicht zahlreiche Einzel-"Mikroelektroden", wobei jede „Mikroelektrode" oder eine definierte Zahl an „Mikroelektroden" eine, zwei oder eine Mehrzahl von Sondenbiomoleküle trägt. Bevorzugt ist, dass die Sondenbiomoleküle aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus Oligonukleotiden, Peptiden, Proteinen und Kohlenhydraten besteht. Besonders bevorzugt sind Oligonukleotide.

Der erfindungsgemäße Biochip wird bevorzugt für die Detektion von Nukleinsäuresequenzen von unterschiedlichen pathogenen Mikroorganismen, für Nukleinsäuresequenzen in Verbindung mit unterschiedlichen genetischen Krankheiten oder für Nukleinsäuresequenzen von unterschiedlichen Gewebearten verwendet.

Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren einen Kit zur Detektion von Zielbiomolekülen in einer Probe, umfassend eine Mehrzahl von Biomolekülen und umfasst:

a) einen Träger, der partiell funktionalisiert ist, mit grundsätzlich elektrisch leitfähigen Polymerketten, an denen Sondenbiomoleküle befestigt sind,
b) eine Erkennungsspezies.

Definitionen und Abkürzungen

Nachfolgend werden die hier verwendeten Bezeichnungen und Definitionen, zur weiteren Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung erläutert.

Der Ausdruck „zu Detektieren" oder „Detektion", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine qualitative als auch eine quantitative Bestimmung und Identifikation von Zielmolekülen in der Probe.

Der Ausdruck „Biomolekül" bezeichnet jedes Molekül, das in der Natur vorkommt oder künstlich hergestellt wurde, gemäß einer Matrix, die in der Natur vorkommt und umfasst beispielsweise Antikörper, Proteine, Peptide, Nukleinsäuresequenzen, d.h. Polynukleotide oder Oligonukleotide, die mindestens zwei Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide umfassen und optional noch mindestens ein modifiziertes Nukleotid umfassen, beispielsweise ein Nukleotid, das eine modifizierte Base enthält.

Der Ausdruck „Peptid", wie er hier verwendet wird, bezeichnet genaugenommen jedes Peptid aus mindestens zwei Aminosäuren insbesondere ein Protein, ein Proteinfragment oder Oligopeptid, das extrahiert, getrennt oder im Wesentlichen isoliert oder hergestellt wurde, insbesondere diejenigen, die durch chemische Synthese oder durch Expression in rekombinanten Organismen erhalten werden.

Der Ausduck „Träger" bezeichnet jeden dreidimensionalen Körper, der nicht chemisch oder physikalisch mit der Probe wechselwirkt. Der Träger kann elektrisch leitfähig oder nicht elektrisch leitfähig sein.

Der Ausdruck „wechselwirken", wie er hier verwendet wird, bedeutet jede Wechselwirkung zwischen molekularen Einheiten, dies umfasst die Bildung von chemischen Bindungen (kovalent oder ionisch), van-der-Waals-Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, Adsorptionsphänomenen und ähnlichem.

Der Ausdruck „Komplex" bezeichnet eine Einheit, die durch mindestens zwei unterschiedliche molekulare Einheiten gebildet wird, die wie oben beschrieben wechselwirken. Ein erfindungsgemäßer Komplex wird durch die oben spezifizierten Wechselwirkungen zusammengehalten.

Nachfolgend wird die Erfindung im Detail erläutert, hinsichtlich der Zeichnungen und der technischen Beschreibung. Es ist verständlich, dass die nachfolgenden Beispiele nur zur Veranschaulichung dienen und keine Einschränkung des Umfangs der Erfindung bedeuten:

1 zeigt eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens,

2 zeigt ein Diagramm einer chemischen Reaktion der Erkennungsspezies auf die Reaktion, die von der katalytisch aktiven Spezies herbeigeführt wird,

3 zeigt zwei erfindungsgemäße Ausführungsformen zur Einbringung von Sondenbiomolekülen in eine Polymerkette,

4 zeigt den Einfluss der Oxidationsstufe von stickstofffunktionalisierten PPy/PPy-ODN Polymerketten auf deren Leitfähigkeit,

5 zeigt den Einfluss der Länge der stickstofffunktionalisierten PPy/PPy-ODN Polymerketten auf deren Leitfähigkeit,

6 zeigt den Einfluss der Position der Funktionalisierung (N-Funktionalisierung im Vergleich mit der Funktionalisierung in 3-Stellung) auf die Leitfähigkeit der Polymerketten (180 nm Länge),

7 zeigt die Stabilität einer Impedanzmessung des Ansprechverhaltens von Kopolymeren PPy-OH/PPy-CP und PPy-OH/PPy-M5, in 3-Stellung funktionalisiert, vor der Hybridisierung und Abscheidung,

8 zeigt einen Vergleich der Graphen des Ansprechverhaltens der Polymere mit einer in 3-Stellung funktionalisierten Polymerkette, PPy-OH/PPy-CP (Graph 1) im Vergleich mit PPy-OH/PPy-M5 (Graph 2), mit einer Kettenlänge von 120 nm, nach Hybridisierung (mit CP-Bio) und Abscheidung,

9 zeigt das Verhältnis der Impedanzmodule von PPy-OH/PPy-CP und PPy-OH/PPy-M5, die in Stellung 3-Position funktionalisiert sind (Kettenlänge von 120 nm; [Ziel] = 1 nM),

10 zeigt die Empfindlichkeit der impedanzspektroskopischen Messung als eine Funktion der Konzentration der Zielmoleküle

11 zeigt das Ergebnis der voltamperometrischen Messung von PPy-OH/PPy-CP (Graph 1) und PPy-OH/PPy-M5 (Graph 2), die in 3-Stellung funktionalisiert sind, nach Hybridisierung mit CP-Bio und Abscheidung von BCIP/NBT (Länge der Polymerkette: 50 nm),

12a zeigt das Ergebnis der impedanzspektroskopischen Messung einer Negativprobe PPy-OH/PPy-M5, die in 3-Stellung funktionalisiert ist, während der Abscheidung von BCIP/NBT auf PPy-OH/PPy-CP (kinetisch).

12b zeigt das Ergebnis der impedanzspektroskopischen Messung während der Abscheidung von BCIP/NBT auf Polymerketten des Kopolymers PPy-OH/PPy-CP, das in 3-Stellung funktionalisiert ist (kinetisch).

1 zeigt ein Substrat 101, das beispielsweise aus einem Metall oder einer Metalllegierung hergestellt ist (Beispiele sind Kupfer, Silber, mit Gold beschichtetes Silizium, Silizium mit Kupfer beschichtet, usw.). Die Substrate 101 tragen zahlreiche Polymerketten 102, die an dem Substrat 101 durch kovalente Bindungen befestigt sind. Die Polymerketten sind regelmäßig oder unregelmäßig angeordnet und haben die gleiche oder unterschiedliche Länge. In einer bevorzugten Ausführungsform sind sie regelmäßig angeordnet und bilden eine „Bürste", bei der die Polymerketten im Wesentlichen die gleiche Länge haben. Bevorzugterweise ist das Polymer ein Polypyrrol, das über seine 2- oder 1-Stellung mit der Oberfläche verbunden ist. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann ein anderes elektrisch leitfähiges Polymer als Polypyrrol (und dessen substituierte Derivate) verwendet werden, beispielsweise Polythiophen, Polyanilin, Polytetrahydrofuran, deren substituierte Derivate und ähnliche. Die monomeren Baueinheiten der Homopolymere sind über ihre jeweilige 3- oder 1-Stellung verbunden. Es versteht sich, dass auch Kopolymere oder unterschiedliche monomere Baueinheiten vom Umfang dieser Erfindung umfasst werden. Hinsichtlich der Substituenten, ist es offensichtlich, dass der Fachmann die Substituenten gemäß des erforderlichen Grades an Elektroleitfähigkeit aussucht.

Ein Biomolekül 105, beispielsweise ein Oligonukleotid, das eine Bindungsstelle 104 und ein komplementäres Segment 103 trägt, wird über eine Bindungsstelle 104 auf einer Polymerkette 102 befestigt. Die Befestigung wird durch die Bildung einer chemischen Bindung zwischen dem Sondenbiomolekül und der Polymerkette durch Methoden erreicht, die im Wesentlichen einem Fachmann bekannt sind.

Um die Detektion eines Zielbiomoleküls durchzuführen, wird das Substrat 101 mit den Sondenbiomolekülen 105, die an zahlreiche Polymerketten 102 gebunden sind, mit einem Zielmolekül 106 in Kontakt gebracht. Die Zielbiomoleküle sind in einer Lösung, Dispersion, Emulsion oder ähnlichem enthalten. Bevor das Zielbiomolekül 106 mit dem Biochip in Kontakt kommt, reagiert das Zielbiomolekül 106 mit einem Erkennungsbiomolekül 107, wobei das Zielbiomolekül 106 und das Erkennungsbiomolekül 107 komplementäre Teile besitzen, die in der Lage sind, eine chemische oder physikalische Wechselwirkung miteinander einzugehen. Es ist bevorzugt, dass das Zielbiomolekül 106 und das Erkennungsmolekül 107 Oligonukleotide sind, die komplementäre Sequenzen besitzen. Das Erkennungsbiomolekül 107 umfasst des Weiteren einen Anhang 109, der bevorzugt Biotin ist. Das Biotin ist bevorzugt über eine chemische, kovalente Bindung an das Erkennungsbiomolekül 107 gebunden. Es versteht sich, dass in einer anderen spezifischen Ausführungsform die Verwendung eines Erkennungsbiomoleküls nicht notwendig ist. In diesem Fall ist der Anhang direkt an dem Zielbiomolekül befestigt.

Das Sondenbiomolekül 105 und das Zielbiomolekül 106 bilden zusammen mit dem Erkennungsbiomolekül 107 einen Erkennungskomplex, wie es in 1c gezeigt ist. Der Erkennungskomplex 1c wird dann mit einem signalerzeugenden Reagenz 110, umfassend einen Teil zum Binden des Anhangs 111, der beispielsweise Avidin oder Streptavidin sein kann, zur Reaktion gebracht. Der Anhang 110 umfasst weiterhin einen Biokatalysator 112, der beispielsweise eine Alkalische Phosphatase ist, wobei aber auch jeder andere Katalysator oder Enzym, wie in dem vorstehenden Abschnitt erwähnt wurde und für den Zweck der Erfindung geeignet ist, alternativ dazu verwendet werden kann.

Biotin 109 und Streptavidin 111 bilden den Biotin-Streptavidin-Komplex, wodurch die katalytisch aktive Spezies 112 an dem Erkennungskomplex befestigt wird.

Eine nachfolgende Reaktion mit BCIP/NBT führt zu einer Oxidation von BCIP und einer Reduktion von NBT. Das oxidierte BCIP/NBT scheidet sich als Niederschlag 113 auf der Polymerkette 102 des Biochips ab.

Die Polymerketten werden nach der Abscheidung von BCIP/NBT 113 konformationell starr. Diese Fixierung führt zu einer Veränderung ihrer elektrischen Leitfähigkeit, die durch Leitfähigkeitsmessungen detektiert werden kann, wie es vorstehend erwähnt wurde.

In einer anderen Ausführungsform werden unterschiedliche Paare von Enzymen und signalerzeugenden Reagenzien verwendet. Diese Paare umfassen beispielsweise Meerrettichperoxidase zusammen mit 4-Chlor-1-naphthalin, Alkalische Phosphatase und Derivate von Indolylphosphaten, Glukoseoxidasen und Tetrazoliumsalzen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.

Die Messung der Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit der Polymerketten 102 wird mittels Impedanzspektroskopie, Cyclovoltammetrie und ähnlichen durchgeführt.

2 zeigt die Redoxreaktion der Erkennungsspezies BCIP/NBT unter dem Einfluss der Alkalischen Phosphatase. Nach der Oxidation und der Addition von sauren Protonen wird ein farbiges, tetrameres Produkt von NBT erhalten, das eine intensive Farbe besitzt, die bei 530 nm absorbiert. NBT scheidet sich auf den Polymerketten 102 ab und kann ebenso durch Kolorimetrie- oder UV/VIS-Messungen detektiert werden.

3 zeigt zwei Ausführungsformen, wie ein Oligonukleotid-Sondenbiomoleküls an einer Polymerkette befestigt werden kann, die Pyrroleinheiten umfasst.

3a zeigt ein Substrat S. An dieses Substrat S, beispielsweise ein Substrat das goldbeschichtetes Silizium umfasst, sind über die 3-Stellung verbundene Polypyrrolketten befestigt. Des Weiteren ist eine Ferroceneinheit über eine geeignete Verbindung an dem Polymer befestigt. Ein Ring des Ferrocens ist mit einer Acylgruppe substituiert, die modifiziert werden kann, um das Oligonukleotid-Sondenmolekül daran anzubringen. Aber auch jede anderen geeigneten fällt in den Umfang dieser Erfindung. Die Buchstaben n und 1 sind ganze Zahlen von 1 bis 4. Wie in 3a gezeigt, ist ein einziges Biomolekül an jeder monomeren Bildungseinheit befestigt, d.h. an jede Pyrroleinheit der polymeren Ketten.

3b zeigt eine andere Ausführungsform zum Befestigen eines Oligonukleotid-Sondenbiomoleküls an der über die 3-Stellung verbundene Polypyrrolkette. Wie in 3b gezeigt, ist nur ein Oligonukleotid-Sondenbiomolekül an jeder Polymerkette befestigt.

4 zeigt die Entwicklung des Widerstands des Ladungstransfers (R_t) durch die Polymerkette, die an der Stickstoffposition funktionalisiert ist, als eine Funktion des an die Elektrode angelegten Potentials. Dieser Widerstand nimmt ab, wenn das angelegte Potential zu positiven Werten hin ansteigt. Dies ist ein Anzeichen dafür, dass die Polymerketten umso leitfähiger sind, je mehr sie oxidiert sind. Bei einem Potential von + 0,5 V nimmt der Widerstand R_t um das achtfache ab, verglichen mit einem angelegten Potential von 0 V. Daher dienen die elektrisch leitfähigen oder halbleitenden Polymerketten einerseits als Matrix zur Immobilisierung von Oligonukleotiden auf einem festen Träger und andererseits auch als Überträger, wobei die intrinsische Leitfähigkeit moduliert werden kann.

5 zeigt den Einfluss der Polymerkettenlänge von PPy/PPy-ODN (die Polymere sind an ihrer Stickstoffposition funktionalisiert) auf ihre Leitfähigkeit als Nyquist-Diagramm (Imaginärteil des Widerstands als Funktion von dessen Realteil). Graph 1 zeigt die Messung an einem Polymer mit der Kettenlänge von 80 nm und Graph 2 ein Polymer mit einer Kettenlänge von 160 nm. Wie man in 5 erkennen kann, ist es so, dass die Leitfähigkeit 10 mal höher ist, bei einer Kettenlänge von 160 nm ist, als wenn die Länge der Polymerketten 80 nm beträgt. Deshalb sind die Polymerketten umso leitfähiger, je länger sie sind (bis zu ungefähr 200 nm). Die ionische Leitfähigkeit steigt mit der Kettenlänge an. Jedoch nimmt die elektronische Leitfähigkeit ab einer bestimmten Kettenlänge (näherungsweise 200 nm) wieder ab, so dass dies den limitierenden Faktor bei der Erhöhung der Leitfähigkeit darstellt. Deshalb ist es möglich, die Leitfähigkeit der Polymerketten durch Variation ihrer Längen anzupassen.

6 zeigt den Unterschied zwischen einem am Stickstoff funktionalisierten Kopolymer und einem in 3-Stellung funktionalisiertem Kopolymer in Form eines Nyquist-Diagramms. Graph 1 zeigt ein Kopolymer das in N-Position funktionalisiert ist und Graph 2 zeigt ein Kopolymer das in Stellung 3 funktionalisiert ist. Die Leitfähigkeit ist 6 mal höher aufgrund einer Funktionalisierung in 3-Stellung des Oligonukleotids, verglichen mit einer Stickstofffunktionalisierung. Deshalb ist es besonders bevorzugt, die Oligonukleotide in 3 Stellung des Pyrrolmonomers anzubringen, wenn es bevorzugt wird, mit Transducern zu arbeiten, die eine höhere Leitfähigkeit haben.

7 zeigt die Stabilität der Widerstandsverhaltens (Bodediagramm, das das Impedanzmodul als Funktion einer Frequenz zeigt) von in 3-Stellung funktionalisierten Kopolymeren PPy-OH/PPy-CP und PPy-OH/PPy-M5 vor der Hybridisierung und Abscheidung. Das Ansprechverhalten, das erhalten wird, ist identisch und perfekt stabil.

8 zeigt ein Bodediagramm von in 3-Stellung funktionalisierten Kopolymeren PPy-OH/ PPy-CP und PPy-OH/ PPy-M5 mit einer Kettenlänge von 120 nm sowohl mit als auch ohne Abscheidung des Ziels mit einer Zielkonzentration von [Ziel] = 1nM. Die Graphen sind einen Funktion der Frequenz in Hz hinsichtlich des Impedanzmoduls Z. Graph 1 zeigt das Impedanzverhalten mit Niederschlag und Graph 2 das Impedanzverhalten ohne Niederschlag. Wie man aus 8 erkennen kann, ist die Unterschied des Ansprechverhaltens mit oder ohne Niederschlag bei niedrigen Frequenzen (1–100 Hz) sehr bedeutend. Das Modul Z ist näherungsweise 2 mal höher mit Niederschlag. 8 zeigt die hohe Empfindlichkeit des Verfahrens in Verbindung mit dem Substrat deutlich. Es ist deshalb möglich, mit Impedanztechniken sehr klar zwischen positiven Punkten (CP in diesem Beispiel) und negativen Punkten (M5) zu unterscheiden.

9 zeigt das Verhältnis der Impedanzmodule von Polymerketten PPy-OH/ PPy-CP und PPy-OH/ PPy-M5, die in 3-Stellung funktionalisiert, mit einer Kettenlänge von 120 nm. Die Konzentration von Zielmolekülen war 0,1 nM. Das Verhältnis zwischen diesen Modulen liegt im Bereich von 2 mit einer Frequenz von 1 Hz und für eine Polymerkettenlänge von 120 nm. Es ist ebenso offensichtlich aus dem Beispiel in 9, dass die Frequenz die Empfindlichkeit der Detektion beeinflusst.

10 zeigt die Empfindlichkeit der Impedanzmessungen als eine Funktion der Konzentration an Zielmolekülen. Die Konzentration (log μM) ist eine Funktion des Verhältnisses der Impedanzmodule PPy-OH/ PPy-CP und PPy-OH/ PPy-M5, die in 3-Stellung funktionalisiert sind. Gemessen bei einer Konzentration der Zielkonzentration von 0,1 μM ist das Verhältnis der Impedanzmodule gleich 8 und bei einer Konzentration von 1 nM der Zielkonzentration ist das Verhältnis der Impedanzmodule gleich 2.

Folgerung: Für eine Konzentration von Zieloligonukleotiden von 1 nM, ist das Verhältnis der Impedanzmodule bei einer Frequenz von 1 Hz gleich 2. Deshalb ermöglicht es diese Technik, die Konzentration der Zieloligonukleotide auf einen Bereich von 10³ zu erniedrigen, bevor das Detektionslimit erreicht ist, das bei einem Faktor von 1 bei dem Verhältnis der Impedanzmodule von CP und M5 erhalten wird.

11 zeigt 2 Voltamperogramme, eines in 3 Stellung funktionalisierten Kopolymers PPy-OH/ PPy-CP nach Hybridisierung und Abscheidung und andererseits ein negatives Kontroll-Kopolymer PPy-OH/ PPy-M5, das in der 3-Stellung funktionalisiert ist. Die Konzentration des Ziel CP-Bios war 1 nM. Die gemessene Intensität des Oxidationspeaks des Ansprechverhaltens des Kopolymers PPy-OH/ PPy-CP (3) ist schwächer als das von Kopolymer PPy-OH/ PPy-M5, das keinen Niederschlag aufweist. Das Verhältnis der Intensität des Oxidationspeaks von deren Kopolymere CP und M5 bei einem Potential von –50 mV ist ca. 1,6. Dasselbe gilt für den Reduktionspeak, der bei ca. –180 mV zu finden ist. Deshalb ermöglicht es diese elektrochemische Technik auch, zwischen positiven Polymerketten (CP) und negativen Ketten (M5) zu unterscheiden.

12 zeigt Impedanzmessungen in einem Puffer des Substrats. Dies ermöglicht die Verfolgung der Entwicklung der Abscheidungsreaktion während der Reaktionszeit. Auf dem Kopolymer PPy-OH/ PPy-M5 (3), bei dem keine Hybridisierung stattfand, entwickelt sich das Bodediagramm, das das Impedanzmodul als Funktion der Frequenz zeigt, hinsichtlich der Zeit nur leicht. Die Leitfähigkeit der Polymerketten verändert sich deshalb nicht.

12b zeigt die Veränderung in der elektrischen Leitfähigkeit in einem Bodediagramm während der Abscheidung von BCIP/NBT auf den Polymerketten von einem in 3 Stellung funktionalisierten Kopolymer PPy-OH/PPy-CP. Der Graph von 12b ist eine Funktion der Frequenz in Hz gegen das Impedanzmodul in kHz. Die Konzentration von Zielmolekülen war 1 nM (CP-Bio) und die Länge der Polymerketten war 180 nm.

Mit dem in 3-Stellung funktionalisierten Kopolymer PPy-OH/ PPy-CP, bei dem eine Hybridisierung stattfand, entwickelt sich die Kurve, wie vom Impedanzmodul als Funktion der Frequenz erhalten, während des Zeitraums von ca. 40 min. Für jede Frequenz im Bereich von 1 und 100 Hz, verdoppelt sich der Wert des Moduls während der Reaktionszeit. Dieser Anstieg wird mit der Kinetik des Niederschlags in Verbindung gebracht, der sich als Konsequenz der Hybridisierung der Oligonukleotide auf der Elektrode bildet.

Beispiele

Abkürzungen und Definitionen

ECS: gesättigte Kalomelelektrode (Referenzelektrode)
CP: Oligonukleotid zur Positivkontrolle mit folgender Sequenz: 5' TTT TTT TTT TGC CTT GAC GAT ACA GCT A3'
CP-Biotin (CP-Bio): Komplementäres, biotinyliertes Oligonukleotid von CP mit der folgenden Sequenz: 5' Biotin – T AGC TGT ATC GTC AAG GCA 3'
M5: Oligonukleotid zur Negativkontrolle mit der folgenden Sequenz: 5' TTT TTT TTT TTT GGA GCT GCT GGC G 3'
M5-Biotin (M5-Bio): Komplementäres, biotinyliertes Oligonukleotid von M5 mit der folgenden Sequenz: 5' Biotin – C GCC AGC AGC TCC AAA 3'
ODN: Oligonukleotid
TH1X: TH1X ist eine Pufferlösung bestehend aus < 13.3 g/L Na₂HP₂O₄, 29,22 g/L NaCl, 20 g/L PEG 4000, 6,5 % Tween 20, 1 g/L Gelatine, 14 % DNA von Heringsperma 10 mg/mL ultrabeschallt
TR: TR ist ein Puffer zum Waschen, bestehend aus: 8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 0,76 g/L Na₂HPO₄, 0,19 g/L KH₂PO₄, 0,5% Tween 20, 1 mM EDTA.
PAL: Alkalische Phosphatase
BM purple AP Substrat: Chromogenes Substrat für die Alkalische Phosphatase, (Roche Applied Substrate)
CV: Cyclische Voltammetrie

Die im folgenden Beispiel 2 verwendete elektrochemische Zell ist eine Micam Zelle mit einem Volumen von 1 mL mit einer Platin Gegenelektrode (Durchmesser: 4 mm). Der Gesamtaufbau besitzt 3 Elektroden. Für das Beispiel 3 wurden keine elektrochemische Zelle verwendet. Ein Tröpfchen von 50 μL einer elektrisch hergestellten Lösung wird auf einen Biochip aufgetragen, der eine integrierte Referenzelektrode und eine Gegenelektrode aufweist.

Beispiel 1

1. Elektropolymerisation von Stickstofffunktionalisiertem Polypyrrol

Alle Kopolymere sind elektrisch hergestellt mit einem angelegten Potential von +1V gegen (ECS) aus einer wässrigen Lösung von LiClO₄ 0,1 M umfassend 20 mM von Pyrrolmonomeren und 5 μM eines Pyrrol-Oligonukleotidmonomers (CP oder M5). Das Polypyrrol-Homopolymer wurde ebenfalls elektrisch hergestellt mit einem angelegten Potential von +1 V gegen ECS aus einer 20 mM Lösung von Pyrrol. Eine Micamzelle wurde als elektrochensche Zelle verwendet. 9 Spots auf jedem Biochip wurden mit Polymerketten versehen:
Es wurden 4 Spots mit Ketten aus Kopolymeren von Polypyrrol/Polypyrrol-CP (Qs = 55 μC; Qs = 70 μC; Qs = 40 μC; Qs = 100 μC), 4 Spots mit Kopolymer aus Polypyrrol/Polypyrrol-M5 (Qs = 55 μC; Qs = 70 μC; Qs = 40 μC; Qs = 100 μC) und ein Spot mit einem Polypyrrol-Homopolymer ohne Sondenbiomolekül (Qs = 60 μC) hergestellt. Nach der Ablagerung der Polymerketten auf jedem Spot, wurde das elektrochemische Verhalten von jedem Polymer durch cyclische Voltammetrie (CV) in einer wässrigen Lösung von 0,1 M LiClO₄ durch Veränderung der Potentiale zwischen –0,2 V und +0,6 V gegen ECS gemessen. Anschließend wurde jeder Spot mit Ketten mit einem Hybridisierungspuffer analysiert.

Erste Phase der Hybridisierung

Die Hybridisierung der M5 Proben wurde durch 30 min Inkubation des Biochips in einer Lösung erreicht, umfassend das Ziel ODN M5 Biotin in einer Konzentration von 0,5 μM. Jeder Spot wurde danach über VC mit einem Hybridisierungspuffer durch Veränderung der Potentiale zwischen –0,2 V und +0,6 V gegen ECS analysiert.

Zweite Phase der Hybridisierung

Danach wurde der Biochip erneut in der gleichen Hybridisierungslösung, umfassend die Zielbiomoleküle, Oligonukleotid M5 Biotin in einer Konzentration von 0,5 μM für 30 min inkubiert.

Jeder Spot mit den Polymerketten wurde mit CV in einer neuen Lösung von Hybridisierungspuffer durch Veränderung der Potentiale zwischen –0,2 V und +0,6 V gegen ECS analysiert. Nach der Messung jedes Spots wurde der Biochip 4 mal mit der Waschpufferlösung gewaschen.

Auf jeden Spot wurde ein Tröpfchen einer Lösung aus Streptavidin Alkalischer Phosphatase (PAL) gegeben, die auf den 100 Teil verdünnt war. Der Biochip wurde für 5 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurde der Biochip 4 mal mit der Waschpufferlösung gewaschen.

Abscheidung

Auf jeden Spot wurde ein Tröpfchen einer Lösung von BM purple AP Substrat aufgebracht. Der Biochip wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur in Dunkelheit gelassen (Inkubation). Anschließend wurde der Biochip 4 mal mit der Waschpufferlösung gewaschen. Die Waschpufferlösung bestand aus 8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 0,76 g/L NaH₂PO₄, 0,19 g/L KH₂PO₄, 0,5 % Tween 20, 1 μM EDTA.

Eine blaue Ablagerung oder Niederschlag zeigte sich auf jedem M5 Spot.

Jeder Film wurde durch CV in einer Lösung von Hybridisierungspuffer durch Veränderung der Potentiale zwischen –0,2 V und +0,6 V gegen ECS analysiert.

Beispiel 2

4 Biochips wurden hergestellt, wobei jeder 9 Spots umfasste. 4 Spots eines jeden Chips wurde mit Ketten von Kopolymeren PPy-OH/ PPy-CP, in N-Position funktionalisiert, 4 Spots wurden mit Ketten von Kopolymeren PPy-OH/ PPy-M5, in N-Position funktionalisiert ausgestattet. Ein Spot bestand aus reinem Gold, ausschließlich zur Benutzung als Gegenelektrode.

Die Synthese der elektrisch leitfähigen Polymere wurde durch ein angelegtes Potential von +0,9 V gegen ECS durchgeführt. Die Lösung für die Elektrosynthese der Kopolymere bestand aus 0,1 M LiClO₄ in Wasser, umfassend 20 mM an monomeren Pyrrol und 5 μM eines monomeren Pyrrols, funktionalisiert mit Oligonukleotiden (CP oder M5). Die elektrochemische Zelle war eine Micamzelle mit 3 Elektroden.

Biochip 1 wurde mit einer Polymerkettenlänge von 40 nm hergestellt (Qs = 20 mCx cm^–2/Stelle). Biochip 2 wurde mit einer Polymerkettenlänge von 60 nm hergestellt (Qs = 30 mCx cm^–2/Stelle). Biochip 3 wurde mit einer Polymerkettenlänge von 80 nm hergestellt (Qs = 40 mCx cm^–2/Stelle). Biochip 4 wurde mit einer Polymerkettenlänge von 20 nm hergestellt (Qs = 10 mCx cm^–2/Stelle).

Hybridisierung

1 μL ODN-Biotin (ODN = CP oder M5 jedes mit 10 μM) in 99 μL TH1X Puffer wurde für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Endkonzentration von ODN-Biotin war 0,1 μM. Biochip 1 und 3 wurden mit CP-Biotin inkubiert, wobei Biochips 2 und 4 mit M5-Biotin inkubiert wurden.

Tagging

Ein Tröpfchen von 30 μL Streptavidin-PAL Komplex (0,4 μL von Ci = 1 mg/L), in 30 μL Hybridisierungspuffer verdünnt, wird auf jeden Biochip aufgetragen, gefolgt von einer Inkubation von 5 Minuten bei Umgebungstemperatur und dem Waschen mit der Waschpufferlösung (TR).

Abscheidung

Ein Tröpfchen von 30 μL BM purple AP Substratlösung wird auf jeden Biochip aufgetragen, gefolgt von einer Inkubation von 45 Minuten bei Umgebungstemperatur, gefolgt von 4 mal waschen mit TR.

Ein blauer Niederschlag erscheint auf jeden hybridisierten Spot, an dem die Hybridisierungsreaktion statt fand.

Analyse der Polymerketten hinsichtlich ihrer durchschnittlichen Länge

Die Analyse der Polymerketten des Biochips 1 und 4 wurde nach der Abscheidung mit Cyclischer Voltammetrie durchgeführt. Das elektrochemische Verhalten jedes Spots wurde mit einer Scangeschwindigkeit von 10 mV/ s in einer wässrigen Lösung von 0,1 M LiClO₄ durch Veränderung des Potentials im Bereich von –0,1 V und +0,5 V gegen ECS gemessen.

Tabelle 1 zeigt den Einfluss des Niederschlags auf einem Kopolymer mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von 20 nm. Die Ip-Oxidation des nicht hybridisierten Spots lag bei 35 nA (bei E = +0,35 V/ECS), wobei die Ip-Oxidation des hybridisierten Spots mit Niederschlag 27 nA betrug (bei E = +0,35 V/ECS).

Tabelle 1 zeigt den Einfluss des Niederschlags auf dem stickstofffunktionalsierten Polymer PPy/PPy-ODN.

Tabelle 1

Tabelle 1 zeigt die Werte der Intensität der Oxidationspeaks des voltamperometrischen Ansprechverhaltens, erhalten bei stickstofffunktionalisierten PPy/PPy-ODN Kopolymeren nach Hybridisierung und Abscheidung. Die Referenzmessung ist durch das PPy/PPy-M5 Kopolymer gegeben, bei dem keine Hybridisierung statt fand und nachfolgend kein Niederschlag gebildet wurde. Eine weniger bedeutende Intensität im Bereich von 20–30% wird bei Polymerketten erhalten, bei denen Hybridisierung und Bildung eines isolierenden Niederschlags statt fand. Die Werte zeigen, dass die Länge der Polymerketten eine wichtige Rolle bei der Empfindlichkeit der Messung spielen.

Tabelle 1 zeigt des Weiteren den Einfluss des Niederschlags auf einem Kopolymer mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von 40 nm. Die Ip-Oxidation des nicht hybridisierten Spots lag bei 45 nA (bei E = +0,35 V/ECS), wobei die Ip-Oxidation des hybridisierten Spots mit Niederschlag bei 33 nA lag (bei E = +0,35 V/ECS).

Tabelle 1 zeigt des Weiteren den Einfluss des Niederschlags auf einem Kopolymer mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von 60 nm. Die Ip-Oxidation des nicht hybridisierten Spots lag bei 65 nA (bei E = +0,35 V/ECS), wobei die Ip-Oxidation des hybridisierten Spots mit Niederschlag bei 49 nA lag (bei E = +0,35 V/ECS).

Auch der Einfluss des Niederschlags auf einem Kopolymer mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von 80 nm wird in Tabelle 1 gezeigt. Die Ip-Oxidation des nicht hybridisierten Spots lag bei 73 nA (bei E = +0,35 V/ECS), wobei die Ip-Oxidation des hybridisierten Spots mit Niederschlag bei 50 nA lag (bei E = +0,35 V/ECS).

Die wichtigste Intensität, die für ein stickstofffunktionalisiertes Kopolymer PPy/PPy-CP beobachtet wird, hinsichtlich eines blinden Kopolymers PPy/PPy-M5 (in N Stellung funktionalisiert) wurde mit Polymerketten mit einer Länge von 80 nm erhalten. In diesem Fall ist die Intensität rundherum 30% schwächer. Deshalb liegt die optimale Kettenlänge im Falle eines stickstofffunktionalisierten Kopolymers bei ca. 50–160 nm, am meisten bevorzugt ist sie zwischen 80–120 nm. Die Bildung eines isolierenden Niederschlags auf der Oberfläche einer langen Polymerkette beeinflusst die Messung an einer Polymerkette. Je länger die Polymerkette ist, umso leichter ist es für den Niederschlag sich zwischen die langen Polymerketten einzulagern und die ionische Leitfähigkeit beträchtlich zu blockieren.

Es ist wichtig, den Einfluss des Oxidationsgrades der Polymerketten, deren Länge und deren Struktur (Position der Funktionalisierung durch die Oligonukleotide) auf die Leitfähigkeit zu zeigen. Die Leitfähigkeit der Polymermatrix ist einer der Hauptvorteile dieser Fixierungsmethode hinsichtlich anderer Immobilisierungsverfahren für Oligonukleotide die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Die 4 und 5 zeigen das Ergebnis der Impedanzspektroskopie und Messungen an einem stickstofffunktionalisierten Polymer PPy/PPy-CP.

Des Weiteren erlaubt die Position der Funktionalisierung der Oligonukleotide an den monomeren Pyrrolen ebenfalls die Modulierung der Leitfähigkeit der Polymerketten (6). Die unterschiedlichen möglichen Wechselwirkungen zwischen den Substituenten können eine Torsion der Polymerketten verursachen. Die Struktur von einem in 3-Stellung funktionalisierten Polymer begünstigt die elektrische Leitfähigkeit stärker, da die Torsion weniger bedeutend ist. Der elektronische Transfer zur Kette hin wird verbessert und die Leitfähigkeit des in 3 Stellung funktionalisierten Kopolymers wurde beträchtlich verbessert.

Die Messungen wurden in einem Faradaykäfig durchgeführt, um das Grundrauschen zu minimieren. Für eine Stabilitätskorrektur wurde ein Filter verwendet. Für jede Frequenz wurde über 3 Messungen gemittelt (Na = 3). Das an die Elektrode angelegte Potential kann von dem Fachmann durch übliche Messungen ausgewählt werden. Der ausgewählte Frequenzbereich liegt in der Größenordnung von 100 kHz-0,1 Hz. Die Amplitude des sinusförmigen Eingangssignal wurde bei näherungsweise 40 mV gewählt.

Die Leitfähigkeit der Polymermatrix kann durch die Erhöhung des Oxidationsgrades verbessert werden (4). Die elektronische Struktur des Polymers vom Polypyrroltyp ist mit dem angelegten Oxidationspotential korreliert. Die Beweglichkeit der Ladungen auf der konjugierten Kette des Polymers wird durch ein erhöhtes Oxidationspotential vergrößert.

Jedoch werden die Impedanzmessungen weniger stabil, wenn die Polymerketten nicht nahe des Gleichgewichtspotentials sind.

Die Länge der Polymerketten beeinflusst die gemessene Impedanz (5).

Die Länge der Polymerkette beeinflusst die gemessene Impedanz so, dass längere Ketten zu einer gemessenen Abnahme der Impedanz führen. Dies bedeutet, dass längere Polymerketten eine größere elektrische Leitfähigkeit besitzen als kürzere Polymerketten.

Beispiel 3

Material

Die Polymerketten wurden mit Hilfe eines 50 μL Tröpfchen elektrosynthetisiert, dieser wird auf den Chip aufgetragen, der eine integrierte Referenz- und Gegenelektrode hat.

Als Potentiostat wurde ein 4-Kanal VMP-2 (Bio-Logic Grenoble, France) verwendet, die Software für die Chromoamperometrie und die Impedanzspektroskopie war: EGG und Bio-Logic. Die Polymerketten wurden mit einem angelegten Potential von +0,75V/ECS auf einem Substrat elektrosynthetisiert, wie es in Beispiel 2 ausgeführt wurde. Die Lösung für die Elektrosynthese der Kopolymere bestehend aus 0,1 M LiClO₄ in Wasser, das 0,1 M von Pyrrol-OH Monomer, das in 3 Stellung funktionalisiert ist, und 25 μM von Pyrrol-ODN Monomer, das in 3 Stellung funktionalisiert (CP und M5-Y) enthält. 4 Filme eines Kopolymers PPy-OH/PPy-CP und 4 Filme eines Kopolymers PPy-OH/PPy-M5 wurden hergestellt. Die Länge jeder Polymerkette wurde an jedem Spot variiert.

Die Hybridisierung wurde wie folgt durchgeführt:
Inkubation während 1 Stunde bei Umgebungstemperatur, gefolgt von der Addition der Hybridisierungslösung
[ODN-Bio] 1 = 1 μM
oder
[ODN-Bio] 2 = 0,1 μM
oder
[ODN-Bio] 3 = 1 nM

Marker Verfahren

Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur mit einem Tröpfchen von 30 μL einer Lösung von Streptavidin Alkalische Phosphatase (PAL) (Konzentration von PAL gleich 1 mg/mL), das ist 0,4 μL von PAL und 30 μL von TH1X, was 400 ng/Tröpfchen auf dem Biochip ergibt (8 Stellen).

Abscheidungsverfahren

Die Positionierung einer Lösung von BM purple AP Substrat auf dem Biochip, gefolgt von einer Inkubation von 40 min bei Raumtemperatur ohne Lichtexposition.

Nach dem Inkubationsschritt werden die Spots und der Biochip mit der Waschpufferlösung gewaschen (TR).

Impedanzmessungen

Die Impedanzmessungen wurden an Stellen für jedes Polymer auf dem Biochip realisiert (4 positive Spots (CP) und 4 Blindspots (M5) in LiClO₄ 0,1 M nach Abscheidung).

Die Impedanzmessungen wurden unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie in Beispiel 2 angezeigt.

In 7 wird die Variation im Vergleich des Impedanzverhaltens der sogenannten Positivkopolymere, bei denen eine Hybridisierung und Abscheidung stattfand und das Verhalten von den negativkalibrierten Kopolymeren, bei denen keine Hybridisierung statt fand, gezeigt. Vor der Hybridisierung ist das elektrochemische Verhalten von beiden Kopolymeren identisch. Deshalb beeinflusst nicht einmal die festgelegte Oligonukleotidsequenz (CP oder M5) die Leitfähigkeit der Polymermatrix.

Die Impedanzmessungen nach der Hybridisierung und Abscheidung (8) bestätigen, dass die Bildung eines isolierenden Niederschlags auf den Polymerketten den ionischen Transfer und den elektronischen Transfer an der Schnittstelle Polymer/Lösung als Film blockiert. Die Leitfähigkeit der Polymerkette wird stark beeinflusst und das schon durch eine sehr kleine Menge an Niederschlag, der mit einer kleinen Menge an hybridisierten Zieloligonukleotiden korreliert werden kann. Diese elektrochemische Technik ist perfekt an das ausgewählte System, der Abscheidung eines isolierenden Substrats zur Detektion der Hybridisierung von Oligonukleotiden angepasst. Für eine Kettenlänge von ca. 120 nm lagert sich der gebildete Niederschlag beträchtlich zwischen die Ketten der Polymermatrix und blockiert die Leitfähigkeit partiell.

Die Änderungen der elektrischen Leitfähigkeit des Kopolymers sind wichtiger, wenn schwache Frequenzen zwischen 1 und 100 Hz verwendet werden (9).

Die Detektionsempfindlichkeit liegt in der Größenordnung von 1 pM, dies entspricht 10⁸ Molekülen/mL (10).

Die Impedanzmessungen können in dem Puffersubstrat durchgeführt werden (12). Deshalb ist es möglich, die Entwicklung der Abscheidungsreaktion in Echtzeit mitzuverfolgen. Die Detektion der Hybridisierung über kinetische Messungen der Abscheidung ist schneller und verlässlicher als vergleichbare Verfahren für die Messung von Impedanzmodulen von kalibrierenden Kopolymeren und positiven Kopolymeren.

Ebenso wurde eine Studie über die Cyclische Voltamperometrie bei Kopolymeren, die in 3 Stellung funktionalisiert sind, für eine Konzentration von einem Ziel CP-Bio von 1 nM (11) durchgeführt. Die Intensität der gemessenen Oxidationspeaks beim Ansprechverhalten eines CP Kopolymers ist 40% schwächer als die, die für das Kopolymer M5 gemessen wurden. Dieser Verlust an Intensität ist direkt mit einer Abnahme der Leitfähigkeit der Polymerketten korreliert. Dies ist eine direkte Folge der Bildung eines isolierenden Niederschlags auf der Oberfläche des Polymers. Mit dieser Technik ist es deshalb auch möglich, das Phänomen der Hybridisierung zu detektieren und zu quantifizieren. Es versteht sich, dass es die Technik auch ermöglicht, Assays mit Proteinen oder Haptenen zu quantifizieren, falls spezifische Liganden zur Verfügung stehen. Jedoch nimmt die Empfindlichkeit leicht ab, verglichen zur Impedanzspektroskopie. Die letztere ist deshalb bevorzugt, aufgrund ihrer einfachen Handhabbarkeit und auch wegen der Möglichkeit der Miniaturisierung der Messvorrichtung.

Claims

Verfahren zur Detektion eines Zielbiomoleküls in einer Probe, die zahlreiche Biomoleküle umfasst, wobei das Zielbiomolekül direkt oder indirekt mit einem Anhang ausgestattet ist, dieser Anhang umfasst eine katalytisch aktive Einheit, die eine Reaktion katalysiert, die ein unlösliches Reaktionsprodukt erzeugt, wobei dieses Verfahren die Schritte umfasst: a) das Bereitstellen eines festen Trägers, wobei ein Teil einer Oberfläche des festen Trägers zahlreiche flexible, elektrisch leitfähige Polymerketten trägt, b) das Befestigen der Sondenbiomoleküle an den Polymerketten, c) das In-Kontakt-Bringen zwischen der Probe und dem festen Träger, der die Sondenbiomoleküle umfasst, wobei sich ein Erkennungskomplex zwischen einem Sondenbiomolekül und einem Zielbiomolekül bildet, d) das Zusetzen einer im Wesentlichen löslichen Erkennungsspezies, e) die Umwandlung der Erkennungsspezies durch eine katalytische Aktivität der katalytisch aktiven Einheit in eine unlösliche Erkennungsspezies, die sich auf den Polymerketten abscheidet, f) die Detektion des Niederschlags.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion des Niederschlags die Messung seines elektrischen Verhaltens umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Niederschlag die Beweglichkeit der Polymerketten verringert.
Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Abnahme der Beweglichkeit die elektrische Leitfähigkeit der Polymerketten verändert.
Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit durch ein Verfahren detektiert wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus amperometrischen Messungen, Differentialpulsvoltammetrie, Chromoamperometrie, Impedanzmessungen.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die katalytisch aktive Einheit ein Biokatalysator ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Biokatalysator ein Enzym ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Oxidasen, Peroxidasen, Reduktasen und Dehydrogenassen besteht, besonders bevorzugte Enzyme sind die Peroxidase oder Phosphatase.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Anhang des Weiteren einen Biotin/Avidin- oder Biotin/Streptavidin-Komplex umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein einziges Sondenbiomolekül an jeder Polymerkette befestigt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass 2 Sondenbiomoleküle an jeder Polymerkette befestigt sind und wobei die Sondenbiomoleküle gleich oder verschieden sein können.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sondenbiomolekül aus einer Gruppe ausgewählt ist, aus Oligonukleotide, Polypeptiden, Proteinen, Antigenen, Antikörpern, Enzymrezeptoren und Kohlenhydraten umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sondenbiomolekül des Weiteren eine Elektronendonorgruppe umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektronendonorgruppe einen Übergangsmetall-Sandwichkomplex umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger elektrisch leitfähig ist, oder ein Isolator ist, der auf eine leitfähige Schicht aufgebracht ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielbiomolekül ein Oligonukleotid ist, das ein Segment umfasst, das partiell komplementär zu dem Sondenmolekül ist.
Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Anhang weiterhin eine erste Erkennungsspezies umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Erkennungsspezies ein Oligonukleotid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid ein Segment umfasst, das teilweise komplementär zu dem Zielbiomolekül ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die lösliche Erkennungsspezies aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus 5-Brom-5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat (BCIP), 4-Nitrotetrazolium-Chloridblau (NBT), Dimethylbenzidin, Diaminobenzidin, 4-Chlor-Naphthol, 3-Amino-3-ethyl-carbazol, Tetramethylbenzidin (TMB) besteht.
Biochip, umfassend einen festen Träger mit im Wesentlichen elektrisch leitfähigen Polymerketten, die an spezifischen Stellen auf diesem Träger befestigt sind, wobei die Polymerketten an den jeweiligen Stellen gleich oder unterschiedlich sind, und weiter umfassend Sondenmoleküle, die gleich oder unterschiedlich sind, und die an alle oder eine Mehrzahl dieser Ketten gebunden sind, wobei ein Segment der Sondenmoleküle in der Lage ist, mit einem Segment der Zielmoleküle spezifisch wechselzuwirken.
Biochip gemäß Anspruch 21, wobei die Biomoleküle aus einer Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Oligonukleotiden, Peptiden, Proteinen, Antigenen, Antikörpern, Enzymrezeptoren, Kohlenhydraten.
Biochip gemäß Anspruch 22, wobei die Biomoleküle Oligonukleotide sind.
Biochip gemäß Anspruch 23, wobei die Zielbiomoleküle Nukleinsäuresequenzen von unterschiedlichen pathogenen Mikroorganismen sind.
Biochip gemäß Anspruch 24, wobei die Nukleinsäuresequenzen Nukleinsäuresequenzen sind, die unterschiedliche genetische Krankheiten betreffen.
Biochip gemäß Anspruch 23, wobei die Nukleinsäuresequenzen Nukleinsäuresequenzen von unterschiedlichen Geweben sind.
Biochip gemäß Anspruch 23, wobei die Nukleinsäuresequenzen Nukleinsäuresequenzen sind, die unterschiedliche Individuen betreffen.
Kit zur Detektion von Zielbiomolekülen in einer Probe, umfassend zahlreiche Biomoleküle, des Weiteren umfassend: a) einen Träger, teilweise funktionalisiert mit grundsätzlich elektrisch leitfähigen Polymerketten und daran befestigten Sondenbiomolekülen, b) eine Erkennungsspezies.