DE1063330B

DE1063330B - Substances for foreign transplants

Info

Publication number: DE1063330B
Application number: DER19912A
Authority: DE
Inventors: Dr Med Norman Rosenberg; Eugene Robert Lawrenc Gaughran
Original assignee: EUGENE ROBERT LAWRENCE GAUGHRA; NORMAN ROSENBERG DR MED
Current assignee: EUGENE ROBERT LAWRENCE GAUGHRA; NORMAN ROSENBERG DR MED
Priority date: 1955-11-01
Filing date: 1956-10-30
Publication date: 1959-08-13

Description

Stoffe für Fremdtransplantationen Es wurden schon verschiedene Transpiantationsmittel für Säugetiere vorgeschlagen; es fehlt aber ein röhrenförmiges Material, vor allem in Y- oder T-Form, das leicht erhältlich ist, präserviert und aufbewahrt werden kann und für den Träger verträglich ist, d. h. nicht zu Trombosen, Arterienerweiterung oder einem Reißen der Plastik führt.Substances for foreign transplants There have already been various transplants suggested for mammals; but it lacks a tubular material, above all in Y- or T-shape, which is easily available, can be preserved and stored can and is compatible with the wearer, d. H. not to thrombosis, arterial dilation or the plastic tearing.

Die Erfindung betrifft nun ein röhrenförmiges, in trockener Form oder in einer sterilen Flüssigkeit aufzubewahrendes, bei 240 mm Quecksilbersäule Luftinnendruck undurchlässiges, steriles, zum Einsetzen in Menschen oder Säugetiere geeignetes Kollagenmaterial, vorzugsweise in Y- oder T-Form, das einen Kollagengehalt von mindestens 80 ovo aufweist und in dem die Kollagenfasern praktisch ihre natürliche Zusammensetzung aufweisen. The invention now relates to a tubular, in dry form or stored in a sterile liquid at 240 mm mercury Internal air pressure impermeable, sterile, for use in humans or mammals suitable collagen material, preferably in Y or T shape, which has a collagen content of at least 80 ovo and in which the collagen fibers are practically their natural Have composition.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Herstellen des röhrenförmigen Kollagenmaterials, insbesondere bei dem röhrenförmige Blutgefäße von Säugetieren, vorzugsweise von Rindern, mit einer 0,25- bis 50/oigen Ficin-Enzymlösung bei Temperaturen von 30 bis 450 C in einem p-Bereich der Lösung von 4,0 bis 7,0 während einer Zeit von 2 bis 8 Stunden bis zum Ansteigen des Kollagengehalts auf mindestens 80 °/o abgebaut werden, worauf das behandelte Material zur Entfernung des Enzyms mit Wasser gewaschen und anschließend einer Härtungsbehandlung unterworfen wird. The invention further relates to a method for producing the tubular collagen material, particularly in the case of tubular blood vessels of mammals, preferably of cattle, with a 0.25 to 50% ficin enzyme solution at temperatures from 30 to 450 ° C. in a p-range of the solution from 4.0 to 7.0 for a period of 2 to 8 hours for the collagen content to rise at least 80 ° / o are degraded, whereupon the treated material for removal of the enzyme washed with water and then subjected to a hardening treatment will.

Ficin ist ein proteolytisches kristallisiertes Enzym, gewonnen aus dem Milchsaft des Feigenbaumes (vergleiche z. B. Hackhs »Chemical Dictionaryc, 3. Auflage, McGraw-Hill Book Company Inc., NewYork N.Y., S.339). Ficin is a proteolytic crystallized enzyme obtained from the milky sap of the fig tree (compare, for example, Hackhs, Chemical Dictionary, 3. Edition, McGraw-Hill Book Company Inc., New York N.Y., p.339).

Wird die Härtung mit wäßrigem Formaldehyd durchgeführt, so sind Konzentrationen des Formaldehyds in Wasser von 0,3 bis 3,3 ozon Temperaturen zwischen 10 und 350 C und eine Behandlungsdauer von 4 bis 24 Stunden geeignet. Weitere Härtungsmittel sind beispielsweise Chromoxyd oder Methanol. Anschließend an die Härtungsbehandlung wird das Material beispielsweise mit Ahtylen- oder Propylenoxyd sterilisiert. Das gewaschene gehärtete Produkt kann in einer Flüssigkeit, wie 5O0/oigem Äthylalkohol oder Isopropylalkohol, die gegebenenfalls sterilisierende Substanzen, z. B. 1 0/o Propylenoxyd, enthalten, aufbewahrt oder auch anschließend einer Gefriertrocknung unterworfen werden. If the curing is carried out with aqueous formaldehyde, the concentrations are of formaldehyde in water from 0.3 to 3.3 ozone temperatures between 10 and 350 C and a treatment time of 4 to 24 hours is suitable. Other hardeners are for example chromium oxide or methanol. Subsequent to the hardening treatment For example, the material is sterilized with ethylene or propylene oxide. That Washed hardened product can be in a liquid such as 50% ethyl alcohol or isopropyl alcohol, which may contain sterilizing substances, e.g. B. 1 0 / o Propylene oxide, contained, stored or also after a freeze-drying be subjected.

Beispiel 1 3 g (Naßgewicht) frische Rinder-Kopfschlagader, die von fremdem oder Lymphgewebe frei ist, wird mit 20 g einer wäßrigen Lösung von 1/oigem handelsüblichem Ficin, das Spuren (z. B. 0,00005 bis 0,005 Gewichtsprozent) von Natriumthioglykolat als Enzym- beschleuniger und den Standard-Phosphat-Citrat-Puffer des p-Wertes von 5 enthält (Handbook of Chemistry and Physics, Chemical Rubber Publishing Co., 30. Ausgabe, 1947, S. 1405; McIlvaine Standard Puffer), bei einer Temperatur von 370 C während einer Zeit von 3 Stunden behandelt. Example 1 3 g (wet weight) of fresh bovine carotid artery obtained from foreign or lymphatic tissue is free, with 20 g of an aqueous solution of 1 / oigem commercial ficin containing traces (e.g. 0.00005 to 0.005 percent by weight) of Sodium thioglycolate as an enzyme accelerator and the standard phosphate citrate buffer of the p-value of 5 (Handbook of Chemistry and Physics, Chemical Rubber Publishing Co., 30th Edition, 1947, p. 1405; McIlvaine Standard Buffer), at one temperature of 370 C for a period of 3 hours.

Danach wird das Material mechanisch von losem Gewebe gereinigt, mit fließendem Wasser so lange gewaschen, bis die Waschflüssigkeit klar ist, anschließend bei 250 C 18 Stunden in eine 0,330/oige wäßrige Formaldehydlösung eingetaucht und etwa 15 Stunden in langsam fließendem Wasser gewaschen. Then the material is mechanically cleaned of loose tissue, with Washed under running water until the washing liquid is clear, then immersed in a 0.330% aqueous formaldehyde solution at 250 ° C. for 18 hours and washed in slow running water for about 15 hours.

Das erhaltene Material wird auf Festigkeit und Dichtigkeit geprüft, beispielsweise indem ein Ende der Röhre mit einem Drucklufthahn verbunden wird, während alle anderen Öffnungen zugebunden werden, das Ganze in Wasser getaucht und der Luftdruck erhöht wird. Eine Röhre wird als befriedigend angesehen, wenn sie sich bei einem Luftdruck von wenigstens 240 mm Hg nicht ungewöhnlich erweitert und keine Zuluft durchläßt. Derartige Röhren können in 500/oigem wäßrigem Äthylalkohol aufgehoben werden. Zum längeren Lagern kann das Fertigprodukt in einer Sterilisierungslösung auf 1 °/o Propylenoxyd in 500/oigem wäßrigem Äthylalkohol aufbewahrt werden. The material obtained is tested for strength and tightness, for example by connecting one end of the tube to a compressed air tap, while all other openings are tied, the whole thing is immersed in water and the air pressure is increased. A tube is considered satisfactory if it does not expand abnormally at an air pressure of at least 240 mm Hg and no Lets air through. Such tubes can be in 500% aqueous Ethyl alcohol are canceled. The finished product can be stored in a Sterilizing solution on 1% propylene oxide in 500% aqueous ethyl alcohol be kept.

Es werden 71l dicke Gewebequerschnitte auf die übliche Weise durch Einbetten in Paraffin hergestellt. There are 71l thick cross-sections of tissue in the usual way Embedding made in paraffin.

Die eine Probe wird mit Standard Hämatoxylin und Eosin, die andere mit Verhöffscher Bindegewebefarbe angefärbt (»Biological Staining Methods«, 5. Ausgabe, 1952, George T. Gurr Ltd., London) und die erhaltenen Präparate mikroskopisch untersucht.One sample is made with standard hematoxylin and eosin, the other stained with Verhöffscher connective tissue dye ("Biological Staining Methods", 5th edition, 1952, George T. Gurr Ltd., London) and the obtained preparations examined microscopically.

Die Proben bestehen aus einer dichten äußeren Schicht aus groben Kollagenbündeln, die mit Fuchsin stark gefärbt sind, und aus einer inneren Schicht dünner, geschichteter Kollagenringe. Diese können geringe oder nicht störende Mengen unvollständig abgebauten Muskelgewebes enthalten. The samples consist of a dense outer layer of coarse Bundles of collagen that are heavily colored with fuchsine and made up of an inner layer thin, layered collagen rings. These can be small or non-disruptive amounts Contain incompletely degraded muscle tissue.

Bei oberflächlicher Betrachtung ist das Produkt weiß, die äußere Oberfläche gibt den Eindruck von spiralen Vernetzungen grober Faserbündel, die innere Oberfläche ist glatt und glitzert. On superficial inspection, the product is white, the outer one The surface gives the impression of a spiral network of coarse fiber bundles, the inner one Surface is smooth and glitters.

Wahlweise kann die Röhre nach der Behandlung mit Enzymlösung auch durch Behandeln mit einem Chromoxydbad während 45 Minuten bei Raumtemperatur gehärtet und anschließend 1 Stunde in fließendem Leitungswasser gewaschen werden. Die Gerblösung kann folgendermaßen hergestellt werden: eine Mischung aus 103 g Ammoniumbichromat und 178 g konzentrierter Schwefelsäure (etwa 96°/o) wird mit Wasser zu 1 1 verdünnt, und 24 Gewichtsprozent wäßriges Natriumbisulfit werden unter Bewegen zugegeben, bis der Bichromattest mit Diphenylcarbazid nicht mehr positiv ist. Das erhaltene Präparat wird auf 3 1 gebracht und 1 Woche bei Raumtemperatur aufgehoben. Zum Gerben werden 2 ccm dieser gealterten Chromoxydlösung je Gramm Kollagen auf 200 ccm verdünnt. Optionally, the tube can also be used after treatment with enzyme solution cured by treatment with a chromium oxide bath for 45 minutes at room temperature and then washed for 1 hour in running tap water. The tanning solution can be prepared as follows: a mixture of 103 g ammonium dichromate and 178 g concentrated sulfuric acid (about 96%) is diluted with water to 1 liter, and 24 percent by weight aqueous sodium bisulfite are added with agitation, until the bichromate test with diphenyl carbazide is no longer positive. The received The preparation is brought to 3 l and stored for 1 week at room temperature. For tanning 2 cc of this aged chromium oxide solution per gram of collagen are diluted to 200 cc.

Ein 26 kg schwerer männlicher Bastard-Hund wird mit Pentobartital-Natrium lokal vom Becken bis zum Brustbeinknorpel betäubt. Der betäubte Teil wird von Haaren frei gemacht, gewaschen und mit Jodtinktur bestrichen. Die Bauchhöhle wird mit einem Medianschnitt freigelegt, der etwa 7,5 cm unter dem Brustbeinknorpel beginnt und 5 cm hinter dem Schambein endet. Die untere Bauchschlagader wird freigelegt und beweglich gemacht, nachdem alle Nebengefäße im Operationsbereich abgebunden worden sind. Unterhalb der linken Nierenschlagader und iiber den Hüftschlagadern werden Gefäßklemmen angebracht und ein kleiner Teil der Schlagader zwischen den Klemmen herausgeschnitten. In die Hüftschlagadern jenseits der Klemmen wird Heparin eingespritzt. A 26 kg male bastard dog is given pentobartital sodium locally anesthetized from the pelvis to the sternum cartilage. The numbed part is made up of hair freed, washed and smeared with iodine tincture. The abdominal cavity is made with a Uncovered median incision that begins about 7.5 cm below the sternum cartilage and Ends 5 cm behind the pubic bone. The lower abdominal artery is exposed and Made mobile after all secondary vessels in the operating area have been ligated are. Below the left renal artery and above the hip arteries Hemostatic clamps attached and a small portion of the artery between the clamps cut out. Heparin is injected into the hip arteries beyond the clamps.

Eine unverzweigte Fremdtransplantation von 3,7 cm Länge, die 7 Tage in einer Sterilisationslösung von 1 Gewichtsprozent Propylenoxyd in S00loigem Äthylalkohol gelegen und anschließend 28 Tage vor ihrer Verwendung darin aufbewahrt worden war, wird 15 Minuten mit steriler Kochsalzlösung gewaschen und dann zum Überbrücken des chirurgisch entfernten Teils der Schlagader verwendet. An unbranched alien graft of 3.7 cm in length that took 7 days in a sterilizing solution of 1 percent by weight propylene oxide in 500% ethyl alcohol was located and then kept in it for 28 days prior to its use, is washed for 15 minutes with sterile saline and then to bypass the surgically removed part of the artery used.

Die vorderen und hinteren Gefäßverbindungen werden durch fortlaufende, nach außen gekehrte Matratzennähte mit einfachen laufenden Stichen aus 5-0-Schlagader-Nähseide hergestellt. Dann werden die Klemmen entfernt und der Blutfluß wieder in Gang gebracht.The anterior and posterior vascular connections are made by continuous, Outward-facing mattress seams with simple running stitches made from 5-0 artery sewing floss manufactured. The clamps are then removed and blood flow restarted.

Die operierte Stelle wird mit Bauchfell bedeckt, um ein Anwachsen mit dem Darm zu verhindern. Der Schnitt in der Bauchdecke wird mit unterbrochenen Nähten aus 2-0-Nähseide wieder geschlossen.The operated area is covered with peritoneum to allow growth with the intestines to prevent. The cut in the abdominal wall is interrupted with Seams made of 2-0 sewing silk are closed again.

Dieser Hund- wurde nach 90 Tagen getötet und eine Autopsie durchgeführt. This dog was killed after 90 days and an autopsy was performed.

Allgemeiner Befund Es wurden keine Zeichen großer Dilation gefunden. General Findings No signs of major dilation were found.

Zwei Drittel der inneren Oberfläche der Transplantation war mit glattem, glitzerndem und von dem Endothelium des Versuchstieres nicht unterscheidbarem Pseudo-Endothelium bedeckt. Der mittlere Teil der Transplantation bestand aus einem unregelmäßigen rauhen Teil.Two thirds of the inner surface of the graft was covered with smooth, glittering pseudo-endothelium indistinguishable from the endothelium of the test animal covered. The middle part of the transplant consisted of an irregular one rough part.

Mikroskopischer Befund Subakute entzündliche Reaktionen wurden an beiden Nahtlinien beobachtet. Diese waren teilweise durch die Seide hervorgerufen worden. Der größte Teil der Transplantation war vollständig mit neuem Fasergewebe infiltriert. Die Kollagenablagerung war nahe den Nahtlinien am größten. Elastisches Gewebe war nicht zu bemerken. Der als Pseudoendothelium beschriebene Teil bestand aus wohl differenziertem Bindegewebe, dessen Fasern in länglicher Richtung angeordnet waren. Der mittlere Teil der Transplantation bestand aus amorphem, durch Eosin leicht anfärbbarem Material ohne nukleare Elemente. Offensichtlich war dieser nicht störende wandständige Thrombus dabei, sich dem Organismus anzupassen. Microscopic Findings Subacute inflammatory reactions were indicated observed both seam lines. These were partly caused by the silk been. Most of the transplant was complete with new fiber tissue infiltrated. The collagen deposition was greatest near the suture lines. Elastic There was no tissue. The part described as pseudoendothelium existed of well-differentiated connective tissue, the fibers of which are arranged in an elongated direction was. The middle part of the transplant consisted of amorphous, light by eosin dyeable material without nuclear elements. Obviously this one wasn't bothersome wall-mounted thrombus in the process of adapting to the organism.

Diese Befunde zeigen, daß die Transplantation völlig erfolgreich war, da sich innerhalb von 14 Tagen (der üblichen Zeit innerhalb welcher sich grober Mißerfolg, d. h. Tod des Versuchstiers oder Paralyse des hinteren Teils einstellt) keine nachteiligen Folgen zeigten. Außerdem war die Transplantation auf dem Wege, mit neuem Gewebe durchsetzt zu werden. These findings show that the transplant was completely successful was, because within 14 days (the usual time within which more coarse Failure, d. H. Death of the test animal or paralysis of the posterior part) showed no adverse consequences. Besides, the transplant was on the way to be interspersed with new tissue.

Beispiel 2 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde mit einem 30 kg wiegenden weiblichen Bastard-Hund wiederholt, wobei eine 3,3 cm lange Transplantation eingesetzt wurde, die nach der 7tägigen Sterilisationszeit 14 Tage in der Sterilisationslösung aufbewahrt worden war. Example 2 The procedure of Example 1 was followed with a 30 kg weigher female bastard dog repeated with a 3.3 cm long graft inserted which was 14 days in the sterilization solution after the 7-day sterilization period had been kept.

Nach 268 Tagen ist der Hund lebendig und aktiv. After 268 days, the dog is alive and active.

Er hat fühlbare Pulse in den Oberschenkeln und zeigt keinerlei Symptome für ein Fehlschlagen der Transplantation.He has palpable pulses in his thighs and shows no symptoms for failure of the transplant.

Daraus ist ersichtlich, daß die Transplantation völlig gelungen ist. From this it can be seen that the transplant was completely successful.

Vergleichbare analoge Ergebnisse können durch bestimmte, beispielsweise durch die folgenden Abänderungen erzielt werden. Als Ausgangsmaterial wird ein röhrenförmiges Gefäß von einem Säugetier, vorzugsweise ein Blutgefäß von einem Rind, verwendet, einschließlich von solchen in Y-, T- oder sonst verzweigten Formen. Comparable analogous results can be achieved by certain, for example can be achieved by the following amendments. The starting material used is a tubular A mammal vessel, preferably a bovine blood vessel, including those in Y, T or otherwise branched forms.

Die Enzymlösung kann handelsübliches Ficin oder ein gereinigtes und konzentriertes, das proteolytische Enzym enthaltendes Material sein. Die aktive Ficin-Konzentration in der Lösung soll etwa 0,25 bis 50/0, vorzugsweise 0,5 bis 2,00/0 und insbesondere 0,5 bis 1,5 0/o, betragen, wobei die höheren Konzentrationen einen schnelleren Abbau bewirken. Die Behandlungstemperatur soll zwischen 30 und 450 C, vorzugsweise zwischen 34 und 400 C und insbesondere zwischen 36 und 380 C, liegen, wobei die höheren Temperaturen wieder schnelleren Abbau ergeben. Das Verhältnis von Gewichtsteilen nasser Arterien zur Enzymlösung soll dabei innerhalb eines Bereiches von 1. bis 3 Teilen Arterie je 10 Teile Lösung, vorzugsweise zwischen 1 und 2 :10, insbesondere bei 1,5 :10, liegen. Die Behandlungslösung sollte auf einen p-Wert zwischen 4,0 und 7,0, vorzugsweise zwischen 4,5 und 6,0 und insbesondere zwischen 5,0 und 5,5, gepuffert sein, wobei in dem letzten pn-Bereich der schnellste Abbau erreicht wird. Die Abbauzeiten betragen 2 bis 8 Stunden, vorzugsweise 2,5 bis 6 und insbesondere 2,3 bis 3 Stunden. Konzentration, Menge, p-Wert, Temperatur und Behandlungszeit werden so aufeinander abgestimmt, daß die gewünschte Erhöhung des festen Kollagengehalts erreicht wird. The enzyme solution can be commercially available ficin or a purified one concentrated material containing the proteolytic enzyme. The active one Ficin concentration in the solution should be about 0.25 to 50/0, preferably 0.5 to 2.00 / 0 and in particular 0.5 to 1.5 0/0, with the higher concentrations cause a faster breakdown. The treatment temperature should be between 30 and 450 C, preferably between 34 and 400 C and in particular between 36 and 380 C, the higher temperatures result in faster degradation. The relationship from parts by weight of wet arteries to the enzyme solution should be within a range from 1 to 3 parts of artery per 10 parts of solution, preferably between 1 and 2:10, in particular at 1.5: 10. The treatment solution should have a p-value between 4.0 and 7.0, preferably between 4.5 and 6.0 and in particular between 5.0 and 5.5, with the fastest in the last pn area Degradation is achieved. The degradation times are 2 to 8 hours, preferably 2.5 up to 6 and in particular 2.3 to 3 hours. Concentration, amount, p-value, temperature and treatment time are coordinated so that the desired increase the solid collagen content is achieved.

Die Behandlung mit wäßrigem Formaldehyd wird in einer Konzentration von 0,3 bis 3,30/0 vorzugsweise von 0,3 bis 1,00/o und insbesondere von 0,3 bis 0,5 O/o, bei Temperaturen im Bereich von 10 bis 350 C, vorzugsweise 20 bis 350 C und insbesondere 25 bis 300 C, während einer Zeit von 4 bis 24 Stunden, vorzugsweise von 15 bis 20 Stunden und insbesondere von 17 bis 18 Stunden, durchgeführt. Atmosphären-oder erhöhter Druck kann verwendet werden. Treatment with aqueous formaldehyde is used in one concentration from 0.3 to 3.30 / 0, preferably from 0.3 to 1.00 / 0 and in particular from 0.3 to 0.5 O / o, at temperatures in the range from 10 to 350.degree. C., preferably from 20 to 350.degree and in particular 25 to 300 C, for a time of 4 to 24 hours, preferably from 15 to 20 hours and especially from 17 to 18 hours. Atmospheric or increased pressure can be used.

Es können auch andere Härtungsmittel verwendet werden, die entsprechende Eigenschaften verleihen, z. B. Glyoxal, Chromoxyd oder wasserfreie Alkohole, wie Methanol, Äthanol od. a. Other hardening agents can also be used, the corresponding Give properties, e.g. B. glyoxal, chromium oxide or anhydrous alcohols, such as Methanol, ethanol or a.

Die Sterilisation kann durch Behandlung mit einem Alkylenoxyd, wie Äthylen- oder Propylenoxyd, mit ß-Propiolacton oder mit verdünntem wäßrigem Formaldehyd durchgeführt werden. Sterilization can be carried out by treatment with an alkylene oxide such as Ethylene or propylene oxide, with ß-propiolactone or with dilute aqueous formaldehyde be performed.

Claims

PATENT CLAIMS 1. Tubular, in dry form or in a sterile liquid to be stored at an internal pressure of 240 mm mercury impervious, sterile, suitable for insertion into humans or mammals Collagen material preferably in Y- or T-shape, which has a collagen content of at least 80% and in which the collagen fibers are practically their natural Have composition.

2. Process for making tubular collagen material according to claim 1, characterized in that tubular blood vessels of mammals, preferably cattle, with a 0.25 to 50% ficin enzyme solution at temperatures from 30 to 450 C in a pH range of the solution from 4.0 to 7.0 for a time degraded from 2 to 8 hours until the collagen content rises to at least 800 / o after which the treated material is washed with water to remove the enzyme and then subjected to a hardening treatment.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the Hardening treatment with aqueous formaldehyde at a concentration of 0.3 to 3.3 0 / o at temperatures between 10 and 350 C for a time of 4 to 24 hours is carried out.

4. The method according to claim 1 and 2, characterized in that as Hardening agent chromium oxide is used.

5. The method according to claim 1 to 3, characterized in that as Hardening agent methanol is used.

6. The method according to claim 1 to 5, characterized in that the hardened material is sterilized.

7. The method according to claim 1 to 6, characterized in that with Ethylene or propylene oxide is sterilized.