DE1543796A1

DE1543796A1 - Verfahren zur Herstellung biologisch aktiver Peptide

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Publication number: DE1543796A1
Application number: DE19661543796
Authority: DE
Inventors: Greven Hendrik Maria
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1965-07-28
Filing date: 1966-07-27
Publication date: 1970-01-02
Also published as: US3479333A; CH491864A; GB1138767A; NL6509727A; FR1499229A

Description

OR.ING. F. WUESTHOFF IHPL. ING. G. PULS DR.E.T.PBCHMANN

PATENTANWÄLTE

Sf/ IJ Vf EJ O

Ί: "Λ-Κνι:-_Λ :

1Λ-31

E e s c Ix r ..e_iM i_. \\u -A A
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Ii.V ο ORGAIIOl
Kloosterstraat; 6

OSS / Iiederlandβ

betreffend

Verfahren zur Herstellung biologisch a'kt.tfe.r Peptide,,

Erfindung "bezieht sichauf die Herstellung neuei* Decape^i.,^e, b«i denen- die Sequenz; der ersten 1o Aminosäure· reate der des Adrönocortioo Iropeii Hormone ejitapriclit, gerechnet vom endständigen Stickstoff des Moleküls.

Das bekannte Decapeptiü mit dieser AminobäuröseQ.uenz, bei dem alle optisch aktiven Aiaino saureres te in der L-Konfiguration auftretsn, ist z.B, in HeIv. Ghim, Acta 44, 1991 (1961) beschrieben worden.

8AD

154379b

Von dieser Verbindung ist bekannt, daß nie die I-Ielanocyten (MSH-Y/irkung) anregt, was beschrieben ist in Recent Progress in Hormone Research 18, 6? (196,?)« Weiterhin stimuliert das Decapeptid.die Ausscheidung des Adrenocorticotropen Hormons (ACTH) aus der Hypophyse (CBF-WIrkung), vergleiche Experientia 16, 414 (1960),, Schließlich wurde in Nature 189, 681 (1961) beschrieben, daß dieses Peptid nach Inkubation mit Fettgeweben von entsprechend sensitiven Tierarten, in vitro eine Aktivität auf die Mobilisierung von Fettpolstern ausübt und den freien Fettsäurespiegel des Inkubationsmediums anhebt. Die letztgenannte Aktivität, gemessen als minimale Wirkungsdosis bei Kaninchenfettgeweben, liegt bei etwa 1/14 der ■&** von ACTH selbst, vergleiche Ar oh. Biochem. Biophys." 99* 294- (1962).

Es ist nun ein Verfahren gefunden worden zur Herstellung biologisch aktiver Decapeptide, mit einer dem Adrenocorticotropen Hormon entsprechenden folge der ersten 1c Aminosäurereste, gerechnet vom endständigen Stickstoff, Dieses Verfahren ist daduroh charakterisiert, daß ein Decapeptid gemäß den bekannten Synthesen von Peptiden sxi.t !-Aminosäuren hergestellt wird, bei dem jedoch zumindest der P.heiiylaianinrest in der D-Form ersehe int.

Die neuen Decaptptirte unterscheiden sich von den bekannten Decapeptiden, bei denen die ersten 9 Aminosäurereete die !-Konfiguration besitzen, durch ihre verbesserte Aktivität auf

die Fettmobilisier: >?;.£, .^nassen in. vi br ο "bsi 5c,- ~2:~-_:;.-'.i. lceit und- in vivo, y-o χει sun Beispiel als Aktivität -.Ies 7-D™ Phe-de.capept.idi-: .eukr ale sehnmal grower als üi-s des bekannten Deeapepvi.üeso Auüerde.m vmrde gefunden, daß Deeanapticle, bei denen mindestens der Pherivlalaninrest in der D-S'onf!duration auftritt, einen überraschenden Effekt auf das erlernte Verhalten von Ratten besitEen, nämlich ein beschleunigtes Auslöschen des angelernten Verhc*ltens bewirken*

Die Synthese dieser Verbindungen kann ^ϊτ'-ίΛ den für die Synthese von Peptiden der L-Amino säure η bekannter. Methoden erfolgen· Abgesehen von der optischen Isomerie können diese Peptide durch die folgende Aminosäure-sequenz gekennzeichnet werden«

X
ι

H-S e r-Ty r-Se r-Me t-Glu-His-Phe -Ar g-T ry-G Iy-OII

123456789 10 X β OH oder KHp.

So kann das Tripeptid (1-3), bekannt aus Angew. Chem. 72, 915 (1960) gekuppelt werden mit dem Heptapeptid (4-10). Auch ist es möglich gemäß HeIv. CMm. Acta 44, 1991 (1961), das Tetrapeptid (1-4) mit dem Hexapeptid (5-10) zu kuppeln, oder das Pentapeptid (1-5), das in J.Am.Chem. Soo. 79, 1636 (1957) beschrieben ist, mit dem Pentapeptid (6-10) aus Hature 182, 1669 (1958) bzw. J. Am. Chem. Soo. 80, 1486 (1958). Ebenso

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BAD ORIGINAL

kann das Dipeptid (1-2), beschrieben in J. Am. Chem. Soc. 79, 1636 (1957) mit dem in J. Am. Chem. Soo. 79, 6087 (1957) be-, schriebenen Oktapeptid (3-10) gekuppelt werden.

Diese Kupplungen können nach konventionellen Methoden der Peptidsynthese durchgeführt werden, z.B. mittels Dicyclohexylcarbodiimid- oder nach der Azidsynthese. Pur diese Zwecke wird Gebrauch gemacht von den bekannten Methoden zum Schütze der funktioneilen Gruppen der Aminosäuren und Peptide, die nicht an der Reaktion teilnehmen sollen. Im allgemeinen werden solche Gruppen angewandt, die nach der Bildung der Peptidkette leicht wieder durch Hydrolyse oder Reduktion abgespalten wer·»- den können.

In vitro wird die Wirkung auf die Fettmobilieierung der beschriebenen Verbindungen durch Messen dea Gehaltes an nicht veresterten Fettsäuren (NVFS) bestimmt nach Inkubation des Fettgewebes mit der aktiven Verbindung während einer bestimmten Zeit. Bei diesem Verfahren wurde die Methode von White and Engel, beschrieben in J. Clin. Invest. 37, 1556 (1958) im wesentlichen übernommen. Als Versuchstiere wurden meist Kaninchen und Ratten benutzt, bei denen gefunden wurde, daß sie gegenüber fettmobilisierenden Mitteln empfindlich sind. Die Bestimmungemethode kann folgendermaßen zusammengefaßt werden«

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SAD ORIGINAL

Das von Tieren, z.B. von der Bauchhöhle der Ratte oder den Nieren des Kaninchens stammende Fettgewebe wird möglichst rasch in Anteilen von 50 mg in 25 ml-Inkubatoren gegeben, mit 1 ml Krebs-Ringer Bicarbonat-Puffer versetzt, der 4$ Rinder-Albumin und o,o1 ml einer Lösung der zu prüfenden Substanz enthält.

Der Puffer wird mit einem Gasgemisch von 95?ί Sauerstoff und 5<fo Kohlensäure ge sättigt „ Die Inkubatoren werden dann 3 h bei 37⁰C geschüttelt und ihr Inhalt anschließend in Zentrifugenhülsen gegeben, zu denen 2,5 ml eines Extraktionsgemisches hinzugefügt werden, das aus 40 Volumenteilen Isopropylalkohol, 10 Teilen Heptan und 1 Teil einer 1n Schwefelsäurelösung besteht. Man läßt über Nacht stehen und gibt dann 3 ml Heptan und 2 ml destilliertes Wasser hinzu. Daraufhin werden die Zentrifugenhülsen 2 Min. lang geschüttelt und anschließend der Inhalt zentrifugiert. Es wird nun der Gehalt an NVFS in der Flüssigkeit durch Titration mit einem Indikatorgemisch nach Dole bestimmt, das in J. din. Invest,, 35, 150 (1956) beschrieben ist. Nach Anbringen.der notwendigen Korrekturen wird die Nettomenge der gebildeten freien Fettsäuren (NVFS) erhalten und in Ai Gramm - äquivalent NVFS pro Gramm' Fettgewebe pro 3 h ausgedrückt. Durch Vergleich der Dosis-Aktivität-Kurven kann man das Verhältnis der Aktivitäten der verschiedenen Substanzen bestimmen.»

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BAD ORIGINAL

In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die Versuchsergebnisse angeführt, die mit dem bekannten Decapeptid erhalten wurden, das hier "All L"-decapeptid genannt wird, und bei dem alle optisch aktiven Aminosäurereste in der L-Konfiguration auftreten. Darunter stehen die Werte, die mit dem Decapeptid erhalten wurden, bei dem der L-Phenylalaninrest in Position 7 durch den entsprechenden Rest in D-Konfiguration ersetzt wurde. Es wurde der IJVFS-Gehalt von fünf verschiedenen Dosierungen bestimmt. Als Versuchstiere wurden Kaninchen benutzt. Alle Bestimmungen wurden dreifach durchgeführt.

Tabelle 1

	Dosierung in mg	/U Äq. 2IVI¹SVg Fett/3h
»All I" decapeptid	0.04	1.3 + 0.1
	0.2	2.5 + 0.7
	1.0	5.9 + 1.4
	5.0	12,8 + 5.5
	25.0	19.3 + 2.5
7-D—phe-decapeptid	0.04 - -	2.2 + 0.7
	0.2	8.5 + 1.2
	1.0	14.7 + 0.6
	5.0	17.1 + 1.7
	25.0	20.2 + 5.1

nicht veresterte Fettsäure.

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ORiGi_NAL

Verglichen mit dem "All L"-decapeptid ist die Fettmobilisierungsaktivität des Decapeptids, "bei dem aer 1-Phenylalaninrest durch die entsprechende D-Form ersetzt wurde, klar erhöht. Diese Steigerung kann einerseits dadurch verursacht sein, daß die urs prüiigli ehe Aktivität des Decapeptidee durch den Ersatz der !-Aminosäure durch deren D-Form erhöht vairde, oder andererseits dadurch, daß die Zersetsun_f'f diener Peptide in Gewebe geringer ist. Der letztgenannte Grund scheint wahrscheinlicher. Die obengenannten Peptide wurden nicht nur in vitro sondern auch in vivo an Kaninchen getestet, wobei die HVFS-Mengen gemessen wurden, die nach zunehmenden Zeitdauern an das Blut abgegeben wurden und nach Eingabe der Peptidpräparationen für die Prüfung in verschiedener Dosierung.

Tabelle 2

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BAD ORIGINAL

labeile 2

.Dosierung Ii ii. mg	"All L"-Ge ...i»	i.v.	Tier	/U Ac_- ο	. ITVFS'	/1 Serum nach Zeit (Ii)	2	best.·
	peptid			j	1/2	' 1		4
	1.0		400 i			710
	»s	Y 1	92	1370	710	650	710
	5oO	V 2	630	1650	710	843	950
7-D-Phe-	η	V 3	790	2590	2020	544	800
decapeptid		V 4		3050	2680		576
	0.2		705			1250
	Il	Y 5	534	756	768	1205	1120
	1.0	V 6	576	2290	1910	1535	1055
	it	V 7	394	3160	2470	1980	1230
	5.0	V 8	156	2810	2240	3520	1040
It	V 9	1120	4230	4280	4450
V10	4300	5100	-

nicht veresterte Fettsäure.

Bemerkung* NVFS-YTerte höher als 1000 yu-Jäquivalente werden als positive Reaktion betrachtet.

Aus dieser Tabelle geht hervor, daß das Verhältnis der in vivo-Aktivitäten von 7-D-Phe-decapeptid zu ¹¹AIl-I¹*-decapeptid etwa dem Verhältnis entspricht, das bei der in vitro-Aktivltät gemessen wurde. Die Aktivität des 7-D-Phe-decapeptides

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ORIGINAL

ist .noch nach 2 und nach 4 h vorbanden, AtUi-I¹Uf::, ■".■"■:.- "'<..:■. 'h das "All !"-decapeptid verursachte ;_;.ri3t.Iv;, ά<^:-;~ H.- · ^ι:-:.<;.· .^;c von weit kürzerer Dauer ist, Deingctma-i;! LsU ;]!:■ }r^v ■■■■.-ν r^ re- rechtfertigt, daß das B-Phe-peptid .Lj-: Korper \'β?ί ■ .>v- ;..«?:,.ciit zersetzt wird.

Bine der experimentellen Methoden, l>ei deueu. aus erlernte Verhalten von Ratten studiert werden kann» ist die» I>e;j der der Tragstangensprungkäfig ("pole jump cage") "benutzt wird. Ratten werden dazu abgerichtet, auf eine Staage au springen, sowie ein Licht als sogenannter tonditionierter Reiz, aufleuchtet· 5 see. nach diesem Reiz läßt man einen ilsktrisoiien Strom durch den Metallgitterboden fließen, der einen Schock verursacht. An drei aufeinanderfolgenden Tagen warden zehn Abriclitungsverbi'^he pro Tag durchgeführt mit einem festgelegten Ver« suohsintervall von 60 see. Ratten, die mindestens zehn positive Reaktionen während diener drei Tage mit 30 Versuchen aeigen, werden als· abgeriohtet betrachtet und für die Auelöschungsversuche benutzt. In diesen Versuchen wird festgestellt, wie rasch das verlangte Verhalten wieder ausgelöscht wird, indem man die Anzahl der positiven Antworten der Ratten auf die Anzahl der konditionierten Reize bezieht.

Eb wird derselbe Prozeß wie bein Lernen durohgeführt, mit der Ausnahme, daß der unkonditionierte Reiz, d.h. der eltktrisohe Schock, weggelassen wird. Me Gtsamtaneahl der von

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BAD ORIG»NAU

jeder Ratte gezahlten po^itiv^i: konditionierten Antworten sowohl während -.'los Lernene als i'uoh während der Auslöschung dient als ein Index iilr das konditionierte Pehlverhalten ("avoidance /behaviour") des Tiere?:'. A(JTE ist dafür bekannt, die Auslösciiurjg des konditionierten Verhaltens zu verzügern, was beschrieben wird von J,Y. I-Turphy et al« in J. comp» physiol. Psychol. 48, 47 (1955). Das stickstoffenuständige Decapsptid von ACTH hat denselben Effekt, wenn ea einmal sub kutan angewendet wird, in einer Dosis von 10 /ug pro Versuchs tier, und zwar in i'orm eines AdBorptionskomplexes mit Zink phosphat direkt nach der Lernperiode und: unmittelbar vor der Auslöschungsperiode, Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Decapeptide, bei denen zumindest der Phenylalaaninrest in der D-Porm auftritt, eine beschleunigte Auslöschung anstelle einer verzögerten Auslöschung zeigen. Diese Decapeptide wurden angewandt in Form eines schwerlöslichen Komplexes mit einem unlöslichen Salz, Oxyd oder Hydroxyd von Zink, Nickel, Kobalt, Kupfer oder Eieen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle enthalten.

!Tabelle 3

Angew. Peptid

Index für das oondi-l tionierte Pehlverhalten (Durchschnitt von 8-10 gieren)

!»•rnperiode

kein«

luslöschungB-periodt

Placebo

ACIH, 3 I.U.

»All l*~decaptptid,10/ug

7-D-Phe-decapeptid,10yug

10 23 20

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- 11 -

OHSGlNAL

deriei:,, zumindest !?;■ Vo¹H;, 1<^1 ::<"'■ i":-;:« st :..;'. -V-;:/ V "V ---■ .-. / -VΜ-* 'bezieht i:iCQ alt H'..¹;'.,' iV.--:/; auch, "iuf oi'; .v: -j.¹'- "^;: :..... ■_ : r/:"^:;lc-» neller je ΓΊν^τβ . ■ ' :'.:■■■':■- peptide, ^Ie:

a)- Die s.etallisciifcM υ.ϋ^;:ί .;_„;;;:^;:ni:^;.iim3ali:€ ^!.e? ^;J?:. ■;■.' :■"".■.:.-'-.'::■· Lp;;v.ii_} irisbesondere die was;- :rlö-slic.hen CaI^o₁ '·■;; ■: ·■-"■,■,;. ·;1υ. ■ Additionssalze cer i.iaiiiogrupper: sit a"ü^rc-;.^v-""^;-i·.-■'.:.'.-.:- Säuren, wie Salzsäure, -Bromwaaseretoff, So.hwf'::?elKä!u'·;.· .;":"^! ::^:v:.ö3ph.orsäure und mit organischen Säuren._f wie liSEigo:-'-::;-¹;·, Periist-eiiisäure, lialoneäure» llilchsäure,- Vieinsä.ure, ^:-^; .■■ \:.tr\'·■'-'-. ve _t Benzoesäure und aliphatische und aromf/tisout ■':v.lf■■"■'.£äurenj

"b) Stickstoff ständige Acylverbindungen, wie z,B# Acetyl^» und Benzoylverbindungenf

c) Die Ester der Carboxylgruppen, ζ·Β· Ester you niederen aliphatischen Alkoholenj

d) Die Säureamide der Carboxylgruppen, wie a,B. der )f -Carboxylgruppe des Glutaminsäurerestes, und insbesondere das Amid des C-ständigen Glyzine;

β) Peptide, bei denen die Aminogruppe blockiert ist, z.B. duroh. eine Tosyl-, [Erityl-, Benzyloxycarbonyl- oder t-Butoxyoarbonyl-Gruppe;

f) Schwerlösliche Komplexverbindungen, die aus den beschriebenen Peptiden bestehen und einem pharmazeutisch unbedenklichen schwer löslichen Salz, Hydroxyd oder Oxyd eines oder mehrerer der Hetalle: Zink, Nickel, Kobalt, Kupfer und Eisen. Diese Komplexe sind charakterisiert durch ihre im Vergleich

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- 12 -

BAD ORIGINAL

/J s

\:.:,-Z II.il.■;.■- c-Lamntär,- ,'¹Iy di's^-a ^jr^snutL^K.gee-j.g-ieter Hilfe«*

werden, 2*3^ -in iabl-s-jtenforia für airsa^ule, 3 u"o lingual e oder oromucosale Anwendung tinä" in für ύ±Θ Injakticn geeignete Jona, beispielsweise in lor-ü einer IiGsnag, Bamlsion oder Suspension* Iuoil für dies3 .3"λecke können die köirreationeilen Hilfsstoffe verwendet wei'den.

Die beschriebenen Decapeptide können nicht nur als Heilmittel sondern auch als Zwischenprodukt für die Herstellung von Medikamenten mit längerer Aminosäurekette verwendet werden, z.B. für Peptide mit ACTH-Aktivität. Die folgenden Beispiele beschreiben die erfindungsgemäße Synthese einiger Decapeptide.

Beispiel 1

Synthese des 7-D-Phe-deeapeptides gemäß dem folgenden Schema:

- 13 -

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^BAD

ν? :■ -J ν'

BOG

OtBu

B0Q~|Ser Tyr"Ser Metf-I^ H^Tu~^^~"~~~~~~^I^_I^e_'_2.^---^

	Tyr	Ser	Met	OtBu	.D-Ehe
BOG-feeχ				G-Iu His
	Tyr	Ser	Met	ψ	D-Phe
H-Öer			GIu His

Arg Sry Glsj-OH

In diesem Schema sind die Aminosäuren inii; den üblichen Abkürzungen angegeben. Alle optisch aktiven Aminosäurereste liegen in der !-!Form vor, mit Ausnahme des Phenylalaninrestes.

Außerdem sind folgende Abkürzungen benutzt worden» . BOO: t-Butoxyoarbonyl NPi p-Hitrophenyl . Z :Benzyloxycarbonyl tBui Ϊ-Butyl Me i Methyl

Zu einer Lösung von 37 g t-Butoxycarbonyl-D-Phe-OB und 19»3 g p-Nitrophenol in 1oo ml Äthylacetat wurden 28,1 g Bi-*. cyclohexylcarbodiimid in 100 ml Ithylacetat gegeben. Die Reak«·

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BADORiG¹NAL.

543796

"t.ionsaiischimg circle gerührt, imü 1 Ii bei -5^JG «mti danach 2 Ji-. b'3i Haumtomperatur stellen gelassen. Danacli wuvde die Mischung filtriert und. das Filtrat zur Trockene gedampft. Der Rückstand 'vur-de in iithylaoetat mnkristalläsiert, um 40$ 1 g des Esters (8O'/j) zu erhalten, Schmelzpunkts 128 Ms 128.,.5⁰Cr Spez.Dreiiungj + 22,3 in !DiDistliylformamid.

2. ι-Butoxycarbonyl-D-Phe-ArgCITO₂)

38,6 g t~Butoxycarl3onyl-D-Phe-0-(p-nitrophenyl) wurden in einer Lösung von 55,2 g H-Arg(N0₂)-Try-Gly-0CH₅ ^#2,1 HCl in 300 ml Dimethylformamid von O⁰C aufgelöst« !lach Zusatz von 29,4 ml Triethylamin wurde die Mischung 1 h bei O⁰G und über Macht bei Raumtemperatur gerührt. !Nach Yakuumverdampfen wurde das zurückbleibende Öl in 700 ml Äthylacetat gelöst und hintereinander mit 5?-5iger Zitronensäurelösung, Wasser, 5$iger ITatriumbicarbonatlösung, Wasser, 5$iger Zitronensäurelösung, Wasser gewaschen, dann getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde in 100 ml Äthanol gelöst, die Lösung dann in 1 1 trockenen Äthers unter heftigem Rühren geschüttet und der Niederschlag filtriert und getrocknet, um 60 g Tetrapeptid-lster (8O56) zu erhalten- Spez. Drehung: -43,3° in Methanol.

3* H-D-Phe-Arg (HO₂ )-Try-Gly-OCH₃*IiCl

48 g t-Butoxycarbonyl-tetrapeptidester, wie unter 2.) her-

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^BA0 origi_Nal

ι a.

'...Zu-einer'Lösung-von 5,36 g H-D₂ Ί·45 HCl in 30 ml'Dimethylformamid, von O⁰C wurden 0,7.2 g

is danach 0,08 ml Essigsäure und ..soiiliöSlich eine Lösung von 5 g B93S^loxycarbGnyl~Glu(0-t-Butyl)-HiS-U₃ in 49 ml Äthylacetat hinzugefügt. Die Mischung wurde dann 60 h bei O⁰C aufbewahrt, im Vakuum eingedampft und die dann erhaltene Lösung in 500 ml Wasser gegossen. Der erhaltene Niederschlag wurde zweimal mit 200 ml Äthylaoetat extrahiert. Die organische Schicht wurde solange gewaschen, bis sie neutral reagierte und dann zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit siedendem JLthylace tat aufgenommen, um danach 3»16 g (58$) des geschützten Hexapeptidesters zu erhalten· Schmelzpunkts128°G, Spez.Drehung: -14,6° in Dimethylformamid.

- 16 Ö09881/16S2

BAD ORIGINAL

15437SS

^:. ."■-:■ " '^ssjloxyca^oonvl-liesapop^lcliin^a^, hergestellt. gariaß -..■■. ^:- /üpcla in einar Mischung vo?i 40 '-I I&oxan und 10 V/aas er :?itf.~l'i£tt S'aeli Salats τοιι. 3_P1 ml ia-Allcaiilösung am:- Eßii-ir 1.:.^io;?JiaXö 35 Hiin verseift,, ITaoh Ausscheiden des 1 derschlages ivurden 3_?2 ml i-n-SalasäTirs irad. 300 ml Wasser hinzugefügt unit der Niederschlag nach Piltration und Auswaschen bei 30⁰C im Yalruuiü getrocknet» Das Bensyloxycarbonyl-hezapeptid wurde in Qiiier Ausbeute von 2₉65 g (SS^) erhalten. Spez. Drehung ι 18,4° in Dimethylformamid. .

6. H-GIu- (O-t-Butyl) -HiB-^Phe-Arg-Iry-qiy-OH

2,5 g Benzyloxycarbonylhexapeptid, hergestellt nach 5·)» wurde in 40 ml 90$iger Essigsäure suspendiert. Danach wurden 400 mg eines 10?£ Palladium enthaltenden Aktivkohlekatalysators hinzugefügt, worauf die Mischung bei 20⁰C und 3 at Überdruck 48 h lang hydriert wurde. Nach Vakuumeindampfen des Reaktionsproduktes bis zur Trockene wurden 250 ml trockenen Äthers hinzugefügt. Es bildete sich ein pfirsichfarbener Niederschlag, der mit Äther gewaschen wurde. Nach dem Trocknen erhielt man 2 g des Hexapeptides. Spez. Drehung? 0° in Dimethylformamid*

- 17 -909881/US 2

.- 17

7. t-ButoxyoarTaopyl-Ser-Iyr-Ser-Meii-gltt(O-t-Butyl.)-Hia-D»

Mit Hilfe vonNatriumnitrit vjurden 4,4 g BuI? oxy car bonyl-Syr-Ser-Met-lpH^ in "bekannter Weise in das Li⁷Aa umgewandelt, das dann zu einer lösung von 5,1 g des in 6«) hergestellten Hexapeptides in 75 ml Dimethylformamid bei O⁰C hinzugefügt wurde₀ Hach Zugabe von 0,6 g iriäthylamia. ließ aiaa das- G-emisch 4 2age bei O G stehen, dampfte dann zur trockene imä ©iiromato-' graphierte das Eeaktionsprodiikt ifoer eine mit Garboxymethy 1— Zellulose gefüllte Säule. Die Substanz wurde dann in ein G-emisch von t-Butanol und Wasser (1 ί 1) gegeben und mit verdünnter Essigsäure eluiert, um 1,8 g des geschützten'Decapeptides zu erhalten» Eine Bestimmung der Aminosäuren dieses Produktes nach Stein und Moore ergibt die nachfolgend in Tabelle verzeichne ;ü Werte j angegeben in Mol Prozent:

Tabelle 4

A.mino säure	His	Arg	Ser	GIu	Giy	.Met .	Tyr	Phe·.
Mol <fo	90,3	85.3	■89» 6	90.5	95 ο 7	85»9	94·0	92.3

8, 7-D-Phe~decapeptid

450 mg des oben hergestellten geschützten Deoapeptides

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wurden in 2 ml einer Mischung von 10 ml Trifluoressigsäure •und 1 ml Wasser aufgelöst. Nach. 1 h wurde die rot gefärbte Lösung zur Trockene eingedampft, der Rückstand danach mit einer Mischung von t-Butanol und Wasser (1 % 1) aufgenommen und mit eines Ionenaustauscher in Acetatform behandelt. Daraufhin wurde die Lösung filtriert und lyophilisiert. Ausbeute an 7-DvP'.i3'-deoapeptidi 392,4 mg.

Beispiel 2 Synthese von 2~S~;Pyr-*7-S-Phe~de6apeptid

1. t-Butoxycarbonyl-Ser-D-Tyr-OCH,

29_o1 g Dicyclohexylaminsalz des t-Eutoxyoarbonyl-Ser-OH und 17,5 g H-D-Tyr-OCH,. HGl wurden in einer Mischung von 94 ml Dimethylformamid und 470 ml Acetonitril suspendiert. U&oh J5G min dau3r-ηάem Rühren bei 2O⁰C wurde die Suspension auf -2⁰C gekühlt und unter weiterem Kühlen auf unterhalb O⁰C eine Lösung von 15,5 g Dieyelohexylcarbodiimid in 57 ml Acetonitril zugesetzt. Es wurde dann 4 h bei 0 C und schließlich bei Raumtemperatur weiter gerühmt. Dann wurde die Reaktionsmisuhung filtriert und in Yakmim eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde in A'thylacetat aufgenommen und mit 5^igeo? Zitronensäure, Wasser, Seigern latriumbicarbonat und nochmals mit V7asser gewaschen. ITach dem Trocknen wurde ein sehr feines

- 19 -.

909SS1/1i$2

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10_f7 g-dee Γοίαειι, gemäß "· ^ 'ssrgoEtoll^ss. ΪΏ,ΰορ-ϋΜθΘ

-is 70 ml KethaaGl ■ gsIG^':, ^::ωΐι'C:c:i:2i sri's f,,i-a!l -lyaraaiahyörat -νersetzt^ ;tfor:¥af die MUoira^ig_: aei- Εεΐϋ·όο?:ρ7;.^'οΐΐ.Γ uust Naoht "stehen gelassen wurde« Ji Zi>. <2 *"" ' ■-· "is?de

■.der .gebildete lledei'salilag; f:H ^n- ι^α '' Bttt&nol-Wasser (1 s 1) ausfcric u,Il-öiei ■ jisüi -ί,^ , , & . .Schmelspunkti 120⁰G■ unter Zersetzen.» Spez."Drehungs -4,0° in Dimethylformamid.

3. t-Butoxycarbonyl-Ser-D-TjT-Ser-Met-OCH,

3,6 g des gemäß 2.) hergestellten Hydrazides wurden in 17 ml 2il Salzsäure bei O⁰C gelöst. Dann wurden 0,69 g ITatriumnitrit in 3 ml Wasser und danach 15 ml DimethyIforuamid zugefügt. Die Mischung,wurde 8 min geschüttelt und dann mit.20 ml V/asser, und 20 ml 2n Kaliumcarbonat verdünnt. Die llischung wurde dann dreiaal mit je 20 ml üthylacetat extrahiert, die vereinigten Auszüge wurden zweimal mit Wasser gewaschen. Inzwischen waren 1,9 g H-Ser-Met-OCHi in 5 ml Dimethylformamid bei O⁰O suspendiert worden, und bu dieser Suspension wurde nun die

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BAD ORIGINAL

Azidlösung hinzugefügt, worauf die Mischung 24 h bei O⁰G aufbewahrt wurde. Daraufhin wurde sie mit V/aseer gewaschen, und das Wasser verdampft. Als Rückstand erhielt man ein öl, das bis jetzt nicht kristallisiert erhalten werden konnte. Ausbeute» 32 g (56$). Spez.Drehung» -32,0° in Methanol.

4. t-Butoxycarbonyl-Ser-D-Tyr-Ser-Met-NgH*

1,9 g des gemäß 3.) hergestellten Tetrapeptidesters wurden in 10 ml Methanol gelöst. Der Lösung wurden dann Of32 g Hydrazinhydrat hinzugegeben, worauf die Mischung 60 h bei Raumtemperatur und 24 h bei O⁰C stehen gelassen wurde. Der entstandene Niederschlag wurde filtriert und getrocknet. Nach Kristallisation aus Methanol-Ä'thylaoetat (1 χ 5) wurden 1,3 g des Hydrazides erhalten (68$). Schmelzpunkts 164 - 165⁰C, Spez.Drehungi -42,6° in Methanol-Wasser (1 ι 1)

5 · ^wGeBohtitztes^w-2-D-Tyr-7D~?he--decapeptid

550 mg des nach 4.) hergestellten Hydrazides wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst, flach Kühlen auf -20⁰C wurden 2,25 ml 1n Salzsäure hinzugefügt. Danach wurde eine Lösung von 0,06 g Natriumnitrit in 1 ml Wasser bei O⁰C hinzugegeben und die Mischung 8 min gerührt,.worauf sie mit 2 ml 2,5 η Kaliumbicarbonat-Lösung neutralisiert wurde. Die Mischung

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wurde dann zweimal mit je 15 ml Äthylacetat extrahiert, die Auszüge mit Wasser gewaschen,auf 5 ml Gesamtlösung eingedampft und dann mit einer Mischung von 20 ml Dimethylformamid, 0,15 g Triäth'ylamin und 750 mg Hexapeptid versetzt, wie in Beispiel 1 unter 6.) beschrieben. Die Mischung wurde 40 h bei 0 0 aufbewahrt und dann auf 7,5 ml eingedampft und mit Wasser auf 150 ml verdünnt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und im Vakuum bei 55⁰O getrocknet, um eine Ausbeute von 450 mg des geschützten Decapeptides: t-Butoxycarbonyl-Ser-D-Tyr-Ser-Met-aiu(O-t-butyl)-His-D-Phe-Arg-!Try-Gly-OH, zu erhalten, das charakterisiert ist durch einen Rf-Wert von 0,23, gemessen mit DünnschichtchromatograpMe auf AlgO^ mit dem System Ithylacetatj Pyridin : Essigsäure j Wasser = 60 j 20 ; 6 s 11. Ifaoh Abspalten der Schutzgruppen mit Hilfe eines Gemisches von Trifluoressigsäure und Wasser (10 ί 1) wurde das erhaltene Decapeptidtrifluorace Sat judt einem Ionenaustauscher in Acetatform behandelt, um 305 mg des 2-D~2yr-7-D-Phe-d8capeptides zu erhalten. Rf W 0,58 auf SiO₂ mit dem System n-Butanol ·. Essigsäure : Wasser = 100 i 15 : 35.

Beispiel 3
Synthese des 1-D-Ser-2~D-3}vr-7-D-Phe-decapeptides

Ausgehend von 5»1 g des Dioyclohexylaminealzss des t-Butoxycarbonyl-D-Ser-OH und 3,1 g H-D-Tyr-OGE«' HGl wurden

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3,8 g Dipeptidester erhalten. Schmelzpunkts 123-126⁰C, /

Spez.Drehung: +1° in Methanol. Hieraus wurden 3,2 g des entsprechenden Hydrazides erhalten vom Schmelzpunkt 196-2OO°C (unter Zersetzung) .und mit einer Spez.Drehung von +17,3° in Essigsäure. Bs wurde dann das Tetrapeptid t -But oxy cart) onyl-D-Ser-D-Tyr*-Ser-Met-OCH~ erhalten als harziges Produkt mit einer Ausbeute von 3,0 g,das ohne weitere Reinigung in 2,7 g des entsprechenden Hydrazides umgewandelt wurde. Durch Titration mit Perchlorsäure in Essigsäure wurde die Gegenwart einer Spur freien Hydrazins festgestellt, das als Salz gebunden ist. 800 mg des so erhaltenen t-Butoxy-D-Ser-D-Tyr-Ser-Met-lTpH^ wurden mit 1,1 g des Hexapeptids H-GIu(O-t-butyl)-His-D-Phe~Arg« Try-Gly-OH, das in Beispiel 1 "beschrieben wurde, gekoppelt zu 610 mg des folgenden geschützten Decapeptides: t-Butoxycarbonyl-D-Ser-D-Tyr-Ser-Me t^-Glu (O-t-butyl) -

His-D-Phe-Arg-Iry-Gly-OH, aus dem das 1-D-Ser~2~D-Tyr-7~D-Phe-decapeptid durch Abspalten der Schutzgruppen erhalten wurde. Ausbeute: 397 mg.

Beispiel 4 Synthese des 7-D~Phe-8-D-Arg-decapeptides

9,24 g t-Butoxycarbonyl-D-Arg-(M)₂)-OH vom Schmelzpunkt 108-11Q⁰C und spez.Drehung + 7.0° in Dimethylformamid wurden nach der Methode der gemischten Anhydride mit 11,0 g H-Try-GIy-OGH, als Monoacetat gekoppelt in 6,5 g (40?S) t-Butoxy-

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g mit der speζ,Drehung -24,7°

in Methanol. 4 g dieses Tripeptides wurden, nach Abspalten der t-Butoxycarbonyl-Gruppe, mit 2,2 g t-Butoxycarbonyl-B-Phe-O-p-nitrophenyl, beschrieben im Beispiel 1, gekuppelt in das Setrapeptid t-Butoxycarbonyl-D-Phe-D-ArgCliOgJ-Try-Gly-OCHv mit einer Ausbeute von 2,5 g. Wach Abspalten der t-Butoxyoarbonyl-Gruppe und Kuppeln mit BensByloxycarbonyl-Glu(O-t-Butyl)-wurden 2,05 g Benzyloxycarbonyl-Glu(0-t-Butyl)-His-JD-

2 erhalten. 950 mg dieses Materials

wurden nach Verseifen und Hydrieren mit t-Butoxy-Ser-Tyr-Ser-Met-N, zu t-Butoxy-Ser-0;yr~Ser-Met-Glu-(O-t-Butyl)-.HiB-D-Phe-D-Arg-5!ry-Gly-0H gekuppelt. Auebeute 510 mg. Nach Behandeln mit einer Mischung aus {Crifluoreesigsäure und Wasser (10s 1) folgte eine Behandlung mit einem Ionenaustauscher in Acetatform, wonach schließlich 255 ng des T-D-Phe-S-D-Arg-deoapeptidee erhalten wurden.

Beiapi¹·! 5 Synthese des 1~D*Ser-»2-D-Iyr->7~D-Phe-;8-»D-ArK~decapeptid8

660 mg I-Butoxycarbonyl-D-Ser-D-Tyr-Ser-Met-N,, beschrieben im Beispiel 3, wurden mit 740 mg H-GIu(O-t-butyl)-His-D-Phe-D-Arg-5ry-Gly-0H, beschrieben im Beispiel 4, gekuppelt zu dem geschtitsten Deoapeptids t-Butoxycarbonyl-D-Ser-B-Tyr-Ser-. Met-Glu-(O-t-Butyl)-His-D-PÄ»-D-Arg-Try-Gly-OH mit einer Aus-

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beute von 490 mg. Nach Abspalten der Schutzgruppeη und Aus-* tausch des Trifluoracetätes wurden 245 mg 1-D-Ser~2-D-Tyr-7-v D-Phe-8-D-Arg-decapeptid erhalten.

Beispiel 6 Suspension des 7-D-Phe-decapeptids

200 /Ug 7-D-Phe-decapeptid wurden in 6 ml 0,01 η Salzsäure gelöst. Dann wurde eine Mischung aus 0,3 ml ZnCl₂ (104 mg ZnCl₂ pro ml), 1 ml Na₃HPO₄ (6,3 mg Na₂HPO₄^H₂O pro ml + 35,0 mg NaCl pro ml) und 0,5 ml 0,1 η HCl zu der Peptidlösung hinzugefügt unter Rühren. Der pH-Wert der Mischung wurde dann auf 7»8 bis 8 eingestellt mit 0,5 η NaOH und das Gesamtvolumen dann mit destilliertem T/asser auf 10 ml gebracht. Die Anwendung dieses Präparates auf konditionierte Ratten verursachte ein unerwartetes Auslöschen ihres Fehlverhaltens, wie aus Tabelle 3 zu entnehmen ist„

Beispiel 7 Suspension des 2~D~!Eyr-7-D-Phe~decapeptid8

17,7 mg 2-D-Tyr-7-D-Phe-decapeptids wurden in 10,62 ml 0,01 η HCl gelöst. Zu 3 ml dieser Lösung wurden 0,06 ml ZnCl₂-Iösung mit 50 mg Zink pro ml hinzugefügt. Dann wurde der pH-V/ert auf 8,1 bis 8,5 eingestellt mittels einer 0,5 η

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natronlauge „Die erhaltene Suspension enthielt 0,6 ing Zink und 1 ig Peptid pro ml Lösung. Praktisch war das gesamte Peptid an das Zinkhydroxyd, adsorbiert und nur ein geringer Prozentsatz "befand" sich in lösung. In entsprechender Weise wurden zwei Suspensionen mit 0,3 mg bzw« 0,15 mg Zink pro ml und 1 mg peptid pro ml hergestellt. Die Wirkung, dieser Suspensionen auf das Fehlverhalten von Hatten entsprach der der Suspension des Beispiel 6.

Beispiel 8 Suspension des 1-D~Ser-2D-Tyr^7-I)~Phe-deeapeptidi3

1j5 ml Zinkchloridlösung mit 50 Big Zink pro ml -wurden . zu einer Lösung mit 1,35 mg Ha₂HPO₄'2HgO in 2 ml V/asser hinzugefügt." Der-gebildete .niederschlag wurde durch Zusatz von 2 Tropfen 4 η HCl in Lösung gebracht. I-arm wurden 5-mg Peptid in 4 ml W-asser gelöst und zu dieser Lösung die Zinkphosphatlösung hinzugefügt« . Schließlich"'xvurden 7,5 ml dieses G-eriisches UBd' 3» 3 ml 0,6 η natronlauge gleichseitig zu 12,5. -1 eii:er Lösung von-2$-Benzylalkohol-und .0.,2 5> JuXJl in 0,6 η Natronl hinzugegeben'*» Der eich eins teilende ρ H-V/er t betrug 3,0, Volumen wurde mit 1,7 ml Wasser --v,\f 7^r:-'sil ^τ^ΐΊτΛ_α .CIs ΰ -baltene Suspeiiöion zeigte einen aiuiliohen ikffekt auf das verhalten v/ie die Suspensionen "der-Beispiele 6 ιιηα 7 =

-.!Patentanspruch

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ÖAD ORIGINAL

Claims

DR. ING. F. WUESTHOFF DIPI* ING. G. PUXS DR.B.V.PECHMANN

PATKNTANWAl/TE

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1A-31 976

P a t e η t a η s ρ r u c h.

Verfahren zur Herstellung biologisch aktiver Peptide und deren funktioneller Derivate mit einer Sequenz der ersten 10 Aminosäurereste, die dem Adrenocorticotropen Hormon, vom endständigen Stickstoff angerechnet, entspricht, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der an sich bekannten Herstellung des Decapeptids den rhenylalaninrest in der D-Form einbaut.

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