DE1598133A1 - Verfahren und diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen - Google Patents

Verfahren und diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen

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DE1598133A1 DE19661598133 DE1598133A DE1598133A1 DE 1598133 A1 DE1598133 A1 DE 1598133A1 DE 19661598133 DE19661598133 DE 19661598133 DE 1598133 A DE1598133 A DE 1598133A DE 1598133 A1 DE1598133 A1 DE 1598133A1
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Description

C. F. Boehringer & Soehne
GmbH
Mannhe im
Verfahren und diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden, bzw. von Substanzen, aus denen durch eine vorgeschaltete Reaktion Wasserstoffperoxid oder andere Hydroperoxide freigesetzt werden, sowie von Peroxidase bzw. anderen peroxidatisch wirkenden Substanzen. Von besonderem diagnostischem Interesse ist der Nachweis von Glucose im Harn, Blut und Serum bei Diabetes, sowie der Nachweis von peroxidatisch wirkenden Substanzen, wie Hämoglobin im Harn und Blut, und der Nachweis von Hydroperoxiden z.B. in der Milchwirtschaft, Kosmetik und Polymerchemie.
Es sind eine Reihe von Verbindungen bekannt, die von Wasserstoffperoxid und Peroxidase als Katalysator zu einem Farbstoff oxidiert werden. Die Substanzen, die bevorzugt verwendet werden, sind z.B.: Benzidin, o-Dianisidin, o-Tolidin, Guajakol usw. Diese Verbindungen sind aber teilweise nicht sehr stabil und koennen nach den neuesten Erkenntnissen gesundheitsschädlich sein, so daß ihre Handhabung nicht ungefährlich erscheint.
Es wurde überraschenderweise eine Substanzgruppe gefunden, die z.T. bessere Indikatoreigenschaften als die bisher verwendeten Benzidinkoerper zeigt, aber dabei absolut beständig ist und sich demzufolge besonders gut dazu eignet, Wasserstoffperoxid und andere Hydroperoxide sowohl im optischen Test als auch mit Hilfe
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von Reagenzpapieren zu bestimmen. Die Substanzen sind physiologisch unschädlich und besitzen die allgemeine Formel I
R5 (I),
R1-C-(N)n-N=C X R2
in welcher bedeuten:
R, eine Aminogruppe, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierte aliphatischen araliphatische,
aromatische bzw. heterocyclische Reste, oder die Gruppe r
-C-(N) -N=G <&Kl5
Il I n R3 R6
X R2
R2 Wasserstoff, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierte aliphatische, aromatische oder heterocyclische Reste,
R., Wasserstoff, eine Alkyl- oder gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierte Phenylgruppe,
Ru eine Amino-, Hydroxy- oder Alkoxygruppe,
R5 und Rg Wasserstoff, Amino-, Hydroxy-, Alkoxy- oder Alkylgruppen,
X Sauerstoff, Schwefel oder eine gegebenenfalls mit R1 substituierte Iminogruppe,
η die Zahlen 0 oder 1,
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wobei X zusammen mit R1, bzw. R1 zusammen mit Rg, bzw. R1 zusammen mit R, einen gegebenenfalls substituierten Ring bilden koennen.
Die Bestimmung von Hydroperoxiden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist vorzugsweise für gekoppelte und ungekoppelte Enzymreaktionen geeignet, wie z.B. Bestimmung von Glucose, Galactose, Aminosäure, Harnsäure, Peroxiden, Hämoglobin, Peroxidase oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen sowie Enzymaktivitäten. Die routinemäßige Bestimmung von derartigen Substraten ist wegen ihrer elementaren Wichtigkeit aus der klinischen Chemie und aus der Lebensmittelchemie nicht mehr wegzudenken. Bei der Bestimmung von Glucose beispielsweise wird diese von Glucoseoxidase zu Gluconsäure oxidiert, wobei der Luftsauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert wird. Das Wasserstoffperoxid oxidiert dann mittels Peroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz den erfindungsgemäß verwendeten Indikator zum entsprechenden Farbstoff. Weitere Beispiele für derartige analytisch brauchbare. Enzymsysteme, die unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid reagieren, sind L-Aminosäureoxidase + L-Aminosäuren, D-Aminosäureoxidase + D-Aminosäuren, Uricase + Harnsäure, · Xanthinoxidase + Hypoxanthin bzw. Xanthin, Glycinoxidase + Glycin, Monoaminooxidase + Monoamin (wie Adrenalin, Mescalin etc.), Diaminoxidase + Diamine (wie Histamin), Luciferase + Luciferin, D-Asparaginsäureoxidase + D-Asparaginsäure, Leber-Aldehydoxidase + Aldehyd, Galactoseoxidase + Galactose, Edson's Flavinenzym + Milchsäure.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung in an sich bekannter Weise, ist demnach dadurch gekennzeichnet, daß man als Chromogen Substanzen der allgemeinen Formel I verwendet. Die Auswertung
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erfolgt beispielsweise durch optische Ausmessung im Spektralphotometer oder bei Verwendung von Testpaperstreifen durch Vergleich der Parbstärke mit Blindproben bekannter Zusammensetzung bzw. Farbtafeln.
Selbstverständlich läßt sich umgekehrt das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Bestimmung der Chromogene I mit Hilfe von Hydroperoxiden und einer peroxidatisch wirksamen Substanz benutzen, was bei der Produktionsüberwachung dieser Diagnostika sehr nützlich ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die diagnostischen Mittel sind in den folgenden Beispielen näher erläutert.
BAD
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Beispiel 1
ί
Nachweis von Peroxiden in Flüssigkeiten
7,5 mg Peroxidäse werden in 100 ml eines 0,1 m Citrat- oder Phosphatpuffers von pH 5,6 geloest und damit ein Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) imprägniert. Danach werden 0,31 g o-Vanillin-(o~vanilloyl)-hydrazon in 100 ml Alkohol geloest und das Filterpapier nochmals imprägniert. Beim Eintauchen in Loesungen von Wasserstoffperoxid verschiedener Konzentrationen werden die Papiere,entsprechend der Konzentration, verschieden stark violett gefärbt.
Beispiel 2 Nachweis von Glucose im Harn
7,5 mg Peroxidase und 143 mg Glucoseoxidase werden in 100 ml eines 0,1 m Citrat- oder Phosphatpuffers vom pH 5*6 geloest. Mit dieser Loesung imprägniert man Filterpapier (2j5l6 der Firma Schleicher & Schüll). Danach werden 0,30 g 2,3-Dihydroxybenzal-(vanilloyl)-hydrazon in 100 ml Alkohol geloest und das Filterpapier noch einmal imprägniert. Beim Eintauchen in glucosehaltigen Harn zeigt das Papier ab ca. 50 mg % eine Rosafärbung, die je nach Intensität den Glucosegehalt angibt.
Beispiel 3 Nachweis von Glucose im Blut
7*5 mg Peroxidase, 143 mg Glucoseoxidase und 200 mg alginsaures Natrium werden in 100 ml 0,4 m Citrat- oder Phosphatpuffer von pH 5,6 geloest. Mit dieser Loesung wird ein Filterpapier (23 S der Firma Schleicher & Schüll) imprägniert. In einem
.A
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zweiten Imprägniervorgang wird, dasselbe Papier mit einer Loesung von 0,316 g o-Vanillin-(vanilloyl)-hydrazon in 100 ml Alkohol getränkt» Danach wird das Papier in einem dritten Imprägniervorgang gemäß unserer Anmeldung Aktenzeichen B 82 023 IXbA 2 mit einer Loesung von J5 g Paraffin in 100 ml Petroläther imprägniert. Bringt man auf ein so hergestelltes Papier einen Tropfen Blut mit 50 mg % Glucose, läßt eine Minute einwirken und wäscht das Blut mit Wasser ab, so zeigt das Papier eine deutlich violette Färbung. Die Färbintensität hängt von der Glueosekonzentration im Blut ab.
Beispiel 4 Nachweis von Glucose in Flüssigkeiten
Es werden Tabletten folgender Zusammensetzung gepreßt:
0,002 g o-Vanillin-(vanilloyl)-hydrazon
0,001 g Peroxidase
0,002 g Glucoseoxidase
0,0069 g see. Natriumphosphat
0,013 g prim. Natriumphosphat.
Eine solche Tablette wird in 5 ml Alkohol/Wasser (1:1) geloest, mit 0,2 ml der zu messenden Glucoseloesung versetzt, mit Alkohol auf 10 ml aufgefüllt und bei einer Wellenlänge von 520 nm colorimetrisch gemessen. Aus der gemessenen Extinktion wird der Glucosegehalt aufgrund einer Eichkurve ermittelt.
Beispiel 5 Nachweis von Glucose mit weiteren Indikatoren
Je 1 m-Mol der in nachstehender Tabelle aufgeführten Indikatoren
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wird in 1 ml Methanol geloest bzw. suspendiert, mit 1 ml einer Loesung von l4j mg Glucoseoxidase, 7*5 mg Peroxidase in 100 ml Phosphat- oder Citratpuffer (pH 5*6) sowie 1 ml einer Glucoseloesung versetzt. Man erhält die in der Tabelle angeführten
Farbreaktionen:
Formel
t -C-(N) -N=C Ii in
Substanz R1 η Λ Χί 2 R3 J[ w R 4 Farbe des
Kr. Reaktions
produktes
6
OH
OCH.
OH
1 0 H H
OCH.
"braun
OH
OCH.
1 0 H H
OCH.
OH
violett
OH
/0CH3
OH
1 0 H H
braun
OH
OCH,
OH
1 0 H H
OH
gelblichbraun
OH
OCH.
1 0 H H
OH OH
rotviolett
OCH,
OH CH
IQH η (f
009821 /0821
OCH-
OH
rotbraun
Substanz
Nr. 1
η X R2 R
RC
Farbe des
Reaktions-
produktes
OH
OCH.
OH
1 0 H H
OH
rotviolett
OH
OCH.
OCH.
1 0 H H
grau
OH
OCH.
1 0 H H OH
CH.
braunviolett
OH
OCH.
1 0 H H
CH.
OH
braunviolett
OH
OCH.
1 0 H H NH,
OCH.
blauviolett
OH
OCH.
1 0 H H
NH,
OH
braun
OCH
1 0 H H
OH
OCH
violett
OH
12a o=l T
1 0 H H
OCH
rotbraun
OH
009821 /0821
1 0 H H
OCH-
OH
blauviolett
Substanz „ Nr. 1
R,
η X R2 R3
Farbe des Reaktionsproduktes
NO,
1 0 H H
OGH,
OH
rosa
OH OH
1 0 H H
OCH.
rosa
OH
1 0 H H
OCH
3 rosa
OH
1 0 H H
OCH
3 rosa
OH
17 r^N^
OH
1 0 H H
OCH.
OH
blaßviolett
1 0 H H
OCH,
OH
rotviolett
OCH. OH
CH=N-NH-C-Il 0
1 0 H H
OCH.
OH
orange
1 0 H H
OCH.
OH
gelblichrot
009821/0821
Substanz R
Nr. 1
η X R2 R
Farbe des Reaktionsproduktes
OCH OH
CH=N-N
10HH
OCH,
OH
himbeerfarben
10HH
OCH.
OH
blauviolett
f5
ι ω
23 CH-N CH_
CH
10HH
OCH.
OH
violett
1SHH
OCH.
OH
blauviolett
1 0 H CH, NH,
braun
NH2-
1 NH H H
OCH.
OH
dunkelkarmin
CH
3 1 0 H H
OH
OCH
rosa
OH
00 982 1/082 1
Substanz „ Nr. ·
OH
η X Rn R-
1 0 H H
6_
OCH.
OH
Farbe des
Reaktions-
produktes
"blau
NH,
O O ./- H
OCH
weinrot
OH
Substanz R.-C-(n)
Nr-. 1 » ·
X Rn
Nr.
R,
R.
OCH.
OH
Farbe des Reaktionsproduktes
violett
OCH.
OH
lila
N-
OCH.
OH
blau
•A
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Beispiel 6 Nachweis von Blut im Urin
Ein Filterpapier (2^16 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit einer Loesung von O,;5l6 g o-Vanillin-(vanilloyl)-hydrazon in 100 ml Methanol imprägniert.
500 ml Akazienpflanzenschleim, der durch Kochen von 200 g Akazien in 500 ml Wasser hergestellt wurde, und 25 ml Cumolhydroperoxid werden zusammen gegeben und 5 Minuten im Mixer heftig gerührt. Weiter werden in 1,5 1 V/asser l6j5 g Natriumeitrat und j57 g Zitronensäure geloest. In dem auf diese V/eise erhaltenen Citratpuffer werden J5,5 g Gelatine geloest, worauf man die oben genannte Loesung zugibt. Die vereinigten Loesungen vermischt man mit 5 ml einer 1 #igen wäßrigen Emulsion einer peroxidhaltigen Stärke (vorzugsweise das US-Handelsprodukt "Dialdehyd starch") und - nachdem wieder gut durchgemischt wurde - mit 50 ml Natriumlaurylsulfat und rührt 5 Minuten weiter. Die so erhaltene Emulsion wird dann 5 Minuten in einen Homogenisator mit 100kg/6m Druck gegeben. Zu der homogenisierten Mischung gibt man 250 ml des wie oben hergestellten Citratpuffers. Die mit dem Indikator imprägnierten Papiere werden in die erhaltene Emulsion getaucht und Io Stunden bei 5O0C in einem UmIuftrockenschrank getrocknet. Die so erhaltenen Testpapiere ergeben beim Eintauchen in einen bluthaluigen Urin eine violette Farbreaktion.
#//' BAD ORIGINAL
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Claims (2)

Patentansprüche
1.) Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung in an sich bekannter Weise, dadurch gekennzeichnet, daß man als Chromogene Substanzen der allgemeinen Formel I
R5 (D
X R2
verwendet, in der bedeuten:
R1 eine Aminogruppe, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierte aliphatische, araliphatischen aromatische bzw. heterocyclische Reste, oder
■p
die Gruppe -/ 4
-C-(N) -I=
Il ι n ^r3 6
X R2 ^
R2 Wasserstoff, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierte aliphatische, aromatische oder heterocyclische Reste,
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R~ Wasserstoff, eine Alkyl- oder gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierte. Phenylgruppe,
R1, eine Amino-, Hydroxy-, oder Alkoxygruppe,
Rc- und Rg Wasserstoff, Amino, Hydroxy-, Alkoxy- oder Alkylgrüppen,
X Sauerstoff, Schwefel oder eine gegebenenfalls mit R1 substituierte Iminogruppe,
η die Zahlen 0 oder 1,
wobei X zusammen mit R,,bzw. R, zusammen mit R2, bzw. R, zusammen mit R-, einen gegebenenfalls substituierten Ring bilden koennen.
2.) Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Peroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Chromogen Substanzen der Formel I enthalten.
2·) Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen bestehend aus Hydroperoxid oder Hydroperoxid bildenden Substanzen und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Chromogen Substanzen der Formel I enthalten.
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