DE1806741A1

DE1806741A1 - Process for achieving a finely crystalline or amorphous solid state when freezing water-containing substances, in particular biological objects

Info

Publication number: DE1806741A1
Application number: DE19681806741
Authority: DE
Inventors: Moor Dr Hans; Riehle Dipl-Ing Udo
Original assignee: Balzers and Pfeiffer Hochvakuum GmbH
Current assignee: Balzers Hochvakuum GmbH
Priority date: 1967-11-14
Filing date: 1968-11-02
Publication date: 1969-06-19
Also published as: NL6800448A; DE1806741B2; GB1230120A; CH459598A; DE1806741C3; NL135905C; FR1592246A

Description

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Verfahren zur Erzielung eines feinkristallinen oder amorphen festen Zustandes beim Gefrieren wasserhaltiger Substanzen, insbesondere biologischer ObjekteProcess for obtaining a finely crystalline or amorphous solid Condition when water-containing substances freeze, especially biological objects

Bei der Herstellung von Präparaten, z.B. für die Elektronenmikroskopie, kommt es entscheidend darauf an, dass die Struktur der untersuchten Objekte durch den Präparationsvorgang nicht verändert oder gar zerstört wird. Wasserhaltige Substanzen, z.B. biologische Gewebe, werden üblicherweise zuerst durch Einfrieren fixiert, sodann wird mittels eines Mikrotoms die zu untersuchende Fläche freigelegt, gegebenenfalls zwecks Kontrasterhöhung mit einem Metall im Vakuum bedampft und anschliessend im Lichtoder Elektronenmikroskop untersucht. Die Fixierung, durch Gefrieren hat den bekannten Nachteil, dass die Struktur der untersuchten"Objekte durch Eiskristallbildung gestört wird und zwar umso mehr, Je grosser die sich bildenden Eiskristalle sind. Um beim Einfrieren einen feinkristallinen oder wenn möglich sogar amorphen festen Zustand des gefrorenen Wassers zu erreichen, wurde schon vorgeschlagen, die Abkühlung möglichst schlagartig durchzuführen, beispielsweise durch Eintauchen der zu gefrierenden Substanzen oder eines Behälters mit dieser Substanz in ein verflüssigtesIn the manufacture of specimens, e.g. for electron microscopy, it is crucial that the structure of the objects examined is not changed or even destroyed by the preparation process. Substances containing water, e.g. biological tissues, are commonly used first fixed by freezing, then the area to be examined is exposed by means of a microtome, if necessary for the purpose of increasing the contrast vaporized with a metal in a vacuum and then examined in a light or electron microscope. The fixation, by freezing has the known disadvantage that the structure of the examined "objects by Ice crystal formation is disturbed and more so, the larger the size forming ice crystals are. In order to achieve a finely crystalline or, if possible, even amorphous solid state of the frozen water during freezing To achieve, it has already been proposed to carry out the cooling as suddenly as possible, for example by immersing the to be frozen Substances or a container with this substance in a liquefied

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Gas, etwa flussigen Stickstoff, als Kältemittel» Auf dieae Weise gelingt es, einen amorphen oder genügend fein kristallinen (sogenannten vitrifizierten) Zustand in einer äusseren Randzone der zu gefrierenden Substanz zu erreichen, deren Dicke im wesentlichen von der Art der Sub» stanz, ihrem Wassergehalt und der angewendeten Abkühlgeschwindigkeit abhängt. . , 'Gas, such as liquid nitrogen, as a refrigerant »This way if an amorphous or sufficiently finely crystalline (so-called vitrified) state in an outer edge zone of the substance to be frozen, the thickness of which depends essentially on the type of sub » punch, their water content and the cooling rate used. . , '

Es ist ein Verfahren vorgeschlagen worden, wonach beim Abkühlen der zu gefrierenden Substanz durch Anwendung eines hohen Druckes von etwa 2ooo at infolge Erniedrigung des Gefrierpunktes das Einfrieren zunächst unter» drückt wird, bis eine Temperatur von etwa -2o C erreicht ist, worauf durch plötzliche Druckentlastung ein unterkühlter Zustand geschaffen wird, aus welchem heraus die Substanz schlagartig gefriert. Leider hat ' sich gezeigt, dass dieses bekannte Verfahren des Schnellgefrierens zu einem grobkristallinen Eisgefüge führt oder jedenfalls sehr schwer so zu handhaben ist, dass der gewünschte Vitrifizierungszustand erreicht wird» Diese Grobkristallbildung kann vielleicht dadurch erklärt werden, dass die Temperatur der zu gefrierenden Substanz->im Augenblick des Gefrierens infolge der dabei freiwerdenden Kristallisationswärme und wegen unzureichender Wärmeableitung kurzzeitig auf einen Wert ansteigt, bei welchem die Geschwindigkeit des Kristallwachstums stark erhöht ist.A method has been proposed, according to which when the to freezing substance by applying a high pressure of about 2,000 at as a result of the lowering of the freezing point, the freezing initially under » is pressed until a temperature of about -2o C is reached, whereupon a supercooled state is created by sudden pressure relief from which the substance suddenly freezes. Unfortunately, it has been shown that this well-known method of rapid freezing increases leads to a coarsely crystalline ice structure or is very difficult to handle in such a way that the desired state of vitrification is achieved » This coarse crystal formation can perhaps be explained by the fact that the temperature of the substance to be frozen-> at the moment of freezing as a result of the heat of crystallization released and because of inadequate heat dissipation increases briefly to a value at which the rate of crystal growth is greatly increased.

Die Erfahrung lehrt, dass die me'sten biologischen Zellsysteme zu einem mehr oder weniger grossen Grad der Unterkühlbarkeit vor dem Einfrieren "■ neigen. Wird das die Zellen umgebende V/asser durch eine plötzliche Druckabsenkung nahe seiner normalen Gefriertemperatur zu spontaner Kristallbildung angeregt, so ergibt sich die Möglichkeit, dass die extrazellulär entstehenden Eiskristalle die Zellwände durchdringen und so das intrazelluläre Wasser durch heterogene Bekeimung zur Bildung grosser Kristalle anregen.Experience shows that most biological cell systems become one more or less high degree of hypothermia before freezing "■ tend. The water surrounding the cells becomes water by a sudden drop in pressure near its normal freezing temperature to spontaneous crystal formation When stimulated, there is the possibility that the ice crystals formed extracellularly penetrate the cell walls and thus the intracellular ones Water through heterogeneous germination to form large crystals stimulate.

Die vorliegende Erfindung hat sich.die Aufgabe gestellt* ein Verfahren zur Erzielung eines feinkristallinen oder amorphen festen ZustandesThe present invention has set itself the task * a method to achieve a finely crystalline or amorphous solid state

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beim Gefrieren wasserhaltiger Substanzen, insbesondere biologischer Objekte, anzugeben,wobei die zu gefrierende wasserhaltige Substanz während eines Teiles der Abkühlungsperiode einem hohen Druck unterworfen wird. Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass der Druck aufrechterhalten wird, bis die Oberflächentemperatur der zu gefrierenden Substanz ~5o C unterschritten hat.when freezing water-containing substances, especially biological ones Objects, indicate, the hydrous substance to be frozen during subjected to high pressure for part of the cooling period. The inventive method is characterized in that the Pressure is maintained until the surface temperature of the substance to be frozen has dropped below ~ 5o C.

im Vergleich zu dem bekannten Verfahren muss also "bei dem Verfahren nach ■4er Erfindung die Druckentlastung nicht angewendet" werden, um den Gefriervorgang einzuleiten. Der Erfindung liegt vielmehr die neue Erkenntnis sugrunde, dass, um das angestrebte Ziel der Vitrifikation der zu gefrierenden Substanz besser zu erreichen, die Anwendung eines hohen druckes wenigstens während eines Teiles der Abkühlungsperiode zwar Eiützlich ist, dass Jedoch der naheliegende Weg der Entspannung zwecks schlagartiger Einleitung des Gefrierene bei -2o°C, wobei man Grobkristallbildung in Kauf nimmt, vermieden werden soll, entgegen der an sich gültigen Regel, dass schnelles Gefrieren zu einem feineren Kristallgefüge führt als langsames.in comparison to the known method must therefore "in the method according to ■ 4er invention the pressure relief is not applied "to the freezing process initiate. Rather, the invention is based on the new knowledge that in order to achieve the desired goal of vitrification of the to be frozen To achieve better substance, the application of a high pressure at least during part of the cooling period It is useful that, however, the obvious way to relax sudden initiation of freezing at -2o ° C, whereby one coarse crystal formation accepts, should be avoided, contrary to the actually valid rule that rapid freezing leads to a finer crystal structure than slow.

Der durch die Erfindung erzielte Portschritt lässt sich vielleicht dadurch erklären, dass durch die Aufrechterhaltung des hohen Druckes bis zu einer Temperatur T=- 5o°C, d.h. einer Temperatur, bei welcher die intrazelluläre Bildung von Kristallisationskeimen kritischer Grosse bereits einen hohen _, Wert erreicht hat, bewirkt wird, dass die folgende Druckabsenkung eine nochmalige starke Vermehrung der in den Zellkörpern vorhandenen Kristallkeime kritischer Grosse mit dem Effekt einer submikroskopische feinen Eisstruktur mit sich bringt. Dabei stört es nicht, wenn das bereits zu einem früheren Zeitpunkt eingefrorene extrazelluläre Wasser β gegebenenfalls eine gröbere Struktur aufweist.The port step achieved by the invention can perhaps be made possible by this explain that by maintaining high pressure up to one Temperature T = - 50 ° C, i.e. a temperature at which the intracellular Formation of crystallization nuclei of critical size already have a high _, If the value has been reached, the following pressure reduction causes a further strong increase in the number of crystal nuclei present in the cell bodies critical size with the effect of a submicroscopic fine Brings ice structure with it. It does not matter if the extracellular water that was frozen at an earlier point in time may be β has a coarser structure.

Ein Beispiel für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens und eine hiezu geeignete Vorrichtung werden anhand anliegender Zeichnungen näher beschrieben,An example of the implementation of the method according to the invention and a device suitable for this purpose will be described in more detail with reference to the attached drawings,

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Die Fig. 1 zeigt den wesentlichen Teil der Einrichtung in detallierterFig. 1 shows the essential part of the device in more detail

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Ausführung! die. Pig. 2 zeigt die Gesaratanordnung.Execution! the. Pig. Fig. 2 shows the general arrangement.

In Fig. 1 bedeutet 1 einen röhrenförmigen, einseitig geschlossenen, dünnwandigen Behälter aus einem gut wärmeleitenden Material, z.B. Kupfer, welcher die zu getierende Probe 2 aufnimmt. An seinem oberen Ende 2 ist dieser Behälter trichterförmig erweitert und zwischen dem Kühlteil und dem Druckteil/der Anordnung eingespannt. Ueber die zentrale Bohrung 6 des Teiles 5 kann mittels einer Uebertragerflüssigkeit - am einfachsten Wasser - auf die zu gefrierende Probe ein hoher Druck von beispielsweise looo At, welcher mit an sich bekannten Vorrichtungen erzeugt werden kann, ausgeübt werden. Der Behälter ragt in einen Raum 7 hinein, der eine Zuführungsleitung für das Kühlmittel aufweist, welche aus den Leitungswegen 8, 9 ^und 1° gebildet wird. Bei Kühlung umspült das"' Kühlmittel die Aussenwandung des Behalters 1, wobei es , wenn es flüssig ' ist, im Raum 7 hochsteigt, bis es in den als Auffangrinne ausgebildeten Hohlraum 11 des Teiles 4 überläuft und schliesslich durch die Oeffnungen 12 entweichen kann. . *In FIG. 1, 1 denotes a tubular, thin-walled container, closed on one side, made of a material that conducts heat well, for example copper, which accommodates the sample 2 to be made. At its upper end 2, this container is widened in the shape of a funnel and is clamped between the cooling part and the pressure part / the arrangement. Via the central bore 6 of the part 5, a high pressure of, for example, 100 At, which can be generated with known devices, can be exerted on the sample to be frozen by means of a transfer fluid - most simply water. The container protrudes into a space 7 which has a supply line for the coolant, which is formed from the line paths 8, 9 ^and 1 °. When cooled, the "coolant" flows around the outer wall of the container 1, and when it is liquid it rises in the space 7 until it overflows into the hollow space 11 of the part 4, which is designed as a collecting channel, and can finally escape through the openings 12. *

Die Fig. 2 zeigt, wie diese Einrichtung mit einer Hilfsvorrichtung zur Erzeugung des benötigten Druckes zusammengebaut werden kann. Dazu ist der von einem an dem Tisch 14 befestigten Stativ I5/16 gehalterte, der Druckübertragung dienende Teil 5 als Hydraulikzylinder ausgebildet 2XE, wobei der Zylinderraum 17 mit der Bohrung 6 verbunden ist. und der ·· hydraulische Druckkolben l8 über die Hubstange I9 vom Druckluftkolben 2o .eines Druckluftzylinders betätigt werden kann. Der Druckluftzylinder 21, d dessen unterer Teil gezeichnet ist, ist in bekannter Weise mit Druekluftzu- und -ableitungen 22/25 versehen. 'Fig. 2 shows how this device with an auxiliary device for Generating the required pressure can be configured. For this purpose, the one held by a tripod I5 / 16 attached to the table 14 is the Pressure transmission serving part 5 designed as a hydraulic cylinder 2XE, the cylinder space 17 being connected to the bore 6. and the ·· Hydraulic pressure piston l8 via the lifting rod I9 from the compressed air piston 2o .an compressed air cylinder can be operated. The air cylinder 21, i the lower part of which is drawn, is in a known manner with Druekluftzu- and derivatives 22/25. '

Der Rahmen 24 dient der Halterung des Druckluftzylinders. 25 ist eine an den Säulen I5/I6 des Stativs geführte, in vertikaler Richtung mittels des Handrades 26 und der Gewindespindel 27 verschiebbare Trägerplatte für den Kühlteil 4. 28 ist ein Manometer, das der Ueberwachung des auf die Probe im Behälter 1 ausgeübten Druckes dient.The frame 24 is used to hold the compressed air cylinder. 25 is one on the columns I5 / I6 of the stand guided in the vertical direction by means of the Handwheel 26 and the threaded spindle 27 displaceable support plate for the Cooling compartment 4. 28 is a manometer that monitors the on the sample in the container 1 exerted pressure is used.

Zur beispielsweisen Durchführung des erfindungsgemässen Verfahren wirdTo carry out the process according to the invention by way of example,

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die zu gefrierende Probe 2 bei abgesenktem KUhlteil \ in den Behälter 1. eingebracht, sodann dieser durch Betätigen des Handrades 26 gegen den Druckteil 5 gedruckt, worauf die Probe mittels der beschriebenen pneumatisch-hydraulischen Einrichtung duch die Druckübertragerflüssigkeit mit einem Druck von looo bis 2ooo at beaufschlagt wird. Unter Aufrechterhaltung dieses Druckes wird darauf durch die Leitungswege 8,9,Io das Kühlmedium z.B. flüssiger Stickstoff oder ein tiefgekühltes, bei der gewünschten Temperatur noch nicht kondensiertes Gas eingeführt, wodurch die Probe sich mit einer bestimmten grossen Geschwindigkeit abkühlt. Es empfiehlt sich, den Druck beim Abkühlen-solange aufrechtzuerhalten, bis wenigstens, eine äussere Randzone der wasserhaltigen Substanz eingefroren ' 1st, jedenfalls aber solange bis die Oberflächentemperatur der zu ge-the introduced to be frozen sample 2 with lowered KUhlteil \ in the container 1 then, this printed by operating the hand wheel 26 against the pressure part 5, after which the sample by means of the described pneumatic-hydraulic means duch the Druckübertragerflüssigkeit at a pressure of looo to 2ooo at is applied. While this pressure is maintained, the cooling medium, for example liquid nitrogen or a deep-frozen gas that has not yet condensed at the desired temperature, is then introduced through the conduits 8, 9, Io, whereby the sample cools at a certain high speed. It is advisable to maintain the pressure during cooling until at least 'one outer edge zone of the water-containing substance is frozen', but in any case until the surface temperature of the

frierenden Substanz - 5° C unterschritten hat, was z.B. durch ein an der Probe, angebrachtes Thermoelement überprüft werden kann. Zweckraässigerweise wird mit der Aufhebung des Druckes zugewartet, bis ein praktisch vollständiger Temperaturausgleich zwischen dem angewendeten Kühlmittel und dem Gefriergut eingetreten ist«freezing substance has fallen below - 5 ° C, which is e.g. due to a the sample, attached thermocouple can be checked. Appropriately the pressure is not released until a practically complete temperature equilibrium between the coolant used and the frozen food has entered "

Da der Druck, wenn er zulange andauert, bei biologischen Objekten zu Schädigungen führen la nn, empfiehlt es sich, in diesem Falle einen während der Abkühlung nur allmählich ansteigenden, also variablen Druck anzuwenden, so dass er in jedem Augenblick der Vorkühlungsphase, d.h. oberhalb der vorgewählten Erstarrungstemperatur, gerade ausreicht, das Einfrieren zu verhindern. . . · :> Since the pressure, if it lasts too long, can lead to damage in biological objects, it is advisable in this case to apply a pressure that increases gradually during cooling, i.e. variable pressure, so that it is maintained at every moment of the pre-cooling phase, i.e. above the preselected solidification temperature, just sufficient to prevent freezing. . . · :>

Die Grosse der für die Durchführung der Erfindung nützlichen Drücke liegt zwischen etwa loo und einigen looo At. Es soll ein so hoher Druck angewendet werden, dass sich eine Gefrierpunkterniedrigung der zu gelierenden wasserhaltigen Substanz um wenigstens 5°- C ergibt.The magnitude of the pressures useful for practicing the invention is between about loo and some looo at. Such a high pressure is supposed to be applied be that there is a depression of the freezing point to be gelled water-containing substance by at least 5 ° - C results.

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§09825/1565§09825 / 1565

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raum und -einem Kühlraum auszubilden und das Kühlmittel in dem Kühlraum beim Abkühlen mit möglichst hoher Geschwindigkeit einströmen zu lassen. Da ferner, wie sich ebenfalls aus den obigen Ausführungen ergibt, die Abkühlung der Probe und die Anwendung des Druckes zeitlich genau aufeinander abgestimmt werden müssen, ist es zweckmässig, für das Steuern dieser beiden Vorgänge ein automatisches Schaltgerät zu benutzen, welches das zeitliche Verhältnis zwischen dem Einströmen des Kühlmittels und der Druckanwendung genau regelbar einzustellen gestattet. Ohne Jedesmal die schwierige Messung der Oberflächentemperatur der Probe durchführen zu· müssen« kann dann dieser zeitliche Abstand auf Grund von Vorversuchen so gewählt werden, dass eine optimale Vitrifizierung der Probe erreicht wird.- Das" Steuergerät kann so ausgebildet werden, dass die Grosse des Druckes nach einem vorgewählten zeitlichen Programm verläuft oder in Abhängigkeit von der an der Probe gemessenen Temperatur geregelt wird.to form space and a cooling space and the coolant flows into the cooling space as it cools at the highest possible speed permit. Furthermore, as can also be seen from the above, the cooling of the sample and the application of the pressure are precisely timed need to be coordinated, it is useful for controlling of these two processes to use an automatic switching device, which the temporal relationship between the inflow of the coolant and the Pressure application can be precisely adjusted. Without having to carry out the difficult measurement of the surface temperature of the sample every time « this time interval can then be selected on the basis of preliminary tests that an optimal vitrification of the sample is achieved. Control unit can be designed so that the size of the pressure according to a preselected time program or depending on the temperature measured on the sample is controlled.

Die Ausbildung des Steuergerätes"bildet nicht den Gegenstand vorliegender Erfindung.The design of the control unit "does not form the subject matter of the present case Invention.

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Der Anwendungsbereich der Erfindung beschränkt sich nicht/den oben erwähnten Zweck der strukturerhaltenden Fixierung biologischer Untersuchungsobjekte, sondern umfasst ebenso die Konservierung hochwertiger biologischer Stoffe, z.B. von Blutplasma. Auch für die strukturerhaltende Fixierung anorganischer Stoffe kann die Erfindung mit Vorteil eingesetzt werden, z.B. um die Stoffverteilung in Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Gelen oder dgl. Mischphasen zu studieren bzw. soLsche Mischphasen für spätere Anwendungen durch Gefrieren zu fixieren. Auch in Fällen, in denen eine gewisse Strukturveränderung in Kauf genommen werden kann, kann die Anwendung der Erfindung von Vorteil sei, nämlich dadurch, dass man schön mit wesentlich geringeren Abkühlgeschwindigkelten und damit wirtschaftlicher zum gleichen Ziele kommt.The scope of the invention is not limited to that mentioned above Purpose of the structure-preserving fixation of biological examination objects, but also includes the preservation of high-quality biological objects Substances, e.g. from blood plasma. Also for the structure-preserving fixation of inorganic Substances, the invention can be used with advantage, e.g. to distribute the substance in solutions, suspensions, emulsions, gels or Like. To study mixed phases or soLsche mixed phases for later applications to fix by freezing. Even in cases where a certain Structural changes can be accepted, the application can the invention is advantageous, namely by being beautiful with essential lower cooling speeds and thus more economically to the same goal.

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Claims

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3. ^ν - ?? ** ^ν - ^% · π ⁷ βη according to "n ^ pruch!, Thereby κ ekennr, eiehnet, d-5- ~ i- d» v riruck during the Ibkühlenp so long held, is , until ('in -'- actically complete ^ eDPeT ¹ PtUr "has occurred between the aneeviendeten tel and ^ de» ^ zn freezing ^ ubr.tqnz.

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6. The method according to claim 1, characterized in that high pressure is used that sth a "" -freepunktsernied- "ir, un °" d ^ y "u freezing water-containing" iiibstann to veniK * En ° 5 C

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