DE1806741C3 - Process for achieving a finely crystalline or amorphous solid state during rapid freezing of water-containing substances, in particular biological objects - Google Patents

Process for achieving a finely crystalline or amorphous solid state during rapid freezing of water-containing substances, in particular biological objects

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DE1806741C3 DE19681806741 DE1806741A DE1806741C3 DE 1806741 C3 DE1806741 C3 DE 1806741C3 DE 19681806741 DE19681806741 DE 19681806741 DE 1806741 A DE1806741 A DE 1806741A DE 1806741 C3 DE1806741 C3 DE 1806741C3
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    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/42—Low-temperature sample treatment, e.g. cryofixation

Description

30 frierende wasserhaltige Substanz während eines Teiles30 freezing hydrous substance during one part

der Abkühllungsperiode einem hohen D nick unterworfen wird. Dieses Verfahren ist erfindungsgemaßsubjected to a high nick during the cooling period will. This method is according to the invention

Bei der Herstellung von Präparaten, z. B. für die dadurch gekennzeichnet, daß der Druck aufrechter-Elektronenmikroskopie, kommt es entscheidend halten wird, bis die Oberfiächentemperatui" 'der zu gedarauf an, daß die Struktur der untersuchten Ob- 35 frierenden Substanz — 50° C unterschritten hat.
jekte durch den Präparationsvorgang nicht verändert Im Vergleich zu dem bekannten Verfahren mußIn the manufacture of preparations, e.g. B. for the characterized in that the pressure upright electron microscopy, it is crucial to hold until the Oberfiächentemperatui "'that depends on the fact that the structure of the examined ob- 35 freezing substance has fallen below 50 ° C.
projects not changed by the preparation process

oder gar zerstört wird. Wasserhaltige Substanzen, also bei dem Verfahren nach der Erfjndung die z. B. biologische Gewebe, werden üblicherweise zu- Druckentlastung nicht angewendet werden, um den erst durch Einfrieren fixiert, sodann wird mittels eines Gefriervorgang einzuhalten. Der Erfindung liegt viel-Mikrotoms die zu untersuchende Fläche freigelegt, 40 mehr die neue Erkenntnis zugrunde, daß, um das gegebenenfalls zwecks Kontrasterhöhung mit einem angestrebte Ziel der Vitrifikation der zu gefrierenden Metall im Vakuum bedampft und anschließend im Substanz besser zu erreichen, die Anwendung eines Licht- oder Elektronenmikroskop untersucht. Die hohen Druckes wenigstens während eines Teiles der Fixierung durch Gefrieren hat den bekannten Nach- Abkühlungsperiode zwar nützlich ist, daß jedoch der teil, daß die Struktur der untersuchten Objekte durch 45 naheliegende Weg der Entspannung zwecks schlag-Eiskristallbildung gestört wird, und zwar um so mehr, artiger Einleitung des Gefrierens bei — 20° C, wobei je größer die sich bildenden Eiskristalle sind. Um man Grobkristallbildung in Kauf nimmt, vermieden beim Einfrieren einen feinkristallinen oder wenn werden soll, entgegen der an sich gültigen Regel, daß möglich sogar amorphen festen Zustand des gefröre- schnelles Gefrieren zu einem feineren Kristallgefüge nen Wassers zu erreichen, ist es schon bekannt, die 50 führt als langsames.or even destroyed. Substances containing water, that is to say in the method according to the invention the z. B. biological tissue, are usually not applied to the pressure relief first fixed by freezing, then it is maintained by means of a freezing process. The invention lies in a lot of microtome the area to be examined is uncovered, 40 more based on the new knowledge that, in order to possibly for the purpose of increasing the contrast with a desired goal of vitrification of the frozen food Metal vaporized in a vacuum and then better to achieve the application of a substance in the substance Examined by a light or electron microscope. The high pressures at least during part of the Fixation by freezing has the well-known post-cool-down period, but that the part that the structure of the objects examined by 45 obvious way of relaxation for the purpose of impact ice crystal formation is disturbed, and all the more so, like initiation of freezing at - 20 ° C, whereby the larger the ice crystals that form are. In order to accept coarse crystal formation, avoided when freezing a finely crystalline or if should be, contrary to the rule that is valid in itself that possible even amorphous solid state of freezing- rapid freezing to a finer crystal structure It is already known that the 50 leads as slow.

Abkühlung möglichst schlagartig durchzuführen, bei- Der durch die Erfindung erzielte Fortschritt läßtTo carry out cooling as suddenly as possible, both The progress achieved by the invention can

spielsweise durch Eintauchen der zu gefrierenden sich vielleicht dadurch erklären, daß durch die AufSubstanzen oder eines Behälters mit dieser Substanz rechterhaltung des hohen Druckes bis zu einer Temin ein verflüssigtes Gas, etwa flüssigen Stickstoff, als peratur T=-500C, d.h. einer Temperatur, bei Kältemittel. Auf diese Weise gelingt es, einen amor- 55 welcher die intrazelluläre Bildung von Kristallisaphen oder genügend fein kristallinen (sogenannten tionskeimen kritischer Größe bereits einen hohen vitrifizierten) Zustand in einer äußeren Randzone der Wert erreicht hat, bewirkt wird, daß die folgende zu gefrierenden Substanz zu erreichen, deren Dicke Druckabsenkung eine nochmalige starke Vermehrung im wesentlichen von der Art der Substanz, ihrem der in den Zellkörpern vorhandenen Kristallkeime Wassergehalt und der angewendeten Abkühlge- 60 kritischer Größe mit dem Effekt einer submikroskoschwindigkeit abhängt. pisch feinen Eisstruktur mit sich bringt. Dabei störtFor example, by immersing the substance to be frozen, this can be explained by the fact that a liquefied gas, such as liquid nitrogen, as a temperature T = - 50 0 C, i.e. a temperature for refrigerants. In this way it is possible to create a cupid which has achieved the intracellular formation of crystal isaphs or sufficiently finely crystalline (so-called ionic nuclei of critical size) in an outer edge zone of the value that the following substance to be frozen is closed Achieve, the thickness of which, the pressure drop, a further strong increase essentially depends on the type of substance, its water content of the crystal nuclei present in the cell bodies and the critical size of cooling used, with the effect of a submicroscopic speed. pisch fine ice structure with it. It bothers you

Es ist auch ein Verfahren bekannt, wonach beim es nicht, wenn das bereits zu einem früheren Zeit-Abkühlen der zu gefrierenden Substanz durch An- punkt eingefrorene extrazelluläre Wasser gegebenenwendung eines hohen Druckes von etw:i 2000 at in- falls eine gröbere Struktur aufweist,
folge Erniedrigung des Gefrierpunktes das Einfrieren 65 Ein Beispiel für die Durchführung des erfindungszunächst unterdrückt wird, bis eine Temperatur von gemäßen Verfahrens und eine hierzu geeignete Voretwa — 20° C erreicht ist, worauf durch plötzliche richtung werden an Hand der Zeichnungen näher be-Druckentlastung ein unterkühlter Zustand geschaffen schrieben.A method is also known, according to which it does not, if the extracellular water frozen at an earlier time-cooling of the substance to be frozen by point-freezing, given a high pressure of about 2000 at, has a coarser structure,
consequent lowering of the freezing point the freezing 65 An example of the implementation of the invention is initially suppressed until a temperature of the appropriate method and a suitable pre-approx State created.

1 8G6 741 a 1 8G6 741 a

3 ' 43 '4

Die Fig. 1 zeigt den wesentlichen Teil der Ein- wartet, bis ein praktisch vollständiger Temperaturrichtung in detaillierter Ausführung; ausgleich zwischen dem angewendeten Kühlmittel1 shows the essential part of the waiting time until a practically complete temperature direction in detailed execution; equalization between the applied coolant

die F i g. 2 zeigt die Gesamtauordnung. und dem Gefriergut eingetreten ist.
. In Fig. 1 bedeutet 1 einea röhrenförmigen, ein- In manchen Fällen wird das erfindungsgemäße seitig geschlossenen, dünnwandigen Behälter aus 5 Verfahren vorteilhafterweise so ausgebildet, daß einem gut wärmeleitenden Material, z.B. Kupfer, während der Abkühlung ein variabler Druck angewelcher die zu gefrierende Probe 2 aufnimmt An wendet wird. Da nämlich der Druck, wenn er zu seinem oberen Ende 3 ist dieser Behälter trichterför- lange andauert, bei biologischen Objekten zu Schämig erweitert und zwischen dem Kühlteil 4 und dem digungen führen kann, empfielt es sich in diesem Druckteil 5 der Anordnung eingespannt. Über die ip Falle, daß während des Vorkühlens der zu gefriezentrale Bohrung 6 des Teiles 5 kann mittels einer renden Substanz auf eine vorgewählte Einfriertem-Übertragerflüssigkeit — am einfachsten Wasser — peratur der Druck so variiert wird, daß er in jedem auf die zu gefrierende Probe ein hoher Druck von Augenblick der Vorkühlung gerade ausreicht, das beispielsweise 1000 at, welcher mit an sich bekannten Einfrieren zu verhindern.the F i g. 2 shows the overall layout. and the frozen food has entered.
. In Fig. 1, 1 denotes a tubular, single In some cases the thin-walled container according to the invention, which is closed on the side, is advantageously designed in such a way that a highly thermally conductive material, e.g. copper, a variable pressure, during cooling, the sample 2 to be frozen takes on is applied. Since the pressure, when it is funnel-shaped at its upper end 3, expands to Schämig in the case of biological objects and can lead between the cooling part 4 and the endings, it is advisable to clamp this pressure part 5 of the arrangement. About the ip case that during the pre-cooling of the central hole 6 of the part 5 to be frozen, the pressure is varied by means of a generating substance on a preselected freezing transfer fluid - the simplest is water - so that the pressure is varied in each case on the sample to be frozen high pressure from the moment of pre-cooling is just enough, for example 1000 atm, which is known to prevent freezing.

Vorrichtungen erzeugt werden kann, ausgeübt wer- 15 Die Größe der für die Durchführung der ErfindungDevices can be generated, exercised

den. Der Behälter 1 ragt in einen Raum 7 hinein, der nützlichen Drücke liegt zwischen etwa 100 und eini-the. The container 1 protrudes into a space 7, the useful pressures are between about 100 and a few

eine Zuführungsleitung für das Kühlmittel aufweist, gen lOOÖat. Es soll ein so hoher Druck angewendethas a supply line for the coolant, gen lOOÖat. Such a high pressure is supposed to be applied

welche aus den Leitungswegen 8, 9 und 10 gebildet werden, daß sich eine Gefrierpunktemiedrigung derwhich are formed from the lines 8, 9 and 10 that a freezing point depression of the

wird. Bei Kühlung umspült das Kühlmittel die Außen- zu gefrierenden wasserhaltigen Substanz um wenig-will. When cooling, the coolant washes around the water-containing substance to be frozen by little

wandung des Behälters 1, wobei es, wenn es flüssig 20 steiu. 5 C ergibt.wall of the container 1, and when it is liquid 20 steiu. 5 C results.

ist, im Raum 7 hochsteigt, bis es in den als Auffang- Um eine hinreichend schnelle Temperaturschwanrinne gebildeten Hohlraum 11 des Teiles 4 überläuft kung zu erreichen, welche auch für die Durchfüh- und schließlich durch die Öffnungen 12 entweichen rung der Erfindung von Bedeutung ist, empfiehlt es kann. sich, wie das beschriebene Beispiel zeigt, den Trägeris, rises in room 7 until it is used as a catch to a sufficiently rapid temperature fluctuation trough formed cavity 11 of the part 4 overflows to achieve kung, which is also for the implementation and finally escape through the openings 12 tion of the invention is of importance, recommends it can. As the example described shows, the carrier

Die F i g. 2 zeigt, wie diese Einrichtung mit einer as für die zu gefrierende Substanz als gut wärmeleitendeThe F i g. 2 shows how this device with an as for the substance to be frozen as a good heat conductor

Hilfsvorrichtung zur Erzeugung des benötigten Trennwand zwischen einem Druckraum und einemAuxiliary device for generating the required partition between a pressure space and a

Druckes zusammengebaut werden kann. Dazu ist der Kühlraum auszubilden und das Kühlmittel in demPressure can be configured. For this purpose, the cooling space and the coolant in the

von einem an dem Tisch 14 befestigten Stativ 15/16 Kühlraum beim Abkühlen mit möglichst hoher Ge-from a stand 15/16 attached to the table 14 cooling space when cooling with the highest possible

gehalterte, der Druckübertragung dienende Teil 5 als schwindigkeit einströmen zu lassen. Da ferner, wieheld, the pressure transmission serving part 5 to flow in as speed. Since further, how

Hydraulikzylinder ausgebildet, wobei der Zylinder- 30 sich ebenfalls aus den obigen Ausführungen ergibt,Hydraulic cylinder formed, the cylinder 30 also results from the above explanations,

raum 17 mit der Bohrung 6 verbunden ist und der die Abkühlung der Probe und die Anwendung desSpace 17 is connected to the bore 6 and the cooling of the sample and the application of the

hydraulische Druckkolben 18 über die Hubstange 19 Druckes zeitlich genau aufeinander abgestimmt wer-hydraulic pressure piston 18 via the lifting rod 19 pressure are precisely timed to be coordinated with one another

vom Druckluftkolben 20 eines Druckzylinders be- den müssen, ist es zweckmäßig, für das Steuern die-from the compressed air piston 20 of a pressure cylinder, it is useful to control the

tätigt werden kann. Der Druckzylinder 21, dessen ser beiden Vorgänge ein automatisches Schaltgerätcan be made. The pressure cylinder 21, the two processes of which an automatic switching device

unterer Teil gezeichnet ist, ist in bekannter Weise mit 35 zu benutzen, welches das zeitliche Verhältnis zwi-the lower part is drawn, is to be used in a known manner with 35, which represents the time relationship between

Druckluftzu- und -ableitungen 22, 23 versehen. sehen dem Einströmen des Kühlmittels und derCompressed air supply and discharge lines 22, 23 are provided. see the inflow of the coolant and the

Der Rahmen 24 dient der Halterung des Druck- Druckanwendung genau regelbar einzustellen ge-The frame 24 is used to hold the pressure and pressure application can be precisely adjusted.

luftzylinders. 25 ist eine an den Säulen 15, 16 des stattet. Ohne jedesmal die schwierige Messung derair cylinder. 25 is one on the pillars 15, 16 of the equips. Without the difficult measurement of the

Stativs geführte, in vertikaler Richtung mittels des Oberaächentemperatur der Probe durchführen zuStand guided, perform in the vertical direction by means of the surface temperature of the sample

Handrades 26 und der Gewindespindel 27 verschieb- 40 müssen, kann dieser zeitliche Abstand auf Grund vonHandwheel 26 and the threaded spindle 27 must move 40, this time interval can be due to

bare Trägerplatte für den Kühlteil 4. 28 ist ein Mano- Vorversuchen so gewählt werden, daß eine optimalebare carrier plate for the cooling part 4. 28 is a mano preliminary tests are chosen so that an optimal

meter, das der Überwachung des auf die Probe im Vitrifizierung der Probe erreicht wird. Das Steuerge-meter, which is used to monitor the sample in vitrification of the sample. The tax

Behälter 1 ausgeübten Druckes dient. rät kann so ausgebildet werden, daß die Größe desContainer 1 applied pressure is used. advises can be designed so that the size of the

Zur beispielsweisen Durchführung des erfindungs- Druckes nach einem vorgewählten zeitlichen Progemäßen Verfahrens wird die zu gefrierende Probe 2 45 gramm verläuft oder in Abhängigkeit von der an der bei abgesenktem Kühlteil 4 in den Behälter 1 einge- Probe gemessenen Temperatur geregelt wird,
bracht, sodann dieser durch Betätigen des Handrades Die Ausbildung des Steuergerätes bildet nicht den 26 gegen den Druckteil 5 gedrückt, vorauf die Probe Gegenstand vorliegender Erfindung.
mittels der beschriebenen pneumatisch-hydraulischen Der Anwendungsbereich der Erfindung beschränkt Einrichtung durch die Druckübertragungsflüssigkeit 50 sich nicht auf den obenerwähnten Zweck der strukmit einem Druck von 1000 bis 2000 at beaufschlagt turerhaltenden Fixierung biologischer Untersuchungswird. Unter Aufrechterhaltung dieses Druckes wird Objekte, sondern umfaßt ebenso die Konservierung darauf durch die Leitungswege 8, 9. 10 das Kühlme- hochwertiger biologischer Stoffe, z. B. von Blutdium z. B. flüssiger Stickstoff oder ein tiefgekühltes, plasma. Auch für die strukturerhaltende Fixierung bei der gewünschten Temperatur noch nicht konden- 55 anorganischer Stoffe kann die Erfindung mit Vorteil siertes Gas eingeführt, wodurch die Probe sich mit eingesetzt werden, z. B. um die Stoffverteilung in einer bestimmten großen Geschwindigkeit abkühlt Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Gelen od. dgl. Es empfiehlt sich, den Druck beim Abkühlen so lange Mischphasen zu studieren bzw. solche Mischphasen aufrechtzuerhalten, bis wenigstens eine äußere Rand- für spätere Anwendungen durch Gefrieren zu fixiezone der wasserhaltigen Substanz eingefroren ist, 60 ren. Auch in Fällen, in denen eine gewisse Strukturjedenfalls aber so lange, bis die Oberflächentemperatur veränderung in Kauf genommen werden kann, kann der zu gefrierenden Substanz — 500C unterschritten die Anwendung der Erfindung von Vorteil sein, nämhat, was z. B. durch ein an der Probe angebrachtes Hch dadurch, daß man schon mit wesentlich gerin-Thermoelement überprüft werden kann. Zweckmäßi- geren Abkühlgeschwindigkeiten und damit wirtschaftweisc wird mit der Aufhebung des Druckes züge- 65 licher zum gleichen Ziele kommt.For example, to carry out the pressure according to the invention according to a preselected time-based program, the sample to be frozen 2 runs 45 grams or is regulated as a function of the temperature measured at the temperature measured in the container 1 when the cooling part 4 is lowered,
brought, then this by operating the handwheel. The design of the control device does not form the 26 pressed against the pressure part 5, before the sample is the subject of the present invention.
The scope of application of the invention is limited by means of the described pneumatic-hydraulic device by means of the pressure transmission fluid 50, which is not limited to the above-mentioned purpose, which is subjected to a pressure of 1000 to 2000 at structural door-preserving fixation of biological examination. While this pressure is maintained, objects, but also includes the preservation on them through the lines 8, 9. 10, the cooling of high-quality biological substances, e.g. B. of blood z. B. liquid nitrogen or a frozen, plasma. Also for the structure-preserving fixation of non-condensing inorganic substances at the desired temperature, the invention can advantageously introduce gas, whereby the sample can also be used, e.g. B. to the distribution of matter at a certain high speed cools solutions, suspensions, emulsions, gels or the like. It is advisable to study the pressure during cooling as long mixed phases or to maintain such mixed phases until at least one outer edge for later applications is frozen by freezing to fixiezone the water-containing substance, 60 reindeer Even in cases where a certain structure any case, until the surface temperature change can be accepted, can the to be frozen substance -. 50 0C below the application of the invention be advantageous, namely what z. B. by a Hch attached to the sample in that one can already be checked with a considerably low thermocouple. With the release of the pressure, the same goal will be achieved more expediently and thus more economically.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen1 sheet of drawings

Claims (4)

wird, aus welchem heraus die Substanz schlagartig Patentansprüche: gefriert. Leider hat sich gezeigt, daß dieses bekannte Verfahren des Schnellgefrierens zu einem grobkri-from which the substance suddenly freezes. Unfortunately, it has been shown that this known method of rapid freezing leads to a coarse 1. Verfahren zur Erzielung eines feinfcristallinen siallmen Eisgefüge führt oder jedenfalls sehr schwer oder amorphen festen Zustandes beim schnellen 5 so zu handhaben ist, daß der gewünschte vitnfizie-Gefrieren wasserhaltiger Substanzen, insbesondere rungszustand erreicht wird. Diese Grobkristallbildung biologischer Objekte, wobei die zu gefrierende kann vielleicht dadurch erklärt werden, daß die Temwasserhaltige Substanz während eines Teiles der peratur der zu gefrierenden Substanz im Augenblick Abkühlungsperiode einem hohen Druck unter- des Gefrierens infolge der dabei frei werdenden worfen wird, dadurch gekennzeichnet, io Kristallisationswärme und wegen- unzureichender daß der Druck aufrechterhalten wird, bis die Wärmeableitung kurzzeitig auf einen Wert ansteigt, Oberflächeptetapfcratür der zu gefrierenden Sub-, !bei welchem die Geschwindigkeit des Kristallwachsstanz —50° C unterschritten hat turns stack erhöht ist1. The method for achieving a fine crystalline siallmen ice structure leads or at least very difficult or amorphous solid state at the fast 5 is to be handled in such a way that the desired vitnfizie-freezing water-containing substances, in particular rungsstatus is reached. This coarse crystal formation biological objects, the one to be frozen can perhaps be explained by the fact that they contain water Substance during part of the temperature of the substance to be frozen at the moment Cooling period a high pressure under freezing due to the released is thrown, characterized by io heat of crystallization and because of inadequate that the pressure is maintained until the heat dissipation rises briefly to a value Surface teapot door of the sub to be frozen,! At which the speed of the crystal wax punch -50 ° C has fallen below the turns stack is increased 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- Die Erfahrung lehrt, daß die meisten biologischen kennzeichnet, daß während der Abkühlung ein 15 Zellsysteme zu einem mehr oder weniger großen variabler Druck angewendet wird. Grad der Unterkühlbarkeit vor dem Einfrieren nei-2. The method according to claim 1, characterized in that experience teaches that most biological indicates that during the cooling one cell system becomes more or less large variable pressure is applied. Degree of hypothermia before freezing 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- gen. Wird das die Zeilen umgebende Wasser durch kennzeichnet, daß während des Vorkühlens der eine plötzliche Druckabsenkung nahe seiner normalen zu gefrierenden Substanz auf eine vorgewählte Gefriertemperatur zu spontaner Kristallbildung an-Einfriertemperatur der Druck so variiert wird, 20 geregt, so ergibt sich die Möglichkeit, daß die extradaß er in jedem Augenblick der Vorkühlung ge- zellulär entstehenden Eiskristalle die Zellwände rade ausreicht, das Einfrieren zu verhindern. durchdringen und so das intrazellulare Wasser durch3. The method according to claim 1, characterized against. If the water surrounding the lines is through indicates that during the pre-cooling the pressure drops suddenly close to its normal Substance to be frozen to a preselected freezing temperature to spontaneous crystal formation at-freezing temperature the pressure is varied, 20 excited, so there is the possibility that the extradaß In every moment of the pre-cooling, the ice crystals that form cellularly form the cell walls Just enough to prevent freezing. penetrate and so the intracellular water through 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- heterogene Bekeimung zur Bildung großer Kristalle kennzeichnet, daß ein so hoher Druck angewen- anregen,4. The method according to claim 1, characterized in that heterogeneous nucleation to form large crystals indicates that such a high pressure will stimulate det wird, daß sich eine Gefrierpunkterniedrigung as Die vorliegende Erfindung hat sich die Aufgabe geder zu gefrierenden wasserhaltigen Substanz um stellt, ein Verfahren zur Erzielung eines leinkristalwenigstens 5° C ergibt. linen oder amorphen festen Zustandes beim schnellenIt is detected that a depression of the freezing point occurs. The present invention has the object of geder hydrous substance to be frozen, a method for obtaining a single crystal at least 5 ° C results. linen or amorphous solid state when fast Gefrieren wasserhaltiger Substanzen, insbesondere biologischer Objekte, anzugeben, wobei die zu ge-To indicate the freezing of water-containing substances, in particular biological objects, whereby the
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