DE1907977A1

DE1907977A1 - Reaktive Teilchen zur Herstellung von unsolubilisierten biologischen Reagenzien

Info

Publication number: DE1907977A1
Application number: DE19691907977
Authority: DE
Inventors: Csizmas Louis Lajos; Virendra Patel
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1968-02-19
Filing date: 1969-02-18
Publication date: 1969-09-25
Also published as: US3639558A; GB1252770A; FR2002181A1; NL6902527A

Description

Reaktive Teilchen zur Herstellung von unsolubilisierten

biologischen Reagentien

Die Erfindung bezieht sich auf aktive Teilchen, die zur direkten chemischen Anlagerung an biologische Substanzen fähig sind, und. auf die durch diese Reaktion gebildeten unsolubilisierten biologischen Reagentien sowie auf Verfahren zur Herstellung derartiger Teilchen und Reagentien. Die erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen und unsolubilisierten biologischen Reagentien besitzen eine gesteuerte Reaktivität bzw, Teilchengröße.

Bis jetzt fanden zwei allgemeine Typen von Teilchen, an welche biologische Substanzen mindestens temporär angelagert werden können,'Verwendung. Der erste Typus waren feste Teilchen, wie Kollodium- oder Latexteilchen und rote Blutkörperchen, die als inerte Teilchen verwendet wurden, an welche aufgrund ihrer Oberflächeneigenschaften die verschiedensten biologischen Substanzen temporär adsorbiert werden konnten. Es

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zeigte sich jedoch, daß viele "biologische Stoffe an derartigen inerten Teilchen nicht derart adsorbiert werden konnten, daß sie an der Teilchenoberflache lange genug festgehalten wurden, um eine entsprechende Verwendung zu ermöglichen. Typisch für den zweiten Teilchentyp waren rote Blutkörperchen, die zunächst zwecks Stabilisierung gegen lyse mit !Formaldehyd und dann mit einem chemischen Kupplungsmittel, wie Bisdiazobenzidin, behandelt worden waren. Derartige Teilchen konnten durch Kuppeln über ein Kupplungsmittel chemisch mit biologischen Substanzen, umgesetzt werden.

Aufgrund ihrer festgelegten Reaktionsfähigkeit und Größe sind beide erwähnten Teilchenarten nur von begrenzter Verwendungsfähigkeit. So sind bei dem zweiten Teilchentypus die stabilisierten roten Blutkörperchen von praktisch einheitlicher Größe und haben alle gleiche Oberflächeneigenschaften,und wenn diese Oberflächeneisenschafteri durch Zugabe von chemischen Kupplungsmitteln geändert werden, wird der Oberfläche eine neue chemische Reaktionsfähigkeit erteilt. Außer der Verwendung von unterschiedlichen Hiefe% chemischen Kupplungsmitteln zeigt sich kein Weg, auf welchem die Oberflächenreaktivität dieser behandelten Teilchen geändert werden kann, und da die ursprünglichen chemischen Eigenschaften des Ausgangsteilehens stets " für die Auswahl der chemischen Kupplungsmittel maßgebend sind,, war in der Vergangenheit für derartige Teilchen nur ein sehr enger Reaktivitätsbereich möglich.

Eine weitere Einschränkung ergab sich daraus, daß die Größe und infolgedessen das Gewicht der Teilchen nicht geändert werden kann. Einige Teilchen, insbesondere rote Blutkörperchen, sind so klein, daß für ihre Sedimentierung bei gewissen immunologischen Versuchen sehr lange Zeiten notwendig

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sind. Der Fachmann weiß, daß derartige Versuche 1 bis 2 Stunden lang beobachtet werden müssen, um zu entscheiden, ob eine Agglutination eingetreten ist oder nicht. Diese Versuchszeiten könnten wesentlich verringert werden, wenn Teilchen von größerem Umfang verfügbar wären.

Die Erfindung hat sich daher zum Ziel gesetzt, zur unmittelbaren chemischen Anlagerung an biologische Substanzen fähige reaktive Teilchen zur. Verfügung zu stellen, die wesentlich größer sind als die bisher bekannten und dabei eine variable Reaktionsfähigkeit aufweisen.

Ferner können erfindungsgemäß unsolubilisierte biologische Reagentien hergestellt werden, die größer und schwerer sind als die bisher verfügbaren.

Die beiden wichtigsten Verwendungszwecke für unsolubilisierbare biologische Reagentien in Teilchenform ist die Durchführung von immunologischen Versuchen und von enzymatischen Umsetzungen und Verfahren. Bei dem ersteren Anwendungszweck muß die Reaktionsfähigkeit und die Größe der Teilchen, an welche die biologischen Stoffe angelagert werden, sorgfältig gesteuert werden. Da sehr große Teilchen nicht agglutinierungsfähig sind, wie dies für immunologische Versuche Voraussetzung ist, können nicht von vornherein besonders große Teilchen verwendet werden. Derartige Teilchen würden sich vielmehr sofort absetzen, da di-e Teilchengröße und das Teilchengewicht die recht schwachen Agglutinierungskräfte überwinden würden. Um für die enzymatischen Umsetzungsprozesse verwendbar zu sein, müssen die Teilchen des Reagens so groß sein, daß sie filtrierbar sind, um zu verhindern, daß die Enzyme aus einer Stufe des Verfahrens in eine spätere Stufe, in welcher ihre Anwesenheit

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nicht erwünscht ist, mitgenommen werden. In diesem Falle sind daher größere Teilchen notwendige

Dank der Erfindung verfügt man nun über ein Verfahren, mit dessen Hilfe ursprünglich kleine Teilchen, wie rote Blutkörperchen, Mikrobenzelien und mit Gelatine überzogene inerte Teilchen als Trägerteilchen verwendet werden können, auf welche über chemische Kupplungsmittel ein oder mehrere Überzüge eines eiweißartigen Stoffes mit Hilfe einer Kovalenzbindung aufge-Φ bracht werden können. Auf das Trägerteilchen können mehrere derartige Überzüge aufgebracht werden, so daß zum Schluß seine Größe und sein Gewicht wesentlich größer ist als. bei dem ursprünglichen Teilchen. Mit Hilfe dieser Methode ist eine bessere Kontrolle über die zum Kuppeln von zwei biologischen Stoffen verfügbare Reaktivität und über die Teilchengröße zu erreichen. Der größere Umfang ist deshalb zweckmäßig, weil beispielsweise die Sedimentationszeit für Trägerteilchen, wie E. coli, von 12 bis 18 Stunden, die benötigt werden^, wenn kein Überzug vorhanden ist, auf 6 bis 8 Stunden verringert werden kann.

Bei der Herstellung der reaktiven Teilchen werden zunächst " Trägerteilchen mit eiweißartiger Außenfläche in ein flüssiges Medium eingebracht, worauf dann mindestens ein-eiweißartiges

Material unter Verwendung eines ersten chemischen Kupplungsein

mittels an diese Teilchen gekuppelt wird, so daß sich/einheitlicher Überzug auf den Trägerteilchen ausbildet. An die Außenfläche der auf diese Weise einheitlich überzogenen Teilchen wird dann ein zweites chemisches Kupplungsmittel angelagert, das ungebundene, freie reaktionsfähige Gruppen bereitstellt, die zu einer Reaktion mit biologischen Substanzen durch Ausbildung einer Kovalenzbindung fähig sind.

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Um mit Hilfe eines derartigen reaktionsfähigen Teilchens ein unsolubilisiertes biologisches Reagens herzustellen, braucht^man nur eine biologische Substanz in einem flüssigen Medium mit den reaktiven Teilchen zu vermischen. Die an der Außenseite der Teilchen vorhandenen freien reaktionsfähigen Gruppen reagieren mit der biologischen Substanz und halten diese unter Ausbildung von Kovalenzbindunsen an der Oberfläche fest. Wie bereits erwähnt, können mehrere Überzüge aus eiweißartigem Material verwendet werden, um die Teilchengröße entsprechend einzustellen.

Mit den erfindungsgemäßen Teilchen können die verschiedensten biologischen Stoffe gekuppelt werden, jedoch erhält man die am besten verwendungsfähigen biologischen Reagentien mit Substanzen, die eine Antigenwirkung aufweisen. Derartige Substanzen sind Antigene und Haptene mit immunologischen Eigenschaften sowie Enzyme mit enzymatischen Eigenschaften. Im folgenden werden diese Stoffe ganz allgemein als "Substanzen mit Antigenwirkung" bezeichnet.

Auf jeder Stufe des oben beschriebenen Verfahrens können die Kupplungsmittel und die Eiweißstoffe derart gewählt werden, daß der Außenfläche der Teilchen in jedem gegebenen Stadium die gewünschte Reaktivität verliehen wird.

Weitere Vorteile der Erfindung bestehen darin, daß auf allen Stufen durch die Eiweißstoffe .reaktionsfähige Gruppen verfügbar gemacht werden. Diese einheitliche Reaktivität ist möglich, weil die an der Oberfläche von Trägerteilchen, wie roten Blutkörperchen oder Mikrobenzellen, von Natur aus vorhandenen reaktiven Gruppen inaktiviert werden, wenn die betreffenden Teilchen mit dem Eiweißstoff überzogen werden. Ein

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weiterer Vorteil besteht darin, daß, da die verschiedensten Eiweißstoffe als Überzug dienen können, hoch reaktive Kupplungsmittel verwendet werden können, ohne daß Gefahr besteht, daß die Zellwände des Trägerteilchens, falls das Teilchen von zellularer Natur ist, brechen, denn die Kupplungsmittel kommen mit den-Zellenoberflächen nicht in Berührung. Schließlich hat man noch den weiteren Vorteil, daß jedem der Überzüge ein Farbstoff oder eine Beize zugefügt werden kann, so daß die Reagensteilchen besser zu sehen sind.

Bei Verwendung von Mikrobenζeilen und roten Blutkörperchen als Trägerteilchen ist es manchmal vorteilhaft, sämtliche von Natur aus vorhandenen Antigenstellen auszuschalten» Dies gilt insbesondere für Mikrobenzellen als Trägerteilchen. Ebenfalls gilt es bei der Untersuchung von biologischen "Flüssigkeiten auf die Anwesenheit von immunologischen Stoffen, worin Antikörper zu den antigenen Gruppen auf den Trägerteilchen anwesend sein können, welche eine nicht spezifische Agglutinierung verursachen und daher zu JäLschen Testresultaten führen könnten, wenn die antigenen Stellen nicht überdeckt wären. So können das N-Antigen von roten Blutkörperchen aus dem Schaf-, Pferde- und Rinderblut, das Forssman-Antigen von Blutkörperchen aus dem Schafsblut und das A-, B- und AB-Antigen der menschlichen roten Blutkörperchen sämtliche mit Hilfe des eiweißhaltigen Überzuges abgedeckt werden.

Die Trägerteilchen können rote Blutkörperchen, Mikröbenzellen, mit Gelatine überzogene Teilchen oder Gemische aus den erwähnten Stoffen sein. Die roten Blutkörperchen als Trägerteilchen können von den verschiedensten Tieren stammen. Beispiele für verwendbare rote Blutkörperchen sind diejenigen, die man aus den folgenden Tieren erhält: Opossum, Ratte, Kanin-

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chen, Meerschweinchen, Ziege, Pferd, Schaf, Alligator, Schildkröte und schließlich Mensch. Die roten Blutkörperchen werden dadurch gewonnen, daß man dem betreffenden Tier Blut abzapft und die roten Blutkörperchen durch Zentrifugieren vom Plasma trennt·. Die Körperchen werden dann in physiologischer Salzlösung aufbewahrt, bis sie mit dem ersten Kupplungsmittel umgesetzt werden.

Die erfindungsgemäß als Trägerteilchen verwendbaren Mikrobenzellen können ein beliebiger selbstreproduzierender Mikroorganismus sein, dessen Portpflanzung nicht unbedingt von anderen Organismen abhängig sein muß. Sowohl grampositive als gramnegative Bakterienzellen können verwendet werden. Auch Funguszellen und Protozoenzellen, ebenso wie Virenteilchen, können verwendet werden. Es handelt sich dabei im allgemeinen um einzellige Organismen, die gelegentlich zu Klumpen oder Aggregaten vereinigt sind. Die Zellen können in dieser Form verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie nicht aufgrund ihrer Aggregatgröße ein Trägerteilchen darstellen, das so groß ist, daß das damit gebildete Testsystem in Anwesenheit einer Substanz, die der an die aggregierten Zellen gebundenen Antigensubstanz homolog ist, agglutiniert. Bevorzugt als Mikrobenzellen sind im allgemeinen Bakterienzellen oder ihre Aggregate, die von gleichmäßiger Form und Größe sind und eine maximale Ausdehnung in einer Richtung von etwa 0,2 bis 10 /U haben. Auch eine Mischung aus verschiedenen, jedoch gleichförmigen Zellen kann verwendet werden, jedoch ist dies nicht die bevorzugte Arbeitsweise. Unter diesen Bakterien sind die verwendbaren Mikrobenzellen unter anderem diejenigen von Teil I des Pflanzensystems einschließlich der Klassen I, II und III, Ord-

und nung I. Die Mikrobenzellen entsprechen Klasse HI, Ordnung I/ schließen die intrazellularen Virenteilchen ein, die eine maximale Ausdehnung von etwa 0,2 /U haben.

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Für eine komplette Liste von verwendbaren Bakterienzellen sei verwiesen auf Bergey's Manual Of Determinative Bacteriology von R.S. Breed, E.G.D. Murray, U.R. Smith, 7. Auflage, 194-7» Verlag Williams and Wilkins Company. Besonders gut verwenden lassen sich Bakterien der Klasse II, Unterordnung II, Familie IV (Pseudomonadaceen) und Klasse II, Ordnung IV, Familie IV (Enterobacteriaceen). Sämtliche Stämme I - V können als bevorzugte Mikrobenzellen zur erfindungsgemäßen Verwendung angesehen werden. Ebenso sind die zu Klasse II, Ordnung IV, Familie V (Brucellaceen), X·(Lactobacillaceen) und XIII (Bacillaceen) gehörenden Mikrobenzellen bevorzugt. Will man kleinere Teilchengrößen, wie etwa 0,2 ax und darunter haben, so kann man Organismen aus Ordnung I und II der Klasse III verwenden. Insbesondere die Virales der Ordnung II sind sehr klein , was jedoch ihre Verwendungsfähigkeit einschränkt.

.Eine für Zwecke der Erfindung bevorzugte Bakterienzelle ist Escherichia coli. Eine andere, ebenfalls besonders bevorzugte Mikrobenzelle ist die leicht verfügbare Hefe, Saccharomyces cerevisiae. Die Hefewachstumsphasen der Funguszellen sind ebenfalls bevorzugt als Trägerteilchen.

Andere besonders gut verwendbare Mikrobenzellen sind Bacillus subtilis, Lactobacillus leich'mannii, Bacillus pumilus und Pseudomonus fragi.

Diese Mikrobenzellen können erhalten werden durch Züchten einer Ausgangskultur der betreffenden Zellen in einem Nährmedium. Wenn die Zellen ihr maximales Wachstum erreicht haben, werden sie geerntet. .

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Die Trägerteilchen mit eiweißhaltiger Oberfläche können dadurch gebildet werden, daß man unlösliche Teilchen mit einem Durchmesser zwischen 0,1 und 10/U mit Gelatine, einem eiweiß-

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haltigen Material, überzieht, wozu^eine Technik, wie Coacer-

vierungs-Überziehen oder Einkapseln, anwendet. So kann man beispielsweise Polystyrolteilchen, wie die in der US-Patentschrift 3 234 096 beschriebenen, dadurch einkapseln, daß man sie in Gelatinelösung emulgiert und die Emulsion dann sprühtrocknet. An der Oberfläche der Teilchen muß nur ein dünner G-elatinefilm abgelagert werden, mit dem dann die Kupplungsmittel umgesetzt werden. Man kann die Trägerteilchen auch ganz aus Gelatine, zusammen mit entsprechenden Vernetzungsmitteln, wie einem solubilisierten Polyacrolein, herstellen.

Die entweder in der ersten oder in der zweiten Stufe zum chemischen Kuppeln erfindungsgemäß zu verwendenden Kupplungsmittel sind., allgemein gesprochen, Verbindungen mit zwei oder mehr der folgenden reaktiven Gruppen: Azo-, Sulfonsäure- oder mit Nitrogruppen aktivierte Fluorgruppen, Azid-, Imin- und reaktive Chlorgruppen, gebunden an einen Ring mit guten Resonanzstrukturen. Diese reaktiven Gruppen reagieren mit primären Aminogruppen, SuIf hydryl-(Mercapto )_-gruppen, Carboxylgruppen und Hydroxylgruppen in den die Oberfläche der Trägerteilchen darstellenden Stoffen und den eiweißhaltigen Stoffen sowie mi't den biologischen Substanzen, die mit den reaktiven Teilchen gekuppelt werden sollen.

Eine repräsentative Aufzählung derartiger Kupplungsmittel ist die folgende: Bisdiazobenzidin, Bisdiazobenzidindisulfonsäure, Tetraazo-p-phenylendiamin, Difluordinitrobenzol, Difluordinitrodiphenylsulfon, ein Carbodiimid, Toluoldiisocyanat, Cyanursäurechlorid, Dichlor-s-triazin, lT-t-Butyl-5-methyl~

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isoxazoliumperchlorat, ein Dialdehyd, ein J. ,ß-ungesättigter 'Aldehyd und Gemische daraus. Einige dieser Kupplungsmittel, insbesondere die Cyanuratverbindungen, die Dialdehyde und die o£ ,ß-ungesättigten Aldehyde, schützen die roten Blutkörper-. chen und die Mikrobenzellen gleichzeitig mit ihrer Kupplungswirkung auf andere Gruppen an der Zellenoberfläche, so daß diese Zellen dann gegen Lyse stabilisiert sind. Y/erden daher derartige Kupplungsmittel verwendet, so ist eine getrennte Stabilisierungs- oder Konservierungsbehandlung überflüssig. Vor Anwendung des R-t-Butyl-5-iaethylisoxazoliumperehlorates muß die Oberfläche, auf die es gekuppelt werden soll, mit φ einem Succinylierungsreagens, wie Bernsteinsäureanhydrid, behandelt werden.

Als Carbodiimide können u.a. die folgenden verwendet werden: N,N'-Dicyelohexycarbodiimid; 1-Äthyl-3(3-dimethyIaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid und 1-Cyclohexyl-3(2-morpholinyl-(4)-äthylcarbodiimid)metho-p-toluolsulfonat. Ein spezifisches Difluordinitrobenzol, das verwendet werden kann, ist das 1,3-Difluor—4-,6-dinitrobenzol und ein spezifisches Difluordinitrodiphenylsulfon ist das pjp'-Difluor-m.m'-dinitrodiphenylsulfon.

kann Das Beschichtungsmaterial für die Trägerteilchen/ein

" beliebiger eiweißhaltiger Stoff sein, z.B. ein Serum-Albumin oder Globulin, erhalten von verschiedenen Tierarten, oder es kann auch ein anderer einheitlicher Stoff sein, wie ein Myoglobin oder Hämoglobin. Besonders bevorzugt ist Rinderserum-Öllbumin, das auch leicht verfügbar ist. Andere Stoffe, wie Ovalbumin, o^-ß- und «^-Globuline oder ß-^-Lipoprotein und Thyroglobulin können ebenfalls verwendet werden. Im allgemeinen ■ ist es notwendig, daß das zu verwendende Überzugsmaterial so homogen ist, daß man bei seiner Verwendung eine einheitliche Oberfläche erhält. Die oben genannten Stoffe entsprechen die-

• ser Anforderung.

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Als "biologische Substanzen, welche mit den erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen zu unsolubilisierten biologischen Reagentien umgesetzt werden können, kann eine große Zahl von Stoffen mit antigener Wirksamkeit dienen (s. oben). So können beispielsweise die verschiedensten Antigene mit immunologischen Eigenschaften als Überzugsstoffe verwendet werden und außer -den oben bereits angeführten seien die folgenden erwähnt: menschliches Serumalbumin, menschliches chorionisches Gonadotropin (HCG-); Antigene der Blutgruppen A und B, c^-Globuline der menschlichen Plasmafraktion; ^-Globuline von verschiedenen Tierarten; menschliches Transferrin; Trichinellaantigen und ähnliche antigene Stoffe von entweder pathogenen oder natürlichen Organismen; Leutinisierungshormone; Insulin und von. Tuberculin -a- gereinigte Proteinderivate.

Eine andere Klasse von antigenwirksamen Stoffen, die an die erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen gekuppelt sein können, sind Enzyme, wie Diastase, Maltase, Zymase, Amylase und andere Enzyme. Wenn ein Enzym an ein Trägerteilchen gekuppelt ■ ist, kann es vorzugsweise zur Durchführung von enzymatischen Umwandlungsprozessen verwendet werden. So können die ersten drei der oben angeführten Enzyme in einem dreistufigen Verfahren für die Umwandlung von Stärke in Alkohol verwendet werden, und. das letzte der angeführten Enzyme kann dazu dienen, eine Stärkeaufschwemmung in einen Zuckersirup zu überführen. Der Vorteil bei der Anwendung der Enzyme in unsolubilisierter Form durch das erfindunssgemäße Kuppeln an reaktive Teilchen besteht darin, daß die Enzyme mit dem aufzuarbeitenden Material nicht vermischt werden. Die Teilchen werden in einer festgelegten Stellung zurückgehalten oder sie werden in eine Schicht eingebettet, durch welche das umzusetzende Material durchläuft.

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Als weiteres Beispiel für eine enz'ymatische Umwandlung sei die Überführung von Schwarzlauge-Molassen in Alkohol genannt, wobei an die erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen sowohl Invertase als Zymase gekuppelt werden, worauf die Molasse darüberläuft. ·

Mit Hilfe der Erfindung kann man außerdem mehrere dieser verschiedenen antigenaktiven Substanzen gleichzeitig an die Außenseite kuppeln, um Reagensteilchen mit mehrfacher Reaktivität herzustellen. So wurden beispielsweise menschliches- und Rinder-^-Globulin gleichzeitig dazu benutzt, Reagensteilchen herzustellen, die dazu verwendet werden können, in biologischen Proben beide Substanzen durch Verhinderung des Agglutinationstestes zu bestimmen. Auch Rinderserumalbumin,' menschliches !^--Globulin und Rinder-^-Globulin wurden verwendet, um dem erfindungsgemäß hergestellten unsolubilisierten , biologischen Reagens gleichzeitig mehrfache Reaktivität zu verleihen.

Antikörper für diese verschiedenen Stoffe sind y~-Globulinmoleküle, die derart modifiziert sind, daß sie Antigenrezeptor-stellen für die Antigene aufweisen, deren immunologische Gegenstücke sie darstellen; aus diesem Grunde kann die Anwesenheit von Antikörpern durch ihre Reaktion mit entweder ihrem entsprechenden Antigen oder· dem Antikörper zu dem ^-Globulin, aus dem sie gebildet sind, nachgewiesen werden. Die hier erwähnten antigenen immunologischen Stoffe sind Stoffe, die, wenn sie in das' Kreislaufsystem eines Tieres eingeführt werden, Antikörper produzieren, die für diesen bestimmten antigenen Stoff spezifisch sind. Derartige antigene Stoffe sind u.a. Serumprotein, wie /■-Globulin und Serumalbumin,oder Blutgruppensubstanzen "A" und "B", von denen ein Test für die Blutgruppenermittlung gemacht werden kann,und ebenso die anderen oben erwähnten Antigene.

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Der Ausdruck "immunologisches Gegenstück", wie er oben verwendet wurde, bezeichnet entweder ein Antigen oder einen Antikörper, der spezifisch mit dem entsprechenden Antikörper bzw. Antigen reagiert.

Wie bereits erwähnt, können die reaktiven Teilchen mit einem Farbstoff oder Lack versehen werden, um die visuelle Unterscheidung zu erleichtern, die das zum Schluß erhaltene unsolubilisierte biologische Reagens von dem Hintergrund abhebt. Farbstoffe wie Hämatoxylin, Fuchsin und Kristallviolett können für diesen Zweck verwendet werden. Eine andere zweckmäßige Vorbereitung für die Mikrobenzellen besteht darin, daß man sie mit einem organischen Lösungsmittel, wie einem Alkohol, A'ther oder dgl., wäscht, um etwa vorhandene Polysaccharid- oder Wachsschichten zu entfernen, welche die Reaktion zwischen den Trägerteilchen und den Kupplungsmitteln stören könnten."

Die erfindungsgemäßen unsolubilisierten biologischen Rea-

gentien können als immunologische Indikatorteilchen verwendet

man
werden, indem/die reaktiven Teilchen mit spezifischen antigen-

aktiven Substanzen umsetzt. Wenn das immunologische Gegenstück

die
zu dem an /.reaktiven Teilchen gekuppelten Stoff unmittelbar durch Verwendung der immunologischen Indikatorteilchen bestimmt werden soll, kann man den Versuch als direkten Agglutinationstest bezeichnen, der so durchgeführt wird, daß man die Indikatorteilchen mit einer Probe der Flüssigkeit vermischt, in der das immunologische Gegenstück vermutet wird und beobachtet, ob eine'Agglutinierung stattfindet. Das Auftreten einer Agglutinierung bedeutet dann die Anwesenheit des Stoffes, auf den getesbet wird, während bei seiner Abwesenheit keine Agglutinierung eintritt. Die Agglutinierungsversuche können durchgeführt werden durch Kuppeln eines Antigens an die er-

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findungsgemäßen reaktiven .Teilchen, die dann unmittelbar verwendet werden für den Test auf die Anwesenheit des immunologischen Gegenstückes in der gleichen Flüssigkeit.

Die gleichen Indikatorteilchen können auch verwend.et werden zum Nachweis eines Stoffes mit einer reaktiven Stelle entsprechend dem an die reaktiven Teilchen angegliederten immunologischen Material; man testet in diesem Pail auf die Verhinderung einer Agglutinierung. Soll beispielsweise auf ein Antigen getestet- werden, so setzt man eine gewisse Menge des diesem Antigen entsprechenden Antikörpers dem Testmedium zu und zwar vor oder gleichzeitig mit den Indikatorteilchen, die in diesem Falle aus an das betreffende Antigen gekuppelten reaktiven Teilchen bestehen. Enthält die untersuchte Flüssigkeit das Antigen, so'reagiert dieses mit dem vorher oder gleichzeitig zugesetzten Antikörper, so daß der Antikörper daran verhindert wird, mit dem Indikatorsystem zu agglutinieren. Die Agglutinierung, die sonst eintreten würde, ist also bei Anwesenheit eines Antigens verhindert und die biologischen Reagentien bilden eine Sedimentation in dem Versuchsgefäß.

Der AgglutinieruBgsteat bzw«, der'Test zur Verhinderung der Agglutinierung kann mit den entsprechenden Indikatorteilchen durchgeführt werden, um die Anwesenheit entweder eines Antikörpers oder eines Antigens in Flüssigkeitsproben nachzuweisen, d.h. die erfindungsgemäßen Indikatorteilchen können sowohl zum Nachweis von Antigenen als von Antikörpern verwendet werden.

Der Agglutinierungstest und der Test, der auf.der Verhinderung der Agglutinierung beruht, können normalerweise auf zweierlei Art durchgeführt werden. Die eine Methode ist bekannt als "Glasstreifen-Agglutinierungsmethode" und die andere

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als "Mikrotitrator-Agglutinierungsmethode". Die erstere besteht darin, daß man die Testreagentien und die Flüssigkeitsprobe auf einer ebenen Glasfläche vermischt und wird im allgemeinen nur auf qualitativer Basis durchgeführt, um eine vorbestimmte Konzentration des Stoffes, auf den getestet wird, nachzuweisen. Die letztere Methode wird so durchgeführt, daß man die Testreagentien für jeden Test in eine Reihe von flachen Vertiefungen in der Oberfläche einer Platte aus Kunststoff oder einem anderen geeigneten Material einbringt. Die lineare Anordnung der Vertiefungen erlaubt eine reihenweise Verdünnung des für den betreffenden Agglutinierungs- bzw. Agglutinierungsverhinderungstest angewendeten Antikörper.^» Diese reihenweise Verdünnung wird so durchgeführt, daß man zuerst einen Tropfen eines Verdünnungsmittels in jede der Vertiefungen in der Reihe einbringt, worauf man dann der ersten Vertiefung einen Tropfen einer Antikörperlösung mit einer ursprünglichen Verdünnung von z.B. 1:5 zufügt, wozu man eine Schlinge oder eine kalibrierte Spirale verwendet, die genau einen Tropfen Flüssigkeit hält. Nach dem Vermischen entnimmt man der ersten Vertiefung einen Tropfen Flussigkeii/imd vermischt sie mit dem Verdünnungsmittel in der zweiten Vertiefung. Die Verdünnung in der ersten Vertiefung ist dann 1:10, diejenige in der zweiten Vertiefung 1:20. Dieser Prozeß der immer weitergehenden Verdünnung wird wiederholt, bis sämtliche Vertiefungen in der Reihe behandelt sind, so daß man eine fortlaufende Reihe von Antikörperverdünnungen erhält, von denen die nachfolgende stets die Hälfte des in der vorangehenden enthaltenen Materials enthält. Für den Agglutinierungstest bringt man nach Herstellung dsx reihenweisen Verdünnungen in.jede Vertiefung einen Tropfen einer Suspension von erfindungsgemäßen Indikatorteilchen ein. Soll auf Verhinderung der Agglutinierung getestet werden, so bringt man in jede Vertiefung eine gewisse Menge an ungebundenem Antigen ein, die im allgemeinen einen Überschuß über die anwesende Men—

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ge an Antikörper darstellt und fügt erst dann das unsolubilisierte "biologische Reagens zu. Sollen Proben von Körperflüssigkeiten getestet werden, so werden diese als das Antigen zugegeben, und die reihenweisen Verdünnungen des Antikörpers werden so eingestellt, daß die Konzentration an Antikörper, die der erwarteten Konzentration an nachzuweisendem Antigen etwa entspricht, im Mittelteil der Verdünnungsrreihe liegt. Dieses Vorgehen gestattet eine Feststellung des Titers des Antigens in der Körperflüssigkeit und insofern eine halbquantitative Bestimmung des Antigens.

Herstellung der erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen.

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen und der unsolubilisierten biologischen Reagentien umfaßt verschiedene Reaktionsstufen, die vorzugsweise alle bei Raumtemperatur in einem gepufferten flüssigen Medium durchgeführt werden. Die Trägerteilchen werden in dem flüssigen Medium derart dispergiert, daß die Suspension eine Konzentration von 1 bis 10 $ hat. Die Träeerteilchen werden dann bei Raumtemperatur (20 bis 25 C) so lange mit dem "ersten Kupplungsmittel umgesetzt, daß eine Reaktion stattfindet, was gewöhnlich in weniger als 1 Stunde· der Fall ist. D.ie so behandelten Trägerteilchen werden dann mit dem ersten Überzugsmaterial versehen, indem^'dieses Material einem flüssigen Medium zusetzt, in welchem die wie oben vorbehandelten reaktiven.Teilchen suspendiert sind. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur durchgeführt und dauert weniger als 1 Stunde. Diese beiden Stufen, das Umsetzen mit einem Kupplungsmittel und dann mit dem Überzugsmaterial, können mit Erfolg beliebig oft wiederholt werden, um Teilchen von bestimmter Größe und bestimmtem Gewicht herzustellen, wie sie für einen speziellen Anwendungszweck geeignet sind. 7/enn die gewünschte Größe und das gewünschte Gewicht erreicht sind, können die Teilchen reaktiv gemacht werden, indem man sie mit

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einem zweiten Kupplungsmittel behandelt, was auf die oben für das erste Kupplungsmittel beschriebene Weise geschehen kann, worauf die Teilchen dann unmittelbar mit einer der oben erwähnten^biologischen Substanzen umgesetzt werden können.Die Umsetzung mit der betreffenden biologischen Substanz wird ebenfalls bei Raumtemperatur im flüssigen Medium durchgeführt.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Kupplungsmittel sind im allgemeinen reaktionsfähig genug, um die notwendige Kupplungszeit bei Raumtemperatur auf 10 bis 3O^-Minuten herabzusetzen.

Bevorzugte Durchfüh'rungsform.

Die erfindungsgemäß bevorzugten Trägerteilchen sind Mikrobenzellen, da sie mit Hilfe von bekannten Kulturverfahren leicht erhältlich sind. Unter den Kupplungsmitteln kann keines als besonders bevorzugt bezeichnet werden, jedoch kann -Bi3-diazobenzidin (BDB) im Zusammenwirken mit allen hier erwähnten Überzugsstoffen und biologischen Substanzen verwendet werden. Das bevorzugte eiweißartige Material zur Bildung des Überzuges über die Trägerteilchen ist Rinderserumalbumin.

Die bevorzugten reaktiven Teilchen erhält man dann so, daß man Mikrobenzellen mit nicht-pathogenen Eigenschaften, wie E. coli, züchtet, die Zellen .isoliert und sie bei Raumtemperatur in einem flüssigen Medium mit BDB umsetzt. Die behandelten Trägerteilchen können dann mit Rinderserumalbumin (BSA) überzogen werden, indem man sie in einem flüssigen Medium bei Raumtemperatur etwa 15 Minuten damit behandelt.

Die überzogenen Trägerteilchen können dann durch neuerliches Aufbringen von BDB wieder reaktiv gemacht werden. Die so hergestellten reaktiven Teilchen können unmittelbar mit

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.einer der oben erwähnten biologischen Substanzen zu immunologischen Indikatorteilchen oder enzymatisch en Umsetzungsreagen·» tien umgesetzt werden.

Die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung«, Mit dem Ausdruck "Salzlösung." ist eine physiologische Kochsalzlösung mit einer Konzentration von 0,85 i° bezeichnet.

Beispiel 1 '

10 ml einer 2,5 $igen Suspension von formalinisierten E. coli-Zellen wurden dreimal in Salzlösung gewaschen. Nach der letzten Zentrifugierung wurde die überstehende Flüssigkeit verworfen und 0,25 ml der dichtgepackten Zellen in 6 ml Phosphatpuffer, pH 7,33» suspendiert. Dann wurden 5 ml Rinderserumalbumin (BSA) in Salzlösung (40 mg/5 ml) zugefügt. Zu der Sus-.pension wurden 20 ml Bisdiazobenzidin, Verdünnung 1:5, in Phosphatpuffer und Salzlösung, pH 7,3» zugegeben und das Gemisch 20 min bei Raumtemperatur im rotierenden Schüttelgerät behandelt. Die Zellen nahmen während dieser Zeit eine bräunliche Färbung an. Der Ansatz wurde dann zentrifugiert und in einer Salzlösung mit 0,6 <fo BSA resuspendiert, worauf man das ganze nochmals'15 min bei Raumtemperatur reagieren ließ. Nach dreimaligem Waschen mit Salzlösung wurden die überzogenen Trägerteilchen gelagert.

Beispiel 2

Die gemäß Beispiel 1 überzogenen Trägerteilchen wurden mit Hilfe eines Carbodiimides mit einer biologischen Substanz, menschlichem Choriongonadotropin (HCG) gekuppelt.

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0,25 ml der dicht gepackten, mit BSA überzogenen Trägerteilchen wurden einmal mit Salzlösung gewaschen und dann mit 2 ml HCG mit einem Gehalt von 10 mg/ml vermischt. Der Zellensuspension wurde eine Lösung von 0,2 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid in 0,5 ml Tetrahydrofuran und 1 ml Y/asser zugefügt und der Ansatz bei Raumtemperatur etwa 18 h unter fortgesetztem Schütteln inkubiert. Dann wurden die Zellen nacheinander dreimal mit je 20 ml 0,01 η Natriumcarbonat, dreimal mit je 0,01 η HCl und dreimal mit je 30 ml destilliertem Wasser gewaschen, um sie von dem überschüssigen Kupplungsmittel zu befreien« Zum Schluß wurden die Zellen noch zweimal mit 0,6 $> BSA in Salzlösung gewaschen und in Kochsalzlösung zu einer 4 $igen Zellensuspension resuspendiert. Das Produkt besteht aua E.coli-Trägerteilchen, überzogen mit BSA und trägt an seiner Außenseite das menschliche Choriongonadotropin, das über das Carbodiimid als Kupplungsmittel an den BSA-Überzug gekuppelt ist. Dieses biologische Reagens wurde gegen Kaninchenantiserum für HCG und mit normalem Kaninchenserum getestet, wobei sowohl die Glasstreifen- als auch die Mikrotetrator-Agglutinierungsmethode angewandt wurden. Die Resultate zeigten, daß das gebildete ■ Reagens gegenüber HCG hoch sensitiv und spezifisch war, ohne daß eine nicht-spezifische Agglutinierung auftrat.

Beispiel 3

Beispiel 2 wurde unter Verwendung des gleichen Oarbodiimid-Kupplungsmittels wiederholt, wobei jedoch das HCG ersetzt war durch 2 ml einer Lösung mit 40 mg Insulin bzw₀ 2 ml einer Lösung von menschlichem Serumalbumin (HSA), die 10 mg des Antigens enthielt. Diese biologischen Reagentien wurden beide auf gleiche Art gegen Kaninchenantxserum und gegen normales Kaninchenserum getestet, wobei man die gleichen guten Resultate wie oben erhielt.

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Beispiel 4

Die mit einem Überzug versehenen Trägerteilchen nach Beispiel 1 wurden durch Zugabe von Woodwards Reagens L nach vorausgehender Succiniliierungsbehandlung reaktionsfähig gemacht. Die reaktiven Teilchen wurden dann getrennt mit HSA und Insulin gekuppelt.

0,25 ml der dichtgepackten, mit BSA überzogenen Trägerte'ilchen wurden zentrifugiert und dann dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Dann wurden die Teilchen mit 20 ml einer 0,1 'folgen wäßrigen Lösung von Natriumbicarbonat vermischt, 3 mg Bernsteinsäureanhydrid zugefügt und die Suspension über Eacht bei 4°C geschüttelt. Die Zellen wurden dann dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, in 5 ml destilliertem Wasser resuspendiert und mit 10 Mikroliter Triäthylamin vermischt. Dem Gemisch wurden 17 mg Woodwards Reagens L (N-tert-Butyl-5-methylisoxazoliumperchlorat) zugefügt, worauf nach 10 min die zu kuppelnde biologische Substanz zugegeben wurde.

Als erste Kupplung wurden 10 mg HSA in 2 ml Salzlösung zugegeben, das Gemisch über Macht bei 25 C geschüttelt, dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und in 5 ml destilliertem Wasser resuspendiert. Zur Durchführung des Testes auf Agglutinierung bzw. auf Verhinderung der Agglutinierung wurde d_as biologische Reagens in .Salzlösung mit 0,6 <?o BSA resuspendiert.

Die oben beschriebene Kupplung wurde als zweite Kupplung wiederholt, wobei 2 ml einer 0,2 ?öis;en Lösung von Insulin in Salzlösung zu der Suspension der reaktiven Teilchen zugegeben wurden.

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Beispiel 5

Gemäß Beispiel 1 wurden überzogene Trägerteilchen hergestellt, wobei jedoch diesmal 10 mg BSA in 25 ml Salzlösung und 10'tnl Bisdiazobenzidin, im Verhältnis von 1:5 in mit
Phosphat gepufferter Salzlösung (pH 7,3) gelöst, verwendet
wurden. Die erhaltenen Teilchen wurden wie folgt als Trägerteilchen weiterverwendet: Die überzogenen Teilchen wurden in Phosphatpuffer, pH 7,3 bis 7,4, resuspendiert, worauf die
folgenden Salzlösungen von antigenaktiven Substanzen zu einzelnen Ansätzen zugegeben wurden: Pferde-^-globülin-i00 Au
(Antitoxineinheiten) und 200 Au in 2,5 ml Salzlösung; ein
Gemisch aus menschlichem· ^-Globulin - 20 mg in 2,5 ml Salzlösung und Rinder-^-globulin in 2,5 ml Salzlösung; menschliches Serum, 1 ml in 1,5 ml Salzlösung und menschliches
Plasma, 1 ml in 1,5 ml Salzlösung. Als nächstes wurden 10 ml BDB in einer Verdünnung von 1:80 in Phosphatpuffer, ,pH 7,3
bis 7,4, zu jedem Ansatz zugegeben und das resultierende Gemisch 20 bis 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt, um das
BDB mit den Trägerteilchen zu reaktiven Teilchen umzusetzen
und das Kuppeln der biologischen Substanzen an die reaktiven Teilchen über BDB zu bewirken. Die biologischen Reagentien
würden dann einzeln mit Salzlösung gewaschen und in Salzlösung, die für einige der Ansätze 1 fo normales Kaninchenserum (URS) bzw. 0,6 io BSA enthielt, resuspendiert.

Die so hergestellten biologischen Reagentien wurden dann für Tests auf Agglutinierung bzw. Agglutinierungsverhinderung mit Hilfe der Mikrotitratortechnik benutzt. Die Resultate
zeigten, daß die Reagentien zum spezifischen Nachweis der
entsprechenden Antigene und ihrer Antikörper benutzt werden
konnten. Es wurden für diese Reagentien Sedimentationszeiten von etwa 6 bis 8 h beobachtet, während bei aus unbeschichteten E. Coli-Trägerteilchen hergestellten Reagentien Sedimentationszeiten von 12 bis 18 h die Regel sind.

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Beispiel 6

Es wurden Trägerteilchen hergestellt mit zwei primären Überzügen, einem ersten "aus BSA und einem zweiten aus menschlichem y— Globulin, die dann mit einem Antigen, Rinder-yglobulin, gekuppelt wurden. Der erste Überzug wurde gemäß Beispiel 1 aufgebracht, wobei jedoch 5 ml einer 2,5 ^igen Suspension von formalinisierten E. coli-Zellen, 10 mg BSA'in 2,5 ml Salzlösung und 10 ml BDB, im Verhältnis von 1:5 in mit Phosphat gepufferter Salzlösung verdünnt. (pH 7,3 bis 7,4), verwendet wurden. . ■ ■ ·

Als nächstes wurden zu 0,125 ml der dichtgepackten Zellen 20 mg menschliches /--Globulin in 2,5 ml Salzlösung zugefügt, worauf noch 10 ml BDB, im Verhältnis von 1:80 in mit Phosphat gepufferter Salzlösung verdünnt, zugegeben wurden; das Gemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur auf eine rotierende Schüttelvorrichtung gesetzt. Dann wurde das ganze zentrifugiert und die Zellen in Salzlösung resuspendiert, worauf sie 15 min bei Raumtemperatur stehengelassen wurden, um weiter zu reagieren. Die zweifach beschichteten Trägerteilchen wurden dann dreimal mit Salzlösung gewaschen,und es wurden ihnen 20 mg Rinder-2Γ-globulin in 2,5 ml Salzlösung zugefügt, worauf noch 10 ml BDB, im Verhältnis von 1:160 in mit Phosphat gepufferter Salzlösung, zugegeben wurden. Das Gemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur auf eine rotierende Schütteleinrichtung gesetzt und dann zentrifugiert und wie oben behandelt, um eine weitere Reaktion vor sich gehen zu lassen.

Dieses biologische Reagens war verwendbar für immunologische Tests auf Rinder-T"-globulin und seinen Antikörper.,

Mit Hilfe der obisren Methode wurde ein ebenso beschichtetes Trägerteilchen hergestellt, wobei die folgenden Primärschichten verwendet wurden: BSA, BSA und menschliches f- -

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Globulin. Das mit diesem dreifach beschichteten' Trägerteilchen gekuppelte Antigen war menschliches-v--Globulin.

Beispiel 7

Vier Ansätze von je 2 ml eitfer 2,5 $igen Suspension von formalinisiertem E. coli wurden dreimal mit Salzlösung gewaschen. Nach der letzten Zentrifugierung wurde die überstehende Flüssigkeit verworfen und die dichtgepackten Zellen in 1 ml eines Natrium-Kalium-Phosphat-Puffers vom pH 8,4 re~ suspendiert. Als nächstes wurden die in Tabelle 1 angegebenen Kupplungsmittel in der dort zu ersehenden Menge, gelöst in 2 tigern Aceton, der Suspension der Trägerteilchen zugesetzt und das ganze gemischt und 1/2 h bei 37°C inkubiert, zentrifugiert und in 1 ml des obieren Puffers vom pH 8,4 resuspendiert. Dann wurden die in Tabelle I aufgeführten Eiweißstoffe in den dort angegebenen Mengen in 0,25 ml des pH 8,4-Puffers zugesetzt und das ganze vermischt, 1 h bei 37°C inkubiert, zentrifugiert, dreimal mit je 5 ml Phosphat-Kochsalzlösung (pH 7,2) gewaschen und in 1,5 ml mit Phosphat gepufferter Salzlösung resuspendiert. Zu der Suspension wurden die-in ■Tabelle I aufgeführten Antigen-Wirkstoffe in den dort angegebenen Mengen in 1,5 ml Salzlösung zugegeben und noch 5 ml BDB in einer Verdünnung von 1:80 in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (pH 7,3 bis 7,4) zugefügt, worauf das ganze 20 min bei Raumtemperatur auf eine rotierende Schütteleinrichtung gesetzt wurde, um das jeweilige biologische Reagens zu bilden. Die Reagentien wurden durch Zentrifugieren isoliert, dreimal mit Salzlösung gewaschen und zum Gebrauch in Salzlösung resuspendiert.

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	Kupplungs mittel	' 25/Ug "	Tabelle I	Antigen-Y/irk- stoff
Ansatz Kr.	DNDFB,*	50/Ug	Eiweiß stoff	BSA, 5 mg
1	DNDFB,	' 25/Ug	Rinder-"f -globu lin, 5 mg	Rind er- j~ -globulin, . 2,5 mg
2	FNPS,**	50/Ug	BSA, TO mg	BSA, 5 mg
3	FNPS,'	Rinder-/"- -globu lin, 5 mg	Rinder-y-globulin, 2,5 mg
4	BSA, 10 mg

- 1,3-Dinitro-4,6-dinitrobenzol

- ρ,ρ·-Difluor-m,m'-dinitrodiphenylsulfon

Die so erhaltenen Reagentien wurden mit Erfolg für immunologische Tests auf die Anwesenheit der Antigen-Wirkstoffe und ihrer Antikörper benutzt.

Beispiel 8

2 ml einer 2,5 $igen Suspension von formalinisierten E. coli-Zellen in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) vom pH 7,2 bis 7,4 wurden vermischt mit 2,5 mg Rinder-^r-globulin in 3 ml PBS. Als nächstes wurden dem Gemisch 100 mg 1-Ä"thyl-3(3-dimethylaminoprppyl)-carbodiimid-Hydrochlorid, gelöst in 5 ml Salzlösung, zugefügt und das ganze 1 h bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Die beschichteten Trägerteilchen wurden dann dreimal mit je 10 ml PBS mit einem Gehalt an 1 5^-igem. .normalem Kaninchenserum gewaschen und resuspenc&ert in 1,5 ml Salzlösung mit einem Gehalt an 1 <fo NRS.

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Die beschichteten Trägerteilchen wurden dann nochmals mit Phosphatpuffer vom pH 8,4 gewaschen und in 1,5 ml des Puffers resuspendiert, worauf ihnen 5 mg BSA, suspendiert in 1,5 ml Salzlösung und 5 ml BDB, verdünnt im Verhältnis von 1:80 in Phosphat-Salzlösung (pH 7,2 bis 7,4),zugemischt wurden. Das ganze wurde dann gemäß Beispiel 1 weiterbehandelt. Es erwies sich als brauchbares immunologisches Reagens.

Beispiel 9

Gemäß Beispiel 1 wurden beschichtete Trägerteilchen hergestellt, wozu 5 ml formalinisierte E. coli-Zellen, 1,25 ml Salzlösung mit 5 mg Rinder-/"-globulin und 10 ml BDB, verdünnt im Verhältnis von 1:40 mit Phosphat-Salzlösung (pH 7,2 bis 7,4), verwendet wurden. Auf den Teilchen wurde dann ein äußerer Überzug aus Rinder-y-globulin angebracht, wozu eine zweistufige BDB-Kupplungsmethode angewandt wurde, bei welcher die beschich-'teten Teilchen mit 5 ml BDB, verdünnt im Verhältnis von 1:80 in Phosphat-Salzlösung, bei Raumtemperatur 20 min reagierten. Die resultierenden reaktiven Teilchen wurden mit Salzlösung gewaschen, . worauf ihnen 5 mg Rinder- y-globulin in 1,25 ml Salzlösung zugefügt wurde. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 18 h unter fortgesetztem Schütteln in Gang gehalten, worauf die Weiterbehandlung gemäß Beispiel 5 erfolgte.

Diese zweistufige Kupplungsmethode führt dazu, daß die reaktiven Teilchen unter Verwendung von BDB separat gebildet werden, ohne daß.die biologische Substanz anwesend ist.

Beispiel 10

Mit Hilfe der in einigen der obigen Beispiele ausgeführten Methode wurden eine Anzahl von beschichteten Teilchen hergestellt, die zur Herstellung von biologischen Reagentien des hier beschriebenen Typs verwendet wurden„ In Tabelle II sind die

- 26 9098 3.9/142 2 "' ^;: *'

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verwendeten Trägerteilchen,.Kupplungsmittel und Eiweißstoffe aufgeführt einschließlich ihrer Mengen in den folgenden Lösungsmitteln: für die Trägerteilchen - Salzlösung; für BDB - mit Phosphat gepufferte Salzlösung, pH 7,2 bis 7,4; für die Carbodiimide - Tetrahydrofuran; für Woodwards Reagens - Behandlung und Verdünnungsmittel gemäß Beispiel 4; für die Eiweißstoffe Salzlösung.

Tabelle II

Trägerteilchen
ml einer 2,5
Suspension

Kupplungsmittel, Art und Menge Eiweißstoffe, Art und Menge

E. coli

Lactobacillus
lei'chmannii

Bacillus pumilus'

DCC Carbodiimid 0,2 g in 0,5 ml

Woodwards Reagens L 17 mg

BDB 20 ml, Verdünnung 1:5

Merler -Carbodiimid, 0,05 mg in 5 ml

BDB 20 ml in Verdünnung 1:5

BDB 20 ml,¹ Verdünnung 1:5

BDB 20 ml, Verdünnung 1:5

Woodwards Reagens L 17 mg menschl.Serumalbumin, 10 mg in 2 ml

menschl.Serumalbumin, 10 mg in 2 ml

Pferde-)^ -globulin, 400 Au in 2 ml

menschl.Serumalbumin, 3 mg in 5 ml

Pferde-,)" -globulin, 200 Au in 5 ml

menschl;Serumalbumin, 10, 20, 40 und 80 mg in 1 ml

BSA 40 mg in 5 ml

Pferde- jr-globulin, 200 Au in 5 ml

menschl.Serumalbumin ; 3 mg in 5 ml

Pferde->~-globulin, 200 Au in 5 ml

menschl.Serumalbumin, 10 mg in 2 ml

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Tabelle II (Fortsetzung)

Trägerteilchen

ml einer

2,5 ^-Suspension

Kupplungsmittel, Art und Menge

Eiweißstoffe, Art und Menge

Bacillus subtilis

Pseudomonas fragi

BDB 20 ml, Verdünnung 1:5

BDB 20 ml', Verdünnung 1:5

BDB 20 ml, Verdünnung 1:5

DCC*-Carbodiimid 0,2 g in 0,5 ml

menschl.Serumalbumin, 3 mg in 5 ml Pferde- .^-globulin 200 Au in 5 ml menschl.Serumalbumin, 3 mg in 5 ml

Pf erde-y- -globulin 200 Au in 5 ml menschl.Serumalbumin, 10 mg in 2 ml

DGC-Carbodiimid ist NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid und Merler-Carbodiimid ist 1-Cyclobexyl-3(2-morpholinyl-(4)-äthylcarbodiimid)-Metho-p-toluol- sulfonat.

Die beschichteten Trägerteilchen können sämtliche mit den aufgeführten Kupplungsmitteln verwendet werden, um reaktive Teilchen herzustellen, die ihrerseits verwendet werden können, um eine große Reihe biologischer Substanzen zu desolubilisieren und Reagentien daraus herzustellen.

Beispiel 11

Die beschichteten Trägerteilchen können lyophilisiert werden, damit sie trocken gelagert werden können. Man verfährt zur Lyophilisierung wie folgt:

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- 28 - 1A-35 822

5 ml einer 2,5 $igen Suspension von formalinisierten E. coli-Zellen wurden dreimal mit Salzlösung gewaschen, in 3 nil einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung vom pH 7_t2 bis 7,4 resuspendiert und 2,5 mg HCG (2590 I.TJ./mg), gelöst in 2,5 ml Salzlösung, zugefügt. Als nächstes wurden 10 ml BDB, verdünnt im Verhältnis 1s 5 in mit Phosphat gepufferter Salzlösung vom pH 7,2 his 7,4, zugegeben und das ganze 20 min rotierend geschüttelt und einmal mit Salzlösung und zweimal mit einer Salzlösung, die 0,6 fo BSA enthielt, gewaschen.· Die Zellenkonzentra— tion wurde nach dem nachfolgenden Zentrifugieren durch Zusatz von Salzlösung mit 0,6 $ BSA und 6 $ Sucrose auf 3 bis 4 % eingestellt. Das Gemisch wurde in einzelnen Tropfen auf Glasplättchen aufgebracht und in Mengen von 0,5 bis 1,0 ml in Glasampullen eingeschlossen und 24 bis 48 h bei -40 bis -51 C unter Vakuum von weniger als 150/U Quecksilber lyophilisiert. Die' Glasampullen wurden unter Vakuum verschlossen und bei niedri- _gem Feuchtigkeitsgehalt gelagert. Die so getrockneten beschichteten Teilchen sind unbestimmte Zeit haltbar.

Patentansprüche

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Claims

Patentansprüche

1. Zur Herstellung von unsolubilisierten biologischen Reagentien geeignete reaktive Teilchen, die zur unmittelbaren chemischen Anlagerung an biologische Substanzen befähigt sind, gekennzeichnet durch ein festes Träger- oder Kernteilchen mit eiweißartiger Oberfläche und einem oder mehreren Überzügen aus Eiweißstoffen, wobei die Schichten am Kern und untereinander durch eine mit Hilfe von Kupplungsmittlern erzeugte Kovalenzbindung festgehalten werden und ein dem äußersten Überzug beigefügtes weiteres Kupplungsmittel das beschichtete Teilchen zur Anlagerung an die betreffende biologische Substanz durch Kovalenzbindung befähigt.

2ο Reaktive Teilchen nach Anspruch 1, dadurch g e -

kerir; zeichnet

daß als Träger- oder Kernteilchen

rote Blutkörperchen, Mikrobenzellen oder Teilchen mit einer Gel'atineoberflache vorhanden sind.

3. Reaktive Teilchen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Trägerteilchen einen größten Durchmesser von etwa 10 Mikron haben.

4. Reaktive Teilchen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die eiweißartigen Überzugsschichten aus Albuminen oder \^U-Globulinen bestehen.

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5. Reaktive Teilchen nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß als Kupplungsmittel eine oder mehrere der folgenden Verbindungen vorhanden ist bzw. sind: Bisdiazobenzidin, Bisdiazobenzidindisulfonsäure, Tetraazo-p-phenylendiamin, Difluordinitrobenzol, DifluordinitrodiphenyTsulfon, ein Carbodiimide Toluoldiisocyanat, Gyanursäurechlorid, Dichlor-s-triazin, F-t-Butyl-5-methylisoxazoliumperchlorat, ein Dialdehyd, ein </ ,ß-ungesättigter Aldehyd.

6. Reaktives Teilchen nach Anspruch 1, dadurch g e kennzeich-net , daß das dem äußersten Überzug beigefügte Kupplungsmittel, das die Anlagerung an die betreffende biologische Substanz ermöglicht, Bisdiazobenzidin ist.

7. Reaktive Teilchen nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß ihre Gröi3e dazu ausreicht, Agglutinierungen zu bilden, wenn die Teilchen nach Kuppeln an eine immunologische Substanz in Kontakt mit dem Gegenstück dieser Substanz gebracht werden.

8. Verfahren zur Herstellung der reaktiven Teilchen nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennze-ichnet , daß man Träger- oder Kerntejlchen mit eiweißartiger Oberfläche in ein flüssiges Medium einbringt und mit Hilfe eines ersten Kupplungsmittels an die Teilchen derart einen Eiweißstoff kuppelt, daß sich auf dem einzelnen Teilchen eine eiweißartige Überzugsschicht ausbildet, worauf man den so beschichteten Teilchen ein zweites Kupplungsmittel zufügt, das sie zur Anlagerung an die betreffende biologische Substanz durch Kovalenzbindung befähigt.

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9. Verfahren nach Anspruch 8., dadurch gekennzeichnet , daß man Träger- oder Kernteilchen mit einem größten Durchmesser von etwa 10 Mikron verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9» dadurch gekennzeichnet , daß man auf den Trägerteilchen vor Zugabe des zweiten Kupplungsmittels mehrere Überzugsschiühten aus Eiweißstoffen erzeugt.

11. Verfahren nach einem" der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß man als Trägerteilchen rote Blutkörperehen, Mikrobenzellen oder Teilchen mit einer Geiatinoberflache verwendet.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet , daß man als Eiweißstoffe Albumine oder y--Globuline verwendet.

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