DE19653439A1 - Verfahren zur direkten, exponentiellen Amplifikation und Sequenzierung von DNA Molekülen und dessen Anwendung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur direkten, exponentiellen Amplifikation und Sequenzierung von DNA Molekülen wie auch auf die Anwendung besagten Verfahrens. Direkte, exponentielle Amplifikation und Sequenzierung von DNA Molekülen wird im folgenden als "DEXAS" bezeichnet.

Technische Grundlagen

DNA Sequenzbestimmung, wie von Sanger et. al. ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) entwickelt, wird für gewöhnlich mit einer T7 DNA Polymerase (Tabor, S. und Richardson, C.C. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080) durchgeführt. Dieses Verfahren erfordert verhältnismäßig große Mengen eines gereinigten, einzelsträngigen DNA Templates. Vor kurzem wurde Cycle Sequencing entwickelt (Murray, V. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 8889). Dieses Verfahren erfordert kein einzelsträngiges Template und erlaubt die Initiierung der Sequenzreaktion mit verhältnismäßig geringen Mengen an Template. Jedoch muß diese Template DNA bis zu fast gänzlicher Homogenität gereinigt werden und wird in der Regel entweder mittels Klonierung in Plasmide (Bolivar, F. et. al., (1977) Gene 2, 95-113) und anschließender Plasmidreinigung (Birnboim, H.C. und Doly, J. (1979) Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523) oder mittels Amplifikation durch die PCR hergestellt (Mullis, K.B. und Faloona, F. A. (1987) Methods Enzymol. 155, 335-350).

In einer früheren Entwicklung des Cycle Sequencing, die als "gekoppelte Amplifikation und Sequenzierung" oder "CAS" bezeichnet wird, haben Ruano und Kidd ((1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2815-2819) gezeigt, daß man ein Zweistufenprotokoll verwenden kann, um Sequenzen aus DNA Templates zu generieren. In der ersten Stufe werden 15 PCR Zyklen mit Taq DNA Polymerase in Abwesenheit von Dideoxynukleotiden durchgeführt, um eine ausreichende Menge an Sequenziertemplate herzustellen. In einer zweiten Stufe, in der Dideoxynukleotide hinzugegeben werden, produziert CAS die Sequenz und auch die zusätzliche Amplifikation der Zielsequenz.

In Abwandlung dieses Protokolls wurde gezeigt, daß es möglich ist, geringe Mengen eines ungereinigten PCR Produktes in einem zweistufigen Protokoll zur Sequenzierung zu verwenden, wenn in der zweiten Stufe, in der die Sequenzierung durchgeführt wird, zwei Primer verwendet werden.

US 5,427,911 bezieht sich auch auf gekoppelte Amplifikation und Sequenzierung und offenbart ein Verfahren zur Sequenzierung eines DNA Segments, das den Schritt der Amplifikation von DNA Segmenten, um eine ausreichende Menge von Template DNA zur Sequenzierung zu erhalten, und den Schritt der simultanen Synthese verkürzter Sequenzprodukte aus besagtem Template Segment durch nachträgliche Zugabe eines Dideoxynukleotides und eines markierten Primers in die Reaktion, umfaßt.

Obige Verfahren erfordern die Unterbrechung zwischen der ersten Stufe zur exponentiellen Amplifikation der Template DNA, und der zweiten Stufe zur Synthese verkürzter DNA Moleküle, was mühsam und zeitaufwendig sein kann und zu Fehlern beiträgt, insbesondere beim Sequenzieren von großen Mengen an DNA Molekülen oder beim Verarbeiten von großen Mengen an Proben in der Klinik oder im Labor oder beim Sequenzieren rarer Proben für forensische oder archäologische Studien.

Es wäre daher von Vorteil, eine Methode zur Verfügung zu haben, die keine Unterbrechung des exponentiellen Amplifactionsschrittes und des Sequenzierungsschrittes erfordert, so daß die gesamte Reaktion schneller und mit weniger Manipulation durchgeführt werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbessertes, schnelles und zuverlässiges Verfahren für die Sequenzierung von DNA Molekülen, vorzugsweise genomischer DNA, zur Verfügung zu stellen.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes, schnelles, und zuverlässiges Verfahren zur Sequenzierung von DNA Molekülen, vorzugsweise genomischer DNA, das in einem einzigen Schritt in einem einzigen Behältnis durchgeführt werden kann, zur Verfügung zu stellen.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ist es eine Anwendung der Erfindung zur Sequenzbestimmung und in der medizinischen Diagnostik, der Forensik und Populationsgenetik zur Verfügung zu stellen.

Weitere Aufgaben der Erfindung sind für den Fachmann aus der Beschreibung ersichtlich.

Im Gegensatz zu der oben beschriebenen "CAS" Methodik, ist das Prinzip von DEXAS, daß die anfängliche und folgende Cycle Sequencing Reaktion mit zwei Primern durchgeführt wird, einem ersten Primer, und einem zweiten Primer, der auf dem komplementären Strang zum ersten liegt, die in einem nicht-equimolaren Verhältnis vorliegen, und dazu dienen, gleichzeitig genug Template Moleküle ganzer Länge sowie verkürzte Moleküle zu produzieren, die zur Sequenzierung des DNA Moleküls beitragen. Vier Reaktionen werden angesetzt, je eine zur Bestimmung von jeder Base, so daß jede zwei Primer in einem nicht-equimolaren Verhältnis zueinander enthält, von denen entweder einer markiert ist und der andere nicht, oder beide unterschiedlich markiert sind, so daß besagtes nicht-equimolares Verhältnis zwischen dem ersten Primer und dem zweiten Primer, die gleichzeitige und exponentielle Synthese sowohl der verkürzten als auch der ganzen Fragmente vom Beginn der Cycling Reaktion an, ermöglicht. Des weiteren enthält jede Reaktion von Beginn an das zu sequenzierende DNA Template, sowie eine Pufferlösung, thermostabile DNA Polymerase, thermostabile Pyrophosphatase (wahlweise), die vier Deoxynukleotide oder Derivate davon und ein Dideoxynukleotide oder ein Derivat davon. Im Anschluß daran werden Zyklen zur Denaturierung und Extension durchgeführt, so daß in jedem dieser Zyklen von jedem Primer zwei Arten von Extensionsprodukten gebildet werden. Jeder Primer funktioniert so, daß er Extensionsprodukte initiiert, die lang genug sind, die andere Primerposition zu erreichen. Gleichzeitig werden von jedem Primer Produkte initiiert, die auf Grund der Inkorporation eines Dideoxynukleotides vor Erreichen der anderen Primerposition terminiert werden. Vorgenannte Produkte (Produkte ganzer Länge) dienen in folgenden Zyklen sowohl als Template für die Produktion weiterer DNA Stränge ganzer Länge als auch als Template für Extensionen, die zur Sequenzreaktion beitragen und letztere Produkte (verkürzte Produkte) häufen sich während der Zyklen an und tragen zu der Sequenzleiter bei, die erzeugt wird. Somit bewirkt DEXAS die gleichzeitige exponentielle Produktion eines Sequziertemplates und einer Sequenzleiter in einem einzigen Röhrchen, ohne die Notwendigkeit, die Thermo- Cycling-Reaktion zu unterbrechen.

Es ist daher unter Anwendung der vorliegenden Erfindung möglich, die DNA Sequenz von Multikopie- und Einzelkopie DNA Regionen von DNA in einem einzigen Schritt zu bestimmen.

Somit werden oben aufgeführte Aufgabe und die Zielsetzungen vorliegender Erfindung durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Sequenzierung von DNA Molekülen gelöst, bei dem sowohl verkürzte DNA Moleküle als auch DNA Moleküle ganzer Länge zwischen zwei Positionen auf besagtem DNA Molekül in einer Thermo-Cycling-Reaktion gleichzeitig und exponentiell synthetisiert werden, die anfangs ein DNA Molekül, einen ersten Primer, einen zweiten Primer, einen Reaktionspuffer, eine thermostabile DNA Polymerase, thermostabile Pyrophosphatase (wahlweise), Deoxynukleotide oder Derivate davon, und ein Dideoxynukleotid oder ein Derivate davon enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das anfängliche Verhältnis besagter Primer in besagter Thermo-Cycling-Reaktion ungleich 1 ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist das Verhältnis besagter Primer zueinander zwischen etwa 2 : 1 bis etwa 3 : 1, am meisten bevorzugt 2 : 1.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung haben besagte Primer eine solche Länge, daß das Signal-Rausch Verhältnis zwischen den spezifischen verkürzten DNA Molekülen und den unspezifischen DNA Molekülen groß genug ist, um das Lesen der Sequenz nicht substantiell zu verhindern. Bevorzugterweise haben besagte Primer eine Länge von mindestens 25 Nukleotiden.

Die Synthese von Primern kann mittels Verfahren geschehen, die im Stand der Technik bekannt sind. Es können z. B. Primer unter Anwendung bekannter Verfahren synthetisiert werden, was die Stabilität oder Funktion besagter Primer während des Nukleinsäuresequenzierungsverfahrens der vorliegenden Erfindung nicht signifikant verändert.

Ferner werden die PNA-DNA Hybrid-Oligonucleotide (siehe Finn, P. J. et al., N.A.R. 24, 3357-3363 (1996), Koch, T. et al., Tetrahedron Letters, 36, 6933-6936 (1995), Stetsenko, D. A, et al., Tetrahedron Letters 37, 3571-3574 (1996), Bergmann, F et al., Tetrahedron Letters 36, 6823-6826 (1995) und Will, D.W. et al., Tetrahedron 51, 12069-12082 (1995)) ebenfalls als Primer für das erfindungsgemäße Verfahren angesehen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist besagter erster Primer markiert. Des weiteren wird bevorzugt, daß besagter erster Primer und zweiter Primer unterschiedlich markiert sind. Als Einzel- oder differenzielles Markierungsagens und Verfahren können jegliche dem Stand der Technik entsprechende Agenzien oder Verfahren verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie die Stabilität oder Funktion besagten Primers im DNA Sequenzierungsverfahren der vorliegenden Erfindung nicht signifikant verändern. Zum Beispiel können einzelne und differenzielle Markierungen aus der Gruppe bestehen, die solche Enzyme umfaßt wie β-Galaktosidase, alkalische Phosphatase und Peroxidase, Enzymsubstrate, Coenzyme, Farbstoffe, Chromophore fluoreszente, chemolumineszente und biolumineszente Markierungen wie FITC, Cy5, Cy5.5, Cy7, Texas-Rot und IRD40 (Chen et al. (1993), J. Chromatog. A 652: 355-360 und Kambara et al. (1992), Electrophoresis 13: 542-546) Liganden oder Haptene wie z. B. Biotin und radioaktive Isotope wie z. B. ³H, ³⁵S, ³²P, ¹²⁵I und ¹⁴C.

DEXAS ist gegenüber verschiedenen Puffer und unterschiedlichen Deoxynukleotid- und Dideoxynukleotidkonzentrationen verhältnismäßig unempfindlich und kann mit verschiedenen thermostabilen DNA Polymerasen durchgeführt werden.

Die Anzahl der Thermozyklen kann von etwa 18 bis etwa 50 Zyklen reichen, je nach der Menge an Template DNA und deren Reinheit.

Pufferkomponenten, die verwendet werden können, können Tris-HCl mit einem pH von etwa 9,0 bis 9,5 und einer Konzentration von etwa 10 bis 30 mM, Amoniumsulfat bei einer Konzentration von etwa 10 bis 20 mM, vorzugsweise 15 mM, MgCl₂ bei einer Konzentration von etwa 3,5 bis 5,5 mM, wahlweise etwa 0,05 mM Mercaptoethanol, etwa 0,28% Tween 20® und/oder etwa 0,02% Nonidet 40® einschließen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.

Deoxynukleotide können aus dGTP, dATP, dTTP und dCTP ausgewählt werden, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Zusätzlich können auch Derivate von Deoxynukleotiden gemäß der Erfindung verwendet werden, welche als solche Deoxynukleotide definiert sind, die in der Lage sind, durch eine thermostabile DNA Polymerase in wachsende DNA Moleküle inkorporiert zu werden, die in der Thermo-Cycling-Reaktion synthetisiert werden. Solche Derivate können Thionukleotide, 7-deaza-2'-dGTP, 7-deaza-2' -dATP sowie Deoxyinosine Triphosphat, das auch als Ersatz-Deoxynukleotid für dATP dGTP, dTTP oder dCTP verwendet werden kann, einschließen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die oben erwähnten Deoxynukleotide und deren Derivate werden vorzugsweise bei einer Konzentration von zwischen etwa 300 µM bis etwa 2 mM verwendet.

Dideoxynukleotide können aus ddGTP, ddATP, ddTTP und ddCTP ausgewählt werden sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Zusätzlich können auch Derivate von Dideoxynukleotiden gemäß der Erfindung verwendet werden, welche als solche Dideoxynukleotide definiert sind, die in der Lage sind durch eine thermostabile DNA Polymerase in wachsende DNA Moleküle inkorporiert zu werden, die in der Thermo- Cycling-Reaktion synthetisiert werden. Solche Derivate können radioaktive Dideoxynukleotide (ddATP, ddGTP, ddTTP und ddCTP) oder Dideoxynukleotide (ddATP, ddGTP, ddTTP und ddCTP), welche mit FITC, Cy5, Cy5.5, Cy7 und Texas-Rot u. a. markiert sind, einschließen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Bevorzugte Konzentrationen der ddNTPs liegen zwischen etwa 1 und 5 µM.

Das in dem Verfahren gemäß der Erfindung bevorzugte Verhältnis von dNTPs zu ddNTPs (dNTPs : ddNTPs) liegt zwischen 100 : 1 bis 1000:1, bevorzugter zwischen 300 : 1 bis 600 : 1.

Als thermostabile DNA Polymerase wird die Verwendung einer DNA Polymerase bevorzugt, die in dem Puffer oder unter den Bedingungen, die für das Thermo-Cycling verwendet werden, im Vergleich zu Wild-Typ Taq DNA Polymerase eine verminderte Diskriminierung zwischen die vier ddNTPs hat. Bevorzugter wird eine DNA Polymerase verwendet, welche eine "Tabor-Richardson" Mutation trägt oder ein funktionelles Derivat davon, die auch keine 5'-3' Exonucleaseaktivität hat, wie z. B. AmplitaqFS™ (Taq DNA Polymerase (-exos'-3') (F667Y), Tabor und Richardson (1995), loc. cit.), Taquenase™ (Taq DNA Polymerase A235 (-exo5'-3') (F667Y), Tabor und Richardson (1995), loc. cit.) und ThermoSequenase™ (Taq DNA Polymerase (-exos'-3') (F667Y), Tabor und Richardson (1995), loc. cit.) sowie Gemische davon oder andere DNA Polymerasen und Gemische davon, die thermostabil sind, können ebenso in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird besagtes Verfahren bei einer Temperatur ausgeführt, bei der das Signal-Rausch Verhältnis zwischen den spezifischen, verkürzten DNA Molekülen und den unspezifischen DNA Molekülen groß genug ist, so daß das Lesen der Sequenz nicht substantiell verhindert wird. Es ist von untergeordneter Bedeutung, die Annealingtemperatur zu optimieren. Bei menschlichen Einzelkopie DNA Sequenzen reduziert eine höchst mögliche Annealingtemperatur den Hintergrund drastisch. In diesem Fall werden die Annealing- und Syntheseschritte der Thermo-Cycling-Reaktion vorzugsweise bei einer Mindesttemperatur von 62°C, bevorzugter bei 66°C, und am meisten bevorzugt mindestens bei etwa 68°C ausgeführt.

Bevorzugt liegt das Template des zu sequenzierende DNA Moleküls als gesamtgenomische DNA vor, die nicht kloniert oder gereinigt werden muß, jedoch kann dies der Fall sein. In einer Ausführungsform der Erfindung hat die genomische DNA eine Länge von mehr als oder gleich 2 kb. Andere Formen von DNA, die als Template verwendet werden können, beinhalten klonierte oder unklonierte mitochondriale DNA, partiell gereinigte oder ungereinigte DNA, wie z. B. Plasmid DNA von bakteriellen Kolonien. DEXAS funktioniert gut mit etwa 250 ng Template DNA für die Bestimmung von mitochondrialen DNA Sequenzen und etwa 1 µg Template DNA für die Bestimmung von Einzelkopie DNA Sequenzen, wie z. B. gesamtgenomischer DNA, funktioniert aber auch mit geringeren Mengen an mitochondrialer oder genomischer DNA. Zusätzlich ist DEXAS verhältnismäßig unabhängig von der Basenzusammensetzung des Templates.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das vorliegende Verfahren des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß jede Thermo-Cycling-Reaktion für die Bestimmung der Position von A, G, C und T in besagtem DNA Molekül in einem einzigen Schritt in einem einzigen Behältnis, Gefäß oder Röhrchen durchgeführt wird.

Als Lieferant für Nukleinsäuremoleküle im erfindungsgemäßen Verfahren sind Körperflüssigkeiten wie Samen, Urin, Blut oder Fraktionen dessen, Haare, eine einzelne Zelle, Zellen oder Fraktionen davon, hartes Gewebe, wie Knochen, oder weiches Gewebe oder Fraktionen davon und Zellkulturen oder Fraktionen davon, geeignet.

Vorliegende Erfindung dient auch für die Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung zur Bestimmung der Nukleotidsequenz eines gegebenen Nukleinsäuremoleküls, z. B. zur Sequenzierung mit 2 Markierungen von Shotgun Banken bei Genomprojekten großen Umfangs und in der medizinischen Diagnostik der Forensik und Populationsgenetik. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann zur Detektion genetischer Mutationen oder Polymorphismen, zur Identifizierung des Ursprungs der sequenzierten Nukleinsäure oder zur Detektion der Anwesenheit fremder oder infektiöser Agenzien in einer Probe verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf alle Kombinationen aller Verfahrensweisen der o.g. Verfahren.

Die Sequenzreaktionen können nach Vorbereitung direkt auf ein Sequenzgel geladen werden, wie z. B. nach der Zugabe eines für gewöhnlich verwendeten Aufgabepuffers (z. B. Formamid, das 20 mM EDTA (pH 7,4) und 6 mg/ml Dextran Blau enthält) und Denaturierung (z. B. bei 96°C für 4 Minuten). Die Sequenzleiter kann in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren gelesen werden. Das Verfahren der Erfindung ist gut für die Automatisierung geeignet. Da die zwei Primer in der Reaktion unterschiedlich mit Markierungen markiert sein können, welche z. B. mit zwei verschiedenen Wellenlängen detektiert werden können, erlaubt das Verfahren der vorliegenden Erfindung die gleichzeitige Sequenzierung beider Stränge eines Templates und die Detektion beider Reaktionen in einer oder mehreren Gelspuren. Generell können viele DEXAS Reaktionen, die mit unterschiedlichen Farbstoffen durchgeführt werden, gleichzeitig in den gleichen Röhrchen durchgeführt werden und auf eine Sequenziermaschine aufgegeben werden, die mit mehreren Lasern ausgestattet ist, oder mittels anderer Methoden detektiert werden, wie z. B. Autoradiographie.

Kurzbeschreibung der Abbildungen

Fig. 1 Schematische Abbildung von DEXAS. In vier Röhrchen werden zwei Oligonucleotide (27mere), entweder ein markiertes und ein unmarkiertes oder ein mit FITC markiertes und ein mit Cy5 markiertes (Verhältnis 2 : 1), mit menschlicher genomischer DNA (250 ng bis 3 µg), einer Hitze resistenten DNA Polymerase, den vier Deoxynukleotiden und jeweils einem der Dideoxynukleotide, vermischt. Zyklen zur Denaturierung und darauffolgendem Annealing und Extension werden durchführt. Während jeder Extension werden die Primer entweder bis zur komplementären Primerposition verlängert oder durch die Inkorporation eines Dideoxynukleotides unterbrochen. In darauffolgenden Zyklen dienen erstere Produkte sowohl als Template für die weitere Generierung von Produkten ganzer Länge wie auch für die Terminationsreaktionen, letztere Produkte hingegen akkumulieren während aller durchgeführter Zyklen und tragen zum Sequenzsignal bei. Nach dem Cycling werden die Reaktionen denaturiert und je nach ihrer Markierung entweder auf einem A.L.F. oder einem A.L.F. express analysiert.

Fig. 2 DEXAS Reaktion, durchgeführt an einem 521 bp Segment der menschlichen mitochondrialen Kontrollregion. Acht pmol eines FITC markierten (mtDNA 1-L16026) und 4 pmol eines unmarkierten Primers (mtDNA2-H16498) wurden zusammen mit 250 ng gesamtgenomischer menschlicher DNA verwendet (für Details siehe Text). Ein starkes Signal ist vor der ersten prozessierten Base zu sehen und bei etwa Base Nummer 440 ist ein starker Stop zu sehen. Die Sequenz wurde mit der A.L.F. Software prozessiert und nicht manuell editiert. Es wurden insgesamt 433 Basen bestimmt.

Fig. 3 DEXAS Reaktion, durchgeführt an Einzelkopie Genen. Fig. 3A zeigt eine Sequenz des menschlichen p53 Gens, wohingegen Fig. 3B eine Sequenz des menschlichen CCR-5 Gens zeigt (siehe Text für Details). Die Sequenz wurde mit der A.L.F. Software prozessiert und nicht manuell editiert. Es wurden im Falle des p53 Gens insgesamt 305 Basen bestimmt, wohingegen für das CCRS-Gen 343 Basen bestimmt wurden.

Fig. 4 Zweifarbige DEXAS Reaktion unter Anwendung verschiedener Oligonucleotidverhältnisse. Die Reaktionen wurden jeweils mit 250 ng genomischer menschlicher DNA und einer Gesamtmenge von 12 pmol Primer durchgeführt. MtDNA1 war mit FITC markiert (linke Panele) und MtDNA2 mit Cy5 markiert (rechte Panele). Die Verhältnisse zwischen FITC-MtDNA1 und Cy5-MtDNA2 wurden zwischen 2 : 1 (obere Panele), 1 : 1 (mittlere Panele) und 1 : 2 (untere Panele) variiert. Das größte Signal-Rausch- Verhältnis für beide Primer wird erreicht, wenn ein Verhältnis von 2 : 1 verwendet wird. Gezeigt sind die Rohdaten des A.L.F. und des A.L.F.express Gerätes. Die Anordnung der Basensignale von oben nach unten ist jeweils C, A, G, und T.

Fig. 5 DEXAS wurde unter gleichzeitiger Verwendung eines Fluorescein markierten "T3" Primers und eines Cy5 markierten "universal" Primers durchgeführt. Die Figur zeigt die Sequence, die mit dem Cy5 markierten Primers erhalten wurde. Die beide Primer wurden in einer einzigen Reaktion mit einer bakteriellen Kolonie verwendet. Je 4 µl wurden auf einem A.L.F. beziehungsweise einem A.L.F.express analysiert. Die Reaktion mit dem "T3" Primer ergab 407 Basen und die Reaktion mit dem "universal" Primer 668 Basen.

Fig. 6 Das Insert eines Plasmides wurde in einer Reaktion von beiden Seiten unter Verwendung eines FITC markierten "T3" Primers und eines gegenüberliegenden Cy5 markierten "universal" Primers sequenziert. Die gleichzeitige Verwendung zweier unterschiedlich markierter Oligonukleotide in einer DEXAS Reaktion erlaubte die Sequenzierung des 548 Basen großen Inserts ohne zweideutige Positionen zu hinterlassen. Die Primer waren in einem Abstand von 670 bp voneinander positioniert.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung wird genauer durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1 Template Präparation

Gesamtgenomische menschliche DNA wurde ausgehend von 2 ml Blutproben unter Verwendung eines Schnellreinigungskits (Cambridge Molecular Technologies Ltd., Cambridge, UK) präpariert. Gereinigte DNA wurde in ddH₂O auf eine Konzentration von 175 ng pro ml verdünnt.

Sequenzierreagenzien und Bedingungen

Unmarkierte und FITC-markierte Oligonukleotide wurden mit einem ABI DNA/RNA Synthesizers, Model 392 synthetisiert. Cy5 markierte Oligonukleotide wurden von der Firma Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland) bezogen. Die folgenden Oligonukleotide wurden jeweils für die Sequenzierung der mitochondrialen Kontrollregion (mtDNA), des p53 Gens (p53) und des CCR-5 Gens (CCR-5) verwendet: (mtDNA1-L16026) 5'-GAT TCT AAT TTA AAC TAT TCT CTG TTC-3'; (mtDNA2-H16498) 5'-TTA TGA CCC TGA AGT AGG AAC CAG ATG-3'; (p53-1/exon-7) 5'-GGA GGC ACT TGC CAC CCT GCA CAC TGG-3'; (p53-2/intron-8)5'-CTC CTC CAC CGC TTC TTG TTC TGC TTG-3'; (CCRS-1) 5'-GGC TGG TCC TGC CGC TGC TTG TCA T-3'; (CCRS-2) 5'-CTG CTC CCC AGT GGA TCG GGT GTA AAC-3'. Die Numerierung der mtDNA Primer bezieht sich auf das 3'-Ende gemäß Anderson et al. ((1981) Nature 290, 457-465) und L und H beziehen sich auf den L-Strang bezeihungsweise den H-Strang. DEXAS Reaktion wurden entweder unter Verwendung von ThermoSequenase™ (Tabor, S. und Richardson, C. C. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6339-6343) (Amersham, U.K:) Reagentien oder mit dem folgenden 10 × Puffer durchgeführt: 500 mM Tris-HCl (pH 9,2), 160 mM (NH₄)₂SO₄, 35 mM MgCl₂ (ScienTech Corp., St. Louis, MO). Es wurden drei verschiedene Nukleotidgemische für die Termination evaluiert: (i) 1 : 333, 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 1 mM dTTP, wobei die A, C, G, und T Reaktion je 3 µM des entsprechenden Dideoxynukleotides enthielt. (ii) 1 : 666, ebenso jeweils 1 mM jedes Deoxynukleotides enthaltend, aber 1,5 µM des entsprechenden Dideoxynukleotides. (iii) 1 : 1000, ebenso jeweils 1 mM jedes Deoxynukleotides enthaltend, aber 1,0 µM des entsprechenden Dideoxynukleotides. Alle Terminationsgemische wurden mit 50 mM Tris- HCl (pH 9,2), 16 mM (NH₄)₂SO₄, 5 mM MgCl₂ angesetzt.

Für jede Sequenzreaktion wurde ein Prämix aus 1 µl (Units nicht definiert) Taquenase™ (ScienTech Corp., St. Louis, MO) und 1 Unit thermostabiler Pyrophosphatase (NEB, Beverly, MA) angesetzt. Im Falle der ThermoSequenase Reaktionen wurden die Reaktionen wie vom Hersteller empfohlen angesetzt. In anderen Fallen wurde ein 20 µl Gemisch aus Primer (2 pmol bis 12 pmol), DNA (15 ng bis 1,5 µg), Sequenzierpuffer (2 µl des 10 × Puffers, see oben) und Enzym angesetzt und 5 µl Aliquot hiervon wurden zu 2 µl Terminationsmix zugegeben. Die Sequenzreaktionen wurden in einem Thermocycler mit heizbarem Deckel durchgeführt (MJ-Research, Watertown, MA). Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 5 µl Formamid (20 mM EDTA (pH 7,4) und 6 mg/ml Dextran Blau) gestoppt, worauf eine Denaturierung für 4 Minuten bei 95°C erfolgte.

Die Sequenzreaktionen wurden im Falle der Verwendung von FITC markierten Primern auf einem A.L.F. analysiert und im Falle der Verwendung von Cy5 markierten Primern auf einem A.L.F.express (beide Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). In allen Fallen wurden HydroLink Long Ranger™ (FMC, Rockland, ME) Gele und 30 cm Glasplatten verwendet. Die Gelbedingungen entsprachen den Empfehlungen des Herstellers.

Beispiel 2 DEXAS von mitochondrialen DNA Sequenzen

Es wurden zwei Oligonukleotide, beide mit einer Länge von 27 Nukleotiden, welche eine 521 Basenpaarregion der menschlichen mitochondrialen Kontrollregion umspannen, synthetisiert.

27-mere wurden verwendet, um ein unspezifisches Annealing der Primer zu nicht korrekten Priming Positionen zu minimieren und, um es zu ermöglichen, daß während aller Syntheseschritte die Reaktionstemperaturen bei über 62°C blieben. Eines der beiden Oligonukleotide wurde am 5'-Ende mit Fluorescein (mtDNA1) markiert, wohingegen das andere (mtDNA2) nicht markiert wurde. 4 pmole jedes der Primer wurde mit ThermoSequenase™ (Amersham, U.K.) Reagens gemischt, das Enzym (DNA Polymerase und thermostabile Pyrophosphatase), Reaktionspuffer, und ein Gemisch aus Deoxynukleotiden und Dideoxynukleotid enthielt. Zu einzelnen Aliquots dieses Gemisches wurden unterschiedliche Mengen humaner DNA (500 ng, 250 ng, 125 ng, 62 ng, 0 ng) zugegeben. Einem Röhrchen wurden 500 ng Template DNA zugegeben, aber kein unmarkierter Primer. Die Reaktionen wurden bei 95°C für 3 Min. inkubiert, um eine vollständige Denaturierung der Template DNA zu ermöglichen. Hierauf wurden 35 Zyklen von jeweils 30 Sek. bei 62°C und 40 Sek. bei 95°C durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von Formamid und Erhitzung auf 95°C für 4 Min. gestoppt und denaturiert, bevor sie auf ein A.L.F. Sequenzgel geladen wurden.

Wo keine DNA zugegeben worden war, war keine Sequenz detektierbar. Wo nur der markierte Primer und kein unmarkierter Primer zugegeben worden war, war keine Sequenz detektierbar. In den Fallen, wo jedoch 62 ng oder mehr Template verwendet worden war, wurden Sequenzkurven erhalten. In den Reaktionen, wo 250 ng und 500 ng verwendet worden war, war die A.L.F. Software in der Lage, über 400 Basen zu bestimmen.

Unter Verwendung einer gleichbleibenden Menge an Template DNA von 500 ng und einer Gesamtmenge von 12 pmol der beiden Primer wurden die Verhältnisse zwischen dem markierten Primer und dem unmarkierten Primer zwischen jeweils 3 : 1, 2 : 1 1 : 1 1 : 2 und 1 : 3 variiert. Die Reaktion, in der die Primer in equimolaren Mengen vorlagen, ergaben schlechte Signale, wohingegen alle anderen Verhältnisse, unabhängig davon, ob der markierte oder der unmarkierte Primer im Überschuß vorlag, bessere Resultate lieferte. Die Verhältnisse 2 : 1 und 1 : 2 ergaben die besten Resultate. Es war überraschend und unerwartet, daß beide nicht-equimolaren Verhältnisse vorteilhaft sind. Unter Verwendung von 8 pmol des Primers mtDNA1 und 4 pmol des Primers mtDNA2 ermitteln wir derzeit routinemäßig 450 Basenpaare der mitochondrialen Kontrollregion.

In der DEXAS Reaktion kann das Verhältnis der Deoxynukleotide (dNTPs) zu den Dideoxynukleotiden (ddNTPs) variiert werden. Ein höherer Anteil an dNTPs wird wahrscheinlich eine vermehrte Template Produktion in jedem Zyklus ermöglichen, wohingegen ein höherer Anteil an ddNTPs zu vermehrter Terminierung der Extensionsprodukte vor dem Erreichen der Primingposition, des zweiten, unmarkierten Primers führen wird. Letztere Produkte werden zur Sequenzreaktion beitragen, aber nicht zur weiteren Template-Amplifikation. Um zu ermitteln, in welchem Maße das Verhältnis der ddNTPs zu dNTPs die Reaktion beeinflußt, wurden ddNTPs mit dNTPs mit den Verhältnissen von 1 : 333, 1 : 666 und 1 : 1000 vermischt und in einer DEXAS Reaktion mit 8 pmol eines FITC markierten Primers (mtDNA1), 4 pmol eines unmarkierten Primers (mtDNA2) und 300 ng humaner DNA verwendet. Reaktionsbedingungen waren wie oben beschrieben. Die Ergebnisse zeigten, daß das Verhältnis 1 : 666 (ddNTPs : dNTPs) stärkere Signale ergab.

Beispiel 3 DEXAS von Einzelkopien humaner DNA Sequenzen

Um die Anwendbarkeit von DEXAS auf Einzelkopie DNA Sequenzen zu evaluieren, wurden Primer, die ein 507 Basenpaar Segment des Introns 7 und des Exons 8 des humanen p53 Gens flankieren, synthetisiert. Es wurden DEXAS Reaktionen mit jeweils 8 pmol eines FITC markierten Sequenzierprimers (p53-1), 4 pmol eines unmarkierten (p53-2) Primers, und 3,5 µg, 1,75 µg, 875 ng, beziehungsweise 430 ng menschlicher DNA angesetzt. Diese Reaktionen wurden bei 95°C für 3 Minuten denaturiert und 40 Zyklen bestehend aus 30 Sekunden bei 62°C und 40 Sekunden bei 95°C, durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine klar lesbare Sequenz. Um die Resultate zu verbessern, wurden diverse Modifikationen des Protokolls erprobt. Die Annealingtemperatur wurde erhöht und die Menge des Sequenzierprimers verringert. Zusätzlich wurde die Anzahl der Zyklen auf 47 erhöht und unterschiedliche Primerverhältnisse und Templatekonzentrationen erprobt. Die besten Resultate wurden unter Verwendung von 8 pmole des FITC markierten Primers und 4 pmol des unmarkierten Primers und Cycling Temperaturen von 30 Sekunden bei 68°C und 30 Sekunden bei 95°C erzielt. Diese Bedingungen lieferten zwischen 260 und 320 Basen der Sequenz mit 1 bis 5 Mehrdeutigkeiten pro Reaktion in fünf Experimenten (Fig. 3A). Wenn etwa 1 µg oder mehr Template verwendet wurden, wurden die Sequenzsignale unter automatischer Verarbeitung mit der A.L.F. Software gelesen.

Um die allgemeine Anwendbarkeit von DEXAS auf Einzellkopiegenen weiter zu evaluieren, wurden Primer, die ein 382 Basenpaarsegment des CCR-5 Gens flankieren, synthetisiert. Es wurden 3 pmol des CCR5-1, 6 pmol des FITC markierten Primers CCR5-2, 0,5-1,0 µg Template DNA und 45 Zyklen DEXAS verwendet. Bei den durchgeführten Sequenzreaktionen von 40 Proben variierten die Leselängen zwischen 230 bp und 351 bp (Durchschnitt 294 bp). Eine typische Reaktion ist in Fig. 3B gezeigt.

Beispiel 4 Gleichzeitige Sequenzierung beider DNA Stränge

Es wurde gezeigt, daß es möglich ist, beide komplementäre DNA Stränge von Plasmid DNA in einer einzigen Reaktion unter Verwendung zweier unterschiedlicher, fluoreszent markierter Primer zu sequenzieren (Wiemann, S., et al., (1995) Analytical Biochemistry 224, 117-121). Die Anwendbarkeit dieses Ansatzes auf DEXAS wurde unter Verwendung eines FITC markierten Primers (mtDNA1) eines Cy5 markierten Primers (mtDNA2) und 500 ng humaner DNA als Template analysiert. Unter Beibehaltung der obigen Reaktionsbedingungen wurden die Primerverhältnisse variiert (FITC-mtDNA1 : Cy5-mtDNA2) (3 : 1,2 : 1, 1 : 1, 1 : 2 und 1 : 3). Im Anschluß an die Cyclingreaktion und Denaturieren wurden jeweils 5 µl der Reaktion auf ein A.L.F, bzw. ein A.L.F.express Gerät aufgegeben. Wie in vorangegangenen Experimenten, wenn equimolare Mengen an Primer verwendet wurden, wurden deutlich schlechtere Ergebnisse erzielt im Vergleich zu Reaktionen, in denen nicht-equimolare Mengen verwendet wurden (Fig. 4A). Ein Verhältnis von 2 : 1 bei einer Primer Gesamtmenge von 12 pmol ergab das beste Signal- Rausch-Verhältnis. Bei solchen Reaktionen wurden auf beiden Strängen 450 Basen gelesen, ohne ungeklärte Positionen zu ergeben. Die Beobachtung, daß eine größere Menge an FITC markiertem Primer als an Cy5 markiertem Primer vorteilhaft ist, ist wahrscheinlich auf das bessere Signal-Rausch-Verhältnis des Cy5 gegenüber dem FITC zurückzuführen. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, daß der Zweifarbenansatz auch bei Einzelkopiegenen anwendbar ist.

Claims (15)

1. Verfahren zur Sequenzierung eines DNA Moleküls, wobei sowohl verkürzte als auch DNA Moleküle ganzer Länge zwischen zwei Positionen auf besagtem DNA Molekül, in einer Thermocycling Reaktion, die anfänglich ein DNA Molekül, einen ersten Primer, einen zweiten Primer, einen Reaktionspuffer, eine thermostabile DNA Polymerase, Deoxynukleotide oder Derivate davon und ein Dideoxynukleotid oder Derivate davon, beinhaltet, gleichzeitig synthetisiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß das anfängliche Verhältnis besagter Primer zueinander in besagter Thermocycling Reaktion größer als 1 ist.

2. Verfahren gemäß dem Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis besagter Primer etwa 2 : 1 ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Verfahren in einem einzigen Schritt in einem einzigen Behältnis, Gefäß oder Röhrchen durchgeführt wird.

4. Verfahren gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Primer eine Länge von mindestens 25 Nukleotiden haben.

5. Verfahren gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß besagter erster Primer markiert ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß besagter erster Primer und besagter zweiter Primer unterschiedlich markiert sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Thermocycling Reaktion zusätzlich thermostabile Pyrophosphatase enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Annealing- und Syntheseschritte der Thermocycling Reaktion bei einer Temperatur von mindestens etwa 62°C ausgeführt werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes DNA Molekül genomische DNA ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß besagte genomische DNA größer als oder gleich 2 kb lang ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Lieferant der zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküle ein Lieferant ist, ausgewählt aus Körperflüssigkeiten wie Samen, Urin, Blut, oder Blutproben, Haaren, einer einzelnen Zelle, Zellen oder Fraktionen davon, Gewebe oder Fraktionen davon und Gewebekulturen.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß besagte thermostabile Polymerase eine verminderte Diskriminierung zwischen den 4 ddNTPs im Vergleich zu Wild-Typ-Taq DNA Polymerase in dem Puffer oder unter den Bedingungen, die für das Thermocycling verwendet werden, hat.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß besagte thermostabile Polymerase eine DNA Polymerase Taq Polymerase mit einer Tabor- Richardson Mutation ist, welche auch keine 5'-3' Exonukleaseaktivität hat, oder ein funktionelles Derivat davon.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß besagte thermostabile Polymerase Taq DNA Polymerase (-exo5'-3') (F667Y) oder ein funktionelles Derivat davon ist.

15. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Bestimmung der Sequenz einer Nukleinsäure.