DE19741715A1 - Pentopyranosyl-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung - Google Patents
Pentopyranosyl-Nucleosid, seine Herstellung und VerwendungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Pentopyranosyl-Nucleosid
der Formel (I) oder der Formel (II)
deren Herstellung und Verwendung zur Herstellung eines Therapeutikums, Diagnostikums
und/oder elektronischen Bauteils.
Pyranosyl-Nucleinsäuren (p-NA's) sind im allgemeinen zur natürlichen RNA isomere
Strukturtypen, bei denen die Pentose-Einheiten in der Pyranoseform vorliegen und durch
Phosphodiestergruppen zwischen den Positionen C-2' und C-4' repetitiv verknüpft sind (Fig.
1). Unter "Nucleobase" werden dabei die kanonischen Nucleobasen A, T, U, C, G, aber auch
die Paare Isoguanin/Isocytosin und 2,6-Diaminopurin/Xanthin und im Sinne der vorliegenden
Erfindung auch andere Purine und Pyrimidine verstanden. p-NA's, und zwar die von der
Ribose abgeleitete p-RNA's, wurden zum erstenmal von Eschenmoser et al. beschrieben
(Helv. Chim. Acta 1993, 76, 2161; Helv. Chim Acta 1995, 78, 1621; Angew. Chem. 1996,
108, 1619-1623). Sie bilden ausschließlich sogenannte Watson-Crick-gepaarte, d. h. Purin-Py
rimidin- und Purin-Purin-gepaarte, antiparallele, reversibel "schmelzende", quasi-lineare und
stabile Duplices. Homochirale p-RNA-Stränge entgegengesetzten Chiralitätssinns paaren
ebenfalls kontrollierbar und sind in der gebildeten Duplex streng nicht-helical. Diese für den
Aufbau supramolekularer Einheiten wertvolle Spezifität hängt mit der relativ geringen
Flexibilität des Ribopyranosephosphat-Rückgrats sowie mit der starken Neigung der
Basenebene zur Strangachse und der hieraus folgenden Tendenz zu intercatenarer
Basenstapelung im resultierenden Duplex zusammen und läßt sich letzlich auf die Teilnahme
eines 2',4'-cis-disubstituierten Ribopyranoserings am Aufbau des Rückgrates zurückführen.
Diese wesentlich besseren Paarungseigenschaften machen p-NA's gegenüber DNA und RNA
für die Anwendung des Aufbaus supramolekularer Einheiten zu bevorzugten
Paarungssystemen. Sie bilden ein zu natürlichen Nucleinsäuren orthogonales Paarungsystem,
d. h. sie paaren nicht mit in der natürlich Form vorkommenden DNA's und RNA's, was im
besonderen im diagnostischen Bereich von Bedeutung ist.
Eschenmoser et al. (1993, supra) hat zum ersten Mal eine p-RNA, wie in Fig. 2 dargestellt und
nachstehend erläutert, hergestellt.
Hierbei wurde eine geeignete geschützte Nucleobase mit dem Anomerengemisch der
Tetrabenzoyl-Ribopyranose durch Einwirken von Bis(trimethylsilyl)acetamid und einer Lewis-Säure
wie z. B. Trimethylsilyl-trifluormethansulfonat zur Reaktion gebracht (analog H.
Vorbrüggen, K. Krolikiewicz, B. Bennua, Chem. Ber. 1981, 114, 1234.). Unter
Baseneinwirkung (NaOH in THF/Methanol/Wasser im Falle der Purine; gesättigter Ammoniak
in MeOH im Falle der Pyrimidine) wurden die Acylschutzgruppen vom Zucker abgespalten,
und das Produkt unter saurer Katalyse mit p-Anisaldehyddimethylacetal in 3',4'-Position
geschützt. Das Diastereomerengemisch wurde in 2'-Stellung acyliert, das
3',4'-methoxybenzylidengeschützte 2'-Benzoat durch saure Behandlung, z. B. mit Trifluoressigsäure
in Methanol deacetalisiert, und mit Dimethoxytritylchlorid umgesetzt. Die 2'→3'-Wanderung
des Benzoats wurde durch Behandlung mit p-Nitrophenol/4-(Dimethylamino)pyridin/Triethyl
amir/Pyridin/n-Propanol eingeleitet. Fast alle Reaktionen wurden durch
Säulenchromatographie aufgearbeitet. Der so synthetisierte Schlüsselbaustein, das 4'-DMT-3'-
benzoyl-1'-Nucleobasen-Derivat der Ribopyranose, wurde dann zum Teil phosphityliert bzw.
über einen Linker an eine feste Phase gebunden.
Bei der anschließenden automatisierten Oligonucleotidsynthese wurde die trägergebundene
Komponente in 4'-Position wiederholt sauer entschützt, ein Phosphoramidit unter Einwirkung
eines Kupplungsreagenz, z. B. ein Tetrazolderivat, angekuppelt, noch freie 4'-Sauerstoffatome
acetyliert und das Phosphoratom oxidiert, um so das oligomere Produkt zu erhalten.
Anschließend wurden die restlichen Schutzgruppen abgespalten, das Produkt über HPLC
gereinigt und entsalzt.
Das beschriebene Verfahren von Eschenmoser et al. (1993, supra) zeigt jedoch folgende
Nachteile:
- 1. Der Einsatz nicht anomerenreiner Tetrabenzoyl-pentopyranosen (H. G. Fletcher, J. Am. Chem. Soc. 1955, 77, 5337) zur Nucleosidierungsreaktion mit Nucleobasen verringert durch die Notwendigkeit rigoros geschnittener Chromatographien in den nachfolgenden Arbeitsschritten die Ausbeuten des Endproduktes.
- 2. Die Synthese ist mit fünf Reaktionsstufen, ausgehend von Ribopyranosen, die in 1'-Stellung eine Nucleobase aufweisen, bis zum geschützten 3'-Benzoat, sehr langwierig und eine Durchführung im industriellen Maßstab ist kaum möglich. Zusätzlich zu dem hohen Zeitaufwand sind die erhaltenen Ausbeuten an Monomerbausteinen gering: 29% im Falle des Purinbausteins Adenin, 24% im Falle des Pyrimidinbausteins Uracil.
- 3. Bei der Synthese der Oligonucleotide wird 5-(4-Nitrophenyl)-1H-tetrazol als Kupplungsreagenz in der automatisierten p-RNA-Synthese eingesetzt. Die Konzentration dieses Reagenz in der Lösung von Tetrazol in Acetonitril ist dabei so hoch, daß regelmäßig das 5-(4-Nitrophenyl)-1H-tetrazols in den dünnen Schläuchen des Synthesizers auskristallisiert und die Synthese somit zu einem vorzeitigen Ende kommt. Zudem wurde beobachtet, daß die Oligomeren mit 5-(4-Nitrophenyl)-1H-tetrazol verunreinigt waren.
- 4. Die beschriebene Aufarbeitung von p-RNA-Oligonucleotiden, im speziellen die Abspaltung der basenlabilen Schutzgruppen mit Hydrazinlösung, gelingt bei hohem Thymidin-Anteil im Oligomeren nicht immer.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, neue Pentopyranosyl-Nucleoside und ein
neues Verfahren zur Herstellung von Pentopyranosyl-Nucleosiden bereitzustellen, wodurch die
Herstellung von bekannten und neuen Pentopyranosyl-Nucleosiden im größeren Maßstab
ermöglicht werden soll und die oben beschriebenen Nachteile vermieden werden.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Pentopyranosyl-Nucleosid der Formel
(I),
worin
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4, oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R11 gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4, oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R11 gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
worin R12, R13, R14 und R15 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, OR7,
wobei R7 die oben genannte Bedeutung hat, oder CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben
genannte Bedeutung hat, bedeuten und
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16)- oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und
Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyloxycarbonylgruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- oder 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT-)gruppe,
oder der Formel (II)
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16)- oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und
Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyloxycarbonylgruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- oder 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT-)gruppe,
oder der Formel (II)
worin R1' gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O, CnH2n+1 oder OCnH2n-1,oder (CnH2n)NR10'R11', wobei R10', R11', unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben,
ausgenommen 4'-DMT-3'-benzoyl-ribopyranosyl-N-benzoyl-adenosin, N6,N6-Dibenzoyl-9-(2'- O-benzoyl-β-D-ribo-pyranosyl)-adenosin, Ribopyranosyl-N-benzoyl-adenosin, 4'-DMT-3'- benzoyl-ribopyranosyl-urazil und Ribopyranosyl-urazil.
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O, CnH2n+1 oder OCnH2n-1,oder (CnH2n)NR10'R11', wobei R10', R11', unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben,
ausgenommen 4'-DMT-3'-benzoyl-ribopyranosyl-N-benzoyl-adenosin, N6,N6-Dibenzoyl-9-(2'- O-benzoyl-β-D-ribo-pyranosyl)-adenosin, Ribopyranosyl-N-benzoyl-adenosin, 4'-DMT-3'- benzoyl-ribopyranosyl-urazil und Ribopyranosyl-urazil.
Das erfindungsgemäße Pentopyranosyl-Nucleosid ist im allgemeinen ein Ribo-, Arabino-,
Lyxo- und/oder Xylo-pyranosyl-Nucleosid, vorzugsweise ein Ribopyranosyl-Nucleosid, wobei
der Pentopyranosyl-Teil D-konfiguriert, aber auch L-konfiguriert sein kann.
Üblicherweise handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Pentopyranosyl-Nucleosid um ein
Pentopyranosyl-purin, -2,6-diaminopurin, -6-purinthiol, -pyridin, -pyrimidin, -adenosin,
-guanosin, -isoguanosin, -6-thioguanosin, -xanthin, -hypoxanthin, -thymidin, -cytosin,
-isocytosin, -indol, -tryptamin, -N-phthaloyltryptamin, -uracil, -coffein, -theobromin,
-theophyllin, -benzotriazol oder -acridin, insbesondere um ein Pentopyranosyl-purin, -pyrimidin,
-adenosin, -guanosin, -thymidin, -cytosin, tryptamin, -N-phthalotryptamin oder -uracil.
Unter die erfindungsgemäßen Verbindungen fallen auch Pentopyranosyl-Nucleoside, die als
Linker verwendet werden können, d. h. als Verbindungen mit funktionellen Gruppen, die
kovalent an Biomoleküle, wie z. B. in ihrer natürlichen Form vorkommende oder modifizierte
Nucleinsäuren, wie DNA, RNA aber auch p-NA's, vorzugsweise pRNA's, binden können.
Dies ist überraschend, da für p-NA's noch keine Linker bekannt sind.
Beispielsweise fallen hierunter Pentopyranosyl-Nucleoside, bei denen R2, R3, R4, R2', R3'
und/oder R4' ein 2-Phthalimidoethyl- oder Allyloxy-Rest bedeutet. Bevorzugt sind gemäß der
vorliegenden Erfindung beispielsweise Uracil-basierende Linker, bei denen vorzugsweise die
5-Position des Uracils modifiziert wurde, z. B. N-Phthaloylaminoethyluracil, aber auch Indol
basierende Linker, vorzugsweise Tryptaminderivate, wie z. B. N-Phthaloyltryptamin.
Überraschenderweise werden durch die vorliegende Erfindung auch besser handhabbare
Pentopyranosyl-N,N-Diacylnucleoside, vorzugsweise Purine, insbesonders Adenosin, Guanosin
oder 6-Thioguanosin, bereitgestellt, deren Nucleobase auf einfache Weise vollkommen
entschützt werden können. Daher gehören zu der Erfindung auch erfindungsgemäße
Pentopyranosyl-Nucleoside, bei denen R2, R3, R4, R2', R3' und/oder R4' ein Rest der Formel
-N[C(O)R9]2 bedeutet, insbesondere N6, N6-Dibenzoyl-9-(β-D-ribopyranosyl)-adenosin.
Weiterhin ist es überraschend, daß die vorliegende Erfindung Pentopyranosyl-Nucleoside
bereitstellt, die ausschließlich am 3'-Sauerstoffatom des Pentopyranosid-Teils eine
Schutzgruppe, vorzugsweise eine basen- oder metallkatalysiert abspaltbare Schutzgruppe,
insbesondere eine Acylgruppe, besonders bevorzugt eine Benzoylgruppe, tragen. Diese
Verbindungen dienen z. B. als Ausgangsstoffe zur direkten Einführung einer weiteren
Schutzgruppe, vorzugsweise einer säure- oder basenlabilen Schutzgruppe, insbesondere einer
Tritylgruppe, besonders bevorzugt eine Dimethoxytritylgruppe, an das 4'-Sauerstoffatom des
Pentopyranosid-Teils ohne zusätzliche, die Ausbeute verringernde Schritte, wie z. B.
zusätzliche Reinigungsschritte.
Darüberhinaus stellt die vorliegende Erfindung Pentopyranosyl-Nucleoside bereit, die
ausschließlich am 4'-Sauerstoffatom des Pentopyranosid-Teils eine Schutzgruppe,
vorzugsweise einer säure- oder basenlabilen Schutzgruppe, insbesondere einer Tritylgruppe,
besonders bevorzugt eine Dimethoxytritylgruppe, tragen. Auch diese Verbindungen dienen z. B.
als Ausgangsstoffe zur direkten Einführung einer weiteren Schutzgruppe, vorzugsweise
einer basen- oder metallkatalysiert abspaltbaren Schutzgruppe, insbesondere einer Acylgruppe,
besonders bevorzugt einer Benzoylgruppe, z. B. an dem 2'-Sauerstoffatom des
Pentopyranosid-Teils, ohne zusätzliche, die Ausbeute verringernde Schritte, wie z. B.
zusätzliche Reinigungsschritte.
Im allgemeinen können die erfindungsgemäßen Pentopyranosid-Nucleoside in einer
sogenannten Ein-Topf-Reaktion umgesetzt werden, was die Ausbeuten erhöht und daher
besonders vorteilhaft ist.
Folgende Verbindungen stellen bevorzugte Beispiele der erfindungsgemäßen Pentopyranosyl-Nu
cleoside dar:
- A) 4'-DMT-3'-benzoyl-pentopyranosyl-Nucleoside, vorzugsweise ein 4'-DMT-3'-benzoyl ribopyranosyl-Nucleosid, insbesondere ein 4'-DMT-3'-benzoyl-ribopyranosyl-adenin, -guanin, -cytosin, -thymidin oder -uracil sowie ein N-Benzoyl-4-DMT-3'-benzoyl-ribopyranosyl adenin, -guanin oder -cytosin sowie ein N-Isobutyroyl-4'-DMT-3'-benzoyl-ribopyranosyl adenin, -guanin oder -cytosin, O-Allyl-4'-DMT-3'-benzoyl-ribopyranosyl-guanin, -xanthin oder -hypoxanthin.
- B) {4'-O-[4,4'-Dimethoxytriphenyl)-methyl]-β-ribopyranosyl]}-nucleoside, inbesondere ein {4,-O-[4,4'-Dimethoxytriphenyl)-methyl]-β-ribopyranosyl]}-adenin, -guanin, -cytosin, -thymidin oder -uracil.
- C) Ribopyranosyl-N,N'-dibenzoyl-adenosin oder Ribopyranosyl-N,N'-dibenzoyl-guanosin.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines
Pentopyranosyl-Nucleosids der Formel (I)
worin
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7' SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4' oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R11 gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7' SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4' oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R11 gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
worin R12, R13, R14 und R15 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, OR7,
wobei R7 die oben genannte Bedeutung hat, oder CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben
genannte Bedeutung hat, bedeuten und
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16)- oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und
Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyoxycarbonyl-Gruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- oder 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT-)Gruppe,
oder der Formel (II)
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16)- oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und
Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyoxycarbonyl-Gruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- oder 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT-)Gruppe,
oder der Formel (II)
worin R1' gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O, CnH2n+1 oder OCnH2n-1, oder (CnH2n)NR10'R11', wobei R10', R11', unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben,
bei dem ausgehend von dem ungeschützten Pentopyranosid
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O, CnH2n+1 oder OCnH2n-1, oder (CnH2n)NR10'R11', wobei R10', R11', unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben,
bei dem ausgehend von dem ungeschützten Pentopyranosid
- (a) in einem ersten Schritt zuerst die 2'-, 3'- oder 4'-Position des Pentopyranosids geschützt wird, und gegebenenfalls
- (b) in einem zweiten Schritt die andere Position an der 2'-, 3'- oder 4'-Position.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht auf die in der zitierten Literatur beschriebenen
Nucleobasen beschränkt, sondern kann überraschenderweise mit einer Vielzahl von natürlichen
und synthetischen Nucleobasen erfolgreich durchgeführt werden. Zudem ist es besonders
überraschend, daß das erfindungsgemäße Verfahren im Vergleich zu dem literaturbekannten
Verfahren in großen Ausbeuten und mit einer Zeitersparnis von durchschnittlich 60%
durchgeführt werden kann, was für die industrielle Anwendung besonders vorteilhaft ist.
Zusätzlich sind mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die bei dem in der Literatur
beschriebenen Verfahren nötigen Reinigungsschritte, z. B. chromatographische
Zwischenreinigungen, nicht notwendig und die Reaktionen können teilweise als sogenannnte
Ein-Topf-Reaktion durchgeführt werden, was die Raum/Zeit-Ausbeuten deutlich erhöht.
In einer besonderen Ausführungsform erfolgt im Falle einer 2'-geschützten Position eine
Umlagerung der Schutzgruppe von der 2'-Position zur 3'-Position, die im allgemeinen in
Gegenwart einer Base, insbesondere in Gegenwart von N-Ethyldiisopropylamin und/oder
Triethylamin durchgeführt wird. Diese Reaktion kann gemäß der vorliegenden Erfindung
besonders vorteilhaft in dem gleichen Reaktionsbehältnis als Ein-Topf-Reaktion durchgeführt
werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Pyranosyl-nucleosid durch eine
säurelabile, basenlabile oder metallkatalysiert abspaltbare Schutzgruppe Sc1, Sc2, Sc1' oder Sc2'
geschützt, wobei vorzugsweise die Schutzgruppen Sc1 und Sc1' von den Schutzgruppen Sc2
bzw. Sc2' verschieden sind.
Im allgemeinen handelt es sich bei den genannten Schutzgruppen um eine Acylgruppe,
vorzugsweise um eine Acetyl-, Benzoyl-, Nitrobenzoyl- und/oder Methoxybenzoyl-Gruppe,
um Tritylgruppen, vorzugsweise um eine 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT)-Gruppe oder um eine
Fluorenylmethyloxycarbonyl-(Fmoc)Gruppe.
Besonders bevorzugt ist es, wenn die 2'- oder 3'-Position durch eine basenlabile oder
metallkatalysiert abspaltbare Schutzgruppe, vorzugsweise durch eine Acylgruppe, insbesondere
durch eine Acetyl-, Benzoyl-, Nitrobenzoyl- und/oder Methoxybenzoylgruppe, geschützt wird
und/oder die 4'-Position durch eine säure- oder basenlabile Schutzgruppe, vorzugsweise durch
eine Trityl- und/oder Fmoc-Gruppe, insbesondere durch eine DMT-Gruppe geschützt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kommt folglich im Gegensatz zu dem literaturbekannten
Verfahren ohne acetalische Schutzgruppen, wie Acetale oder Ketale, aus, was zusätzliche
chromatographische Zwischenreinigungen vermeidet und folglich die Reaktionen als Ein-Topf-Re
aktionen mit überraschend hohen Raum/Zeit-Ausbeuten durchführen läßt.
Die Einführung der genannten Schutzgruppen erfolgt vorzugsweise bei tiefen Temperaturen,
da diese hierdurch überraschenderweise selektiv eingeführt werden können.
So erfolgt beispielsweise die Einführung einer Benzoylgruppe durch Umsetzen mit
Benzoylchlorid in Pyridin bzw. in einem Pyridin/Methylenchlorid-Gemisch bei tiefen
Temperaturen. Die Einführung einer DMT-Gruppe kann beispielsweise durch Umsetzen mit
DMTCl in Anwesenheit einer Base, z. B. von N-Ethyldiisopropylamin (Hünig-Base), und z. B.
von Pyridin, Methylenchlorid oder einem Pyridin/Methylenchlorid-Gemisch bei
Raumtemperatur erfolgen.
Es ist auch vorteilhaft, wenn nach der Acylierung und/oder nach der gegebenenfalls erfolgten
Umlagerung von der 2'- zu der 3'-Position die Reaktionsprodukte chromatographisch
gereinigt werden. Eine Reinigung nach der Tritylierung ist gemäß dem erfindungsgemäßem
Verfahren nicht notwendig, was besonders vorteilhaft ist.
Das Endprodukt kann, falls notwendig, noch durch Kristallisation weiter gereinigt werden.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines
Ribopyranosyl-nucleosids, bei dem
- (a) eine geschützte Nucleobase mit einer geschützten Ribopyranose umgesetzt wird,
- (b) die Schutzgruppen von dem Ribopyranosyl-Teil des Produktes aus Schritt (a) abgespalten werden, und
- (c) das Produkt aus Schritt (b) gemäß dem oben näher beschriebenen Verfahren umgesetzt wird.
Hierbei ist es zur Vermeidung weiterer zeit- und materialaufwendiger Chromatographien
vorteilhaft, nur anomerenreine geschützte Pentopyranosen, wie z. B. Tetrabenzoyl
pentopyranosen, vorzugsweise β-Tetrabenzoyl-ribopyranosen (R. Jeanloz, J. Am. Chem. Soc.
1948, 70, 4052), einzusetzen.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Linker gemäß Formel (II), worin R4',
(CnH2n)NR10'R11' bedeutet und R10'R11' über einen Rest der Formel (III) mit der bereits
bezeichneten Bedeutung verbunden ist, durch folgendes Verfahren auf vorteilhafte Weise
hergestellt:
- (a) eine Verbindung der Formel (II) mit R4 gleich (CnH2n)OSc3 oder (CnH2n)Hal, worin n die oben genannte Bedeutung hat, Sc3 eine Schutzgruppe, vorzugsweise eine Mesylat-Gruppe, und Hal Chlor oder Brom bedeutet, wird mit einem Azid, vorzugsweise in DMF, umgesetzt, anschließend wird
- (b) das Reaktionprodukt aus (a), vorzugsweise mit Triphenylphosphin z. B. in Pyridin reduziert, dann
- (c) das Reaktionsprodukt aus (b) mit einem entsprechenden Phthalimid, z. B. N- Ethoxycarbonylphthalimid, umgesetzt, und
- (d) das Reaktionsprodukt aus (c) mit einer entsprechenden geschützten Pyranose, z. B. Ribosetetrabenzoat, umgesetzt, und schließlich
- (e) werden die Schutzgruppen, z. B. mit Methylat, abgespalten, und
- (f) die weiteren Schritte, wie oben bereits beschrieben, durchgeführt.
Daneben weisen Indolderivate als Linker den Vorzug der Fluoreszenzfähigkeit auf und sind
daher für Nanotechnologie-Anwendungen, bei denen es ggf. um den Nachweis kleinster
Substanzmengen geht, besonders bevorzugt. So wurden Indol-1-riboside bei N. N. Suvorov et
al., Biol. Aktivn. Soedin., Akad. Nauk SSSR 1965, 60 und Tetrahedron 1967, 23, 4653 bereits
beschrieben. Allerdings gibt es kein analoges Verfahren, 3-substituierte Derivate herzustellen.
Im allgemeinen erfolgt ihre Herstellung über die Bildung eines Aminals der ungeschützten
Zuckerkomponente und einem Indolin, welches dann durch Oxidation in das Indol-1-ribosid
übergeführt wird. Beschrieben wurden z. B. Indol-1-glucoside und -1-arabinoside (Y. V.
Dobriynin et al, Khim.-Farm. Zh. 1978, 12, 33), deren 3-substituierte Derivate meist über
Vielsmeier-Reaktion hergestellt wurden. Dieser Weg der Einführung von Aminoethyl-
Einheiten in 3-Position des Indols ist für eine industrielle Anwendung jedoch zu aufwendig.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform wird daher ein Linker gemäß Formel (I), worin
X und Y unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =C(R16) mit R16 gleich H
oder CnH2n und Z =C(R16)- mit R16 gleich (CnH2n)NR10R11 durch folgendes Verfahren auf
vorteilhafte Weise hergestellt:
- (a) das entsprechende Indolin, z. B. N-Phthaloyltryptamin, wird mit einer Pyranose, z. B. D-Ribose, zum Nucleosidtriol umgesetzt, dann werden
- (b) die Hydroxylgruppen des Pyranosyl-Teils des Produktes aus (a) vorzugsweise mit Acylgruppen, z. B. mittels Essigsäureanhydrid, geschützt, anschließend wird
- (c) das Produkt aus (b), z. B. durch 2,3-Dichlor-5,6-dicyanoparachinon, oxidiert, und
- (d) die Hydroxyl-Schutzgruppen des Pyranosyl-Teils des Produktes aus (c) werden z. B. mittels Methylat abgespalten und anschließend werden
- (e) die weiteren Schritte, wie oben bereits beschrieben, durchgeführt.
Dieses Verfahren läßt sich jedoch nicht nur bei Ribopyranosen anwenden, sondern auch bei
Ribofuranosen und 2'-Deoxyribofuranosen bzw. 2'-Deoxyribopyranosen, was besonders
vorteilhaft ist. Als Nucleosidierungspartner der Zucker wird vorzugsweise Tryptamin,
insbesondere N-Acylderivate des Tryptamins, vor allem N-Phthaloyltryptamin verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform werden die 4'-geschützten, vorzugsweise, die 3'-, 4'-
geschützten Pentopyranosyl-Nucleoside in einem weiteren Schritt phosphityliert oder an eine
feste Phase gebunden.
Die Phosphitylierung erfolgt beispielsweise durch Phosphorigsäuremonoallylester-diisopropyl
amidchlorid in Anwesenheit einer Base, z. B. N-Ethyldiisopropylamin. Die Bindung eines
geschützten erfindungsgemäßen Pentopyranosyl-Nucleosids an eine feste Phase, z. B "long
chain-alkylamino-controlled pore glass" (CPG, Sigma Chemie, München) kann beispielsweise
wie bei Eschenmoser et al. (1993) beschrieben erfolgen.
Die erhaltenen Verbindungen dienen z. B. für die Herstellung von Pentopyranosyl-
Nucleinsäuren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung
einer Pentopyranosyl-Nucleinsäure, mit folgenden Schritten:
- (a) in einem ersten Schritt wird ein geschütztes Pentopyranosyl-Nucleosid, wie oben bereits beschrieben, an eine feste Phase gebunden wird und
- (b) in einem zweiten Schritt wird das gemäß Schritt (a) an eine feste Phase gebundene 3'-, 4'- geschützte Pentopyranosylnukleosid um ein phosphityliertes 3'-, 4'-geschütztes Pentopyranosyl-Nucleosid verlängert und anschließend z. B. durch eine wäßrige Jodlösung oxidiert wird, und
- (c) Schritt (b) solange mit gleichen oder unterschiedlichen phosphitylierten 3'-, 4'-geschützten Pentopyranosyl-Nucleosiden wiederholt, bis die gewünschte Pentopyranosyl-Nucleinsäure vorliegt.
Als Kupplungsreagenz eignet sich besonders Benzimidazoliumtriflat, vorzugsweise nach
Umkristallisieren in Acetonitril und nach Lösen in Acetonitril, da im Gegensatz zu
5-(4-Nitrophenyl)-1H-tetrazol als Kupplungsreagenz keine Verstopfung der Kupplungsreagenz-Lei
tungen und eine Verunreinigung des Produktes erfolgt.
Weiterhin ist es vorteilhaft durch Zusatz von einem Salz, wie Natriumchlorid, zur
schutzgruppenabspaltenden Hydrazinolyse von Oligonukleotiden, insbesondere von p-NA's,
vorzugsweise von p-RNA's, Pyrimidinbasen, vor allem Uracil und Thymin, vor einer
Ringöffnung zu schützen, die das Oligonukleotid zerstören würde. Allyloxygruppen können
vorzugsweise durch Palladium [Pd(0)]-Komplexe z. B. vor der Hydrazinolyse abgespalten
werden.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform können in Schritt (a) und/oder Schritt (b) auch
Pentofuranosyl-nucleoside, z. B. das in ihrer natürlichen Form vorkommende Adenosin,
Guanosin, Cytidin, Thymidin und/oder Uracil, eingebaut werden, was z. B. zu einer
gemischten p-NA-DNA bzw. p-NA-RNA führt.
In einer anderen besonderen Ausführungsform kann in einem weiteren Schritt ein Allyloxy-
Linker der Formel
Sc4NH(CnH2n)CH(OPSc5Sc6)CnH2nSc7 (IV)
worin Sc4 und Sc7 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils eine Schutzgruppe
insbesondere ausgewählt aus Fmoc und/oder DMT,
Sc5 und Sc6 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils eine Allyloxy- und/oder Diisopropylamino-Gruppe bedeuten, eingebaut werden. n hat die bereits oben genannte Bedeutung.
Sc5 und Sc6 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils eine Allyloxy- und/oder Diisopropylamino-Gruppe bedeuten, eingebaut werden. n hat die bereits oben genannte Bedeutung.
Ausgehend von z. B. Lysin können somit in wenigen Reaktionsschritten amino-terminale
Linker aufgebaut werden, die sowohl eine aktivierbare Phosphorverbindung als auch eine
säurelabile Schutzgruppe, wie DMT, tragen und daher leicht in der automatisierbaren
Oligonucleotidsynthese verwendet werden können (siehe z. B. P. S. Nelson et al., Nucleic Acid
Res. 1989, 17, 7179; L. J. Arnold et al., WO 8902439). Das Repertoire wurde in der
vorliegenden Erfindung durch einen Lysin-basierender Linker erweitert, bei dem anstelle der
sonst üblichen Cyanoethyl-Gruppe am Phosphoratom eine Allyloxy-Gruppe eingebracht wurde,
und welcher daher in vorteilhafter Weise in der Noyori-Oligonucleotid-Methode eingesetzt
werden kann (R. Noyori, J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 1691-6).
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich daher auch auf einen Allyloxy-Linker der Formel
Sc4NH(CnH2n)CH(OPSc5Sc6)CnH2nSc7 (IV)
worin Sc4 und Sc7 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils eine Schutzgruppe
insbesondere ausgewählt aus Fmoc und/oder DMT,
Sc5 und Sc6 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils eine Allyloxy- und/oder Diisopropylamino-Gruppe und n wie oben bezeichnet, bedeuten.
Sc5 und Sc6 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils eine Allyloxy- und/oder Diisopropylamino-Gruppe und n wie oben bezeichnet, bedeuten.
Ein besonders bevorzugter Allyloxy-Linker ist (2-(S)-N-Fmoc-O1-DMT-O2-
allyloxydiisopropylaminophosphinyl-6-amino-1,2-hexandiol).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch eine Pentopyranosyl-
Nucleinsäure, die mindestens ein erfindungsgemäßes Pentopyranosyl-Nucleosid und
gegebenenfalls mindestens einen erfindungsgemäßen Allyloxy-Linker enthält.
p-NA's und insbesondere die p-RNA's bilden untereinander stabile Duplices und paaren im
allgemeinen nicht mit den in ihrer natürlichen Form vorkommenden DNA's und RNA's. Diese
Eigenschaft macht p-NA's zu bevorzugten Paarungssystemen.
Solche Paarungssysteme sind supramolekulare Systeme nicht kovalenter Wechselwirkung, die
sich durch Selektivität, Stabilität und Reversiblität auszeichnen, und deren Eigenschaften
bevorzugt thermodynamisch, d. h. durch Temperatur, pH-Wert und Konzentration beeinflußt
werden. Solche Paarungssysteme können z. B. aufgrund ihrer selektiven Eigenschaften auch
als "molekularer Klebstoff" für die Zusammenführung von unterschiedlichen Metallclustern zu
Cluster-Verbänden mit potentiell neuen Eigenschaften verwendet werden [siehe z. B. R. L.
Letsinger, et al., Nature 1996, 382, 607-9; P. G. Schultz et al., Nature 1996, 382, 609-11].
Folglich eignen sich die p-NA's auch für die Anwendung im Bereich der Nanotechnologie,
beispielsweise zur Herstellung neuer Materialien, Diagnostika und Therapeutika sowie
mikroelektronischer, photonischer bzw. optoelektronischer Bauteile und für das kontrollierte
Zusammenführen molekularer Species zu supramolekularen Einheiten, wie z. B. für den
(kombinatorischen) Aufbau von Proteinassemblies [siehe z. B. A. Lombardi, J. W. Bryson, W.
F. DeGrado, Biomoleküls (Pept. Sci.) 1997, 40, 495-504], da p-NA's Paarungssysteme
bilden, die stark und thermodynamisch kontrollierbar sind. Eine weitere Anwendung ergibt sich
daher gerade im diagnostischen und drug discovery-Bereich durch die Möglichkeit,
funktionelle, bevorzugt biologische Einheiten wie Proteine oder DNA/RNA-Abschnitte, mit
einem p-NA-Code zu versehen, der nicht mit den natürlichen Nucleinsäuren interferiert (siehe
z. B. WO93/20242).
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung eines Pentopyranosyl-
Nucleosid der Formel (I),
worin
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4, oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R11 gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4, oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R11 gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
worin R12, R13, R14 und R15 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, OR7,
wobei R7 die oben genannte Bedeutung hat, oder CnH2n-1, oder CnH2n+1, wobei n die oben
genannte Bedeutung hat, bedeuten und
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16)- oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder
CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und
Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyloxycarbonyl-Gruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- und/oder 4,4'-Dimethoxytrityl- (DMT-)Gruppe,
oder der Formel (II)
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16)- oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder
CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und
Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyloxycarbonyl-Gruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- und/oder 4,4'-Dimethoxytrityl- (DMT-)Gruppe,
oder der Formel (II)
worin R1, gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O, CnH2n+1 oder OCnH2n-1, oder (CnH2n)NR10'R11' wobei R10', R11' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben, zur Herstellung eines Therapeutikums, Diagnostikums und/oder elektronischen Bauteils.
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O, CnH2n+1 oder OCnH2n-1, oder (CnH2n)NR10'R11' wobei R10', R11' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben, zur Herstellung eines Therapeutikums, Diagnostikums und/oder elektronischen Bauteils.
Ein Biomolekül, z. B. DNA oder RNA, kann zum nicht-kovalenten Verbinden (Linken) mit
einem anderen Biomolekül, z. B. DNA oder RNA, verwendet werden, wenn beide
Biomoleküle Abschnitte enthalten, die aufgrund komplementärer Sequenzen von Nucleobasen
durch Ausbildung von Wasserstoffbrücken aneinander binden können. Derartige Biomoleküle
finden z. B. in analytischen Systemen ihr Signalamplifizierung Verwendung, wo ein in seiner
Sequenz zu analysierendes DNA-Molekül über einen solchen nicht-kovalenten DNA-Linker
zum einen an einen festen Träger immobilisiert, und zum anderen an ein signalverstärkendes
branchedDNA-Molekül (bDNA) gebunden werden soll (siehe Fig. 3; S. Urdea, Bio/Technol.
1994, 12, 926 oder US-Patent Nr. 5,624,802). Ein wesentlicher Nachteil der zuletzt
beschriebenen Systeme ist, daß sie den Verfahren zur Nucleinsäure-Diagnostik durch
Polymerase-Chain-Reaction (PCR) (K. Mullis, Methods Enzymol. 1987, 155, 335) hinsichtlich
der Empfindlichkeit bis jetzt unterlegen sind. Das ist u. a. darauf zurückzuführen, daß die
nicht-kovalente Bindung vom festen Träger an das zu analysierende DNA-Molekül ebenso wie
die nicht-kovalente Bindung des zu analysierenden DNA-Moleküls nicht immer spezifisch
erfolgt, wodurch es zu einer Vermischung der Funktionen "Sequenzerkennung" und "nicht
kovalente Bindung" kommt. Die Verwendung von p-NA's als orthogonales Paarungssystem,
welches nicht in das DNA- bzw. RNA-Paarungsgeschehen eingreift, löst dieses Problem auf
vorteilhafte Weise, wodurch die Empfindlichkeit der beschriebenen analytischen Verfahren
deutlich erhöht werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Konjugat enthaltend ein
Pentopyranosyl-Nucleosid der Formel (I),
worin
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4, oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R11 gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4, oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R11 gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
worin R12, R13, R14 und R15 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, OR7,
wobei R7 die oben genannte Bedeutung hat, oder CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben
genannte Bedeutung hat, bedeuten und
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16)- oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und
Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyloxycarbonyl-Gruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- oder 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT-)Gruppe,
oder der Formel (II)
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16)- oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und
Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyloxycarbonyl-Gruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- oder 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT-)Gruppe,
oder der Formel (II)
worin R1, gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O, CnH2n+1 oder OCnH2n-1, oder (CnH2n)NR10'R11', wobei R10', R11', unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben, und ein Biomolekül.
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O, CnH2n+1 oder OCnH2n-1, oder (CnH2n)NR10'R11', wobei R10', R11', unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben, und ein Biomolekül.
Konjugate sind im Sinne der vorliegenden Erfindung kovalent gebundene Hybride aus p-NA's
und anderen Biomolekülen, vorzugsweise ein Peptid, Protein oder eine Nucleinsäure,
beispielsweise ein Antikörper oder ein funktioneller Teil davon oder eine in ihrer natürlichen
Form vorkommende DNA und/oder RNA. Funktionelle Teile von Antikörper sind
beispielsweise Fv-Fragmente (Skerra & Plückthun (1988) Science 240, 1038), einzelkettige
Fv-Fragmente (scFv; Bird et al. (1988), Science 242, 423; Huston et al. (1988) Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879) oder Fab-Fragmente (Better et al. (1988) Science 240, 1041).
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um p-RNA/DNA- bzw.
p-RNA/RNA-Konjugate.
Konjugate werden dann vorzugsweise verwendet, wenn die Funktionen "Sequenzerkennung"
und "nicht-kovalente Bindung" in einem Molekül realisiert werden müssen, da die
erfindungsgemäßen Konjugate zwei zueinander orthogonale Paarungssysteme enthalten.
Für die Herstellung von Konjugaten sind sowohl sequentielle als auch konvergente Verfahren
geeignet.
In einem sequentiellen Verfahren wird z. B. nach erfolgter automatisierter Synthese eines
p-RNA-Oligomeren direkt am gleichen Synthesizer - nach Umstellung der Reagenzien und des
Kupplungsprotokolls - z. B. ein DNA-Oligonukleotid weitersynthetisiert. Dieser Vorgang läßt
sich auch in umgekehrter Reihenfolge durchführen.
In einem konvergenten Verfahren werden z. B. p-RNA-Oligomere mit Aminoterminalen-
Linkern und z. B. DNA-Oligomere mit z. B. Thiol-Linkern in getrennten Vorgängen
synthetisiert. Anschließend erfolgt vorzugsweise eine Jodacetylierung des p-RNA-Oligomeren
und die Kupplung der beiden Einheiten nach literaturbekannten Protokollen (T. Zhu et al.,
Bioconjug. Chem. 1994, 5, 312).
Konvergente Verfahren erweisen sich aufgrund ihrer Flexibilität als besonders bevorzugt.
Unter dem Begriff Konjugat im Sinne der vorliegenden Erfindung sind auch sogenannte Arrays
zu verstehen. Arrays sind Anordnungen von immobilisierten Erkennungsspecies, die speziell in
der Analytik und Diagnostik eine wichtige Rolle bei der simultanen Bestimmung von Analyten
spielen. Beispiele sind Peptide-Arrays (Fodor et al., Nature 1993, 364, 555) und Nucleinsäure-
Arrays (Southern et al. Genomics 1992, 13, 1008; Heller, US-Patent Nr. 5,632,957). Eine
höhere Flexibilität dieser Arrays kann dadurch erreicht werden, daß die Erkennungsspecies an
codierende Oligonucleotide gebunden werden und die zugehörigen, komplementären Stränge
an bestimmte Positionen auf einem festen Träger. Durch Aufbringen der codierten
Erkennungsspecies auf den "anti-codierten" festen Träger und Einstellung von
Hybridisierungsbedingungen werden die Erkennungsspecies an den gewünschten Positionen
nicht-kovalent gebunden. Dadurch können verschiedene Typen von Erkennungsspecies, wie z. B.
DNA-Abschnitte, Antikörper, nur durch Anwendung von Hybridisierungsbedingungen
gleichzeitig auf einem festen Träger angeordnet werden (siehe Fig. 4.). Voraussetzung hierzu
sind aber äußerst starke, selektive - um die codierenden Abschnitte möglichst kurz zu halten -
und mit natürlicher Nucleinsäure nicht interferierender Codons und Anticodons notwendig.
p-NA's, vorzugsweise p-RNA's eignen sich hierzu in besonders vorteilhafter Weise.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren, mit denen Erkennungsspecies,
bevorzugt natürliche DNA- oder RNA-Stränge und Proteine, dabei
bevorzugt Antikörper oder funktionelle Teile von Antikörper, durch p-NA-Abschnitte,
bevorzugt p-RNA-Abschnitte, eindeutig codiert werden. Diese können dann gemäß Fig. 4. mit
den zugehörigen Codons auf einem festen Träger hybridisiert werden. Damit kann auf einem
festen Träger, der in Form eines Arrays mit Codons ausgestattet ist, nur durch Einstellung von
Hybridisierungsbedingungen mit immer neuen Kombinationen von Erkennungsspecies an den
gewünschten Positionen immer neue, diagnostisch nützliche Arrays aufgebaut werden. Wird
dann der Analyt, beispielsweise eine biologische Probe wie Serum o. ä. aufgebracht, dann
werden die zu detektierenden Species in einem bestimmten Muster auf dem Array gebunden,
welches dann indirekt (z. B. durch Fluoreszenzmarkierung der Erkennungsspecies) oder direkt
(z. B. durch Impedanzmessung am Anknüpfungspunkt der Codons) registriert wird. Dann wird
die Hybridisierung durch geeignete Bedingung aufgehoben (Temperatur, Salze,
Lösungsmittel, elektrophoretische Vorgänge) so daß wieder nur der Träger mit den Codons
zurückbleibt. Dieser wird dann erneut mit anderen Erkennungsspecies beladen und wird z. B.
für den gleichen Analyten für die Ermittlung eines anderen Musters verwendet. Die immer neue
Anordnung von Erkennungsspecies im Array-Format und die Verwendung von p-NA's als
Paarungssysteme ist gegenüber anderen Systemen, siehe z. B. WO 96/13522 (s. 16, unten),
besonders vorteilhaft.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich daher insbesondere auch auf
ein Diagnostikum enthaltend ein oben beschriebenes Pentopyranosyl-Nucleosid oder ein
erfindungsgemäßes Konjugat, wie oben bereits näher beschrieben.
Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher beschreiben, ohne sie zu
beschränken.
Fig. 1 zeigt einen Ausschnitt aus der Struktur von RNA in ihrer natürlich vorkommenden
Form (links) und in Form einer p-NA (rechts).
Fig. 2 zeigt schematisch die Synthese eines p-Ribo(A,U)-Oligonucleotids nach Eschenmoser
et al. (1993).
Fig. 3 zeigt schematisch einen signalverstärkenden DNA-Test.
Fig. 4 zeigt schematisch eine Anordnung von immobilisierten Erkennungsstrukturen (Arrays)
auf einem festen Träger.
Zuerst 4'-Substitution, dann 2'-Substitution, dann Wanderungsreaktion:
Unter Argonatmosphäre wurden 51,6 g (200 mmol) 1-(β-D-Ribo-pyranosyl)-thymin A in 620
ml wasserfreiem Pyridin gelöst, 71,4 ml (2,1 eq.) N-Ethyldiisopropylamin und 100 g Molsieb
(4 Å) zugesetzt und 15 min lang mit KPG-Rührer gerührt. Man löste 92 g (272 mmol; 1,36
eq.) Dimethoxytritylchlorid (DMTCl) in 280 ml (frisch von festem NaHCO3 destilliertem)
Chloroform, und tropfte diese Lösung innerhalb von 30 min bei -6 bis -5°C der Triollösung
zu. Es wurde 1 h bei dieser Temp., dann über Nacht bei Raumtemperatur (RT.) gerührt,
wieder gekühlt, und weitere 25 g (74 mmol; 0,37 eq.) DMTCl in 70 ml Chloroform zugesetzt.
Man ließ auf RT kommen und rührte 4 h nach.
Eine kleine Probe wurde entnommen, wäßrig aufgearbeitet und chromatographiert, um die
analytischen Daten des 1-{4'-O-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)-methyl] -β-D-ribo-pyranosyl}
thymins zu erhalten:
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1,70 (bs, 2H, OH); 1,84 (d, 3H, Me); 2,90 (bs, 1 H, OH); 3,18, 3,30 (2m, 2H, H(5')), 3,62 (bs, 1 H, H(3')); 3,70-3,82 (m, 8 H, 2 OMe, H(4'), H(2')); 5,75 (d, J = 9,5 Hz, 1 H, H(1')), 6,85 (m, 4H, Harom); 6,96 (m, 1 H, Harom), 7,20 (m, 9H, Harom, H(6)), 8,70 (bs, 1 H, H(3).)
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1,70 (bs, 2H, OH); 1,84 (d, 3H, Me); 2,90 (bs, 1 H, OH); 3,18, 3,30 (2m, 2H, H(5')), 3,62 (bs, 1 H, H(3')); 3,70-3,82 (m, 8 H, 2 OMe, H(4'), H(2')); 5,75 (d, J = 9,5 Hz, 1 H, H(1')), 6,85 (m, 4H, Harom); 6,96 (m, 1 H, Harom), 7,20 (m, 9H, Harom, H(6)), 8,70 (bs, 1 H, H(3).)
Das Reaktionsgemisch wurde mit 2,46 g (20,5 mmol; 0,1 eq.) 4-Dimethylaminopyridin
(DMAP) versetzt, auf -6°C gekühlt und zwischen -6 und -1°C innerhalb von 15 min 27,9 ml
(0,24 mol; 1,2 eq.) Benzoylchlorid (BzCl) in 30 ml Pyridin zugetropft und 10 min nachgerührt.
Zur vollständigen Umsetzung wurden dann im Abstand von 25 min noch jeweils 2,8 ml (24
mmol; 0,12 eq.) BzCl unter Kühlung zugesetzt und schließlich 20 min gerührt.
Man setzte bei RT. 460 ml wasserfreies Pyridin, 841 ml (11,2 mol; 56 eq.) n-Propanol, 44 g
(0,316 mol; 1,58 eq.) p-Nitrophenol, 21,7 g (0,18 mol; 0,9 eq.) DMAP und 136 ml (0,8 mol; 4
eq.) N-Ethyldiisopropylamin zu und rührte bei 61-63°C 48 h lang. Dann blieb der Ansatz bei
RT. 60 h stehen. Das Reaktionsgemisch wurde noch 24 h lang auf 61-63°C erwärmt, auf RT.
abgekühlt und am Rotavapor eingeengt. Der Rückstand wurde in 2 l Ethylacetat
aufgenommen, das Molsieb abfiltriert, die org. Phase dreimal mit je 1 l Wasser extrahiert,
einmal mit 1,2 l 10%iger Citronensäure 5 min ausgerührt und die org. Phase wieder
abgetrennt, einmal mit 1 l Wasser und zum Abschluß mit 1 l gesättigter NaHCO3-Lösung
extrahiert. Die org. Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt (220 g
Rückstand).
Man filtrierte zuerst über Kieselgel 60 (20×10 cm) mit Stufengradienten Heptan/Ethylacetat,
1 : 1 bis 0 : 1) zur Vorreinigung, dann wurde an Kieselgel 60 chromatographiert (30×10 cm;
Stufengradient Dichlormethan/Ethylacetat, 1 : 0 bis 1 : 1).
Man erhielt:
40 g unpolare Fraktionen
52,9 g 1-{3'-O-Benzoyl-4'-O-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]-β- D-ribo-pyranosyl}-thymin B
34,5 g verunreinigtes B
3,4 g polare Fraktionen.
40 g unpolare Fraktionen
52,9 g 1-{3'-O-Benzoyl-4'-O-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]-β- D-ribo-pyranosyl}-thymin B
34,5 g verunreinigtes B
3,4 g polare Fraktionen.
Die verunreinigte Fraktion wurde erneut chromatographiert (KG 60, 45×10 cm;
Dichlormethan/Ethylacetat, 3 : 1) und lieferte weitere 11,3 g B.
Gesamtausbeute: 64,2 g (97 mmol) B, d. s. 48% Ausbeute. 1H-NMR entspricht.
Gesamtausbeute: 64,2 g (97 mmol) B, d. s. 48% Ausbeute. 1H-NMR entspricht.
Zuerst 2'-Substitution, dann 4'-Substitution, dann Wanderungsreaktion:
Alle Ansätze wurden unter N2-Atmosphäre durchgeführt.
54,0 g (0,155 mol) N4-Benzoyl-1-(β-D-ribo-pyranosyl)-cytosin 1 wurden in 830 ml
Dimethylformamid (DMF) und 1,5 l Pyridin (beide Lösungsm. getrocknet und gelagert über
Molsieb 3 Å) unter Erwärmen auf 124°C gelöst. Bei -58° bis -63°C wurden 23,0 g (0,163
mol; 1,05 eq.) BzCl, gelöst in 210 ml Pyridin, in 3,5 h zugetropft. Der Ansatz wurde im
Kühlbad über Nacht gerührt. 90,3 g (1,5 mol; 10 eq.) n-Propanol wurden eingerührt und der
Ansatz bei 40°C im HV. eingeengt. Durch zweimalige Zugabe von 150 ml Toluol und
erneutes Einengen wurden Pyridinreste entfernt. 124,3 g Rückstand wurden in 500 ml CH2Cl2
gelöst, zweimal mit je 300 ml halbkonzentrierter NaHCO3-Lösung ausgerührt, und der
ausgefallene Feststoff abfiltriert und getrocknet: 60,7 g Rückstand. Die CH2Cl2-Phase wurde
eingeengt: 25,0 g. Getrennte Chromatographie an Kieselgel 60 (40×10 cm) mit Gradienten
(AcOEt/iso-Hexan, 4 : 1, dann reines AcOEt, dann AcOEt/MeOH, 19 : 1 bis 2 : 1) lieferte (DC
(Kieselgel, AcOEt)):
35,4 g (78 mmol) 2 wurden in 390 ml CH2Cl2 und 180 ml Pyridin (beides wasserfrei) gelöst
und 0,94 (7,8 mmol; 0,1 eq.) DMAP, 34,6 ml (203 mmol; 2,6 eq.) N-Ethyldiisopropylamin und
33,1 g (98 mmol; 1,25 eq.) DMTCl zugegeben und 2 h bei RT. gerührt.
DC (Kieselgel, AcOEt): Rf 0,6.
CH2Cl2 wurde bei 30°C abgezogen, der Rückstand mit 640 ml Pyridin, 9,37 (78 mmol; 1,0
eq.) DMAP, 32,5 ml (234 mmol; 3,0 eq.) Et3N, 21,7 g (156 mmol; 2,0 eq.) p-Nitrophenol und
93,8 g (1,56 mol; 20 eq.) n-Propanol versetzt und 42 h bei 65°C gerührt. Der Ansatz wurde
am HV. bei 50°C eingeengt, zweimal mit je 250 ml Toluol versetzt und eingeengt. Der
Rückstand wurde in 1 l CH2Cl2 aufgenommen, dreimal mit je 500 ml verdünnter NaHCO3-Lsg.
ausgerührt, die org. Phase mit Na2SO4 getrocknet und eingeengt: 92,5 g Rückstand.
Chromatographie an Kieselgel 60 (50×10 cm) mit Gradienten (Methyl-tert. Butylether/iso-
Hexan, 2 : 1 bis 4 : 1, dann Methyl-tert. Butylether/AcOEt, 1 : 4, dann AcOEt/MeOH, 1 : 1 bis 1 : 3)
lieferte 44,7 g Produkt-haltige Fraktion, die aus 540 ml CH2Cl2/Methyl-tert. Butylether, 1 : 5,
umkristallisiert wurde. Das Kristallisat wurde erneut aus 300 ml CH2Cl2/Methyl-tert.
Butylether, 1 : 1, umkristallisiert.
3: DC (Kieselgel, CHCl3/i-PrOH 49 : 1): Rf 0,14.
3: DC (Kieselgel, CHCl3/i-PrOH 49 : 1): Rf 0,14.
Man erhielt: 30,0 g N4-Benzoyl-1-{3'-O-benzoyl-4'-O-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]-β-
D-ribo-pyranosyl}-cytosin 3
d. s. 51% Ausbeute bezogen auf 2. 1H-NMR entspricht.
d. s. 51% Ausbeute bezogen auf 2. 1H-NMR entspricht.
Zuerst 2'-Substitution, dann 4'-Substitution, dann Wanderungsreaktion:
68,37 g (100 mmol) N6-Benzoyl-9-(2',3',4,-tri-O-benzoyl-β-D-ribo-pyranosyl)-adenin 1 wurde
in 300 ml NH3-gesättigtem MeOH über Nacht bei RT. gerührt und das Kristallisat abfiltriert:
23,5 g (88%) 2.
DC (Kieselgel, AcOEt/MeOH 2 : 1): Rf 0,23.
1H-NMR (300 MHz, DMSO): 3,56-3,78 (m, 3H, H(4'), H(5')); 4,04 (m, 1 H, H(3')); 4.23 (ddd, J = 2,5, 8, 9,5 Hz, H(2')), 4,89 (d, J = 6 Hz, 1 H, OH), 5,07 (d, J = 7 Hz, 1 H, OH), 5,12 (d, J = 4 Hz, 1 H, OH), 5,63 (d, J = 9,5 Hz, 1 H, H(1')), 7,22 (s, 2H, NH2), 8,14 (s, 1 H, H(2)), 8,29 (s, 1 H, H(8)).
13C-NMR (75 MHz, DMSO): 65,0 (t, C(5')); 66,6 (s, C(4')), 68,1 (s, C(3')), 71,1 (s, C(2')), 79,6 (s, C(1')); 118.6 (C(5)); 139,5 (s, C(8)), 149,9 (s, C(4)), 152,5 (s, C(2)), 155,8 (s, C(6)).
DC (Kieselgel, AcOEt/MeOH 2 : 1): Rf 0,23.
1H-NMR (300 MHz, DMSO): 3,56-3,78 (m, 3H, H(4'), H(5')); 4,04 (m, 1 H, H(3')); 4.23 (ddd, J = 2,5, 8, 9,5 Hz, H(2')), 4,89 (d, J = 6 Hz, 1 H, OH), 5,07 (d, J = 7 Hz, 1 H, OH), 5,12 (d, J = 4 Hz, 1 H, OH), 5,63 (d, J = 9,5 Hz, 1 H, H(1')), 7,22 (s, 2H, NH2), 8,14 (s, 1 H, H(2)), 8,29 (s, 1 H, H(8)).
13C-NMR (75 MHz, DMSO): 65,0 (t, C(5')); 66,6 (s, C(4')), 68,1 (s, C(3')), 71,1 (s, C(2')), 79,6 (s, C(1')); 118.6 (C(5)); 139,5 (s, C(8)), 149,9 (s, C(4)), 152,5 (s, C(2)), 155,8 (s, C(6)).
Unter N2-Atmosphäre wurden 16,8 g (62,9 mmol) 2 in 500 ml wasserfreiem Pyridin
suspendiert und auf -4 bis -10°C gekühlt. Innerhalb von 20 min wurden 40 ml (199 mmol; 5
eq.) Trimethyichlorsilan zugetropft und 2,5 h unter Kühlung gerührt.
Bei -10 bis -15°C wurden 36,5 ml (199 mmol; 5 eq.) Benzoylchlorid, gelöst in 73 ml Pyridin,
innerhalb von 25 min zugesetzt, 10 min unter Kühlung und 2 h bei RT. gerührt (DC-Kontrolle
(Kieselgel, AcOEt/Heptan 1 : 1): Rf 0,5). Man kühlte wieder auf -10°C, ließ 136 ml H2O
(Temp. max. +8°C) zulaufen und rührte über Nacht bei RT. Nach vollständigem Umsatz
wurde das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand zweimal in je 200 ml Toluol
aufgenommen und wieder eingedampft. Man versetzte mit je 500 ml Et2O und H2O, ließ
mechanisch 2 h rühren, filtrierte das in beiden Phasen nur wenig lösliche Produkt ab, wusch mit
Et2O und H2O und trocknete über P2O5 am HV.: 23,8 g (80%) 3.
DC (Kieselgel, AcOEt/MeOH 9 : 1): Rf 0,35.
1H-NMR (300 MHz, DMSO): 3,60-3,80 (m, 3H, H(4'), H(5')); 4,06 (bs, 1 H, H(3')); 4.30 (ddd, J = 2,5, 8, 9,5 Hz, H(2')), 4,93 (d, J = 6 Hz, 1 H, OH), 5,20 (d, J = 4 Hz, 1 H, OH), 5,25 (d, J = 4 Hz, 1 H, OH), 5,77 (d, J = 9,5 Hz, 1 H, H(1')), 7,47 (m, 4 H, Harom), 7,60 (m, 2H, Harom), 7,78 (m, 4H, Harom), 8,70 s, 1 H, H-C(2), 8,79 (s, 1 H, H(8)).
13C-NMR (75 MHz, DMSO): 66,2 (t, C(5')); 66,5 (s, C(4')), 68,0 (s, C(3')), 71,0 (s, C(2')), 80,4 (s, C(1')); 112.42 (C(5)); 126,9 (s, C(5)), 126,9, 128,9, 133,3, 133,4 (arom. C), 146,0 (s, C(8)), 150,7 (s, C(4)), 151,8 (s, C(2)), 153,3 (s, C(6)), 172,0 (s, C=O)).
DC (Kieselgel, AcOEt/MeOH 9 : 1): Rf 0,35.
1H-NMR (300 MHz, DMSO): 3,60-3,80 (m, 3H, H(4'), H(5')); 4,06 (bs, 1 H, H(3')); 4.30 (ddd, J = 2,5, 8, 9,5 Hz, H(2')), 4,93 (d, J = 6 Hz, 1 H, OH), 5,20 (d, J = 4 Hz, 1 H, OH), 5,25 (d, J = 4 Hz, 1 H, OH), 5,77 (d, J = 9,5 Hz, 1 H, H(1')), 7,47 (m, 4 H, Harom), 7,60 (m, 2H, Harom), 7,78 (m, 4H, Harom), 8,70 s, 1 H, H-C(2), 8,79 (s, 1 H, H(8)).
13C-NMR (75 MHz, DMSO): 66,2 (t, C(5')); 66,5 (s, C(4')), 68,0 (s, C(3')), 71,0 (s, C(2')), 80,4 (s, C(1')); 112.42 (C(5)); 126,9 (s, C(5)), 126,9, 128,9, 133,3, 133,4 (arom. C), 146,0 (s, C(8)), 150,7 (s, C(4)), 151,8 (s, C(2)), 153,3 (s, C(6)), 172,0 (s, C=O)).
Unter N2-Atmosphäre wurden 26,4 g (55,5 mmol) 3 in 550 ml wasserfreiem CH2Cl2 und 55 ml
Pyridin (jeweils gelagert über Molsieb) gelöst, mit 0,73 g (5,55 mmol; 0, 1 eq.) DMAP versetzt
und auf -87 bis -90°C abgekühlt. Innerhalb von 1 h wurden 8,58 g (61 mmol; 1,1 eq.) BzCl in
14 ml Pyridin zugetropft und über 60 h (Wochenende) bei -78°C belassen. Der Ansatz wurde
eingeengt, zweimal mit je 100 ml Toluol versetzt und eingedampft, um Pyridin zu entfernen.
Chromatographie an Kieselgel 60 (20×10 cm) mit Gradienten (AcOEt/Heptan, 1 : 1 bis 9 : 1)
lieferte 23,2 g 4.
4: DC (Kieselgel, AcOEt): Rf 0,34.
4: DC (Kieselgel, AcOEt): Rf 0,34.
23,2 g (40 mmol) 4 wurden in 160 ml wasserfreiem CH2Cl2gelöst und in Folge mit 14,9 g (56
mmol; 1,1 eq.) DMTCl und 17,7 ml (104 mmol; 2,6 eq.) N-Ethyldiisopropylamin versetzt.
Nach 2 h Rühren bei RT wurden weitere 4,0 g (11,8 mmol; 0,3 eq.) DMTCl zugefügt und
weitere 40 min gerührt. Der Ansatz wurde bei 350-520 mbar und 35°C am Rotavapor
eingeengt.
DC (Kieselgel, AcOEt/Heptan 1 : 1): Rf 0,18.
DC (Kieselgel, AcOEt/Heptan 1 : 1): Rf 0,18.
Der Rückstand wurde in 260 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und in Folge mit 51 ml (679
mmol; 17 eq.) n-Propanol, 16,6 ml (120 mmol; 3 eq.) Et3N, 11,1 g (80 mmol; 2 eq.)
p-Nitrophenol und 5,3 g (44 mmol; 1,1 eq.) DMAP versetzt und bei 60-63°C 23 h lang gerührt.
Dann blieb der Ansatz bei RT. 21 h stehen. Das Reaktionsgemisch wurde am Rotavapor
eingeengt. Der Rückstand wurde zweimal mit je 200 ml Toluol versetzt und eingeengt, in
CH2Cl2 gelöst und dreimal mit Wasser extrahiert.
Chromatographie an Kieselgel 60 (30×10 cm) mit Gradienten (AcOEt/Heptan, 1 : 2 bis 1 : 0;
dann AcOEt/MeOH, 1 : 0 bis 9 : 1) lieferte 13 g 5.
5: DC (Kieselgel, AcOEt/Heptan 4 : 1): Rf 0,2.
5: DC (Kieselgel, AcOEt/Heptan 4 : 1): Rf 0,2.
Man erhielt: 13 g N6-Benzoyl-9-{3'-O-benzoyl-4'-O-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)
methyl]-β-D-ribo-pyranosyl}-adenin 5
d. s. 30% Ausbeute bezogen auf 3. 1H-NMR entspricht.
Zeitersparnis gegenüber literaturbekanntem Verfahren: 50%.
Zuerst 3'-Substitution, dann 4'-Substitution:
Das G-Triol A (393 mg, 1.0 mmol) wurde in 4 ml trockenem Dichiormethan gelöst. Man
versetzte mit Benzoesäuretrimethylorthoester (0.52 ml, 3.0 mmol) und Camphersulfonsäure
(58 mg, 0.25 mmol) und rührte 15 h bei Raumtemperatur. Dann wurde die Mischung auf 0°C
abgekühlt und mit 2 ml einer auf 0°C vorgekühlten Mischung von Acetonitril, Wasser und
Trifluoressigsäure (50 : 5 : 1) versetzt. Man rührte 10 min und entfernte das Lösungsmittel im
Vakuum. Der Rückstand wurde durch Flashchromatographie an Kieselgel (2.3×21 cm) mit
Dichlormethan/Methanol 100 : 3 gereinigt. Man erhielt 25 mg (5%) 4-O-Benzoylverbindung
139 mg (28%) Mischfraktionen und 205 mg (41%) der gewünschten 3-O-Benzoylverbindung
B.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.12, 1.14 (2 d, J = 7.0 Hz, 2×3 H, NHCOCHMe2), 2.78 (hep, J = 7 Hz, 1 H, NHCOCHMe2), 3.85 (dd, J = 6.0, 11.0 Hz, 1 H, H-5'eq), 3.94 (app. T, J = 11.0 Hz, 1 H, H-5'ax), 4.12 (ddd, J = 2.5, 6.0, 11.0 Hz, 1 H, H-4'), 4.52 (dd, J = 3.5, 9.5 hz, 1 H, H-2'), 5.00 (dt, J = 1.5, 6.0 Hz, 2 H, All), 5.19 (dq, J = 1.5, 10.0 Hz, 1 H, All), 5.39 (dq, 1.5, 16.5 Hz, 1 H, All), 5.85 (bt, J = 3.0 Hz, 1 H, H-3'), 5.97 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 6.07 (ddd, J = 6.0, 10.0, 16.5 Hz, 1 H, All), 7.40-7.58 (m, 3 H, Bz), 8.10-8.16 (m, 2 H, Bz), 8.28 (s, 1 H, H-8).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.12, 1.14 (2 d, J = 7.0 Hz, 2×3 H, NHCOCHMe2), 2.78 (hep, J = 7 Hz, 1 H, NHCOCHMe2), 3.85 (dd, J = 6.0, 11.0 Hz, 1 H, H-5'eq), 3.94 (app. T, J = 11.0 Hz, 1 H, H-5'ax), 4.12 (ddd, J = 2.5, 6.0, 11.0 Hz, 1 H, H-4'), 4.52 (dd, J = 3.5, 9.5 hz, 1 H, H-2'), 5.00 (dt, J = 1.5, 6.0 Hz, 2 H, All), 5.19 (dq, J = 1.5, 10.0 Hz, 1 H, All), 5.39 (dq, 1.5, 16.5 Hz, 1 H, All), 5.85 (bt, J = 3.0 Hz, 1 H, H-3'), 5.97 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 6.07 (ddd, J = 6.0, 10.0, 16.5 Hz, 1 H, All), 7.40-7.58 (m, 3 H, Bz), 8.10-8.16 (m, 2 H, Bz), 8.28 (s, 1 H, H-8).
Das Diol B (101 mg, 0.2 mmol) wurde in 3.2 ml trockenem Dichlormethan suspendiert. Man
versetzte mit 171 µl (1.0 mmol) N-Ethyldiisopropylamin, 320 µl (3.96 mmol) Pyridin und 102
mg (0.3 mmol) DMTCl und rührte bei Raumtemperatur. Nach 24 h wurden weitere 102 mg
(0.3 mmol) DMTCl zugegeben und nochmals 24 h gerührt. Dann wurde mit 30 ml
Dichlormethan verdünnt. Die Lösung wurde mit 20 ml 10%iger wässriger Citronensäurelösung
und 10 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und im
Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch Flashchromatographie an Kieselgel (2.3×20
cm) mit Dichlormethan/Methanol 100 : 1 gereinigt. Man erhielt 39 mg des bekannten,
gewünschten Produkts C (24%).
Im folgenden werden drei Wege beschrieben, die die Bereitstellung von Linkern, die einen
Amino-Terminus aufweisen, der dann zum Anlinken funktioneller Einheiten verwendet werden
kann, ermöglichen:
auf der Basis der Modifizierung der 5-Position des Uracils.
Die Herstellung von Hydroxyethyluracil 28 gelingt im großen Maßstab nach bekannter
Methode (J.D. Fissekis, A. Myles, G.B. Brown, J. Org. Chem. 1964, 29, 2670. g-Butyrolacton 25
wurde mit Ameisensäuremethylester formyliert, das Natriumsalz 26 zum Harnstoffderivat
27 umgesetzt und dieses zum Hydroxyethyluracil 28 cyclisiert (Schema 4).
Hydroxyethyluracil 28 wurde mit Methansulfonsäurechlorid in Pyridin mesyliert zu 29 (J.D.
Fissekis, F. Sweet, J. Org. Chem. 1973, 38, 264).
Die folgenden Stufen wurden neu erfunden: Mit Natriumazid in DMF wurde 29 zum Azid 30
umgesetzt und dieses mit Triphenylphosphin in Pyridin zum Aminoethyluracil 31 reduziert. Die
Aminofunktion in 31 wurde schließlich mit N-Ethoxycarbonylphtalimid geschützt (Schema 5).
Nukleosidierung von Ribosetetrabenzoat 33 mit N-Phtaloylaminoethyluracil 32 lieferte das
Ribosetribenzoat 34 in guten Ausbeuten. Das anomere Zentrum des Pyranoseringes ist, wie aus
der Kopplungskonstanten zwischen H-C(1') und H-C(2') von J = 9.5 Hz klar ersichtlich, β-
konfiguriert. Anschließende Abspaltung der Benzoatschutzgruppen mit NaOMe in MeOH
lieferte das Linkertriol 35. 35 wurde bei -78°C in Pyridin/Dichlormethan 1 : 10 in Gegenwart
von DMAP mit Benzoylchlorid umgesetzt. Dabei erhielt man neben dem gewünschten
2'-Benzoat 36 (64%) auch 2',4'-dibenzoyliertes Produkt (22%), welches gesammelt und analog
der Methanolyse von 34 nach 35 wieder in das Triol 35 umgewandelt wurde. Das 2'-Benzoat
36 wurde mit Dimethoxytrityichlorid in Gegenwart von Hünig-Base in Dichlormethan in
4'-Position in Ausbeuten größer 90% trityliert. Die Umlagerung von 4'-DMT-2'-benzoat 37 zum
4'-DMT-3'-benzoat 38 erfolgte in Gegenwart von DMAP, p-Nitrophenol und Hünig-Base in
n-Propanol/Pyridin 5 : 2. Nach Chromatographie wird 38 erhalten. 4'-DMT-3'-benzoat 38 wurde
abschließend mit ClP(OAll)N(iPr)2 in Gegenwart von Hünig-Base zum Phosphoramidit 39
umgesetzt (Schema 6). Dieser läßt sich ohne Änderung der Syntheseprotokolle für die
automatisierte Oligonucleotidsynthese einsetzen.
Ausführung
Synthese eines Uracil-Linker-Bausteins
Synthese eines Uracil-Linker-Bausteins
In einem mit Innenthermometer und Rückflußkühler ausgestatteten 500-ml-Dreihalskolben
wurden 26.0 g (0.11 mol) 29 in 250 ml DMF gelöst und mit 10.8 g (0.166 mol)
Natriumazid versetzt. Die Suspension wurde im Anschluß vier Stunden bei 60°C gerührt
(DC-Kontrolle, CHCl3/MeOH 9 : 1). Das DMF wurde abdestilliert und der Rückstand mit 150 ml
Wasser verrührt. Der Feststoff wurde abfiltriert, mit ca. 50 ml Wasser gewaschen und über
Nacht im Vakuum im Exsiccator über Phosphorpentoxid getrocknet. Man erhielt 14.2 g (71%)
30 in Form eines farblosen Feststoffes vom Schmp. 230-235°C (u. Zers.).
5-(2-Azidoethyl)uracil (30):
Schmp.: 230-235°C u. Zersetz.
DC: CHCl3
Schmp.: 230-235°C u. Zersetz.
DC: CHCl3
/MeOH 9 : 1, Rf
0.48.
UV (MeOH): λmax
UV (MeOH): λmax
263.0 (7910).
IR(KBr): 3209s, 3038s, 2139s, 1741s, 1671s, 1452m, 1245m, 1210m.
1
IR(KBr): 3209s, 3038s, 2139s, 1741s, 1671s, 1452m, 1245m, 1210m.
1
H-NMR (300 MHz, d6
-DMSO): 2.46 (t, 2H, J(CH2
CH2
N, CH2
CH2
N) = 7.0, CH2
CH2
N);
3.40 (t, 2H, J(CH2
CH2
N, CH2
CH2
N) = 7.0, CH2
CH2
N); 7.36 (s, H-C(6)); 11.00
(br. s 2H, H-N(1), H-N(3)).
MS (ESI+
MS (ESI+
): 180.0 [M+H].
In einem mit Innenthermometer und Rückflußkühler ausgestatteten 250-ml-Dreihals-kolben
wurden 14.2 g (78.0 mmol) 30 in 175 ml Pyridin suspendiert und mit 61.4 g (234 mmol)
Triphenylphosphin versetzt2). Es wurde fünf Stunden auf 60°C erwärmt und über Nacht bei
Raumtemp. gerührt (DC-Kontrolle, CHCl3/MeOH 5 : 1). Zur Suspension wurden 40 ml einer
25%igen Ammoniaklösung gegeben, die daraufhin aufklarte. Die Lösungsmittel wurden
i.v.i.RV entfernt. Der Rückstand wurde in 200 ml CH2Cl2/MeOH 1 : 1 30 min bei
Raumtemp. gerührt, der Niederschlag abfiltriert und mit CH2Cl2 gewaschen. Nach Trocknen im
Vakuum im Exsiccator über Phosphorpentoxid erhielt man 10.0 g (85%) 31 vom Schmp.
214-220°C.
5-(2-Aminoethyl)uracil (31):
Schmp.: 214-220°C u. Gasentwicklung, vorher sintern.
DC: CHCl3
Schmp.: 214-220°C u. Gasentwicklung, vorher sintern.
DC: CHCl3
/MeOH/HOAc/H2
O 85 : 20 : 10 : 2, Rf
0.07.
UV (MeOH): λmax
UV (MeOH): λmax
263.0 (6400).
IR(KBr): 3430m, 3109s, 1628s, 1474m, 1394s, 1270s, 1176w, 1103m, 1021m, 966m, 908m, 838m.
1
IR(KBr): 3430m, 3109s, 1628s, 1474m, 1394s, 1270s, 1176w, 1103m, 1021m, 966m, 908m, 838m.
1
H-NMR (300 MHz, d6
-DMSO): 2.21 (t, 2H, J(CH2
CH2
N, CH2
CH2
N) = 6.8, CH2
CH2
N);
2.59 (t, 2H, J(CH2
CH2
N, CH2
CH2
N) = 6.8, CH2
CH2
N); 5.90 (v. br. s, 4H,
H-N(1), H-N(3), NH2
); 7.19 (s, H-C(6)).
MS (ES-
MS (ES-
): 153.9 [M-H].
In einem 250-ml-Rundkolben wurden 9.6 g (61.8 mmol) 31 in 100 ml Wasser suspendiert und
mit 6.64 g (62.6 mmol) Na2CO3 versetzt. Nach 15 min Rühren bei Raumtemp. gab man
portionsweise 14.3 g (65 mmol) N-Ethoxycarbonylphtalimid zu und rührte drei Stunden bei
Raumtemp. (DC-Kontrolle, CHCl3/MeOH 5 : 1). Die nunmehr zähe, weiße Suspension wurde
vorsichtig1) mit konz. Salzsäure auf pH 4 eingestellt und der weiße Niederschlag abfiltriert.
Nach Waschen mit Wasser wurde der Feststoff im Vakuum im Exsiccator über
Phosphorpentoxid getrocknet. Dies lieferte 16.0 g (91%) 32 vom Schmp. 324-327°C.
5-(2-Phtalimidoethyl)uracil (32):
Schmp.: 324-327°C u. Zersetz.
DC: CHCl3
Schmp.: 324-327°C u. Zersetz.
DC: CHCl3
/MeOH 5 : 1, Rf
0.51.
UV (MeOH): λmax
UV (MeOH): λmax
263.0 (5825); λ 298 0 (sh., 1380).
IR(KBr): 3446m, 3216m, 1772m, 721s, 1707s, 1670s, 1390m.
1
IR(KBr): 3446m, 3216m, 1772m, 721s, 1707s, 1670s, 1390m.
1
H-NMR (300 MHz, d6
-DMSO): 2.49 (t, 2H, J(CH2
CH2
N, CH2
CH2
N) = 6.0, CH2
CH2
N);
3.71 (t, 2H, J(CH2
CH2
N, CH2
CH2
N) = 6.0, CH2
CH2
N); 7.24 (s, H-C(6)); 7.84
(mc
, 4H, NPht); 10.76 (br. s, H-N(1), H-N(3)).
MS (ESI-
MS (ESI-
): 284.0 [M-H].
In einem 250-ml-Dreihalskolben, ausgestattet mit Argonüberleitung, Innenthermometer und
Septum, wurden 7.00 g (24 mmol) 32 und 13.6 g (24 mmol) 33 in 120 ml Acetonitril
suspendiert. Dann wurden mittels Spritze zunächst 12.2 ml (50 mmol) BSA zugegeben und
nach 30 min Rühren nochmals 7 ml (28 mmol) BSA zugegeben. Nach kurzzeitigem Erwärmen
auf 40°C klarte sich die Reaktionsmischung auf. Bei Raumtemp. wurden 13 ml (72 mmol)
TMSOTf mittels Spritze zugegeben. Nach einer Stunde konnte noch keine Produktbildung
beobachtet werden (DC-Kontrolle, AcOEt/n-Heptan 1 : 1). Daher wurden weitere 13 ml
(72 mmol) TMSOTf zugegeben. Im Anschluß wurde der Reaktionsansatz auf 50°C erwärmt.
Nach 2.5 h Rühren bei 50°C (DC-Kontrolle) wurde auf RT. gekühlt, auf eine eiskalte
Mischung von 250 ml AcOEt und 190 ml ges. NaHCO3-Lösung und 10 min intensiv
ausgerührt. Man wusch nochmals mit 100 ml NaHCO3-Lösung und extrahierte die wäßrigen
Phasen nochmals mit 100 ml AcOEt. Die ver. org. Phasen wurden mit MgSO4 getrocknet und
die Lösungsmittel i.V.i.RV entfernt. Nach Trocknen im ÖPV erhielt man 20.9 g Rohprodukt.
Chromatographie an Kieselgel (h = 25 cm, ↙ = 5 cm, AcOEt/n-Heptan 1 : 1) lieferte ein
DC-einheitliches, schaumiges Produkt, das mit Et2O digeriert wurde. Filtration und Trocknen im
ÖPV ergab 15 g (86%) 34.
1-(2,3,4-Tri-O-benzoyl-β-D-ribopyranosyl)-5-(2-phtalimidoethyl)uracil (34):
Schmp.: 124°C (sintern).
DC: AcOEt/n-Heptan 1 : 1, Rf
Schmp.: 124°C (sintern).
DC: AcOEt/n-Heptan 1 : 1, Rf
0.09.
UV (MeOH): λmax
UV (MeOH): λmax
263.0(11085); λ 299.0 (sh., 1530).
IR(KBr): 3238w, 3067w, 1772m, 1710s, 1452m, 1395m, 1266s, 1110s, 1070m, 1026m.
1
IR(KBr): 3238w, 3067w, 1772m, 1710s, 1452m, 1395m, 1266s, 1110s, 1070m, 1026m.
1
H-NMR (300 MHz, CDCl3
): 2.79 (mc
, 2H, CH2
CH2
N); 3.96 (mc
, 2H, CH2
CH2
N); 4.06 (dd,
J(Heq
-C(5'), Hax
-C(5')) = 11.0, J(Heq
-C(5'), H-C(4')) = 6.0, Heg-C(5')); 4.12 (t,
J(Hax
-C(5'), Heq
-C(5')) = J(Hax
-C(5'), H-C(4')) = 11.0, Hax
-C(5')); 5.39 (dd,
J(H-C(2'), H-C(1')) = 9.5, J(H-C(2'), H-C(3')) = 2.9, H-C(2')); 5.46 (ddd, J(H-C(4'),
Hax
-C(5')) = 11.0, J(H-C(4'), Heq
-C(5')) = 6.0, J(H-C(4'), H-C(3')) =
2.9, H-C(4')); 6.26 (ψt, J ≈ 2.6, H-C(3')); 6.36 (d, J(H-C(1'), H-C(2')) = 9.5,
H-C(1')); 7.24-7.40, 7.44-7.56, 7.61-7.66, 7.72-7.80, 7.84-7.90, 8.06-8.13 (6m,
16H, 3 Ph, H-C(6)); 7.70, 7.82 (2 mc
, 4H, NPht); 8.37 (s, H-N(3)).
13
13
C-NMR (75 MHz, CDCl3
): 21.19 (CH2
CH2
N); 36.33 (CH2
CH2
N); 64.07 (C(5')); 66.81,
68.22 (C(4'), C(2')); 69.29 (C(3')); 78.59 (C(1')); 112.42 (C(5)); 123.31,
132.05, 133.89 (6C, Pht); 128.33, 128.47, 128.47, 128.83, 128.86, 129.31,
129.83, 129.83, 129.94, 133.55, 133.62, 133.69 (18C, 3 Ph); 135.87 (C(6));
150.39 (C(2)); 162.78 (C(4)); 164.64, 165.01, 165.41 (3C, O2
CPh); 168.43
(2C, CO-Pht).
MS (ESI+
MS (ESI+
): 730.2 [M+H].
Anal.: ber. für C40
Anal.: ber. für C40
H31
N3
O11
(729.70): C 65.84, H 4.28, N 5.76;
gef: C 65.63, H 4.46, N 5.53.
gef: C 65.63, H 4.46, N 5.53.
In einem 1-l-Rundkolben wurden 15 g (20 mmol) 34 in 500 ml MeOH gelöst, mit 324 mg (6
mmol) NaOMe versetzt und über Nacht unter Wasserausschluß bei Raum-temp. gerührt
(DC-Kontrolle, AcOEt/n-Heptan 1 : 1). Es wurde solange Amberlite IR-120 zur entstandenen
Suspension gegeben bis der pH-Wert <7 war. Es wurde der Feststoff in der Hitze gelöst, heiß
vom Ionentauscher abfiltriert und mit MeOH gewaschen. Nach Entfernen der Lösungsmittel
wurde der Rückstand zweimal mit je 150 ml Wasser coevaporiert. Dies lieferte 9 g
Rohprodukt, das 10 min in 90 ml MeOH unter Rückfluß erhitzt wurde. Nach Abkühlen auf
Raumtemp. versetzte man mit 60 ml Et2O und bewahrte über Nacht bei 4°C auf Filtration,
Waschen mit Et2O und Trocknen im ÖPV lieferte 7.8 g (93%) 35.
5-(2-Phtalimidoethyl)-1-(β-D-ribopyranosyl)uracil (35):
Schmp.: 137°C (sintern).
DC: CHCl3
Schmp.: 137°C (sintern).
DC: CHCl3
/MeOH 5 : 1, Rf
0.21.
UV (MeOH): λmax
UV (MeOH): λmax
263.0 (8575); λ 299.0 (sh., 1545).
IR(KBr): 3458s, 1772w, 1706s, 1400m, 1364m, 1304m, 1045m.
1
IR(KBr): 3458s, 1772w, 1706s, 1400m, 1364m, 1304m, 1045m.
1
H-NMR (300 MHz, d6
-DMSO + 2 Tr. D2
O): 2.55 (mc
, 2H, CH2
CH2
N); 3.28-3.61 (m, 4H,
H-C(2'), H-C(4'), Heq
-C(5'), Hax
-C(5')); 3-73 (mc
, 2H, CH2
CH2
N); 3.93 (m,
H-C(3')); 5.50 (d, J(H-C(1'), H-C(2')) 9.3, H-C(1')); 7-41 (s, H-C(6)); 7.84 (s,
4H, NPht).
13
13
C-NMR (75 MHz, d6
-DMSO): 25.63 (CH2
CH2
N); 36.62 (CH2
CH2
N); 64.95 (C(5')); 66.29
(C(4')); 67.37 (C(2')); 71.12 (C(3')); 79.34 (C(1')); 110.39 (C(5)); 122.85,
131.54, 134.08 (6C, Pht); 137.92 (C(6)); 150.84 (C(2)); 163.18 (C(4)); 167.74
(2C, CO-Pht).
MS (ESI-
MS (ESI-
): 416.1 [M-H].
In einem ausgeheizten und mit Argon begasten 1-l-Vierhalskolben wurden 10.6 g (0.025
mmol) 5-(2-Phtalimidoethyl)-1-(β-D-ribopyranosyl)uracil in 20 ml Pyridin gelöst und mit 200
ml Dichlormethan versetzt. Es wurde auf -70°C abgekühlt, unter Kühlung 3.82 ml (0.033
mmol) Benzoylchlorid in 5 ml Pyridin und 20 ml Dichlormethan langsam zugetropft und 35
min bei -70°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 600 ml gekühlte Ammoniumchlorid-
Lösung gegossen und die wäßrige Phase mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organi
schen Phasen wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum zur Trockene ein
geengt. Chromatographie über Kieselgel (Ethylacetat/Heptan 1 : 1) lieferte 7.9 g (60%) 1-(2'-
O-Benzoyl-β-D-ribopyranosyl)-5-(2-phtalimidoethyl)-uracil.
DC Rf 0.24 (Ethylacetat/Heptan 4 : 1).
1H-NMR (300 Mhz, d6-DMSO). 2.67 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.66-398 (m, 5H, H-C(4'), Heq- C(5'), Hax-C(5'), CH2CH2N); 451 (t, 1 H, H-C(3')), 4.98 (dd, 1 H, H-C(2')); 6.12 (d, 1 H, H-C(1')); 7.19 (s, 1 H, H-C(6)); 7.29-7.92 (m, 9H, OBz, NPht).
DC Rf 0.24 (Ethylacetat/Heptan 4 : 1).
1H-NMR (300 Mhz, d6-DMSO). 2.67 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.66-398 (m, 5H, H-C(4'), Heq- C(5'), Hax-C(5'), CH2CH2N); 451 (t, 1 H, H-C(3')), 4.98 (dd, 1 H, H-C(2')); 6.12 (d, 1 H, H-C(1')); 7.19 (s, 1 H, H-C(6)); 7.29-7.92 (m, 9H, OBz, NPht).
5.6 g (10.73 mmol) 1-(2-O-Benzoyl-β-D-ribopyranosyl)-5-(2-phtalimidoethyl)uracil wurden in
60 ml Dichlormethan gelöst, mit 4.72 g (13.95 mmol) 4,4'-Dimethoxytritylchlorid und 2.4 ml
(13.95 mmol) N-Ethyl-diisopropylamin versetzt und 20 min bei RT gerührt. Das Reaktions
gemisch wurde mit 100 ml Dichlormethan verdünnt, mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung
und 20% Zitronensäure-Lösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum zur Trockene ein
geengt. Chromatographie über Kieselgel (Ethylacetat/Heptan 1 : 1 + 2% Triethylamin) lieferte
7.7 g (87%) 1-(2-O-Benzoyl-4-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribopyranosyl)-5-(2-phtalimido
ethyl)uracil.
DC: Rf 0.53 (Ethylacetat/Heptan 1 : 1 + 2% Triethylamin).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.64 (mc, 2H, CH< ;S 25455 00070 552 001000280000000200012000285912534400040 0002019741715 00004 25336UB<2CH2N); 3.12 (mc, 1 H, H-C(4')); 3.59-3.63 und 3.72-3.92 (m, 5H, H-C(3'), Heq-C(5'), Hax-C(5'), CH2CH2N); 3.81 und 3.82 (s, 6H, CH3O); 4.70 (dd, 1 H, H-C(2')); 6.09 (d, 1 H, H-C(1')); 7.05 (s, 1 H, H-C(6)); 6.84-7.90 (m, 22H, ODmt, OBz, NPht).
DC: Rf 0.53 (Ethylacetat/Heptan 1 : 1 + 2% Triethylamin).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.64 (mc, 2H, CH< ;S 25455 00070 552 001000280000000200012000285912534400040 0002019741715 00004 25336UB<2CH2N); 3.12 (mc, 1 H, H-C(4')); 3.59-3.63 und 3.72-3.92 (m, 5H, H-C(3'), Heq-C(5'), Hax-C(5'), CH2CH2N); 3.81 und 3.82 (s, 6H, CH3O); 4.70 (dd, 1 H, H-C(2')); 6.09 (d, 1 H, H-C(1')); 7.05 (s, 1 H, H-C(6)); 6.84-7.90 (m, 22H, ODmt, OBz, NPht).
3 g (3.63 mmol) 1-(2-O-Benzoyl-4-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribopyranosyl)-5-(2-phtal
imidoethyl)uracil, 1 g (7.26 mmol) 4-Nitrophenol, 0.44 g (3.63 mmol) 4-(Dimethyiamino)-
pyridin und 3.75 ml (21.78 mmol) N-Ethyl-diisopropylamin wurden in 5.6 ml iso-Propanol und
25 ml Pyridin gelöst, auf 65°C erhitzt und 3 Tage bei 65°C gerührt. Die Lösung wurde im
Vakuum zur Trockene eingeengt und der Rückstand in 150 ml Dichlormethan gelöst. Nach
Waschen mit 20% Zitronensäure-Lösung und Natriumhydrogencarbonat-Lösung wurde über
Magnesiumsulfat getrocknet. Chromatographie über Kieselgel (Ethylacetat/Dichlormethan/iso-
Hexan 2 : 1:1) lieferte 2.27 g (76%) 1-(3-O-Benzoyl-4-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-
ribopyranosyl)-5-(2.phtalimidoethyl)uracil.
DC Rf 0.27 (Ethylacetat/iso-Hexan 2 : 1 + 1% Triethylamin).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.39 (mc, 2H, CH2CH2N); 2.53 (mc, 1 H, Heq-C(5')); 3.30 (dd, 1 H, H-C(2')); 3.55 (mc, 1 H, Hax-C(5')); 3.69 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.78 und 3.79 (s, 6H, CH3O); 3.79-3.87 (m, 1 H, H-C(4')); 5-74 (d, 1 H, H-C(1')); 5.77 (mc, 1 H, H-C(3')); 6.92 (s, 1 H, H-C(6)); 6.74-8.20 (m, 22H, ODmt, OBz, NPht).
DC Rf 0.27 (Ethylacetat/iso-Hexan 2 : 1 + 1% Triethylamin).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.39 (mc, 2H, CH2CH2N); 2.53 (mc, 1 H, Heq-C(5')); 3.30 (dd, 1 H, H-C(2')); 3.55 (mc, 1 H, Hax-C(5')); 3.69 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.78 und 3.79 (s, 6H, CH3O); 3.79-3.87 (m, 1 H, H-C(4')); 5-74 (d, 1 H, H-C(1')); 5.77 (mc, 1 H, H-C(3')); 6.92 (s, 1 H, H-C(6)); 6.74-8.20 (m, 22H, ODmt, OBz, NPht).
88 mg (0.11 mmol) 1-(3-O-Benzoyl-4-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribopyranosyl)-5-(2-
phtalimidoethyl)uracil wurden in 5 ml Dichlormethan gelöst, mit 75 µl (0.44 mmol) N-Ethyl
diisopropylamin und 70 µl (0.3 mmol) Allyloxy-chlor-(diisopropylamino)phosphin versetzt und
3 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von weiteren 35 µl (0.15 mmol) Allyloxy
chlor-(diisopropylamino)phosphin zur Vervollständigung der Reaktion wurde noch 1 h bei
Raumtemperatur gerührt und das Reaktionsgemisch im Vakuum eingeengt. Chromatographie
an Kieselgel (Ethylacetat/Heptan: Gradient 1 : 2 auf 1 : 1 auf 2 : 1, jeweils mit 2% Triethylamin)
lieferte 85 mg (76%) 1-{2'-O-[(Allyloxy)(diisopropylamino)phosphino]-3'O-benzoyl-4'-O-
[(4,4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]-β-D-ribo-pyranosyl}-5-(2-phtalimidoethyl)-uracil.
DC: Rf 0.36 (Ethylacetat/Heptan 2 : 1).
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): Ausgewählte charakteristische Lagen: 2.28, 2.52 (2 dd, J = 5.0, 11.0 Hz, 2H, 2 H-5'), 3.79, 3.78 (app. 2s, 12H, OMe), 6.14(1 bs, 1 H, H-3').
31P-NMR(CDCl3): 149.8, 150.6.
DC: Rf 0.36 (Ethylacetat/Heptan 2 : 1).
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): Ausgewählte charakteristische Lagen: 2.28, 2.52 (2 dd, J = 5.0, 11.0 Hz, 2H, 2 H-5'), 3.79, 3.78 (app. 2s, 12H, OMe), 6.14(1 bs, 1 H, H-3').
31P-NMR(CDCl3): 149.8, 150.6.
N-Phthaloyltryptamin wird wie beschrieben aus Phthalsäureanhydrid und Tryptamin erhalten
(Kuehne et al J. Org. Chem. 43, 13, 1978, 2733-2735). Dieses wird mit Boran-THF zum
Indolin reduziert (analog A. Giannis, et al., Angew. Chem. 1989, 101, 220).
Das 3-substituierte Indolin wird zuerst mit Ribose zum Nucleosidtriol und dann mit
Essigsäureanhydrid zum Triacetat umgesetzt. Man oxidiert mit 2,3 -Dichlor-5,6-
dicyanoparachinon und spaltet die Acetate mit Natriummethylat, benzoyliert selektiv in
2'-Position, DM-trityliert selektiv in 4'-Position, und führt die Wanderungsreaktion zum
3'-Benzoat durch. Die Bildung des Phosphoramidits erfolgt wie üblich. Dieser läßt sich ohne
Änderung der Syntheseprotokolle für die automatisierte Oligonucleotidsynthese einsetzen.
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 51.4 g (177 mmol) Phthaloyltryptamin A in 354 ml 1M
Boran-THF-Lösung (2 eq.) gelöst und auf 0°C abgekühlt. Bei 0°C wurde langsam 354 ml
Trifluoressigsäure zugetropft (Vorsicht: Gasentwicklung) und 30 min. nachgerührt
(DC-Kontrolle: EtOAc). Dann wurden 17.3 ml Wasser zugegeben, 10 min gerührt und im Vak.
eingeengt. Der Rückstand wurde in 10%iger NaOH-Lösung/Dichlormethan gelöst, die
organische Phase wurde abgetrennt, über NaSO4 getrocknet, filtriert und im Vak. eingeengt.
Der Rückstand (50.9 g) wurde aus heißem Ethanol (3 l) umkristallisiert. Man erhielt 41.4 g B,
Smp. 161-162°C. Die Mutterlauge wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand erneut aus
Ethanol umkristallisiert. Man erhielt weitere 3.2 g B, Smp. 158-159°C.
Gesamtausbeute: 44.6 g (153 mmol) B. d. s. 86%.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.85-2.00, 2.14-2.28 (2m, 2×1 H, CH 2CH2NPhth), 2.70 (bs, 1 H, NH), 3.24-3.38, 3.66-3.86 (2 m, 5 H, CH2CH 2NPhth, H-2a, H-2b, H-3), 6.62 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 6.66-6.72 (m, 1 H, H-5), 6.99 (app t, J = 7.5 Hz, 1 H, H-6), 7.14 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-4), 7.64-7.74, 7.78-7.86 (2 m, 2×2 H, Phth).
13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): 32.70, 36.10 (2 t C-2 CH2CH2NPhth), 39.62 (d, C-3), 53.04 (t, CH2NPhth), 109.65 (d, C-7), 118.74 (d, C-5), 123.25 (d, Phth), 123.92, 127.72(2 d, C-4, C-6), 131.81 (s, C-3a), 132.14 (s, Phth), 33.99 (d, Phth), 151.26 (s, C-7a), 168.38 (s, C=O). Ber: C: 73.96, H: 5.52, N: 9.58; gef.: C: 73.89, H: 5.57, N: 9.55.
MS (ES⁺: 293 (MH⁺, 100%).
Gesamtausbeute: 44.6 g (153 mmol) B. d. s. 86%.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.85-2.00, 2.14-2.28 (2m, 2×1 H, CH 2CH2NPhth), 2.70 (bs, 1 H, NH), 3.24-3.38, 3.66-3.86 (2 m, 5 H, CH2CH 2NPhth, H-2a, H-2b, H-3), 6.62 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 6.66-6.72 (m, 1 H, H-5), 6.99 (app t, J = 7.5 Hz, 1 H, H-6), 7.14 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-4), 7.64-7.74, 7.78-7.86 (2 m, 2×2 H, Phth).
13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): 32.70, 36.10 (2 t C-2 CH2CH2NPhth), 39.62 (d, C-3), 53.04 (t, CH2NPhth), 109.65 (d, C-7), 118.74 (d, C-5), 123.25 (d, Phth), 123.92, 127.72(2 d, C-4, C-6), 131.81 (s, C-3a), 132.14 (s, Phth), 33.99 (d, Phth), 151.26 (s, C-7a), 168.38 (s, C=O). Ber: C: 73.96, H: 5.52, N: 9.58; gef.: C: 73.89, H: 5.57, N: 9.55.
MS (ES⁺: 293 (MH⁺, 100%).
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 45.2 g (155 mmol) A und 23.2 g (155 mmol; 1.0 eq.)
D-Ribose in 750 ml trockenem Ethanol suspendiert und 4 h zum Rückfluß erhitzt (DC-Kontrolle:
CH2Cl2/MeOH 10 : 1). Nach Abkühlen auf RT wurde im Vak. eingeengt. Der Rückstand wurde
in 300 ml Pyridin gelöst und unter Eiskühlung mit 155 ml Essigsäureanhydrid versetzt. Nach
15 min. wurde das Eisbad entfernt und 18 h bei RT gerührt (DC-Kontrolle: EtOAc/iso-Hexan
1 : 1). Diese Lösung wurde im Vakuum eingeengt und 3 mal mit je 300 ml Toluol coevaporiert.
Das erhaltene Öl wird in 900 ml Dichlormethan gelöst und unter Eiskühlung mit 38.8 g (171
mmol; 1.1 eq.) 2,3-Dichlor-5,6-dicyanoparachinon versetzt. Nach 15 min. wurde das Eisbad
entfernt und 1.5 h bei RT nachgerührt (DC-Kontrolle: EtOAc/iso-Hexan 1 : 1). Der ausgefallene
Niederschlag wurde abgesaugt und mit Dichlormethan gewaschen und verworfen. Das Filtrat
wurde mit 600 ml ges. NaHCO3-Lösung gewaschen. Der dabei ausgefallene Niederschlag
wurde erneut abgesaugt und mit Dichlormethan gewaschen und verworfen. Die vereinigten
organischen Extrakte wurden über NaSO4 getrocknet und im Vak. eingeengt. Der Rückstand
(90.9 g) wurde durch Flashchromatographie an Kieselgel 60 gereinigt (10×25 cm; EtOAc/iso-
Hexan 2 : 3).
Man erhielt: 21.5 g reines B und 46.83 g Mischfraktionen, die nach erneuter Chromatographie
weitere 20.4 g reines B lieferten.
Gesamtausbeute: 41.9 g (76 mmol) B, d. s. 49%.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.64, 1.98, 2.19 (3 s, 3×3 H, Ac), 3.06 (t, J = 8.0 Hz, 2 H, CH 2CH2NPhth), 3.81-4.00 (m, 4 H, H-5'ax, H-5'eq, CH 2NPhth), 5.13 (ddd, J = 2.5, 6.0, 10.5 Hz, 1 H, H-4'), 5.36 (dd, J = 3.5, 9.5 Hz, 1 H, H-2'), 5.71 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 5.74 (app t, J = 3.0 Hz, 1 H, H-3'), 7.02 (s, 1 H. H-2), 7.04-7.10, 7.13-7.19 (2 m, 2×1 H, H-5, H-6), 7.33 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 7.58-7.66, 7.72-7.80 (2 in, 5 H, Phth, H-4).
13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): 20.23, 20 65, 20.87(3 q, Ac), 24.41, 38.28 (2 t, CH2CH2), 63.53 (t, C-51), 66.24, 68.00, 68.64 (3 d, C-2', C-3', C-4'), 80.33 (d, C-1'), 109.79 (d, C-7), 113.95 (s, C-3), 119.33, 120.39, 122.04, 122.47 (4 d, C-4, C-5, C-6, C-7), 123.18 (d, Phth), 128.70, 132 17 (2 s, C-3a, Phth), 133.87 (d, Phth), 136.78 (s, C-7a), 168.24, 168 77, 169.44, 169.87 (4 s, C=O).
Ber: C: 63.50, H: 5.15, N: 5.11, gef.: C: 63.48, H: 5.16, N: 5.05.
MS (ES⁺): 566 (M+NH4⁺, 82%), 549 (MH⁺, 74%), 114 (100%).
Gesamtausbeute: 41.9 g (76 mmol) B, d. s. 49%.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.64, 1.98, 2.19 (3 s, 3×3 H, Ac), 3.06 (t, J = 8.0 Hz, 2 H, CH 2CH2NPhth), 3.81-4.00 (m, 4 H, H-5'ax, H-5'eq, CH 2NPhth), 5.13 (ddd, J = 2.5, 6.0, 10.5 Hz, 1 H, H-4'), 5.36 (dd, J = 3.5, 9.5 Hz, 1 H, H-2'), 5.71 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 5.74 (app t, J = 3.0 Hz, 1 H, H-3'), 7.02 (s, 1 H. H-2), 7.04-7.10, 7.13-7.19 (2 m, 2×1 H, H-5, H-6), 7.33 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 7.58-7.66, 7.72-7.80 (2 in, 5 H, Phth, H-4).
13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): 20.23, 20 65, 20.87(3 q, Ac), 24.41, 38.28 (2 t, CH2CH2), 63.53 (t, C-51), 66.24, 68.00, 68.64 (3 d, C-2', C-3', C-4'), 80.33 (d, C-1'), 109.79 (d, C-7), 113.95 (s, C-3), 119.33, 120.39, 122.04, 122.47 (4 d, C-4, C-5, C-6, C-7), 123.18 (d, Phth), 128.70, 132 17 (2 s, C-3a, Phth), 133.87 (d, Phth), 136.78 (s, C-7a), 168.24, 168 77, 169.44, 169.87 (4 s, C=O).
Ber: C: 63.50, H: 5.15, N: 5.11, gef.: C: 63.48, H: 5.16, N: 5.05.
MS (ES⁺): 566 (M+NH4⁺, 82%), 549 (MH⁺, 74%), 114 (100%).
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 44.1 g (80 mmol) A in 400 ml wasserfreiem Methanol
gelöst. Unter Eiskühlung versetzte man mit 4.0 ml 30%iger Natriummethylatlösung und rührte
dann 18 h bei RT. Der ausgefallene Niederschlag wurde abgesaugt und mit kaltem Ethanol
gewaschen. Das Filtrat wurde im Vak. eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan
aufgenommen. Diese Lösung wurde mit ges. NaHCO3-Lösung gewaschen, über NaSO4
getrocknet und im Vak. eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde zusammen mit dem aus der
Reaktionslösung ausgefallenen Niederschlag aus heißem Ethanol umkristallisiert. Man erhielt
22.6 g B, Smp. 196°-198°C. Die Mutterlauge wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand
erneut aus Ethanol umkristallisiert. Man erhielt weitere 9.2 g B, Smp. 188-194°C.
Gesamtausbeute: 25.8 g B, d. s. 76%.
1H-NMR (MeOD, 300 MHz): 3.09 (app. t, J = 7.0 Hz, 2 H, CH 2CH2NPhth), 3.64-3.98 (m, 5 H, H-4', H-5'ax, H-5'eq, CH 2NPhth), 4.05 (dd, J = 3.5, 9.5 Hz, 1 H, H-2'), 4.22 (app t, J = 3.0 Hz, 1 H, H-3'), 5.65 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 6.95-7.05, 7.09-7. 16 (2 in, 2×1 H, H-5, H-6), 7.25 (s, 1 H, H-2), 7.44 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 7.60 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-4), 7.74-7.84 (m, 4 H, Phth).
13C-NMR (d6-DMSO, 75 MHz) 23.87, 37.79 (2 t, CH 2CH 2NPhth), 64.82 (t, C-5'), 66.74 (d, C-4'), 68.41 (d, C-2'), 71.42 (d, C-2'), 81.37 (d, C-1'), 110-42 (d, C-7), 111.05 (s, C-3), 18.17, 119.21, 121.36, 122.92, 123.80 (5 d, C-2, C-4, C-S, C-6, NPhth), 127.86, 131.59 (2 s, C-3a, Phth), 134.27 (d, Phth), 136.62 (s, C-7a), 167.72 (s, C=O).
MS (ES⁻): 457 (M+OH⁻ +H2O, 49%), 439 (M+OH⁻, 100%), 421 (M-H⁺, 28%)
Gesamtausbeute: 25.8 g B, d. s. 76%.
1H-NMR (MeOD, 300 MHz): 3.09 (app. t, J = 7.0 Hz, 2 H, CH 2CH2NPhth), 3.64-3.98 (m, 5 H, H-4', H-5'ax, H-5'eq, CH 2NPhth), 4.05 (dd, J = 3.5, 9.5 Hz, 1 H, H-2'), 4.22 (app t, J = 3.0 Hz, 1 H, H-3'), 5.65 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 6.95-7.05, 7.09-7. 16 (2 in, 2×1 H, H-5, H-6), 7.25 (s, 1 H, H-2), 7.44 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 7.60 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-4), 7.74-7.84 (m, 4 H, Phth).
13C-NMR (d6-DMSO, 75 MHz) 23.87, 37.79 (2 t, CH 2CH 2NPhth), 64.82 (t, C-5'), 66.74 (d, C-4'), 68.41 (d, C-2'), 71.42 (d, C-2'), 81.37 (d, C-1'), 110-42 (d, C-7), 111.05 (s, C-3), 18.17, 119.21, 121.36, 122.92, 123.80 (5 d, C-2, C-4, C-S, C-6, NPhth), 127.86, 131.59 (2 s, C-3a, Phth), 134.27 (d, Phth), 136.62 (s, C-7a), 167.72 (s, C=O).
MS (ES⁻): 457 (M+OH⁻ +H2O, 49%), 439 (M+OH⁻, 100%), 421 (M-H⁺, 28%)
Unter Stickstoffatmosphäre wurde 10.6 g (25 mmol) A in 250 ml trockenem Dichlormethan
aufgenommen. Man versetzt mit 305 mg DMAP (2.5 mmol) und 20 ml Pyridin. Es wurde
erwärmt bis alles in Lösung war und anschließend auf -78°C abgekühlt. Jetzt wurde 3.35 ml
Benzoylchlorid (28.8 mmol) gelößt in 8 ml Dichlormethan innerhalb von 15 min zugetropft.
DC-Kontrolle (EtOAc/Hexan 3 : 1) nach weiteren 30 min zeigte vollständige Reaktion an. Nach
45 min wurde die kalte Lösung über einen Faltenfilter direkt auf 200 ml ges. NH4Cl-Lösung
gegeben und der Filterrückstand wurde mit Dichlormethan gewaschen. Die organische Phase
wurde einmal mit Wasser gewaschen, über MgSO4 getrochnet und eingeengt. Der Rückstand
wurde 2 mal mit Toluol coevaporiert und durch Flashchromatographie an 10×20 cm Kieselgel
mit EtOAc/Hexan 3 : 1 gereinigt. Man erhiehlt 8.1 g B (64%).
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 2.45, 2.70 (2 bs, 2×1 H, OH), 3.04 (t, J = 8.0 Hz, 2 H, CH 2CH2NPhth), 3.80-4.20 (m, 5 H, H-4', H-5'ax, H-5'eq, CH 2NPhth), 4.63 (bs, 1 H, H-3'), 5.46 (dd, J = 3.5, 9.5 Hz, 1 H, H-2'), 6.03 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 7.08-7.31 (m, 5 H, H-2, H-5, H-6, Bz-m-H), 7.41-7.48 (m, 1 H, H-Bz-p-H), 7.50 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 7.64-7.79 (m, 7 H, Phth, H-4, Bz-o-H).
13C-NMR (d6-DMSO, 75 MHz): 24.4(), 38.22 (2 t, CH2 CH2NPhth), 65.95 (t, C-S'), 66.65 (d, C-4'), 69.55 (d, C-3'), 71.87 (d, C-2'), 79.57 (d, C-1'), 109.96 (d, C-7), 113.70 (s, C-3), 119.21, 120.21, 122.11, 122.41, 123.14 (5 d, C-2, C-4, C-5, C-6, NPhth), 128.28 (d, Bz), 128.58, 128.59(2 s, C-3a, Bz), 129.62 (d, Phth), 132.05 (s, Phth), 133.81 (Bz), 136.97 (s, C 7a), 165. 12, 168.29 (2 s, C=O).
MS (ES⁻): 525 (M-H⁺, 12%), 421 (M-PhCO⁺, 23%), 107 (100%).
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 2.45, 2.70 (2 bs, 2×1 H, OH), 3.04 (t, J = 8.0 Hz, 2 H, CH 2CH2NPhth), 3.80-4.20 (m, 5 H, H-4', H-5'ax, H-5'eq, CH 2NPhth), 4.63 (bs, 1 H, H-3'), 5.46 (dd, J = 3.5, 9.5 Hz, 1 H, H-2'), 6.03 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 7.08-7.31 (m, 5 H, H-2, H-5, H-6, Bz-m-H), 7.41-7.48 (m, 1 H, H-Bz-p-H), 7.50 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 7.64-7.79 (m, 7 H, Phth, H-4, Bz-o-H).
13C-NMR (d6-DMSO, 75 MHz): 24.4(), 38.22 (2 t, CH2 CH2NPhth), 65.95 (t, C-S'), 66.65 (d, C-4'), 69.55 (d, C-3'), 71.87 (d, C-2'), 79.57 (d, C-1'), 109.96 (d, C-7), 113.70 (s, C-3), 119.21, 120.21, 122.11, 122.41, 123.14 (5 d, C-2, C-4, C-5, C-6, NPhth), 128.28 (d, Bz), 128.58, 128.59(2 s, C-3a, Bz), 129.62 (d, Phth), 132.05 (s, Phth), 133.81 (Bz), 136.97 (s, C 7a), 165. 12, 168.29 (2 s, C=O).
MS (ES⁻): 525 (M-H⁺, 12%), 421 (M-PhCO⁺, 23%), 107 (100%).
Unter Stickstoffatmosphäre wurde 8.9 g (16.9 mmol) A in 135 ml trockenem Dichlormethan
suspendiert. Man versetzte mit 206 mg DMAP (1.68 mmol), 5.8 ml N-Ethyldiisopropylamin
(33.7 mmol) und ca. 12 ml Pyridin (bis zur vollständigen Lösung). Jetzt wurde mit 34 g
Molsieb 4 versetzt und 30 min gerührt. Nach Abkühlen auf 0°C wurde mit 11.4 g DMTCl
(33.7 mmol) versetzt und nach Entfernen des Kühlbads 75 min gerührt. Dann wurden
nochmals 1.94 g (0.34 eq) und nach weiteren 40 min 1.14 g (0.2 eq) und nach weiteren 65 min
1.14 g DMTCl (0.2 eq) zugegeben. Nach 4.25 h war die Reaktion beendet. Man versetzte
dann mit 25.3 ml n-Propanol (20 eq), rührte noch 30 min nach und engte dann vorsichtig ein
(Schaumbildung). Der Rückstand wurde in 100 ml Pyridin gelößt. Man versetzte mit 1.85 g
DMAP (15.1 mmol; 0.9 eq), 13.05 ml N-Ethyldiisopropylamin (101 mmol; 6.0 eq), 71 ml
n-Propanol (940 mmol; 56 eq) und 3.74 g p-Nitrophenol (26.9 mmol; 1.6 eq). Diese Mischung
wurde unter Stickstoff 96 h bei 75-80°C gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde
die Mischung über Celite filtiert und eingeengt. Der Rückstand wurde durch
Flashchromatographie an 9×17 cm Kieselgel mit Toluol/Diethylether/Triethylamin 90 : 10 : 1
gereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen (9.25 g) wurden zunächst aus EtOAc
umkristallisiert und anschließend aus Toluol/Methanol umgefällt. Man erhielt 5.86 g B (42%).
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 2.64 (bs, 1 H, OH), 2.68 (dd, J = 5.0, 11.5 Hz, 1 H, H-5'eq), 2.94 (dd, J = 7.5, 16.0 Hz, 1 H, CH 2CH2NPhth), 3.03 (dd, J = 8.0, 16.0 Hz, 1 H, CH 2CH2NPhth), 3.67-3.74 (m, 1 H, H-5'ax), 3.69, 3.70 (2 s, 2×3 H, OMe), 3.85 (t, J = 7.5 Hz, 2 H, CH2CH 2NPhth), 3.94 (ddd, J = 3.0, 5.0, 10.5 Hz, 1 H, H-4'), 4.03 (dd, J = 3.5, 9.0 Hz, 1 H, H-2'), 5.51 (d, J = 90 Hz, 1 H, H-1'), 586 (bs, 1 H, H-3'), 6.68-7.66 (m, 25 H), 8.19-8.30 (m, 2H).
13C-NMR (CDCl3, 75 MHz). 24.16, 38.80 (2 t CH2 CH2NPhth), 55.25, 55.26 (2 q, Ome), 65.58 (t, C-5'), 68.29, 69.19, 73,83 (3 d, C-2', C-3', C-4'), 83.03 (d, C-1'), 87.31 (CAr3)110.03 (d, C-7), 113.37, 113.47(2 d), 113.53 (s, C-3), 118.95, 120.20, 122.28, 122.31, 123.10, 127.07, 128.02, 128.08, 128.68 (9 d), 128.74 (s), 130.02, 130.19, 130.22 (3 d), 130.37, 131.95(2 s), 133.40, 133.83 (2 d), 135.98, 136.14, 136.56, 145.12, 158.82, 166.76, 168.52 (7 s, C-7a, 2 COMe, 2 C=O).
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 2.64 (bs, 1 H, OH), 2.68 (dd, J = 5.0, 11.5 Hz, 1 H, H-5'eq), 2.94 (dd, J = 7.5, 16.0 Hz, 1 H, CH 2CH2NPhth), 3.03 (dd, J = 8.0, 16.0 Hz, 1 H, CH 2CH2NPhth), 3.67-3.74 (m, 1 H, H-5'ax), 3.69, 3.70 (2 s, 2×3 H, OMe), 3.85 (t, J = 7.5 Hz, 2 H, CH2CH 2NPhth), 3.94 (ddd, J = 3.0, 5.0, 10.5 Hz, 1 H, H-4'), 4.03 (dd, J = 3.5, 9.0 Hz, 1 H, H-2'), 5.51 (d, J = 90 Hz, 1 H, H-1'), 586 (bs, 1 H, H-3'), 6.68-7.66 (m, 25 H), 8.19-8.30 (m, 2H).
13C-NMR (CDCl3, 75 MHz). 24.16, 38.80 (2 t CH2 CH2NPhth), 55.25, 55.26 (2 q, Ome), 65.58 (t, C-5'), 68.29, 69.19, 73,83 (3 d, C-2', C-3', C-4'), 83.03 (d, C-1'), 87.31 (CAr3)110.03 (d, C-7), 113.37, 113.47(2 d), 113.53 (s, C-3), 118.95, 120.20, 122.28, 122.31, 123.10, 127.07, 128.02, 128.08, 128.68 (9 d), 128.74 (s), 130.02, 130.19, 130.22 (3 d), 130.37, 131.95(2 s), 133.40, 133.83 (2 d), 135.98, 136.14, 136.56, 145.12, 158.82, 166.76, 168.52 (7 s, C-7a, 2 COMe, 2 C=O).
Unter Argonatmosphäre wurde 1658 mg Alkohol A (2.0 mmol) in 10 ml trockenem
Dichlormethan gelößt. Man versetzte mit 1.03 ml N-Ethyldiisopropylamin (6.0 mmol) und 0.63
ml Phosphorigsäuremonoallylesterdiisopropylamidchlorid (2.8 mmol) und rührte 1 h bei
Raumtemperatur. Dann wurde das überschüssige Phosphorylierungsreagenz durch Zugabe von
61 µl (0.8 mmol) Isopropanol zerstört. Nach 10 min wurde im Vakuum eingeengt und der
Rückstand durch Flashchromatographie an 3.3×21 cm Kieselgel mit Hexan/EtOAc/NEt3
(75 : 25 : 1) gereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen wurden eingeengt, in CCl4 aufgenommen
und wieder eingeengt. Man erhielt 2.04 g eines fast farblosen Schaums (quant.), der so direkt
zur Oligomerisierung verwendet werden kann und bei -20°C mehrere Wochen haltbar ist.
DC auf Kieselgel (EtOAc/Hexan/ NEt3 33 : 66 : 1): 0.41.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): Ausgewählte charakteristische Lagen. 2.42, 2.53 (2 dd, J 5.0, 11.0 Hz, 2 H, 2 H-5'eq), 3.76, 3.77, 3.78, 3.79 (4 s, 4×3 H, OMe), 5.70, 5.73 (2 d, J = 9.0 Hz, 2 H, 2 H-1'), 6.16, 6.29 (2 bs, 2 H, 2 H-3').
31P-NMR(CDCl3): 150.6, 151.0.
DC auf Kieselgel (EtOAc/Hexan/ NEt3 33 : 66 : 1): 0.41.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): Ausgewählte charakteristische Lagen. 2.42, 2.53 (2 dd, J 5.0, 11.0 Hz, 2 H, 2 H-5'eq), 3.76, 3.77, 3.78, 3.79 (4 s, 4×3 H, OMe), 5.70, 5.73 (2 d, J = 9.0 Hz, 2 H, 2 H-1'), 6.16, 6.29 (2 bs, 2 H, 2 H-3').
31P-NMR(CDCl3): 150.6, 151.0.
Die Synthese ist im Schema 7 abgebildet und wird im folgenden im Detail beschrieben.
6-Amino-2(S)-hydroxyhexansäure (1) wurde nach literaturbekannter Weise durch
Diazotierung und anschließende Hydrolyse aus L-Lysin hergestellt (K.-I. Aketa, Chem.
Pharm Bull. 1976, 24, 621).
3.4 g LiBH4 (156 mmol, 4 eq) werden unter Argon in 100 ml abs. THF gelöst (exotherm!).
Nach Abkühlen auf ca. 30°C werden 39.6 ml TMSCl (312 mmol, 8 eq) langsam zugetropft
(Gasentwicklung!), wobei sich ein Niederschlag bildet. Anschließend werden im Argon-
Gegenstrom 5.74 g 6-Amino-2(S)-hydroxyhexansäure (1) (39 mmol) portionsweise zugegeben
und es wird auf 65°C erwärmt, bis das DC (Kieselgel; i-PrOH/konz. NH4OH/Wasser 7 : 2 : 1;
Anfärben mit Ninhydrin) kein Edukt mehr zeigt (ca. 3 h). Unter Eiskühlung wird vorsichtig mit
120 ml Methanol versetzt (starke Gasentwicklung!). Das Lösungsmittel wird im Vakuum
eingeengt, der Rückstand wird 3 mal mit je 200 ml Methanol coevaporiert und anschließend in
100 ml abs. DMF gelöst. Nach Zugabe von 16 ml Ethyidiisopropylamin (93.6 mmol, 2.4 eq)
wird die Mischung auf 0°C gekühlt und portionsweise mit 12.1 g FmocCl (46.8 mmol, 1.2 eq)
versetzt. Nach 15 Minuten wird das Kühlbad entfernt und bei Raumtemperatur gerührt bis das
Edukt verbraucht ist (ca. 3 h; DC-Kontrolle: Kieselgel; CHCl3/MeOH/HOAc/Wasser
60 : 30 : 3 : 5). Die Reaktionslösung wird auf 600 ml ges. NaHCO3-Lösung gegeben. Der
Niederschlag wird abfiltriert, mit 20() ml Wasser gewaschen und bei 50°C am HV getrocknet
bis zur Gewichtskonstanz (ca. 6 h). Man erhält 13.9 g eines farblosen Feststoffs, der aus
Ethylacetat (40 ml)/n-Hexan (35 ml) umkristallisiert wird. Ausbeute: 9.05 g (65%).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 7.68, 7.51 (2 d, J = 8.0 Hz, je 2 H, Ar-H), 7.32 (t, J = 8.0 Hz, 2 H, Ar-H), 7.23 (dt, J = 1.6, 8.0 Hz, 2H, Ar-H), 4.92 (bs, 1 H. NH), 4.32 (d, J = 7.0 Hz, 2 H, OCOCH2), 4.13 (bt, J = 7.0 Hz, 1 H, OCOCH2CH), 3.64-3.58 (m, 1 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.54 (dd, J=3.2, 11.0 Hz, 1 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.35 (dd,J = 7.4, 11.0 Hz, 1 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.16-3.06 (m, 2 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.0-2.0 (bs, 2 H, OH), 1.52-1.18 (m, 6 H, H-3, H-3', H-4, H-4', H-5, H-5').
2-(S)-N-Fmoc-O1-DMT-6-amino-1,2-hexandiol (3) wurde nach WO 89/02439 DM-trityliert.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 7.68, 7.51 (2 d, J = 8.0 Hz, je 2 H, Ar-H), 7.32 (t, J = 8.0 Hz, 2 H, Ar-H), 7.23 (dt, J = 1.6, 8.0 Hz, 2H, Ar-H), 4.92 (bs, 1 H. NH), 4.32 (d, J = 7.0 Hz, 2 H, OCOCH2), 4.13 (bt, J = 7.0 Hz, 1 H, OCOCH2CH), 3.64-3.58 (m, 1 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.54 (dd, J=3.2, 11.0 Hz, 1 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.35 (dd,J = 7.4, 11.0 Hz, 1 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.16-3.06 (m, 2 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.0-2.0 (bs, 2 H, OH), 1.52-1.18 (m, 6 H, H-3, H-3', H-4, H-4', H-5, H-5').
2-(S)-N-Fmoc-O1-DMT-6-amino-1,2-hexandiol (3) wurde nach WO 89/02439 DM-trityliert.
Zu einer Lösung von 670 mg des Alkohols (3) (1.02 mmol) in 10 ml abs. Dichlormethan
werden unter Argon 0.51 ml Ethyldiisopropylamin (3.0 minol, 3 eq) und 0.33 ml Chlor-N,N-
diisopropylaminoallyloxyphosphin ( 1.5 mmol, 1.5 eq) gegeben. Man rührt 2 h bei
Raumtemperatur, zieht das Lösungsmittel im Vakuum ab und reinigt den erhaltenen Rückstand
durch Flashchromatographie an 3.2×16 cm Kieselgel (EtOAc/iso-Hexan/NEt3 20 : 80 : 1). Man
erhält 839 mg (97%) eines leicht gelblichen Öls.
DC: Kieselgel; EtOAc/iso-Hexan/NEt3 50 : 50 : 1; UV; Rf = 0.77.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 7.70-6.68 (m, 21 H, Ar-H), 4.92-4.62 (m, 1 H. NH), 4.31 (d, J = 7.0 Hz, 2 H, OCOCH2), 4.13 (t, J = 7.0 Hz, 1 H, OCOCH2CH), 3.98-3.40 (m, 5 H), 3.77 (2 s, je 3 H, OMe), 3.16-2.86 (m, 4 H), 2.58 (t, J 7.0 Hz, 1 H, CHCN), 2.38 (t, 1 H, CHCN), 1.80-1.20 (m, 6 H), 1.20, 1,18, 1.17, 1.16, 1.15, 1.13, 1.08, 1.06 (8s, 12 H,NMe).
31P-NMR (300 MHz, CDCl3): 149.5, 149.0 (2 s).
DC: Kieselgel; EtOAc/iso-Hexan/NEt3 50 : 50 : 1; UV; Rf = 0.77.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 7.70-6.68 (m, 21 H, Ar-H), 4.92-4.62 (m, 1 H. NH), 4.31 (d, J = 7.0 Hz, 2 H, OCOCH2), 4.13 (t, J = 7.0 Hz, 1 H, OCOCH2CH), 3.98-3.40 (m, 5 H), 3.77 (2 s, je 3 H, OMe), 3.16-2.86 (m, 4 H), 2.58 (t, J 7.0 Hz, 1 H, CHCN), 2.38 (t, 1 H, CHCN), 1.80-1.20 (m, 6 H), 1.20, 1,18, 1.17, 1.16, 1.15, 1.13, 1.08, 1.06 (8s, 12 H,NMe).
31P-NMR (300 MHz, CDCl3): 149.5, 149.0 (2 s).
108 mg Indollinker-Phosphoramidit und 244 mg A-Phosphoramidit werden in
Synthesizergläschen eingewogen und für 3 h im Exsikkator über KOH zusammen mit dem mit
28,1 mg CPG-Träger, beladen mit A-Baustein, gefüllten Säulchen am HV belassen. Die
Phosphoramidite werden in 1 ml (Indollinker) bzw. 2,5 ml (A-Phosphoramidit) Acetonitril
gelöst und einige Kügelchen von dem Molsieb zugesetzt und über KOH geschlossen im
Exsikkator belassen.
200 mg Jod werden unter starkem Rühren in 50 ml Acetonitril gelöst. Nachdem alles gelöst ist
(Sichtkontrolle) werden 23 ml Wasser und 4,6 ml sym-Collidin zugegeben und die Lösung
einmal gut durchmischt. Zum Detritylieren wird eine 6%ige Lösung von Dichloressigsäure in
Dichlormethan eingesetzt. Das Cappingreagenz (Acetanhydrid + Base) wird wie für
Oligonucleotidsynthese üblich gekauft und verwendet.
Benzimidazoliumtriflat wird aus heißem Acetonitril umkristallisiert und getrocknet. Mit den
fast farblosen Kristallen wird eine 0,1 M Lösung in wasserfreiem Acetonitril als
Kupplungsreagenz hergestellt. Während der Synthese bleibt diese Lösung immer klar und es
kommt zu keinen Verstopfungen der Synthesizerschläuche.
Abgeänderter DNA-Kupplungscyclus am Eppendorf Ecosyn 300+ (DMT-on):
Detritylierung | 7 Minuten |
Kupplung | 1 Stunde |
Capping | 1,5 Minuten |
Oxidation | 1 Minute |
20 mg Tetrakis(triphenylphosphin)palladium wird in 1,5 ml Dichlormethan gelöst, 20 mg
Diethylammoniumhydrogencarbonat, 20 mg Triphenylphosphin und der das Oligonucleotid
tragende Glasträger zugesetzt, dicht verschlossen (Parafilm) und das Gläschen 5 h bei RT.
bewegt. Dann wird der Glasträger über eine Analysennutsche abgesaugt, und mit
Dichlormethan, mit Aceton und mit Wasser gewaschen.
Der Träger wird mit wäßriger 0,1molarer Natriumdiethyldithiocarbamatlösung aufgeschlämmt
und 45 min bei RT. belassen. Man saugt ab, wäscht mit Wasser, Aceton, Ethanol und
Dichlormethan. Der Träger wird in 1,5 ml 24%iger Hydrazinhydratlösung suspendiert, 24-36
h lang bei 4°C gerüttelt und mit 0,1molarem Triethylammoniumhydrogencarbonatpuffer
(TEAB-Puffer) auf 7 ml verdünnt. Über eine Waters Sep-Pak Cartridge wurde hydrazinfrei
gewaschen. Es wird mit 5 ml einer 80%igen Ameisensäurelösung versetzt und nach 30 min zur
Trockene einrotiert. Der Rückstand wird in 10 ml Wasser aufgenommen, mit Dichlormethan
extrahiert, die wäßrige Phase eingeengt und nun HPL-chromatographiert (tR 33 = min,
Gradient von Acetonitril in 0,1M Triethylammoniumacetat-Puffer). Übliche Entsalzung
(Waters Sep-Pak Cartridge) liefert das Oligonucleotid.
Ausbeute: 17,6 OD.
Substanzidentität nachgewiesen durch ESI-Massenspektroskopie:
M(ber) = 3082 D, (M+2H)2+(gef) = 1541,9 D.
Ausbeute: 17,6 OD.
Substanzidentität nachgewiesen durch ESI-Massenspektroskopie:
M(ber) = 3082 D, (M+2H)2+(gef) = 1541,9 D.
Zuerst wird, wie in Beispiel 2 beschrieben, ein p-RNA-Oligomeres der Sequenz A8, d. h. ein
Octamer, auf dem Eppendorf Ecosyn D 300+ hergestellt und dann die folgenden Reagenzien
ausgetauscht: 6%ige Dichloressigsäure gegen 2%ige Trichloressigsäure, Jod in Collidin gegen
Jod in Pyridin, Benzimidazoliumtriflatlösung gegen Tetrazollösung. Nach Änderung des
Syntheseprogramms wird ein DNA-Oligomeres der Sequenz GATTC nach bekannten
Methoden (M. J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, UK 1984) weiter
synthetisiert. Die Deallylierung, Hydrazinolyse, HPL-Chromatographie und Entsalzung erfolgt
wie für das p-RNA-Oligomere beschrieben (siehe oben) und liefert das gewünschte Konjugat.
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wird ein p-RNA-Oligomeres mit der Sequenz 4'-Indollinker-A8-2'
hergestellt, aufgereinigt, und jodacetyliert. Ein DNA-Oligomeres der Sequenz
GATTC-Thiol-Linker wird nach bekannten Methoden (M. J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL
Press, Oxford, UK 1984) synthetisiert und aufgereinigt (3'-Thiol-Linker von Glen Research:
Nr. 20-2933). Beim Stehenlassen der beiden Fragmente (T. Zhu et al., Bioconjug. Chem. 1994,
5,312) in gepufferter Lösung entsteht das Konjugat, das abschließend über HPLC aufgereinigt
wird.
Claims (32)
1. Pentopyranosyl-Nucleosid der Formel (I),
worin
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4, oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R11 gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
worin R12, R13, R14 und R15 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, OR7, wobei R1 die oben genannte Bedeutung hat, oder CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, bedeuten und
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16) oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und
Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyloxycarbonylgruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- oder 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT-)gruppe,
oder der Formel (II)
worin R1' gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O, CnH2n+1 oder OCnH2n-1, oder (CnH2n)NR10' R11', wobei R10', R11', unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben,
ausgenommen 4'-DMT-3'-benzoyl-ribopyranosyl-N-benzoyl-adenosin, N6,N6-Dibenzoyl- 9-(2'-O-benzoyl-β-D-ribo-pyranosyl)-adenosin, Ribopyranosyl-N-benzoyl-adenosin, 4'-DMT-3'-benzoyl-ribopyranosyl-urazil und Ribopyranosyl-urazil.
worin
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4, oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R11 gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
worin R12, R13, R14 und R15 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, OR7, wobei R1 die oben genannte Bedeutung hat, oder CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, bedeuten und
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16) oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und
Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyloxycarbonylgruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- oder 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT-)gruppe,
oder der Formel (II)
worin R1' gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O, CnH2n+1 oder OCnH2n-1, oder (CnH2n)NR10' R11', wobei R10', R11', unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben,
ausgenommen 4'-DMT-3'-benzoyl-ribopyranosyl-N-benzoyl-adenosin, N6,N6-Dibenzoyl- 9-(2'-O-benzoyl-β-D-ribo-pyranosyl)-adenosin, Ribopyranosyl-N-benzoyl-adenosin, 4'-DMT-3'-benzoyl-ribopyranosyl-urazil und Ribopyranosyl-urazil.
2. Pentopyranosyl-Nucleosid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
Pentopyranosyl-Nucleosid ein Ribo-, Arabino-, Lyxo- und/oder Xylo-pyranosyl-Nucleosid
ist, vorzugsweise ein Ribopyranosyl-Nucleosid.
3. Pentopyranosyl-Nucleosid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß der Pentopyranosyl-Teil D- oder L-konfiguriert ist.
4. Pentopyranosyl-Nucleosid nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß
als Pentopyranosyl-Nucleosid ein Pentopyranosyl-purin, -2,6-diaminopurin, -6-purinthiol,
-pyridin, -pyrimidin, -adenosin, -guanosin, -isoguanosin, -6-thioguanosin, -xanthin,
-hypoxanthin, -thymidin, -cytosin, -isocytosin, -indol, -tryptamin, -N-phthaloyltryptamin,
-uracil, -coffein, -theobromin, -theophyllin, -benzotriazol oder -acridin, eingesetzt wird.
5. Pentopyranosyl-Nucleosid nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß
R2, R3, R4, R2', R3' und/oder R4' ein 2-Phthalimidoethyl- oder Allyloxy-Rest oder ein Rest
der Formel -N[C(O)R9]2 bedeutet.
6. Pentopyranosyl-Nucleosid nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß
das Pentopyranosyl-Nucleosid ein 4'-DMT-3'-benzoyl-Pentopyranosyl-Nucleosid,
vorzugsweise ein 4'-DMT-3'-benzoyl-ribopyranosyl-Nucleosid, ein 1-{4'-O-[4,4'-Di
methoxytriphenyl)-methyl]-β-ribopyranosyl]}-Nucleosid, ein Ribopyranosyl-N,N'-di
benzoyl-adenosin oder ein Ribopyranosyl-N,N'-dibenzoyl-guanosin ist.
7. Verfahren zur Herstellung eine Pentopyranosyl-Nucleosids der Formel (I)
worin
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4, oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R1- gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
worin R12, R13, R14 und R15 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, OR7, wobei R7 die oben genannte Bedeutung hat, oder CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, bedeuten und
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16)- oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und
Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyoxycarbonyl-Gruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- oder 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT-)Gruppe,
oder der Formel (II)
worin R1, gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O CnH2n+1 oder CnH2n-1, oder (CnH2n)NR10'R11', wobei R10', R11', unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben,
dadurch gekennzeichnet, daß ausgehend von dem ungeschützten Pentopyranosid
worin
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4, oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R1- gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
worin R12, R13, R14 und R15 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, OR7, wobei R7 die oben genannte Bedeutung hat, oder CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, bedeuten und
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16)- oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und
Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyoxycarbonyl-Gruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- oder 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT-)Gruppe,
oder der Formel (II)
worin R1, gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O CnH2n+1 oder CnH2n-1, oder (CnH2n)NR10'R11', wobei R10', R11', unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben,
dadurch gekennzeichnet, daß ausgehend von dem ungeschützten Pentopyranosid
- (a) in einem ersten Schritt zuerst die 2'-, 3'- oder 4'-Position des Pentopyranosids geschützt wird, und gegebenenfalls
- (b) in einem zweiten Schritt die andere Position an der 2'-, 3'- oder 4'-Position.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß im Falle einer 2'-geschützten
Position eine Umlagerung der Schutzgruppe von der 2'-Position zur 3'-Position erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Umlagerung in Gegenwart
einer Base, insbesondere in Gegenwart von N-Ethyldiisopropylamin und/oder Triethylamin
durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7-9, dadurch gekennzeichnet, daß das Pyranosyl
nucleosid durch eine säurelabile, basenlabile oder metallkatalysiert abspaltbare
Schutzgruppe Sc1, Sc2, Sc1' oder Sc2' geschützt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7-10, dadurch gekennzeichnet, daß Sc1 und Sc1'
verschieden sind von Sc2 bzw. Sc2'.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7-11, dadurch gekennzeichnet, daß die
Schutzgruppen Sc1, Sc2, Sc1' oder Sc2' ausgewählt werden aus Acylgruppen, vorzugsweise
aus einer Acetyl-, Benzoyl-, Nitrobenzoyl- und/oder Methoxybenzoyl-Gruppe oder aus
Tritylgruppen, vorzugsweise einer 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT)-Gruppe oder einer
Fluorenylmethyloxycarbonyl-(Fmoc)Gruppe.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7-12, dadurch gekennzeichnet, daß die 2'- oder
3'-Position durch eine basenlabile oder metallkatalysiert abspaltbare Schutzgruppe,
vorzugsweise durch eine Acylgruppe, insbesondere durch eine Acetyl-, Benzoyl-,
Nitrobenzoyl- und/oder Methoxybenzoylgruppe, geschützt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7-13, dadurch gekennzeichnet, daß die 4'-Position
durch eine säure- oder basenlabile Schutzgruppe, vorzugsweise durch eine Trityl- und/oder
Fmoc-Gruppe, insbesondere durch eine DMT-Gruppe geschützt wird.
15. Verfahren zur Herstellung eines Pentopyranosyl-nucleosids, dadurch gekennzeichnet, daß
- (a) eine geschützte Nucleobase mit einer geschützten Pentopyranose umgesetzt wird,
- (b) die Schutzgruppen von dem Pentopyranosyl-Teil des Produktes aus Schritt (a) abgespalten werden, und
- (c) das Produkt aus Schritt (b) gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 7-14 umgesetzt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die geschützte Pentopyranose
Anomeren-rein ist.
17. Verfahren nach Anspruche 15 zur Herstellung eines Linkers gemäß Formel (II), worin R4'
(CnH2n)NR10'R11' bedeutet und R10'R11' über einen Rest der Formel (III) mit der in
Anspruch 1 bezeichneten Bedeutung verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß
- (a) eine Verbindung der Formel (II) mit R4, gleich (CnH2n)OSc3 oder (CnH2n)Hal, worin n die oben genannte Bedeutung hat, Sc3 eine Schutzgruppe, vorzugsweise eine Mesylat-Gruppe, und Hal Chlor oder Brom bedeutet, mit einem Azid umgesetzt wird,
- (b) das Reaktionprodukt aus (a) reduziert wird,
- (c) das Reaktionsprodukt aus (b) mit einem entsprechenden Phthalimid umgesetzt wird,
- (d) das Reaktionsprodukt aus (c) mit einer entsprechenden geschützten Pyranose umgesetzt wird, und
- (e) die Schutzgruppen abgespalten werden, und
- (f) die Schritte gemäß einem der Ansprüche 7-16 durchgeführt werden.
18. Verfahren nach Anspruch 15 zur Herstellung eines Linkers gemäß Formel (1), worin X
und Y unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =C(R16) mit R16 gleich H
oder CnH2n und Z =C(R16)- mit R16 gleich (CnH2n)NR10R11 mit der in Anspruch 1
bezeichneten Bedeutung, dadurch gekennzeichnet, daß
- (a) das entsprechende Indolin mit einer Pyranose zum Nucleosidtriol umgesetzt wird,
- (b) die Hydroxylgruppen des Pyranosyl-Teils des Produktes aus (a) vorzugsweise mit Acylgruppen geschützt werden,
- (c) das Produkt aus (b) oxidiert wird,
- (d) die Hydroxyl-Schutzgruppen des Pyranosyl-Teils des Produktes aus (c) abgespalten werden und
- (e) die Schritte gemäß einem der Ansprüche 7-16 durchgeführt werden.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 7-18, dadurch gekennzeichnet, daß das
4'-geschützte Pentopyranosyl-nucleosid in einem weiteren Schritt phosphityliert oder an eine
feste Phase gebunden wird.
20. Verfahren zur Herstellung einer Pentopyranosyl-Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet,
daß
- (a) in einem ersten Schritt ein geschütztes Pentopyranosyl-Nucleosid gemäß einem der Ansprüche 1-6 an eine feste Phase gebunden wird und
- (b) in einem zweiten Schritt das gemäß Schritt (a) an eine feste Phase gebundene 3'-, 4'-ge schützte Pentopyranosylnukleosid um ein phosphityliertes 3'-, 4'-geschütztes Pentopyranosyl-Nucleosid verlängert wird, und
- (c) Schritt (b) wiederholt wird.
21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a) und/oder Schritt
(b) auch Pentofuranosyl-nucleoside eingebaut werden.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß als Kupplungsreagenz
für die Verlängerung gemäß Schritt (b) Benzimidazoliumtriflat eingesetzt wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20-22, dadurch gekennzeichnet, daß in einem
weiteren Schritt (d) die Schutzgruppen und das gebildete Oligomer von der festen Phase
abgespalten wird.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Abspaltung durch
Hydrazinolyse vorzugsweise in Gegenwart eines Salzes durchgeführt wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 20-24, dadurch gekennzeichnet, daß in einem
weiteren Schritt ein Allyloxy-Linker der Formel
Sc4NH(CnH2n)CH(OPSc5Sc6)CnH2nSc7 (IV)
worin Sc4 und Sc7 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils eine Schutzgruppe insbesondere ausgewählt aus Fmoc und/oder DMT,
Sc5 und Sc6 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils eine Allyloxy- und/oder Diisopropylamino-Gruppe und n wie in Anspruch 1 bezeichnet, bedeuten,
eingebaut wird.
Sc4NH(CnH2n)CH(OPSc5Sc6)CnH2nSc7 (IV)
worin Sc4 und Sc7 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils eine Schutzgruppe insbesondere ausgewählt aus Fmoc und/oder DMT,
Sc5 und Sc6 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils eine Allyloxy- und/oder Diisopropylamino-Gruppe und n wie in Anspruch 1 bezeichnet, bedeuten,
eingebaut wird.
26. Allyloxy-Linker der Formel
Sc4NH(CnH2n)CH(OPSc5Sc6)CnH2nSc7 (IV)
worin Sc4 und Sc7 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils eine Schutzgruppe insbesondere ausgewählt aus Fmoc und/oder DMT,
Sc5 und Sc6 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils eine Allyloxy- und/oder Diisopropylamino-Gruppe und n wie in Anspruch 1 bezeichnet, bedeuten.
Sc4NH(CnH2n)CH(OPSc5Sc6)CnH2nSc7 (IV)
worin Sc4 und Sc7 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils eine Schutzgruppe insbesondere ausgewählt aus Fmoc und/oder DMT,
Sc5 und Sc6 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils eine Allyloxy- und/oder Diisopropylamino-Gruppe und n wie in Anspruch 1 bezeichnet, bedeuten.
27. Pentopyranosyl-Nucleinsäure enthaltend mindestens ein Pentopyranosyl-Nucleosid gemäß
einem der Ansprüche 1-6 und gegebenenfalls mindestens einen Allyloxy-Linker gemäß
Anspruch 26.
28. Verwendung eines Pentopyranosyl-Nucleosids der Formel (1),
worin
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4, oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R11 gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
worin R12, R13, R14 und R15 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, OR7, wobei R7 die oben genannte Bedeutung hat, oder CnH2n+1, oder CnH2n-1,wobei n die oben genannte Bedeutung hat, bedeuten und
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16)- oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyloxycarbonyl-Gruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- und/oder 4,4'-Dimethoxytrityl (DMT-)Gruppe, oder der Formel (II)
worin R1' gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O, CnH2n+1 oder OCnH2n-1, oder (CnH2n)NR10'R11', wobei R10', R11', unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben,
zur Herstellung eines Therapeutikums, Diagnostikums und/oder elektronischen Bauteils.
worin
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4, oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R11 gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
worin R12, R13, R14 und R15 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, OR7, wobei R7 die oben genannte Bedeutung hat, oder CnH2n+1, oder CnH2n-1,wobei n die oben genannte Bedeutung hat, bedeuten und
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16)- oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyloxycarbonyl-Gruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- und/oder 4,4'-Dimethoxytrityl (DMT-)Gruppe, oder der Formel (II)
worin R1' gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O, CnH2n+1 oder OCnH2n-1, oder (CnH2n)NR10'R11', wobei R10', R11', unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben,
zur Herstellung eines Therapeutikums, Diagnostikums und/oder elektronischen Bauteils.
29. Konjugat enthaltend ein Pentopyranosyl-Nucleosid der Formel (I),
worin
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4, oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R11 gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
worin R12, R13, R14 und R15 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, OR7, wobei R7 die oben genannte Bedeutung hat, oder CnH2n+1, oder CnH2n-1,wobei n die oben genannte Bedeutung hat, bedeuten und
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16)- oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und
Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyloxycarbonyl-Gruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- oder 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT-)Gruppe,
oder der Formel (II)
worin R1' gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O, CnH2n+1 oder OCnH2n-1, oder (CnH2n)NR10'R11', wobei R10', R11', unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben, und ein Biomolekül.
worin
R1 gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1 mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4, oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R11 gleich H, CnH2n+1 oder R10R11 verbunden über einen Rest der Formel
worin R12, R13, R14 und R15 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, OR7, wobei R7 die oben genannte Bedeutung hat, oder CnH2n+1, oder CnH2n-1,wobei n die oben genannte Bedeutung hat, bedeuten und
R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, CnH2n+1, oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, -C(O)R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest,
X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16)- oder -N(R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und
Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl- oder Allyloxycarbonyl-Gruppe, vorzugsweise eine Benzoyl- oder 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT-)Gruppe,
oder der Formel (II)
worin R1' gleich H, OH oder Hal mit Hal gleich Br oder Cl,
R2', R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O, CnH2n+1 oder OCnH2n-1, oder (CnH2n)NR10'R11', wobei R10', R11', unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R10 bzw. R11 hat, und
X', Y' und Z' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C(R16')- oder -N(R17')- bedeutet, wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von R16 bzw. R17 haben, und Sc1' bzw. Sc2' die oben genannte Bedeutung von Sc1 bzw. Sc2 haben, und ein Biomolekül.
30. Konjugat nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Biomolekül ein Peptid,
Protein oder eine Nucleinsäure ist.
31. Konjugat nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Biomolekül ein
Antikörper oder ein funktioneller Teil davon oder eine in ihrer natürlichen Form
vorkommende DNA und/oder RNA ist.
32. Diagnostikum enthaltend eine Pentopyranosyl-Nucleinsäure gemäß Anspruch 27 oder ein
Konjugat gemäß einem der Ansprüche 29-31.
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