DE19747572C1 - Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmuntests - Google Patents
Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung von FluoreszenzimmuntestsInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Ver
fahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmuntests,
wobei von mindestens einer Lichtquelle Licht auf eine
Fläche, an einem Ende eines Lichtwellenleiters ge
richtet wird und mit dem im Lichtwellenleiter einge
koppelten Licht durch Evanescentfeldanregung an der
Oberfläche des Lichtwellenleiters Fluoreszenz von
mindestens einem an einem chemischen oder biochemi
schen Partner eines allgemeinen Rezeptor-Ligand-
Systems gebundenen Markierungsstoffes angeregt wird
und das Fluoreszenzlicht zum Teil in den Lichtwellen
leiter eingekoppelt wird und aus dem Lichtwellenlei
ter aus der Fläche, in die das anregende Licht einge
koppelt wurde, ausgekoppelt wird und über eine Optik
auf einen optischen Detektor gerichtet wird, mit dem
die Intensität des Fluoreszenzlichtes gemessen wird.
Mit der Erfindung können die verschiedensten bioche
mischen Tests an allgemeinen Rezeptor-Ligand-Syste
men, wie z. B. Antikörper-Antigen durchgeführt werden.
Mit den Tests werden quantitativ chemische oder bio
chemische Substanzen in flüssigen Proben bestimmt.
So können Antikörper mit einem bestimmten Markie
rungsstoff (Fluophore) markiert werden, wobei der
jeweilige Markierungsstoff bei einer bestimmten Anre
gungswellenlänge des Lichtes optisch angeregt werden
kann und das durch die Anregung erhaltene Fluores
zenzlicht, das wiederum mit einer anderen Wellenlänge
auftritt, mit einem geeigneten optischen Detektor
erfaßt und die Intensität des Fluoreszenzlichtes zur
Bestimmung des jeweiligen Anteils der chemischen oder
biochemischen Substanz aus der Probenflüssigkeit aus
genutzt wird. Für die Fluoreszenzanregung wird das
sich an einer Grenzfläche ausbildende evanescente
Feld benutzt. Hierbei müssen die bekannten physikali
schen Zusammenhänge des evanescenten Feldes und dabei
insbesondere die erforderliche Totalreflexion des
Anregungslichtes berücksichtigt werden.
So ist aus WO 97/10 506 eine optische Vorrichtung zur
Durchführung von Fluoreszenzimmunoassays bekannt, bei
der eine Lichtleitfaser verwendet wird, in die Licht
einer Lichtquelle eingekoppelt und Fluoreszenz einer
Probe durch Evanescentfeldanregung erzeugt wird. Da
bei wird die Oberfläche des Lichtwellenleiters vor
Durchführung des jeweiligen Tests, also der Einlei
tung der Probenflüssigkeit in einen Behälter, in dem
auch die Lichtleitfaser aufgenommen ist, entsprechend
mit einer chemischen oder biochemischen Komponente
beschichtet.
Für die Einkopplung des Lichtes in die Lichtleitfaser
ist eine sehr aufwendige und komplizierte Optik er
forderlich, die aus einer Mehrzahl einzelner
optischer Komponenten besteht. So wird das Licht der
verwendeten Lichtquelle über ein Linsensystem auf
einen halbdurchlässigen Spiegel gerichtet und ein
Teil des Lichtes als Referenzsignal auf einen opti
schen Detektor und der andere Teil des Lichtes über
eine weitere Linse in die Faser eingekoppelt. Dabei
ist das der Ein- und Auskoppelfläche entgegengesetzte
Ende der Lichtleitfaser verspiegelt, so daß der größ
te Teil des Anregungs- und Fluoreszenzlichtes wieder
aus der Lichtleitfaser ausgekoppelt wird. Dies führt
dazu, daß das Verhältnis von Anregungs- zu Fluores
zenzlicht für die Auswertung mit dem Fotodetektor
verschlechtert und demzufolge die Meßgenauigkeit in
unerwünschter Weise beeinträchtigt wird.
Ein weiterer Nachteil dieser bekannten Vorrichtung
besteht darin, daß das Licht über die vor der Einkop
pelfläche der Lichtleitfaser angeordnete Linse erfol
gen soll, so daß ein Lichteintritt unter einem defi
nierten Hauptwinkel innerhalb eines schmalen Winkel
bereichs in die Lichtleitfaser, die für die Evanes
centfeldanregung vorteilhaft erforderlich ist, wenn
überhaupt nur sehr schwierig zu erreichen ist.
Die Fluoreszenzimmuntests werden dann nach dieser
bekannten Lösung so durchgeführt, daß die in dem Be
hälter aufgenommene, vorbereitete, beschichtete
Lichtleitfaser mit der Probenflüssigkeit in Kontakt
gebracht wird, indem durch Perforationen im Deckel
des Behälters die Probenflüssigkeit eintritt und die
Anbindung an den auf der Oberfläche der Lichtleitfa
ser immobilisierten komplementären Partner des Rezep
tor-Ligand-Systems erfolgen kann. Nach der Anbindung
wird dann durch Einstrahlung des Lichtes der verwen
deten Lichtquelle Fluoreszenz angeregt und deren In
tensität mit dem optischen Detektor gemessen.
Da für den Anbindungsprozeß der jeweilige Stofftrans
port zur Lichtwellenleiteroberfläche eine Bedeutung
hat und dabei Konvektion und Diffusion berücksichtigt
werden müssen, treten bei der aus WO 97/10 506 be
kannten Lösung Meßfehler auf, da das jeweils in den
Behälter aufgenommene Probenvolumen konstant ist und
das Eindringen der Probenflüssigkeit über die Perfo
rationen sehr schnell geschieht und die Anbindung
damit in einer ruhenden Flüssigkeit erfolgt. In die
sem Falle wird die Anbindung überwiegend durch Diffu
sion beeinflußt, was neben anderen Nachteilen auch
zur Verlängerung der Meßzeit führt.
Bei dieser Art der nicht zeitlich aufgelösten Messung
ist eine Hintergrundkorrektur des Meßsignals notwen
dig, was in WO 97/10506 nicht berücksichtigt wurde.
Ein weiterer wesentlicher Nachteil, der mit dieser
bekannten Lösung verbunden ist, besteht darin, daß
lediglich das Anregungslicht allein als Referenzsi
gnal benutzt wird, um die Genauigkeit der Meßergeb
nisse zu erhöhen. Zur Verbesserung der Meßgenauigkeit
und Aussagekraft der Testergebnisse sowie einer er
höhten Reproduzierbarkeit ist es jedoch erforderlich,
für die Immuntests geeignetere Referenzmessungen
durchzuführen.
Daneben ist in US 5,077,012 eine Vorrichtung zur Auf
nahme biologischer Flüssigkeiten und Proben beschrie
ben, mit der qualitative und quantitative Tests
durchgeführt werden sollen. Sie ist wie eine Spritze
aufgebaut, die cytologische Membranen verwendet.
DE 195 46 535 A1 beschreibt ein Verfahren und eine
Vorrichtung zur Probennahme mit integrierter analy
tisch-chemischer Sensor-Messung. Sie besteht aus ei
ner mit Chemo- und Biosensoren bestückten Meßkartusche
mit integrierten Meßstandards und/oder Speziallösun
gen, die über Luer-Steckverbindungen zwischen Nadel
und Spritze einer Probennahme-Anordnung plaziert
wird.
Eine Vorrichtung für eine Fluoreszenzimmunoanalyse,
die eine Anregungslichtquelle, einen Detektor, eine
optische Faser, mit der ein Antigen bzw. Antikörper
verbunden wird, und ein Spektrometer aufweist, ist in
DE 42 94 539 T1 beschrieben.
Die Verwendung eines Photometers zum Analysieren
flüssiger Medien geht aus DE 34 46 756 C1 hervor.
Lichtquelle und Photometer sind dabei in einer Pump
küvette angeordnet.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine Möglichkeit
zu schaffen, um mit geringem Aufwand, in kurzer Zeit
Fluoreszenzimmuntests mit hoher Meßgenauigkeit
durchführen zu können.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit den Merkmalen
des Patentanspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestal
tungsformen und Weiterbildungen der Erfindung ergeben
sich bei Nutzung der in den untergeordneten Ansprü
chen enthaltenen Merkmale.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung baut auf den bereits
beschriebenen bekannten Stand der Technik auf und
verwendet ebenfalls mindestens eine Lichtquelle, mit
der Licht, zur Fluoreszenzanregung über das evanes
cente Feld, in einen Lichtwellenleiter eingekoppelt
wird und die Intensität des Fluoreszenzlichtes eines
Markierungsstoffes, der an einem Partner eines all
gemeines Rezeptor-Ligand-System gebunden ist, mit
einem optischen Detektor bestimmt wird. Dabei wird
das Fluoreszenzlicht und ein Teil des Anregungslich
tes aus der gleichen Fläche ausgekoppelt, in die das
Anregungslicht eingekoppelt worden ist. Der Lichtwel
lenleiter ist dabei in einer Meßkammer aufgenommen,
die in einem Kolben einer Kolben-Zylindereinheit aus
gebildet ist. Die Meßkammer des Kolbens verfügt dabei
über einen Zufluß, in den Innenraum des Zylinders,
der durch den Kolben führt. Eine solche Kolben-Zylin
dereinheit kann dabei zumindest annähernd, wie eine
herkömmliche Spritze ausgebildet sein, wobei ledig
lich der Kolben entsprechend mit der Meßkammer modi
fiziert werden muß.
Eine weitere Verbesserung kann dadurch erreicht wer
den, in dem im Kolben eine zusätzliche Probensammel
kammer ausgebildet ist, die mit der Meßkammer in Ver
bindung steht. Dadurch entsteht eine Einheit, in der
die Inkubation und die Messung durchgeführt werden
kann und nach Durchführung des jeweiligen Tests die
Probe sicher aufgenommen ist und die entsprechende
Kolben-Zylindereinheit transportiert und ohne größere
Probleme und Gefahrenbildung entsorgt werden kann.
Der Lichtwellenleiter kann an der Seite, an der das
Anregungslicht ein- und das Fluoreszenz- und ein Teil
des Anregungslichtes wieder ausgekoppelt wird, eine
Fläche aufweisen, die den Kolben in diese Richtung
verschließt. Sie bildet also auch einen Abschluß für
Meß- und Probensammelkammer. Außerdem dient sie zur
Fixierung des Lichtwellenleiters an dieser Seite des
Kolbens. Dabei kann der Lichtwellenleiter und die
Fläche vorteilhaft einstückig aus dem gleichen Mate
rial, wie beispielsweise einem Polymer, wie Polyme
thylmethacrylat (PMMA), bestehen.
Am anderen Ende des Lichtwellenleiters ist vorteil
haft ein Lichtabsorber angeordnet, der bevorzugt aus
einem schwarz eingefärbten Kunststoff besteht. Dabei
kann der Lichtabsorber so dimensioniert und ausge
formt sein, daß er den Lichtwellenleiter im unteren
Bereich der Meßkammer ausrichtet und fixiert.
Mit dem Lichtabsorber kann ein weiterer günstiger
Effekt erreicht werden, der das Verhältnis von Anre
gungs- und Fluoreszenzlicht zu einem für die Messung
günstigen Wert verbessert. Mit Hilfe des Lichtabsor
bers wird nahezu das ganze Anregungslicht absorbiert,
während das Fluoreszenzlicht nur um die Hälfte ver
ringert wird, so daß das Verhältnis der beiden Licht
anteile, zugunsten des Fluoreszenzlichtes verschoben
ist. Damit können sehr empfindliche Lichtdetektoren
verwendet werden, um das schwache Fluoreszenzlicht zu
messen.
Für die Durchführung der Tests ist es außerdem gün
stig, in der Fläche, die den Kolben verschließt, eine
verschließbare Öffnung vorzusehen, wobei der Ver
schluß z. B. eine dünne Folie oder ein entsprechender
Stopfen sein kann, die bei Bedarf, worauf später noch
zurückzukommen sein wird, entfernt und die Öffnung
freigegeben werden kann.
Die jeweilige Probenflüssigkeit kann günstigerweise
über eine Zuflußöffnung im Zylinder zugeführt werden,
wie dies auch bei herkömmlichen Spritzen der Fall
ist.
Dabei sollte die Zuflußöffnung günstigerweise mit
einem Ventil, zur Vermeidung eines unerwünschten Pro
benflüssigkeitsaustrittes aus dem Zylinder, nach des
sen Befüllung, verschließbar sein.
Eine weitere günstige Ausführung der erfindungsgemä
ßen Vorrichtung verwendet ein saugfähiges Material,
das zumindest in der Probensammelkammer aufgenommen
ist, wobei auch ein Teil des saugfähigen Materials in
die Meßkammer hineinragen kann.
Vor bzw. in dem bereits erwähnten Zufluß durch den
Kolben in die Meßkammer können Filter und/oder eine
Immunsäule und/oder eine Membran, die permeabel oder
semipermeabel sein kann, vorhanden sein, um bestimmte
in der Probenflüssigkeit enthaltene Komponenten von
der Messung fernzuhalten oder anderweitig gezielt
Einfluß auf die Messung mit der Verwendung einer Im
munsäule und/oder Membran und/oder des Filters vor
nehmen zu können.
Die verschiedenen Fluoreszenzimmuntests können nun
mehr so durchgeführt werden, daß die Oberfläche des
Lichtwellenleiters mit verschiedenen chemischen, bzw.
biochemischen Komponenten, wie z. B. Antikörper, be
schichtet wird, wobei die Beschichtung beispielsweise
in einem zweistufigen Batchprozeß erfolgen kann. Die
ser Batchprozeß beinhaltet neben der Beschichtung
durch z. B. adsorptive Immobilisierung der jeweiligen
Komponenten, auch eine vorherige Reinigung der Licht
wellenleiteroberfläche. Dies kann in einem einfachen
Tauchverfahren durchgeführt werden, mit dem es ein
fach und effektiv möglich ist, eine relativ hohe An
zahl solcher Lichtwellenleiter gleichzeitig zu bear
beiten. Da die Lichtwellenleiter auch durch herkömm
liche Spritzgießverfahren hergestellt werden können
und demzufolge eine Vielzahl an Lichtwellenleitern
nach dem Spritzgießen miteinander verbunden zur Ver
fügung stehen, ist dieser Vorgang selbstverständlich
äußerst effektiv durchzuführen.
Die so beschichteten Lichtwellenleiter werden dann in
die Meßkammer eines, wie bereits beschrieben ausge
bildeten Kolbens, eingesetzt, wobei die Öffnung in
der Fläche am einen Ende des Lichtwellenleiters, die
den Kolben abschließt, ebenfalls verschlossen ist.
Die Verbindung dieser Fläche mit dem Kolben kann dann
durch Verkleben erfolgen, wobei ein luftdichter Ab
schluß gesichert sein soll.
Es besteht auch die Möglichkeit, die Stirnfläche des
verwendeten Kolbens vor der Einführung in den Zylin
der, z. B. mit einer Biokomponente zu belegen.
Alternativ kann auch die Oberfläche der Innenseite
des Zylinders mit einer lyophilisierten Biokomponente
belegt werden. Geeignet ist auch die Belegung der
Oberfläche des Zuflußes des Zylinders.
In so vorbereiteter Form kann die erfindungsgemäße
Vorrichtung für den jeweiligen Bedarf zur Verfügung
gestellt werden, wobei auch längere Lagerzeiten unter
entsprechenden Bedingungen ohne weiteres möglich
sind.
Die so vorbereitete Kolben-Zylindereinheit kann dann
bei Bedarf wie eine Spritze aufgezogen und mit Pro
benflüssigkeit gefüllt werden, wobei eine definierte
Probenflüssigkeitsmenge in den Zylinder eingezogen
werden kann. Die Probenflüssigkeit verbleibt aus
schließlich im Zylinder und kann nicht durch den Zu
fluß im Kolben in die Meßkammer und demzufolge auch
nicht in die Probensammelkammer gelangen, da die dort
enthaltene Luft nicht verdrängt werden kann, weil die
Öffnung, die einen Luftaustritt ermöglicht, noch ver
schlossen ist.
Bei Belegung des Zuflusses des Zylinders und/oder der
Zylinderoberfläche und/oder der Kolbenstirnfläche mit
Biokomponenten treten diese beim Befüllen in die Pro
benflüssigkeit ein. Dabei kommt es zu einer Wechsel
wirkung (Vorinkubation) der Biokomponente mit den
chemischen oder biochemischen Komponenten der Proben
flüssigkeit. Nach dieser Vorinkubation kann die ent
sprechend vorbehandelte Probe in die Meßkammer und
dort am Lichtwellenleiter vorbei geführt werden, wenn
die Luftaustrittsöffnung an der Abschlußfläche geöff
net wird. Dies kann bei einer hierfür verwendeten
Folie durch deren Entfernung bzw. Durchstechen erfol
gen. Die Luft aus der Meßkammer und Probensammelkam
mer kann entweichen und die Kammern werden durch Ka
pillarkräfte befüllt, wobei die Probenflüssigkeit
kontinuierlich an der Lichtwellenleiteroberfläche
vorbeifließt. Das Durchströmen der Probenflüssigkeit
durch die Meßkammer mit definierter Strömungsge
schwindigkeit kann auch durch entsprechend gezielte
Bewegung des Zylinders, bei fixiertem Spritzenkolben
erreicht werden.
Beim Durchströmen der vorinkubierten Probenflüssig
keit durch die Meßkammer muß der Spritzenkolben defi
niert gehalten werden, so daß das Licht der Licht
quelle für das Anregungslicht im richtigen Winkel auf
die Fläche trifft und in den Lichtwellenleiter einge
koppelt werden kann. Wird ein Lichtwellenleiter mit
einem Durchmesser von ca. 1 mm verwendet, können re
lativ große Abstriche an die Positionsgenauigkeit
gemacht werden, ohne daß die jeweiligen Meßergebnisse
negativ beeinflußt werden.
Das bereits erwähnte Ventil am Zufluß in den Zylinder
verhindert, daß die im Zylinder aufgenommene Proben
flüssigkeit unerwünscht wieder entweichen kann und
die gesamte Menge für die Messung ausgenutzt werden
kann, insbesondere ist dieses wichtig, wenn der Zy
linder zum Durchströmen der Meßkammer bewegt wird.
Während des Durchströmens der Probenflüssigkeit durch
die Meßkammer und Anbinden der markierten chemischen
oder biochemischen Komponente an den an der Lichtwel
lenleiteroberfläche immobilisierten Partner des Re
zeptor-Ligand-Systems, wird das mittels der bereits
erwähnten Lichtquelle angeregte Fluoreszenzlicht, das
aus der Stirnfläche des Lichtwellenleiter ausgekop
pelt wird, mit dem bereits erwähnten optischen Detek
tor erfaßt und dessen Intensität gemessen. Der hier
für zu verwendende optische Aufbau soll später weiter
spezifiziert werden.
Eine andere verbesserte Möglichkeit für das Vorbei
führen der, wie beschrieben, vorinkubierten Proben
flüssigkeit am Lichtwellenleiter durch die Meßkammer
kann aber auch so erfolgen, daß in der Probensammel
kammer ein für Flüssigkeit stark aussaugendes Materi
al. wie z. B. Vließ aufgenommen ist. Dieses Material
ragt bis in die Meßkammer hinein und die vorinkubier
te Probenflüssigkeit kann aus dem Zylinder nach Öff
nung des Verschlusses, der in der Fläche vorhandenen
Öffnung, durch Kapillarkraft in die Meßkammer gelan
gen und wird weiter durch Kapillarkräfte in dem flüs
sigkeitsaufsaugenden Material solange durch die Meß
kammer geführt, bis die Probensammelkammer gefüllt
ist. Diese führt zu einem stabileren Flüssigkeits
transport.
Auch hier erfolgt die Messung der Fluoreszenzintensi
tät in dem Zeitraum, in dem die Probenflüssigkeit am
Lichtwellenleiter entlang durch die Meßkammer strömt.
Wird eine so ausgebildete Vorrichtung verwendet, kann
auf das bereits erwähnte Ventil am Zufluß in den Zy
linder verzichtet werden, so daß als Zylinder bei
spielsweise ein herkömmlicher Spritzengrundkörper
verwendet werden kann, der kostengünstig erhältlich
ist.
Bei Anbindung an eine biochemisch sensibilisierte
Oberfläche müssen in einem strömenden System, zwei
unterschiedliche Effekte, nämlich Konvektion und Dif
fusion, berücksichtigt werden.
Aus der Hydrodynamik ist es bekannt, daß ausgehend
von laminaren Strömungen, die Strömungsgeschwindig
keit eines Fluides in einem Rohr oder einem kanalar
tigen Gebilde, wie dies die erfindungsgemäß ausgebil
dete Meßkammer ist, variabel mit dem Abstand von der
Wandung ist. Dabei liegt die Strömungsgeschwindigkeit
direkt an der Wandung bei 0 und steigt mit größer
werdendem Abstand zur Wandung an.
Diese Tatsache berücksichtigend, lassen sich zwei
Schichten in einer solchen laminaren oder quasilami
naren Strömung, wie sie bei der erfindungsgemäßen
Vorrichtung mit Sicherheit auftritt, definieren. Dies
ist einmal eine hydrodynamische Schicht in einem be
stimmten Abstand von der Wandung, und zweitens eine
diffusive Schicht, wobei die jeweiligen Abstände der
Schichten von der Wandung, von der Viskosität und der
Strömungsgeschwindigkeit des Fluides abhängig sind.
Oberhalb der diffusiven Schicht, also mit einem grö
ßeren Abstand von der Wandung, werden die chemischen
und biochemischen Komponenten durch Konvektion an die
Oberfläche herangeführt und innerhalb der diffusiven
Schicht, d. h. in Richtung zur Wandung, erfolgt die
Bewegung dann über Diffusionsprozesse. Der Massen
transport durch Konvektion ist wesentlich größer, als
der, der durch Diffusion erreicht werden kann. Dies
bedeutet für die relativ schnelle Antigen-Antikörper
reaktion, daß durch den relativ langsam ablaufenden
Diffusionsprozeß der Reaktionsprozeß stark verlang
samt wird und dies kann dazu führen, daß für einen
Immuntest beispielsweise eine Zeit von ca. 1 h benö
tigt wird, um ein ausreichend genaues Meßergebnis zu
ermitteln.
Bei einem diffusiven Stofftransport tritt mit hoher
Wahrscheinlichkeit noch eine Rückbindung von bereits
gebundenen chemischen- oder biochemischen Komponenten
auf, der genauso, wie die Tatsache, daß im Inneren
der Strömung die Stoffkonzentration höher als im Be
reich der diffusiven Schicht ist, das Meßergebnis
verfälscht.
Durch Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit des Flui
des kann die Dicke der diffusiven Schicht verringert
werden und so der Einfluß des konvektiven Stofftrans
portes an die Wandung, an der die chemischen oder
biochemischen Komponenten angebunden werden sollen,
vergrößert wird. Dadurch wird das Ansprechverhalten
des Immuntests stark verbessert und demzufolge die
erforderliche Meßzeit verringert.
Alternativ zur Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit
kann aber auch bei nicht erhöhter Strömungsgeschwin
digkeit die Dicke des kanalartigen Durchflusses ver
kleinert werden, um die Ausdehnung der diffusiven
Schicht zu verringern, wie dies bei der erfindungsge
mäßen Anordnung aus Meßkammer und Lichtwellenleiter
vorteilhaft ausgelegt werden kann. Dabei wird der
Abstand zwischen Lichtwellenleiteroberfläche und in
nerer Mantelfläche der Meßkammer möglichst klein ge
halten. Vorteilhaft ist ein Abstand kleiner 2 mm,
bevorzugt zwischen 0,1-0,05 mm, einzuhalten.
Eine so ausgebildete erfindungsgemäße Vorrichtung,
wie sie in den verschiedenen Ausführungen beschrieben
worden ist, kann preiswert als Massenprodukt herge
stellt und vorab mit entsprechenden Biokomponenten
beschichtet vorbereitet werden. Ein weiterer Vorteil
besteht darin, daß ein Kontakt der jeweiligen Proben
flüssigkeit mit einer Person vermieden wird und diese
auch nach Durchführung des Tests sicher verschlossen
gehalten ist, was bei medizinischer Anwendung beson
ders vorteilhaft ist.
Für die Messung der Fluoreszenzintensität ist es gün
stig, im Strahlengang des aus dem Lichtwellenleiter
ausgekoppelten Lichtes, eine Linse und ein für das
ausgekoppelte Fluoreszenzlicht durchlässiges
optisches Filter vor dem optischen Detektor anzuord
nen, wobei das Anregungslicht vom optischen Filter
gesperrt wird. Von der Linse ausgehend soll das aus
gekoppelte Licht parallel durch das jeweilige Filter
in Richtung auf den optischen Detektor gerichtet wer
den.
Um einen möglichst großen Anteil des ausgekoppelten
Lichtes auf den Detektor zu bekommen, muß eine solche
Linse entsprechend groß dimensioniert sein.
Da es aber nachteilig ist, das Anregungslicht der
Lichtquelle durch die Linse in den Lichtwellenleiter
einzukoppeln, ist es günstig, in der Linse eine Aus
sparung vorzusehen, durch die der Anregungslicht
strahl der Lichtquelle ohne Beeinflussung der Linse
in den Lichtwellenleiter eingekoppelt wird. Die so
erreichbaren besseren Einkoppelverhältnisse in den
Lichtwellenleiter rechtfertigen den geringen Verlust
an ausgekoppeltem Licht, der infolge der in der Linse
ausgebildeten Aussparung auftritt.
Der optische Teil der erfindungsgemäßen Vorrichtung
kann weiter verbessert werden, in dem eine zusätzli
che zweite Linse im Nachgang zu dem bereits erwähnten
optischen Filter im Strahlengang des ausgekoppelten
Lichtes angeordnet wird, mit der nunmehr das durch
das Filter geführte Fluoreszenzlicht auf den Detektor
fokussiert wird. Dabei müssen die optischen Parameter
und der Abstand der Linse zum Detektor entsprechend
gewählt bzw. eingestellt werden, so daß das Abbild
des aus dem Lichtwellenleiter ausgekoppelten Fluores
zenzlichtes auf dem optischen Detektor abgebildet
wird.
Möglich ist aber auch, nur mit einer Linse und einem
Filter vor dem Detektor das Licht auf den Detektor zu
fokussieren. Diese Anordnung hat dann aber eine ge
ringe Lichtstärke.
Eine besonders günstige Weiterbildung der Erfindung
ergibt sich mit der Verwendung von zwei verschiedenen
Lichtquellen mit unterschiedlicher Wellenlänge zur
Anregung verschiedener Markierungsstoffe, so daß ent
weder zwei verschiedene Analyte parallel gemessen
werden können oder einer der Analyten als Referenz
analyt dient und so die Sicherheit des Testergebnis
ses stark erhöht werden kann, so daß die Forderung
nach internen Qualitätskontrollen erfüllt werden
kann.
Werden zwei verschiedene Lichtquellen verwendet, sind
selbstverständlich auch zwei verschiedene optische
Filter für das jeweilige Fluoreszenzlicht erforder
lich. Diese sollten vorteilhaft so angeordnet und
manipulierbar sein, daß sie alternierend in den
Strahlengang des ausgekoppelten Lichtes bewegt werden
können, so daß sich dort immer nur jeweils eines der
beiden Filter für das jeweilige Fluoreszenzlicht be
findet.
Da die beiden Lichtquellen nicht an einem gleichen
Ort angeordnet sein können, ist für die zweite Licht
quelle, in der ersten Linse eine zusätzliche Ausspa
rung entsprechend anzuordnen, so daß auch deren Licht
direkt auf die Einkoppelfläche des Lichtwellenleiters
trifft.
Vorteilhaft ist es beim Einbringen des entsprechenden
Filters in den Strahlengang des Fluoreszenzlichtes
parallel dazu den Strahlengang der jeweils anderen
Anregungsquelle zu unterbrechen, so daß kein Licht
dieser Quelle in den Lichtwellenleiter gelangt.
Nachfolgend soll die Erfindung an Ausführungsbeispie
len näher beschrieben werden.
Dabei zeigen:
Fig. 1 einen Lichtwellenleiter in mehreren Ansich
ten für eine erfindungsgemäße Vorrichtung;
Fig. 2 eine erfindungsgemäße Vorrichtung in einer
Schnittdarstellung;
Fig. 3 ein Beispiel eines Kolbens für eine erfin
dungsgemäße Vorrichtung;
Fig. 4 ein weiteres Beispiel eines Kolbens für
eine erfindungsgemäße Vorrichtung;
Fig. 5 ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Vor
richtung mit einem zusätzlichen Ventil in
verschiedenen Betriebsstellungen und
Fig. 6 ein Beispiel für den optischen Teil einer
erfindungsgemäßen Vorrichtung.
In der Fig. 1 ist ein in einer erfindungsgemäßen
Vorrichtung zu verwendender Lichtwellenleiter 1 in
verschiedenen Ansichten dargestellt. Der Lichtwellen
leiter 1 hat an einer seiner beiden Stirnseiten einen
Lichtabsorber 5 aus einem dunklen, vorzugsweise
schwarzen Kunststoffmaterial, der einen sehr großen
Teil des einfallenden Lichtes absorbiert. Wie außer
dem in Fig. 1 erkennbar, hat der Lichtabsorber 5
Ansätze, die eine Führung und Fixierung bei Einfüh
rung des Lichtwellenleiters 1 in eine nachfolgend
noch näher zu beschreibende Meßkammer 9 ermöglichen.
Möglich ist auch einen oder mehrere solcher Ansätze
am Lichtwellenleiter 1 anzubringen.
An der anderen Stirnfläche des Lichtwellenleiters 1
ist eine Fläche 2 ausgebildet, deren Durchmesser we
sentlich größer als der des Lichtwellenleiters 1 ist
und eine Seite, eines ebenfalls nachfolgend noch nä
her zu beschreibenden Kolbens 6, in Richtung zur Um
gebung abschließt. In der Fläche 2 ist in einem zum
Lichtwellenleiter 1 radial äußeren Bereich eine Öff
nung 3 vorhanden, die temporär mit einem Verschluß 4,
verschlossen ist. Ein solcher Verschluß kann bei
spielsweise eine abzieh- oder durchstechbare Folie
sein.
Die in Fig. 1 dargestellte Seitenansicht macht au
ßerdem den Bereich der Fläche 2 deutlich, auf den das
Licht zur Anregung der Fluoreszenz zu richten ist.
Der so vervollständigte Lichtwellenleiter 1 kann in
eine Meßkammer 9 eines Kolbens 6 eingeführt und mit
dem Kolben an der Fläche 2 verklebt werden, wie dies
in Fig. 2 erkennbar ist.
Dabei ist auf der Oberfläche des Lichtwellenleiters 1
bereits eine chemische oder biochemische Komponente
immobilisiert.
Im Kolben 6 ist außerdem mindestens eine Probensam
melkammer 10 ausgebildet, die mit der Meßkammer 9
verbunden ist, wobei die Probensammelkammer 10 ring
förmig um die Meßkammer 9 ausgebildet sein kann. Die
Probensammelkammer 10 sollte so dimensioniert sein,
daß sie das gesamte oder einen großen Teil des Pro
benflüssigkeitsvolumens aufnehmen kann. Im Kolben 6
ist ein Zufluß 8, der eine Verbindung zwischen der
Meßkammer 9 und dem Inneren des Zylinders 7 dar
stellt, in dem der Kolben 6 mit dem Lichtwellenleiter
1 eingeführt worden ist, vorhanden. Der Zylinder 7
verfügt über einen weiteren Zufluß 11, durch den Pro
benflüssigkeit in das Innere des Zylinders 7 gelangen
kann.
Wird nunmehr der Kolben 6 bewegt, so daß sich der
freie Innenraum im Zylinder vergrößert, kann Proben
flüssigkeit durch den Zufluß 11 in das Innere des
Zylinders 7 gelangen, wie dies auch bei herkömmlichen
Spritzen oder anderen Kolben-Zylinderanordnungen der
Fall ist. Da die Öffnung 3 in der Fläche 2 mit dem
Verschluß 4 geschlossen ist, kann keine Probenflüs
sigkeit durch den Zufluß 8 in die Meßkammer 9 gelan
gen. Erst in dem Moment, in dem die Öffnung 3 zumin
dest teilweise freigegeben wird, kann die in der Pro
bensammelkammer 10 und der Meßkammer 9 enthaltene
Luft entweichen und durch die Probenflüssigkeit ver
drängt werden, die nun durch den Zufluß 8, die Meß
kammer 9 in die Probensammelkammer 10 gelangen kann.
Dabei wird bevorzugt der Zylinder 7, bei fixiertem
Kolben 6 bewegt, so daß sich das freie Volumen im
Inneren des Zylinders 7 verkleinert und bei definier
ter Geschwindigkeit dieser Bewegung auch die entspre
chende Strömungsgeschwindigkeit der Probenflüssigkeit
durch die Meßkammer 9 definiert eingestellt werden
kann. Dabei sollte das Ausströmen der Probenflüssig
keit durch den Zufluß 11 mit Hilfe eines, im weiteren
noch zu erklärenden, Ventils 15 verhinert werden.
Aber auch ohne Bewegung des Zylinders 7 und ohne Ven
til 15 kann ein Probenfluß allein durch Kapillarkräf
te in die Meßkammer 9 und von dort in die Probensam
melkammer 10 erfolgen, wenn der Verschluß 4 entfernt
oder durchstochen wurde.
In der Fig. 3 ist ein weiteres Beispiel eines Kol
bens 6, für eine erfindungsgemäße Vorrichtung ge
zeigt. Dabei ist in dieser Darstellung auch die Kol
bendichtung 13 deutlich erkennbar.
Bei diesem Beispiel ist die Probensammelkammer 10 mit
einem für die Probenflüssigkeit besonders saugfähigen
Material 12 ausgefüllt, wobei in dieser Darstellung
nicht eindeutig erkennbar ist, daß ein Teil des sau
genden Materials 12 zumindest teilweise in die Meß
kammer 9 hineinragen kann.
Mit einer solchen Ausführung kann der Flüssigkeits
transport der Probenflüssigkeit durch die Meßkammer
durch Kapillarkraftwirkung des saugenden Materials
unterstützt werden, wobei auch hier die Probenflüs
sigkeit zuerst durch die Meßkammer 9 strömt, wenn die
Öffnung 3 in der Fläche 2 zumindest teilweise freige
geben ist, und ein Luftaustritt dadurch möglich wird
und der Zufluß 11 offen ist.
In der Fig. 4 ist dargestellt, daß im Zufluß 8 des
Kolbens 6 ein Filter oder eine Immunsäule 14 angeord
net sein kann, durch die die Probenflüssigkeit vor
dem eigentlichen Eintritt in die Meßkammer 9 geführt
werden muß. Es ist auch möglich, daß ein Filter oder
eine Membran den Zufluß 8 auf der Kolbenfläche 23
abdeckt.
In der Fig. 5 ist die Anordnung und Funktion eines
Ventiles 15, das den Zufluß 11 in das Innere des Zy
linders 7 sperrt bzw. frei gibt, dargestellt. Bei
diesem Beispiel wird ein einfaches Klappenventil, mit
Rückschlagwirkung eingesetzt, das im Inneren des Zy
linders 7 im Bereich des Zuflusses 11 angeordnet ist.
Wird nunmehr der Kolben 6, wie dies mit dem rechten
Pfeil deutlich gemacht ist, bewegt, kann Probenflüs
sigkeit durch den Zufluß 11 und das geöffnete Ventil
15 in das Innere des Zylinders 7 gelangen.
Wird die Bewegung des Kolbens 6 beendet, schließt das
Ventil 15 und verhindert so, daß Probenflüssigkeit in
unerwünschter Weise aus dem Inneren des Zylinders 7
über den Zufluß 11 austreten kann.
In dieser Stellung ist außerdem erkennbar, daß der
Verschluß 4 an der Öffnung 3 durchstoßen ist und dem
zufolge die Probenflüssigkeit über den Zufluß 8 in
die Meßkammer 9 gelangen kann, wenn dies, wie mit den
beiden Pfeilen an der unteren Abbildung der Fig. 5
angedeutet, der Zylinder 7 bewegt wird, so daß sich
der freie Innenraum im Zylinder 7 verkleinert und die
Probenflüssigkeit durch den Zufluß 8 gedrückt wird.
Ausgehend von der unteren Darstellung in Fig. 5
durchströmt nunmehr die Probenflüssigkeit die Meßkam
mer 9 und gleichzeitig wird die jeweilige Fluores
zenzmessung durchgeführt, wobei der entsprechende
optische Aufbau in der Fig. 6 erkennbar ist.
Bei dem dort gezeigten Beispiel werden zwei Laserdio
den 16 und 17 als Lichtquellen verwendet, um entweder
parallel zwei verschiedene Analyten zu bestimmen oder
zusätzlich eine Referenzmessung durchzuführen.
Dabei richtet die Laserdiode 16 Licht auf die Einkop
pelfläche des Lichtwellenleiters 1, in einem festen
Winkel, so daß das Lieht zur Fluoreszenzanregung un
ter einem definierten Winkel in den Lichtwellenleiter
1 eingekoppelt und geführt wird.
Bei diesem Beispiel wurde eine Laserdiode 16 verwen
det, die Licht mit einer Wellenlänge aussendet, mit
der Fluoreszenz beim Fluorophor Cy5 angeregt werden
kann.
Das aus dem Lichtwellenleiter 1 ausgekoppelte Licht,
das zu einem kleinen Teil aus Fluoreszenzlicht und
einem wesentlich größeren Teil aus rückgestreutem An
regungslicht besteht, gelangt divergent auf die Linse
18 und wird mit Hilfe der Linse 18 als paralleles
oder annähernd paralleles Strahlenbündel durch den
optischen Filter 19 in Richtung auf den optischen
Detektor 22, zur Messung der jeweiligen Fluoreszenz
intensität gerichtet. Der Detektor 22 kann dabei eine
Photodiode, eine Photoavalangediode oder ein Photo
multipler sein.
Dabei befindet sich im Strahlengang vor dem Detektor
ein Filter 19, das für das Fluoreszenzlicht des Fluo
rophors durchlässig ist und die Anteile an Anregungs-
und Streulicht nicht durchläßt.
Die Linse 18 ist, wie dies ebenfalls in der Fig. 6
erkennbar ist, mit zwei schlitzförmigen Aussparungen
versehen, durch die das Anregungslicht der Laserdio
den 16 und 17 direkt auf die Einkoppelfläche des
Lichtwellenleiters 1 gerichtet werden kann, ohne daß
eine Brechung bzw. Ablenkung des Lichtes durch die
Linse 18 erfolgt.
Die Laserdiode 17 sendet Licht mit einer Wellenlänge
aus, mit der der Fluorophor Cy7 angeregt werden kann.
Da der erfaßbare Anteil an Fluoreszenzlicht, der
letztlich auf den Detektor 22 gelangen kann, relativ
klein ist, ist es günstig, den bereits erwähnten Fil
ter 19 und einen zweiten Filter 20, der für Fluores
zenzlicht des Fluorophors Cy7 durchlässig ist, alter
nierend in den Strahlengang vor den Detektor zu bewe
gen, demzufolge muß selbstverständlich auch die je
weilige Messung alternierend erfolgen und eine Syn
chronisation der Meßsignale des Detektors 22 mit der
Bewegung der beiden Filter 19 und 20 durchgeführt
werden.
In der Fig. 6 ist außerdem dargestellt, daß eine
zusätzliche Linse 21, zur Bündelung des Fluoreszenz
lichtes auf den Detektor 22 in den Strahlengang des
aus dem Lichtwellenleiter 1 ausgekoppelten Lichtes,
im Nachgang zu den Filtern 19 oder 20 angeordnet ist.
Bei diesem Beispiel sind die beiden Laserdioden 16
und 17 diametral gegenüber angeordnet, sie können
jedoch auch in einem anderen nahezu beliebigen Winkel
zueinander angeordnet werden.
Dabei muß jedoch der Auftreffwinkel des jeweiligen
Lichtstrahles der Laserdioden 16 und 17 eingehalten
werden, die unterschiedlich sein können, um eine na
hezu optimale Einkopplung des jeweiligen Anregungs
lichtes in den Lichtwellenleiter 1 zu sichern.
Wie aus Fig. 6 ersichtlich, wird beim Bewegen der
Filter 19 und/oder 20 auch vorteilhaft der Strahlen
gang der jeweils nicht benötigten Lichtquelle unter
brochen. So wird z. B. die Laserdiode 16 und der Fil
ter 19 zusammen betrieben, während das Licht der La
serdiode 17 nicht in den Lichtwellenleiter 1 gelangen
kann, da der Strahlengang durch den Filter 20 unter
brochen wurde. Die Filter 19 und 20 sollten daher
beide so gewählt werden, daß diese für Licht der La
serdioden 16 und 17 undurchlässig sind.
Alternativ zu den Schlitzen in der Linse 18, kann der
Durchmesser der Linse 18 verkleinert werden, so daß
die Lichtstrahlen der Laserdioden 16 und 17 nicht
durch die Linse 18 beeinflußt werden unter Beibehal
tung aller eingestellten Winkel.
Außerdem ist in Fig. 6 noch die Anordnung zweier
optischer Filter 24 und 25 erkennbar, die direkt hin
ter den Laserdioden 16 und 17 in deren Strahlengang
angeordnet sind und durch die das jeweilige Anre
gungslicht entsprechend ihrer Auslegung gefiltert
wird.
Um das Licht für die Anregung der Fluoreszenz unter
einem festen und definierten Winkel auf die Einkop
pelfläche des Lichtwellenleiters 1 zu richten, werden
die Laserdioden 16 und 17 als eine Einheit mit einer
entsprechenden Optik verwendet, die die Lichtstrahl
richtung entsprechend parallel ausrichtet.
Claims (21)
1. Vorrichtung zur Durchführung von Fluoreszenzim
muntests, bei der Licht mindestens einer Licht
quelle (16, 17) über eine Fläche an einem Ende
eines Lichtwellenleiters (1) eingekoppelt wird
und mit dem im Lichtwellenleiter (1) eingekop
pelten Licht durch Evanescentfeldanregung an der
Oberfläche des Lichtwellenleiters Fluoreszenz
von mindestens einem an einen chemischen oder
biochemischen Partner eines allgemeinen Rezep
tor-Ligand-Systems gebundenen Markierungsstoffes
angeregt und das Fluoreszenzlicht zum Teil in
den Lichtwellenleiter (1) eingekoppelt und aus
dem Lichtwellenleiter (1) aus der Fläche, in die
das Licht eingekoppelt wurde, ausgekoppelt wird
und über eine Optik auf einen optischen Detektor
(22) gerichtet ist, mit dem die Intensität des
Fluoreszenzlichtes gemessen wird,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Lichtwellenleiter (1) in einer in einem
Kolben (6) einer Kolben-Zylindereinheit ausge
bildeten Meßkammer (9) aufgenommen und die Meß
kammer (9) über einen im Kolben (6) ausgebilde
ten Zufluß (8) mit dem Innenraum des Zylinders
(7) verbunden ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand zwischen
der inneren Mantelfläche der Meßkammer (9) und
der Oberfläche des Lichtwellenleiters (1) klei
ner als 2 mm ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß im Kolben (6) eine
mit der Meßkammer (9) verbundene Probensammel
kammer (10) ausgebildet ist.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß an der Fläche des
Lichtwellenleiters (1), zur Licht Ein- und Aus
kopplung in dem Lichtleiter, eine den Kolben (6)
verschließende Fläche (2) und am anderen Ende
des Lichtwellenleiters (1) ein Lichtabsorber (5)
angeordnet ist.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß am Lichtabsorber (5)
und/oder am Lichtwellenleiter (1) mindestens ein
Führungsansatz ausgebildet ist.
6. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5,
dadurch gekennzeichnet, daß in der Fläche (2)
eine verschließbare Öffnung (3) vorhanden ist.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß am Zylinder (7) eine
Zuflußöffnung (11) vorhanden ist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß die Zuflußöffnung (11)
mit einem Ventil (15) verschließbar ist.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß in der Probensammel
kammer (10) ein Flüssigkeit aufsaugendes Materi
al (12) aufgenommen ist.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet, daß im oder vor dem Zu
fluß (8) zur Meßkammer (9) ein Filter und/oder
eine Membran und/oder eine Immunsäule (14) an
geordnet ist/sind.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang des
aus dem Lichtwellenleiter (1) ausgekoppelten
Lichtes eine Linse (18) und mindestens ein für
das Fluoreszenzlicht durchlässiges optisches
Filter (19) vor dem optischen Detektor (22) an
geordnet sind.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet, daß die Linse (18) min
destens eine Aussparung aufweist, durch die das
Licht der Lichtquelle (16) auf den Lichtwellen
leiter (1) gerichtet ist.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet, daß eine zweite Licht
quelle (17) und ein zweites optisches Filter
(20) mit dem ersten optischen Filter (19) alter
nierend in den Strahlengang des aus dem Licht
wellenleiter (1) ausgekoppelten Lichtes bewegbar
ist und die zweite Lichtquelle (17) Licht einer
Wellenlänge zur Anregung von Fluoreszenz eines
zweiten Markierungsstoffes sendet.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11-13,
dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem/den
optisch(en) Filter(n) (19, 20) und dem Detektor
(22) eine zweite Linse (21) angeordnet ist.
15. Vorrichtung nach Anspruch 13 oder 14,
dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Filter
(19) und/oder (20) für Licht beider Lichtquellen
(16) und (17) undurchlässig sind.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 15,
dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang zwi
schen den Lichtquellen (16, 17) und der Fläche 2
optische Filter (24, 25) angeordnet sind.
17. Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmun
tests mit einer Vorrichtung nach einem der An
sprüche 1 bis 16,
dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtwellenlei
ter (1) mit einer chemischen oder biochemischen
Komponente beschichtet und in die Meßkammer (9)
eingeführt wird;
anschließend Probenflüssigkeit durch die Meßkam
mer (9) entlang der Oberfläche des Lichtwellen
leiters (1) geleitet wird, bei gleichzeitiger
Fluoreszenzanregung mit in den Lichtwellenleiter
(1) eingekoppeltem Licht einer Lichtquelle (16,
17) und das aus dem Lichtwellenleiter (1) ausge
koppelte Fluoreszenzlicht auf einen die Intensi
tät des Fluoreszenzlichtes messenden optischen
Detektor (22) gerichtet wird, so daß beim Durch
strömen der Probenflüssigkeit das Anbinden des
markierten Partners der biochemischen oder che
mischen Komponente, auf der Oberfläche des
Lichtwellenleiters (1), zeitaufgelöst gemessen
wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17,
dadurch gekennzeichnet, daß die Kolbenstirnflä
che (23) und/oder die innere Oberfläche des Zy
linders (7) und/oder die Oberfläche der Zufluß
öffnung (11) vor der Durchführung des Fluores
zenzimmuntests mit einer chemischen oder bioche
mischen Komponente belegt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18,
dadurch gekennzeichnet, daß zum Durchströmen der
Probenflüssigkeit durch die Meßkammer (9) die
Öffnung (3) zumindest teilweise freigegeben
wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19,
dadurch gekennzeichnet, daß mit zwei Lichtquel
len (16, 17) Licht zur Anregung von Fluoreszenz
zweier verschiedener Markierungsstoffe in den
Lichtwellenleiter (1) eingekoppelt und das aus
gekoppelte Fluoreszenzlicht alternierend, durch
entsprechende Bewegung von zwei Filtern (19, 20)
im Strahlengang des ausgekoppelten Lichtes, ge
messen wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20,
dadurch gekennzeichnet, daß ein zweiter Analyt
in der Probenflüssigkeit bestimmt oder eine Re
ferenzmessung durchgeführt wird.
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