DE19747572C1 - Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmuntests - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Ver­ fahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmuntests, wobei von mindestens einer Lichtquelle Licht auf eine Fläche, an einem Ende eines Lichtwellenleiters ge­ richtet wird und mit dem im Lichtwellenleiter einge­ koppelten Licht durch Evanescentfeldanregung an der Oberfläche des Lichtwellenleiters Fluoreszenz von mindestens einem an einem chemischen oder biochemi­ schen Partner eines allgemeinen Rezeptor-Ligand- Systems gebundenen Markierungsstoffes angeregt wird und das Fluoreszenzlicht zum Teil in den Lichtwellen­ leiter eingekoppelt wird und aus dem Lichtwellenlei­ ter aus der Fläche, in die das anregende Licht einge­ koppelt wurde, ausgekoppelt wird und über eine Optik auf einen optischen Detektor gerichtet wird, mit dem die Intensität des Fluoreszenzlichtes gemessen wird.

Mit der Erfindung können die verschiedensten bioche­ mischen Tests an allgemeinen Rezeptor-Ligand-Syste­ men, wie z. B. Antikörper-Antigen durchgeführt werden. Mit den Tests werden quantitativ chemische oder bio­ chemische Substanzen in flüssigen Proben bestimmt.

So können Antikörper mit einem bestimmten Markie­ rungsstoff (Fluophore) markiert werden, wobei der jeweilige Markierungsstoff bei einer bestimmten Anre­ gungswellenlänge des Lichtes optisch angeregt werden kann und das durch die Anregung erhaltene Fluores­ zenzlicht, das wiederum mit einer anderen Wellenlänge auftritt, mit einem geeigneten optischen Detektor erfaßt und die Intensität des Fluoreszenzlichtes zur Bestimmung des jeweiligen Anteils der chemischen oder biochemischen Substanz aus der Probenflüssigkeit aus­ genutzt wird. Für die Fluoreszenzanregung wird das sich an einer Grenzfläche ausbildende evanescente Feld benutzt. Hierbei müssen die bekannten physikali­ schen Zusammenhänge des evanescenten Feldes und dabei insbesondere die erforderliche Totalreflexion des Anregungslichtes berücksichtigt werden.

So ist aus WO 97/10 506 eine optische Vorrichtung zur Durchführung von Fluoreszenzimmunoassays bekannt, bei der eine Lichtleitfaser verwendet wird, in die Licht einer Lichtquelle eingekoppelt und Fluoreszenz einer Probe durch Evanescentfeldanregung erzeugt wird. Da­ bei wird die Oberfläche des Lichtwellenleiters vor Durchführung des jeweiligen Tests, also der Einlei­ tung der Probenflüssigkeit in einen Behälter, in dem auch die Lichtleitfaser aufgenommen ist, entsprechend mit einer chemischen oder biochemischen Komponente beschichtet.

Für die Einkopplung des Lichtes in die Lichtleitfaser ist eine sehr aufwendige und komplizierte Optik er­ forderlich, die aus einer Mehrzahl einzelner optischer Komponenten besteht. So wird das Licht der verwendeten Lichtquelle über ein Linsensystem auf einen halbdurchlässigen Spiegel gerichtet und ein Teil des Lichtes als Referenzsignal auf einen opti­ schen Detektor und der andere Teil des Lichtes über eine weitere Linse in die Faser eingekoppelt. Dabei ist das der Ein- und Auskoppelfläche entgegengesetzte Ende der Lichtleitfaser verspiegelt, so daß der größ­ te Teil des Anregungs- und Fluoreszenzlichtes wieder aus der Lichtleitfaser ausgekoppelt wird. Dies führt dazu, daß das Verhältnis von Anregungs- zu Fluores­ zenzlicht für die Auswertung mit dem Fotodetektor verschlechtert und demzufolge die Meßgenauigkeit in unerwünschter Weise beeinträchtigt wird.

Ein weiterer Nachteil dieser bekannten Vorrichtung besteht darin, daß das Licht über die vor der Einkop­ pelfläche der Lichtleitfaser angeordnete Linse erfol­ gen soll, so daß ein Lichteintritt unter einem defi­ nierten Hauptwinkel innerhalb eines schmalen Winkel­ bereichs in die Lichtleitfaser, die für die Evanes­ centfeldanregung vorteilhaft erforderlich ist, wenn überhaupt nur sehr schwierig zu erreichen ist.

Die Fluoreszenzimmuntests werden dann nach dieser bekannten Lösung so durchgeführt, daß die in dem Be­ hälter aufgenommene, vorbereitete, beschichtete Lichtleitfaser mit der Probenflüssigkeit in Kontakt gebracht wird, indem durch Perforationen im Deckel des Behälters die Probenflüssigkeit eintritt und die Anbindung an den auf der Oberfläche der Lichtleitfa­ ser immobilisierten komplementären Partner des Rezep­ tor-Ligand-Systems erfolgen kann. Nach der Anbindung wird dann durch Einstrahlung des Lichtes der verwen­ deten Lichtquelle Fluoreszenz angeregt und deren In­ tensität mit dem optischen Detektor gemessen.

Da für den Anbindungsprozeß der jeweilige Stofftrans­ port zur Lichtwellenleiteroberfläche eine Bedeutung hat und dabei Konvektion und Diffusion berücksichtigt werden müssen, treten bei der aus WO 97/10 506 be­ kannten Lösung Meßfehler auf, da das jeweils in den Behälter aufgenommene Probenvolumen konstant ist und das Eindringen der Probenflüssigkeit über die Perfo­ rationen sehr schnell geschieht und die Anbindung damit in einer ruhenden Flüssigkeit erfolgt. In die­ sem Falle wird die Anbindung überwiegend durch Diffu­ sion beeinflußt, was neben anderen Nachteilen auch zur Verlängerung der Meßzeit führt.

Bei dieser Art der nicht zeitlich aufgelösten Messung ist eine Hintergrundkorrektur des Meßsignals notwen­ dig, was in WO 97/10506 nicht berücksichtigt wurde.

Ein weiterer wesentlicher Nachteil, der mit dieser bekannten Lösung verbunden ist, besteht darin, daß lediglich das Anregungslicht allein als Referenzsi­ gnal benutzt wird, um die Genauigkeit der Meßergeb­ nisse zu erhöhen. Zur Verbesserung der Meßgenauigkeit und Aussagekraft der Testergebnisse sowie einer er­ höhten Reproduzierbarkeit ist es jedoch erforderlich, für die Immuntests geeignetere Referenzmessungen durchzuführen.

Daneben ist in US 5,077,012 eine Vorrichtung zur Auf­ nahme biologischer Flüssigkeiten und Proben beschrie­ ben, mit der qualitative und quantitative Tests durchgeführt werden sollen. Sie ist wie eine Spritze aufgebaut, die cytologische Membranen verwendet.

DE 195 46 535 A1 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Probennahme mit integrierter analy­ tisch-chemischer Sensor-Messung. Sie besteht aus ei­ ner mit Chemo- und Biosensoren bestückten Meßkartusche mit integrierten Meßstandards und/oder Speziallösun­ gen, die über Luer-Steckverbindungen zwischen Nadel und Spritze einer Probennahme-Anordnung plaziert wird.

Eine Vorrichtung für eine Fluoreszenzimmunoanalyse, die eine Anregungslichtquelle, einen Detektor, eine optische Faser, mit der ein Antigen bzw. Antikörper verbunden wird, und ein Spektrometer aufweist, ist in DE 42 94 539 T1 beschrieben.

Die Verwendung eines Photometers zum Analysieren flüssiger Medien geht aus DE 34 46 756 C1 hervor. Lichtquelle und Photometer sind dabei in einer Pump­ küvette angeordnet.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine Möglichkeit zu schaffen, um mit geringem Aufwand, in kurzer Zeit Fluoreszenzimmuntests mit hoher Meßgenauigkeit durchführen zu können.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestal­ tungsformen und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich bei Nutzung der in den untergeordneten Ansprü­ chen enthaltenen Merkmale.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung baut auf den bereits beschriebenen bekannten Stand der Technik auf und verwendet ebenfalls mindestens eine Lichtquelle, mit der Licht, zur Fluoreszenzanregung über das evanes­ cente Feld, in einen Lichtwellenleiter eingekoppelt wird und die Intensität des Fluoreszenzlichtes eines Markierungsstoffes, der an einem Partner eines all­ gemeines Rezeptor-Ligand-System gebunden ist, mit einem optischen Detektor bestimmt wird. Dabei wird das Fluoreszenzlicht und ein Teil des Anregungslich­ tes aus der gleichen Fläche ausgekoppelt, in die das Anregungslicht eingekoppelt worden ist. Der Lichtwel­ lenleiter ist dabei in einer Meßkammer aufgenommen, die in einem Kolben einer Kolben-Zylindereinheit aus­ gebildet ist. Die Meßkammer des Kolbens verfügt dabei über einen Zufluß, in den Innenraum des Zylinders, der durch den Kolben führt. Eine solche Kolben-Zylin­ dereinheit kann dabei zumindest annähernd, wie eine herkömmliche Spritze ausgebildet sein, wobei ledig­ lich der Kolben entsprechend mit der Meßkammer modi­ fiziert werden muß.

Eine weitere Verbesserung kann dadurch erreicht wer­ den, in dem im Kolben eine zusätzliche Probensammel­ kammer ausgebildet ist, die mit der Meßkammer in Ver­ bindung steht. Dadurch entsteht eine Einheit, in der die Inkubation und die Messung durchgeführt werden kann und nach Durchführung des jeweiligen Tests die Probe sicher aufgenommen ist und die entsprechende Kolben-Zylindereinheit transportiert und ohne größere Probleme und Gefahrenbildung entsorgt werden kann.

Der Lichtwellenleiter kann an der Seite, an der das Anregungslicht ein- und das Fluoreszenz- und ein Teil des Anregungslichtes wieder ausgekoppelt wird, eine Fläche aufweisen, die den Kolben in diese Richtung verschließt. Sie bildet also auch einen Abschluß für Meß- und Probensammelkammer. Außerdem dient sie zur Fixierung des Lichtwellenleiters an dieser Seite des Kolbens. Dabei kann der Lichtwellenleiter und die Fläche vorteilhaft einstückig aus dem gleichen Mate­ rial, wie beispielsweise einem Polymer, wie Polyme­ thylmethacrylat (PMMA), bestehen.

Am anderen Ende des Lichtwellenleiters ist vorteil­ haft ein Lichtabsorber angeordnet, der bevorzugt aus einem schwarz eingefärbten Kunststoff besteht. Dabei kann der Lichtabsorber so dimensioniert und ausge­ formt sein, daß er den Lichtwellenleiter im unteren Bereich der Meßkammer ausrichtet und fixiert.

Mit dem Lichtabsorber kann ein weiterer günstiger Effekt erreicht werden, der das Verhältnis von Anre­ gungs- und Fluoreszenzlicht zu einem für die Messung günstigen Wert verbessert. Mit Hilfe des Lichtabsor­ bers wird nahezu das ganze Anregungslicht absorbiert, während das Fluoreszenzlicht nur um die Hälfte ver­ ringert wird, so daß das Verhältnis der beiden Licht­ anteile, zugunsten des Fluoreszenzlichtes verschoben ist. Damit können sehr empfindliche Lichtdetektoren verwendet werden, um das schwache Fluoreszenzlicht zu messen.

Für die Durchführung der Tests ist es außerdem gün­ stig, in der Fläche, die den Kolben verschließt, eine verschließbare Öffnung vorzusehen, wobei der Ver­ schluß z. B. eine dünne Folie oder ein entsprechender Stopfen sein kann, die bei Bedarf, worauf später noch zurückzukommen sein wird, entfernt und die Öffnung freigegeben werden kann.

Die jeweilige Probenflüssigkeit kann günstigerweise über eine Zuflußöffnung im Zylinder zugeführt werden, wie dies auch bei herkömmlichen Spritzen der Fall ist.

Dabei sollte die Zuflußöffnung günstigerweise mit einem Ventil, zur Vermeidung eines unerwünschten Pro­ benflüssigkeitsaustrittes aus dem Zylinder, nach des­ sen Befüllung, verschließbar sein.

Eine weitere günstige Ausführung der erfindungsgemä­ ßen Vorrichtung verwendet ein saugfähiges Material, das zumindest in der Probensammelkammer aufgenommen ist, wobei auch ein Teil des saugfähigen Materials in die Meßkammer hineinragen kann.

Vor bzw. in dem bereits erwähnten Zufluß durch den Kolben in die Meßkammer können Filter und/oder eine Immunsäule und/oder eine Membran, die permeabel oder semipermeabel sein kann, vorhanden sein, um bestimmte in der Probenflüssigkeit enthaltene Komponenten von der Messung fernzuhalten oder anderweitig gezielt Einfluß auf die Messung mit der Verwendung einer Im­ munsäule und/oder Membran und/oder des Filters vor­ nehmen zu können.

Die verschiedenen Fluoreszenzimmuntests können nun­ mehr so durchgeführt werden, daß die Oberfläche des Lichtwellenleiters mit verschiedenen chemischen, bzw. biochemischen Komponenten, wie z. B. Antikörper, be­ schichtet wird, wobei die Beschichtung beispielsweise in einem zweistufigen Batchprozeß erfolgen kann. Die­ ser Batchprozeß beinhaltet neben der Beschichtung durch z. B. adsorptive Immobilisierung der jeweiligen Komponenten, auch eine vorherige Reinigung der Licht­ wellenleiteroberfläche. Dies kann in einem einfachen Tauchverfahren durchgeführt werden, mit dem es ein­ fach und effektiv möglich ist, eine relativ hohe An­ zahl solcher Lichtwellenleiter gleichzeitig zu bear­ beiten. Da die Lichtwellenleiter auch durch herkömm­ liche Spritzgießverfahren hergestellt werden können und demzufolge eine Vielzahl an Lichtwellenleitern nach dem Spritzgießen miteinander verbunden zur Ver­ fügung stehen, ist dieser Vorgang selbstverständlich äußerst effektiv durchzuführen.

Die so beschichteten Lichtwellenleiter werden dann in die Meßkammer eines, wie bereits beschrieben ausge­ bildeten Kolbens, eingesetzt, wobei die Öffnung in der Fläche am einen Ende des Lichtwellenleiters, die den Kolben abschließt, ebenfalls verschlossen ist. Die Verbindung dieser Fläche mit dem Kolben kann dann durch Verkleben erfolgen, wobei ein luftdichter Ab­ schluß gesichert sein soll.

Es besteht auch die Möglichkeit, die Stirnfläche des verwendeten Kolbens vor der Einführung in den Zylin­ der, z. B. mit einer Biokomponente zu belegen.

Alternativ kann auch die Oberfläche der Innenseite des Zylinders mit einer lyophilisierten Biokomponente belegt werden. Geeignet ist auch die Belegung der Oberfläche des Zuflußes des Zylinders.

In so vorbereiteter Form kann die erfindungsgemäße Vorrichtung für den jeweiligen Bedarf zur Verfügung gestellt werden, wobei auch längere Lagerzeiten unter entsprechenden Bedingungen ohne weiteres möglich sind.

Die so vorbereitete Kolben-Zylindereinheit kann dann bei Bedarf wie eine Spritze aufgezogen und mit Pro­ benflüssigkeit gefüllt werden, wobei eine definierte Probenflüssigkeitsmenge in den Zylinder eingezogen werden kann. Die Probenflüssigkeit verbleibt aus­ schließlich im Zylinder und kann nicht durch den Zu­ fluß im Kolben in die Meßkammer und demzufolge auch nicht in die Probensammelkammer gelangen, da die dort enthaltene Luft nicht verdrängt werden kann, weil die Öffnung, die einen Luftaustritt ermöglicht, noch ver­ schlossen ist.

Bei Belegung des Zuflusses des Zylinders und/oder der Zylinderoberfläche und/oder der Kolbenstirnfläche mit Biokomponenten treten diese beim Befüllen in die Pro­ benflüssigkeit ein. Dabei kommt es zu einer Wechsel­ wirkung (Vorinkubation) der Biokomponente mit den chemischen oder biochemischen Komponenten der Proben­ flüssigkeit. Nach dieser Vorinkubation kann die ent­ sprechend vorbehandelte Probe in die Meßkammer und dort am Lichtwellenleiter vorbei geführt werden, wenn die Luftaustrittsöffnung an der Abschlußfläche geöff­ net wird. Dies kann bei einer hierfür verwendeten Folie durch deren Entfernung bzw. Durchstechen erfol­ gen. Die Luft aus der Meßkammer und Probensammelkam­ mer kann entweichen und die Kammern werden durch Ka­ pillarkräfte befüllt, wobei die Probenflüssigkeit kontinuierlich an der Lichtwellenleiteroberfläche vorbeifließt. Das Durchströmen der Probenflüssigkeit durch die Meßkammer mit definierter Strömungsge­ schwindigkeit kann auch durch entsprechend gezielte Bewegung des Zylinders, bei fixiertem Spritzenkolben erreicht werden.

Beim Durchströmen der vorinkubierten Probenflüssig­ keit durch die Meßkammer muß der Spritzenkolben defi­ niert gehalten werden, so daß das Licht der Licht­ quelle für das Anregungslicht im richtigen Winkel auf die Fläche trifft und in den Lichtwellenleiter einge­ koppelt werden kann. Wird ein Lichtwellenleiter mit einem Durchmesser von ca. 1 mm verwendet, können re­ lativ große Abstriche an die Positionsgenauigkeit gemacht werden, ohne daß die jeweiligen Meßergebnisse negativ beeinflußt werden.

Das bereits erwähnte Ventil am Zufluß in den Zylinder verhindert, daß die im Zylinder aufgenommene Proben­ flüssigkeit unerwünscht wieder entweichen kann und die gesamte Menge für die Messung ausgenutzt werden kann, insbesondere ist dieses wichtig, wenn der Zy­ linder zum Durchströmen der Meßkammer bewegt wird.

Während des Durchströmens der Probenflüssigkeit durch die Meßkammer und Anbinden der markierten chemischen oder biochemischen Komponente an den an der Lichtwel­ lenleiteroberfläche immobilisierten Partner des Re­ zeptor-Ligand-Systems, wird das mittels der bereits erwähnten Lichtquelle angeregte Fluoreszenzlicht, das aus der Stirnfläche des Lichtwellenleiter ausgekop­ pelt wird, mit dem bereits erwähnten optischen Detek­ tor erfaßt und dessen Intensität gemessen. Der hier­ für zu verwendende optische Aufbau soll später weiter spezifiziert werden.

Eine andere verbesserte Möglichkeit für das Vorbei­ führen der, wie beschrieben, vorinkubierten Proben­ flüssigkeit am Lichtwellenleiter durch die Meßkammer kann aber auch so erfolgen, daß in der Probensammel­ kammer ein für Flüssigkeit stark aussaugendes Materi­ al. wie z. B. Vließ aufgenommen ist. Dieses Material ragt bis in die Meßkammer hinein und die vorinkubier­ te Probenflüssigkeit kann aus dem Zylinder nach Öff­ nung des Verschlusses, der in der Fläche vorhandenen Öffnung, durch Kapillarkraft in die Meßkammer gelan­ gen und wird weiter durch Kapillarkräfte in dem flüs­ sigkeitsaufsaugenden Material solange durch die Meß­ kammer geführt, bis die Probensammelkammer gefüllt ist. Diese führt zu einem stabileren Flüssigkeits­ transport.

Auch hier erfolgt die Messung der Fluoreszenzintensi­ tät in dem Zeitraum, in dem die Probenflüssigkeit am Lichtwellenleiter entlang durch die Meßkammer strömt. Wird eine so ausgebildete Vorrichtung verwendet, kann auf das bereits erwähnte Ventil am Zufluß in den Zy­ linder verzichtet werden, so daß als Zylinder bei­ spielsweise ein herkömmlicher Spritzengrundkörper verwendet werden kann, der kostengünstig erhältlich ist.

Bei Anbindung an eine biochemisch sensibilisierte Oberfläche müssen in einem strömenden System, zwei unterschiedliche Effekte, nämlich Konvektion und Dif­ fusion, berücksichtigt werden.

Aus der Hydrodynamik ist es bekannt, daß ausgehend von laminaren Strömungen, die Strömungsgeschwindig­ keit eines Fluides in einem Rohr oder einem kanalar­ tigen Gebilde, wie dies die erfindungsgemäß ausgebil­ dete Meßkammer ist, variabel mit dem Abstand von der Wandung ist. Dabei liegt die Strömungsgeschwindigkeit direkt an der Wandung bei 0 und steigt mit größer werdendem Abstand zur Wandung an.

Diese Tatsache berücksichtigend, lassen sich zwei Schichten in einer solchen laminaren oder quasilami­ naren Strömung, wie sie bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Sicherheit auftritt, definieren. Dies ist einmal eine hydrodynamische Schicht in einem be­ stimmten Abstand von der Wandung, und zweitens eine diffusive Schicht, wobei die jeweiligen Abstände der Schichten von der Wandung, von der Viskosität und der Strömungsgeschwindigkeit des Fluides abhängig sind.

Oberhalb der diffusiven Schicht, also mit einem grö­ ßeren Abstand von der Wandung, werden die chemischen und biochemischen Komponenten durch Konvektion an die Oberfläche herangeführt und innerhalb der diffusiven Schicht, d. h. in Richtung zur Wandung, erfolgt die Bewegung dann über Diffusionsprozesse. Der Massen­ transport durch Konvektion ist wesentlich größer, als der, der durch Diffusion erreicht werden kann. Dies bedeutet für die relativ schnelle Antigen-Antikörper­ reaktion, daß durch den relativ langsam ablaufenden Diffusionsprozeß der Reaktionsprozeß stark verlang­ samt wird und dies kann dazu führen, daß für einen Immuntest beispielsweise eine Zeit von ca. 1 h benö­ tigt wird, um ein ausreichend genaues Meßergebnis zu ermitteln.

Bei einem diffusiven Stofftransport tritt mit hoher Wahrscheinlichkeit noch eine Rückbindung von bereits gebundenen chemischen- oder biochemischen Komponenten auf, der genauso, wie die Tatsache, daß im Inneren der Strömung die Stoffkonzentration höher als im Be­ reich der diffusiven Schicht ist, das Meßergebnis verfälscht.

Durch Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit des Flui­ des kann die Dicke der diffusiven Schicht verringert werden und so der Einfluß des konvektiven Stofftrans­ portes an die Wandung, an der die chemischen oder biochemischen Komponenten angebunden werden sollen, vergrößert wird. Dadurch wird das Ansprechverhalten des Immuntests stark verbessert und demzufolge die erforderliche Meßzeit verringert.

Alternativ zur Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit kann aber auch bei nicht erhöhter Strömungsgeschwin­ digkeit die Dicke des kanalartigen Durchflusses ver­ kleinert werden, um die Ausdehnung der diffusiven Schicht zu verringern, wie dies bei der erfindungsge­ mäßen Anordnung aus Meßkammer und Lichtwellenleiter vorteilhaft ausgelegt werden kann. Dabei wird der Abstand zwischen Lichtwellenleiteroberfläche und in­ nerer Mantelfläche der Meßkammer möglichst klein ge­ halten. Vorteilhaft ist ein Abstand kleiner 2 mm, bevorzugt zwischen 0,1-0,05 mm, einzuhalten.

Eine so ausgebildete erfindungsgemäße Vorrichtung, wie sie in den verschiedenen Ausführungen beschrieben worden ist, kann preiswert als Massenprodukt herge­ stellt und vorab mit entsprechenden Biokomponenten beschichtet vorbereitet werden. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß ein Kontakt der jeweiligen Proben­ flüssigkeit mit einer Person vermieden wird und diese auch nach Durchführung des Tests sicher verschlossen gehalten ist, was bei medizinischer Anwendung beson­ ders vorteilhaft ist.

Für die Messung der Fluoreszenzintensität ist es gün­ stig, im Strahlengang des aus dem Lichtwellenleiter ausgekoppelten Lichtes, eine Linse und ein für das ausgekoppelte Fluoreszenzlicht durchlässiges optisches Filter vor dem optischen Detektor anzuord­ nen, wobei das Anregungslicht vom optischen Filter gesperrt wird. Von der Linse ausgehend soll das aus­ gekoppelte Licht parallel durch das jeweilige Filter in Richtung auf den optischen Detektor gerichtet wer­ den.

Um einen möglichst großen Anteil des ausgekoppelten Lichtes auf den Detektor zu bekommen, muß eine solche Linse entsprechend groß dimensioniert sein.

Da es aber nachteilig ist, das Anregungslicht der Lichtquelle durch die Linse in den Lichtwellenleiter einzukoppeln, ist es günstig, in der Linse eine Aus­ sparung vorzusehen, durch die der Anregungslicht­ strahl der Lichtquelle ohne Beeinflussung der Linse in den Lichtwellenleiter eingekoppelt wird. Die so erreichbaren besseren Einkoppelverhältnisse in den Lichtwellenleiter rechtfertigen den geringen Verlust an ausgekoppeltem Licht, der infolge der in der Linse ausgebildeten Aussparung auftritt.

Der optische Teil der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann weiter verbessert werden, in dem eine zusätzli­ che zweite Linse im Nachgang zu dem bereits erwähnten optischen Filter im Strahlengang des ausgekoppelten Lichtes angeordnet wird, mit der nunmehr das durch das Filter geführte Fluoreszenzlicht auf den Detektor fokussiert wird. Dabei müssen die optischen Parameter und der Abstand der Linse zum Detektor entsprechend gewählt bzw. eingestellt werden, so daß das Abbild des aus dem Lichtwellenleiter ausgekoppelten Fluores­ zenzlichtes auf dem optischen Detektor abgebildet wird.

Möglich ist aber auch, nur mit einer Linse und einem Filter vor dem Detektor das Licht auf den Detektor zu fokussieren. Diese Anordnung hat dann aber eine ge­ ringe Lichtstärke.

Eine besonders günstige Weiterbildung der Erfindung ergibt sich mit der Verwendung von zwei verschiedenen Lichtquellen mit unterschiedlicher Wellenlänge zur Anregung verschiedener Markierungsstoffe, so daß ent­ weder zwei verschiedene Analyte parallel gemessen werden können oder einer der Analyten als Referenz­ analyt dient und so die Sicherheit des Testergebnis­ ses stark erhöht werden kann, so daß die Forderung nach internen Qualitätskontrollen erfüllt werden kann.

Werden zwei verschiedene Lichtquellen verwendet, sind selbstverständlich auch zwei verschiedene optische Filter für das jeweilige Fluoreszenzlicht erforder­ lich. Diese sollten vorteilhaft so angeordnet und manipulierbar sein, daß sie alternierend in den Strahlengang des ausgekoppelten Lichtes bewegt werden können, so daß sich dort immer nur jeweils eines der beiden Filter für das jeweilige Fluoreszenzlicht be­ findet.

Da die beiden Lichtquellen nicht an einem gleichen Ort angeordnet sein können, ist für die zweite Licht­ quelle, in der ersten Linse eine zusätzliche Ausspa­ rung entsprechend anzuordnen, so daß auch deren Licht direkt auf die Einkoppelfläche des Lichtwellenleiters trifft.

Vorteilhaft ist es beim Einbringen des entsprechenden Filters in den Strahlengang des Fluoreszenzlichtes parallel dazu den Strahlengang der jeweils anderen Anregungsquelle zu unterbrechen, so daß kein Licht dieser Quelle in den Lichtwellenleiter gelangt.

Nachfolgend soll die Erfindung an Ausführungsbeispie­ len näher beschrieben werden.

Dabei zeigen:

Fig. 1 einen Lichtwellenleiter in mehreren Ansich­ ten für eine erfindungsgemäße Vorrichtung;

Fig. 2 eine erfindungsgemäße Vorrichtung in einer Schnittdarstellung;

Fig. 3 ein Beispiel eines Kolbens für eine erfin­ dungsgemäße Vorrichtung;

Fig. 4 ein weiteres Beispiel eines Kolbens für eine erfindungsgemäße Vorrichtung;

Fig. 5 ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Vor­ richtung mit einem zusätzlichen Ventil in verschiedenen Betriebsstellungen und

Fig. 6 ein Beispiel für den optischen Teil einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.

In der Fig. 1 ist ein in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zu verwendender Lichtwellenleiter 1 in verschiedenen Ansichten dargestellt. Der Lichtwellen­ leiter 1 hat an einer seiner beiden Stirnseiten einen Lichtabsorber 5 aus einem dunklen, vorzugsweise schwarzen Kunststoffmaterial, der einen sehr großen Teil des einfallenden Lichtes absorbiert. Wie außer­ dem in Fig. 1 erkennbar, hat der Lichtabsorber 5 Ansätze, die eine Führung und Fixierung bei Einfüh­ rung des Lichtwellenleiters 1 in eine nachfolgend noch näher zu beschreibende Meßkammer 9 ermöglichen. Möglich ist auch einen oder mehrere solcher Ansätze am Lichtwellenleiter 1 anzubringen.

An der anderen Stirnfläche des Lichtwellenleiters 1 ist eine Fläche 2 ausgebildet, deren Durchmesser we­ sentlich größer als der des Lichtwellenleiters 1 ist und eine Seite, eines ebenfalls nachfolgend noch nä­ her zu beschreibenden Kolbens 6, in Richtung zur Um­ gebung abschließt. In der Fläche 2 ist in einem zum Lichtwellenleiter 1 radial äußeren Bereich eine Öff­ nung 3 vorhanden, die temporär mit einem Verschluß 4, verschlossen ist. Ein solcher Verschluß kann bei­ spielsweise eine abzieh- oder durchstechbare Folie sein.

Die in Fig. 1 dargestellte Seitenansicht macht au­ ßerdem den Bereich der Fläche 2 deutlich, auf den das Licht zur Anregung der Fluoreszenz zu richten ist.

Der so vervollständigte Lichtwellenleiter 1 kann in eine Meßkammer 9 eines Kolbens 6 eingeführt und mit dem Kolben an der Fläche 2 verklebt werden, wie dies in Fig. 2 erkennbar ist.

Dabei ist auf der Oberfläche des Lichtwellenleiters 1 bereits eine chemische oder biochemische Komponente immobilisiert.

Im Kolben 6 ist außerdem mindestens eine Probensam­ melkammer 10 ausgebildet, die mit der Meßkammer 9 verbunden ist, wobei die Probensammelkammer 10 ring­ förmig um die Meßkammer 9 ausgebildet sein kann. Die Probensammelkammer 10 sollte so dimensioniert sein, daß sie das gesamte oder einen großen Teil des Pro­ benflüssigkeitsvolumens aufnehmen kann. Im Kolben 6 ist ein Zufluß 8, der eine Verbindung zwischen der Meßkammer 9 und dem Inneren des Zylinders 7 dar­ stellt, in dem der Kolben 6 mit dem Lichtwellenleiter 1 eingeführt worden ist, vorhanden. Der Zylinder 7 verfügt über einen weiteren Zufluß 11, durch den Pro­ benflüssigkeit in das Innere des Zylinders 7 gelangen kann.

Wird nunmehr der Kolben 6 bewegt, so daß sich der freie Innenraum im Zylinder vergrößert, kann Proben­ flüssigkeit durch den Zufluß 11 in das Innere des Zylinders 7 gelangen, wie dies auch bei herkömmlichen Spritzen oder anderen Kolben-Zylinderanordnungen der Fall ist. Da die Öffnung 3 in der Fläche 2 mit dem Verschluß 4 geschlossen ist, kann keine Probenflüs­ sigkeit durch den Zufluß 8 in die Meßkammer 9 gelan­ gen. Erst in dem Moment, in dem die Öffnung 3 zumin­ dest teilweise freigegeben wird, kann die in der Pro­ bensammelkammer 10 und der Meßkammer 9 enthaltene Luft entweichen und durch die Probenflüssigkeit ver­ drängt werden, die nun durch den Zufluß 8, die Meß­ kammer 9 in die Probensammelkammer 10 gelangen kann. Dabei wird bevorzugt der Zylinder 7, bei fixiertem Kolben 6 bewegt, so daß sich das freie Volumen im Inneren des Zylinders 7 verkleinert und bei definier­ ter Geschwindigkeit dieser Bewegung auch die entspre­ chende Strömungsgeschwindigkeit der Probenflüssigkeit durch die Meßkammer 9 definiert eingestellt werden kann. Dabei sollte das Ausströmen der Probenflüssig­ keit durch den Zufluß 11 mit Hilfe eines, im weiteren noch zu erklärenden, Ventils 15 verhinert werden. Aber auch ohne Bewegung des Zylinders 7 und ohne Ven­ til 15 kann ein Probenfluß allein durch Kapillarkräf­ te in die Meßkammer 9 und von dort in die Probensam­ melkammer 10 erfolgen, wenn der Verschluß 4 entfernt oder durchstochen wurde.

In der Fig. 3 ist ein weiteres Beispiel eines Kol­ bens 6, für eine erfindungsgemäße Vorrichtung ge­ zeigt. Dabei ist in dieser Darstellung auch die Kol­ bendichtung 13 deutlich erkennbar.

Bei diesem Beispiel ist die Probensammelkammer 10 mit einem für die Probenflüssigkeit besonders saugfähigen Material 12 ausgefüllt, wobei in dieser Darstellung nicht eindeutig erkennbar ist, daß ein Teil des sau­ genden Materials 12 zumindest teilweise in die Meß­ kammer 9 hineinragen kann.

Mit einer solchen Ausführung kann der Flüssigkeits­ transport der Probenflüssigkeit durch die Meßkammer durch Kapillarkraftwirkung des saugenden Materials unterstützt werden, wobei auch hier die Probenflüs­ sigkeit zuerst durch die Meßkammer 9 strömt, wenn die Öffnung 3 in der Fläche 2 zumindest teilweise freige­ geben ist, und ein Luftaustritt dadurch möglich wird und der Zufluß 11 offen ist.

In der Fig. 4 ist dargestellt, daß im Zufluß 8 des Kolbens 6 ein Filter oder eine Immunsäule 14 angeord­ net sein kann, durch die die Probenflüssigkeit vor dem eigentlichen Eintritt in die Meßkammer 9 geführt werden muß. Es ist auch möglich, daß ein Filter oder eine Membran den Zufluß 8 auf der Kolbenfläche 23 abdeckt.

In der Fig. 5 ist die Anordnung und Funktion eines Ventiles 15, das den Zufluß 11 in das Innere des Zy­ linders 7 sperrt bzw. frei gibt, dargestellt. Bei diesem Beispiel wird ein einfaches Klappenventil, mit Rückschlagwirkung eingesetzt, das im Inneren des Zy­ linders 7 im Bereich des Zuflusses 11 angeordnet ist.

Wird nunmehr der Kolben 6, wie dies mit dem rechten Pfeil deutlich gemacht ist, bewegt, kann Probenflüs­ sigkeit durch den Zufluß 11 und das geöffnete Ventil 15 in das Innere des Zylinders 7 gelangen.

Wird die Bewegung des Kolbens 6 beendet, schließt das Ventil 15 und verhindert so, daß Probenflüssigkeit in unerwünschter Weise aus dem Inneren des Zylinders 7 über den Zufluß 11 austreten kann.

In dieser Stellung ist außerdem erkennbar, daß der Verschluß 4 an der Öffnung 3 durchstoßen ist und dem­ zufolge die Probenflüssigkeit über den Zufluß 8 in die Meßkammer 9 gelangen kann, wenn dies, wie mit den beiden Pfeilen an der unteren Abbildung der Fig. 5 angedeutet, der Zylinder 7 bewegt wird, so daß sich der freie Innenraum im Zylinder 7 verkleinert und die Probenflüssigkeit durch den Zufluß 8 gedrückt wird.

Ausgehend von der unteren Darstellung in Fig. 5 durchströmt nunmehr die Probenflüssigkeit die Meßkam­ mer 9 und gleichzeitig wird die jeweilige Fluores­ zenzmessung durchgeführt, wobei der entsprechende optische Aufbau in der Fig. 6 erkennbar ist.

Bei dem dort gezeigten Beispiel werden zwei Laserdio­ den 16 und 17 als Lichtquellen verwendet, um entweder parallel zwei verschiedene Analyten zu bestimmen oder zusätzlich eine Referenzmessung durchzuführen.

Dabei richtet die Laserdiode 16 Licht auf die Einkop­ pelfläche des Lichtwellenleiters 1, in einem festen Winkel, so daß das Lieht zur Fluoreszenzanregung un­ ter einem definierten Winkel in den Lichtwellenleiter 1 eingekoppelt und geführt wird.

Bei diesem Beispiel wurde eine Laserdiode 16 verwen­ det, die Licht mit einer Wellenlänge aussendet, mit der Fluoreszenz beim Fluorophor Cy5 angeregt werden kann.

Das aus dem Lichtwellenleiter 1 ausgekoppelte Licht, das zu einem kleinen Teil aus Fluoreszenzlicht und einem wesentlich größeren Teil aus rückgestreutem An­ regungslicht besteht, gelangt divergent auf die Linse 18 und wird mit Hilfe der Linse 18 als paralleles oder annähernd paralleles Strahlenbündel durch den optischen Filter 19 in Richtung auf den optischen Detektor 22, zur Messung der jeweiligen Fluoreszenz­ intensität gerichtet. Der Detektor 22 kann dabei eine Photodiode, eine Photoavalangediode oder ein Photo­ multipler sein.

Dabei befindet sich im Strahlengang vor dem Detektor ein Filter 19, das für das Fluoreszenzlicht des Fluo­ rophors durchlässig ist und die Anteile an Anregungs- und Streulicht nicht durchläßt.

Die Linse 18 ist, wie dies ebenfalls in der Fig. 6 erkennbar ist, mit zwei schlitzförmigen Aussparungen versehen, durch die das Anregungslicht der Laserdio­ den 16 und 17 direkt auf die Einkoppelfläche des Lichtwellenleiters 1 gerichtet werden kann, ohne daß eine Brechung bzw. Ablenkung des Lichtes durch die Linse 18 erfolgt.

Die Laserdiode 17 sendet Licht mit einer Wellenlänge aus, mit der der Fluorophor Cy7 angeregt werden kann.

Da der erfaßbare Anteil an Fluoreszenzlicht, der letztlich auf den Detektor 22 gelangen kann, relativ klein ist, ist es günstig, den bereits erwähnten Fil­ ter 19 und einen zweiten Filter 20, der für Fluores­ zenzlicht des Fluorophors Cy7 durchlässig ist, alter­ nierend in den Strahlengang vor den Detektor zu bewe­ gen, demzufolge muß selbstverständlich auch die je­ weilige Messung alternierend erfolgen und eine Syn­ chronisation der Meßsignale des Detektors 22 mit der Bewegung der beiden Filter 19 und 20 durchgeführt werden.

In der Fig. 6 ist außerdem dargestellt, daß eine zusätzliche Linse 21, zur Bündelung des Fluoreszenz­ lichtes auf den Detektor 22 in den Strahlengang des aus dem Lichtwellenleiter 1 ausgekoppelten Lichtes, im Nachgang zu den Filtern 19 oder 20 angeordnet ist.

Bei diesem Beispiel sind die beiden Laserdioden 16 und 17 diametral gegenüber angeordnet, sie können jedoch auch in einem anderen nahezu beliebigen Winkel zueinander angeordnet werden.

Dabei muß jedoch der Auftreffwinkel des jeweiligen Lichtstrahles der Laserdioden 16 und 17 eingehalten werden, die unterschiedlich sein können, um eine na­ hezu optimale Einkopplung des jeweiligen Anregungs­ lichtes in den Lichtwellenleiter 1 zu sichern.

Wie aus Fig. 6 ersichtlich, wird beim Bewegen der Filter 19 und/oder 20 auch vorteilhaft der Strahlen­ gang der jeweils nicht benötigten Lichtquelle unter­ brochen. So wird z. B. die Laserdiode 16 und der Fil­ ter 19 zusammen betrieben, während das Licht der La­ serdiode 17 nicht in den Lichtwellenleiter 1 gelangen kann, da der Strahlengang durch den Filter 20 unter­ brochen wurde. Die Filter 19 und 20 sollten daher beide so gewählt werden, daß diese für Licht der La­ serdioden 16 und 17 undurchlässig sind.

Alternativ zu den Schlitzen in der Linse 18, kann der Durchmesser der Linse 18 verkleinert werden, so daß die Lichtstrahlen der Laserdioden 16 und 17 nicht durch die Linse 18 beeinflußt werden unter Beibehal­ tung aller eingestellten Winkel.

Außerdem ist in Fig. 6 noch die Anordnung zweier optischer Filter 24 und 25 erkennbar, die direkt hin­ ter den Laserdioden 16 und 17 in deren Strahlengang angeordnet sind und durch die das jeweilige Anre­ gungslicht entsprechend ihrer Auslegung gefiltert wird.

Um das Licht für die Anregung der Fluoreszenz unter einem festen und definierten Winkel auf die Einkop­ pelfläche des Lichtwellenleiters 1 zu richten, werden die Laserdioden 16 und 17 als eine Einheit mit einer entsprechenden Optik verwendet, die die Lichtstrahl­ richtung entsprechend parallel ausrichtet.

Claims (21)

1. Vorrichtung zur Durchführung von Fluoreszenzim­ muntests, bei der Licht mindestens einer Licht­ quelle (16, 17) über eine Fläche an einem Ende eines Lichtwellenleiters (1) eingekoppelt wird und mit dem im Lichtwellenleiter (1) eingekop­ pelten Licht durch Evanescentfeldanregung an der Oberfläche des Lichtwellenleiters Fluoreszenz von mindestens einem an einen chemischen oder biochemischen Partner eines allgemeinen Rezep­ tor-Ligand-Systems gebundenen Markierungsstoffes angeregt und das Fluoreszenzlicht zum Teil in den Lichtwellenleiter (1) eingekoppelt und aus dem Lichtwellenleiter (1) aus der Fläche, in die das Licht eingekoppelt wurde, ausgekoppelt wird und über eine Optik auf einen optischen Detektor (22) gerichtet ist, mit dem die Intensität des Fluoreszenzlichtes gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtwellenleiter (1) in einer in einem Kolben (6) einer Kolben-Zylindereinheit ausge­ bildeten Meßkammer (9) aufgenommen und die Meß­ kammer (9) über einen im Kolben (6) ausgebilde­ ten Zufluß (8) mit dem Innenraum des Zylinders (7) verbunden ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand zwischen der inneren Mantelfläche der Meßkammer (9) und der Oberfläche des Lichtwellenleiters (1) klei­ ner als 2 mm ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß im Kolben (6) eine mit der Meßkammer (9) verbundene Probensammel­ kammer (10) ausgebildet ist.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß an der Fläche des Lichtwellenleiters (1), zur Licht Ein- und Aus­ kopplung in dem Lichtleiter, eine den Kolben (6) verschließende Fläche (2) und am anderen Ende des Lichtwellenleiters (1) ein Lichtabsorber (5) angeordnet ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß am Lichtabsorber (5) und/oder am Lichtwellenleiter (1) mindestens ein Führungsansatz ausgebildet ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß in der Fläche (2) eine verschließbare Öffnung (3) vorhanden ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß am Zylinder (7) eine Zuflußöffnung (11) vorhanden ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuflußöffnung (11) mit einem Ventil (15) verschließbar ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in der Probensammel­ kammer (10) ein Flüssigkeit aufsaugendes Materi­ al (12) aufgenommen ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß im oder vor dem Zu­ fluß (8) zur Meßkammer (9) ein Filter und/oder eine Membran und/oder eine Immunsäule (14) an­ geordnet ist/sind.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang des aus dem Lichtwellenleiter (1) ausgekoppelten Lichtes eine Linse (18) und mindestens ein für das Fluoreszenzlicht durchlässiges optisches Filter (19) vor dem optischen Detektor (22) an­ geordnet sind.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Linse (18) min­ destens eine Aussparung aufweist, durch die das Licht der Lichtquelle (16) auf den Lichtwellen­ leiter (1) gerichtet ist.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine zweite Licht­ quelle (17) und ein zweites optisches Filter (20) mit dem ersten optischen Filter (19) alter­ nierend in den Strahlengang des aus dem Licht­ wellenleiter (1) ausgekoppelten Lichtes bewegbar ist und die zweite Lichtquelle (17) Licht einer Wellenlänge zur Anregung von Fluoreszenz eines zweiten Markierungsstoffes sendet.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11-13, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem/den optisch(en) Filter(n) (19, 20) und dem Detektor (22) eine zweite Linse (21) angeordnet ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Filter (19) und/oder (20) für Licht beider Lichtquellen (16) und (17) undurchlässig sind.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang zwi­ schen den Lichtquellen (16, 17) und der Fläche 2 optische Filter (24, 25) angeordnet sind.

17. Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmun­ tests mit einer Vorrichtung nach einem der An­ sprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtwellenlei­ ter (1) mit einer chemischen oder biochemischen Komponente beschichtet und in die Meßkammer (9) eingeführt wird; anschließend Probenflüssigkeit durch die Meßkam­ mer (9) entlang der Oberfläche des Lichtwellen­ leiters (1) geleitet wird, bei gleichzeitiger Fluoreszenzanregung mit in den Lichtwellenleiter (1) eingekoppeltem Licht einer Lichtquelle (16, 17) und das aus dem Lichtwellenleiter (1) ausge­ koppelte Fluoreszenzlicht auf einen die Intensi­ tät des Fluoreszenzlichtes messenden optischen Detektor (22) gerichtet wird, so daß beim Durch­ strömen der Probenflüssigkeit das Anbinden des markierten Partners der biochemischen oder che­ mischen Komponente, auf der Oberfläche des Lichtwellenleiters (1), zeitaufgelöst gemessen wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Kolbenstirnflä­ che (23) und/oder die innere Oberfläche des Zy­ linders (7) und/oder die Oberfläche der Zufluß­ öffnung (11) vor der Durchführung des Fluores­ zenzimmuntests mit einer chemischen oder bioche­ mischen Komponente belegt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß zum Durchströmen der Probenflüssigkeit durch die Meßkammer (9) die Öffnung (3) zumindest teilweise freigegeben wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß mit zwei Lichtquel­ len (16, 17) Licht zur Anregung von Fluoreszenz zweier verschiedener Markierungsstoffe in den Lichtwellenleiter (1) eingekoppelt und das aus­ gekoppelte Fluoreszenzlicht alternierend, durch entsprechende Bewegung von zwei Filtern (19, 20) im Strahlengang des ausgekoppelten Lichtes, ge­ messen wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß ein zweiter Analyt in der Probenflüssigkeit bestimmt oder eine Re­ ferenzmessung durchgeführt wird.