DE19802378A1

DE19802378A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Abtastung eines chemischen Arrays

Info

Publication number: DE19802378A1
Application number: DE19802378A
Authority: DE
Inventors: Andreas Dorsel; Steven M Lefkowitz; John W Sadler
Original assignee: Hewlett Packard Co
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 1997-01-30
Filing date: 1998-01-22
Publication date: 1998-08-06
Anticipated expiration: 2018-01-23
Also published as: JPH10311796A; US5837475A; US5945679A; JP4106120B2; DE19802378C2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Erfassen von Chemikalien in einem chemischen Array und insbesondere auf das Verbessern des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses durch Wie derholen des Abtastens der Pixel des Arrays.

In jüngster Zeit wurden chemische Arrays insbesondere bio molekulare Arrays erfolgreich erzeugt. Beispielsweise offen baren Fodor u. a., "Light-directed, Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis", Science, Band 251, 767-773 (1991), hochdichte Arrays, die durch eine lichtgerichtete Synthese gebildet sind. Das Array wurde für eine Antikörper erkennung verwendet. Biomolekulare Arrays werden ferner durch E. Southern (PCT-Veröffentlichung WO 89/10977) zum Analysieren von Polynucleotidsequenzen beschrieben. Der artige biomolekulare Arrays eignen sich für eine große An zahl von Anwendungen von der DNA- und Protein-Sequenzierung zu dem DNA-Fingerabdrucknehmen und der Krankheitsdiagnose.

Ein typischer Lösungsansatz zum Synthetisieren eines Poly merarrays auf einem optischen Substrat wird durch Fodor u. a. (1991) supra, PCT-Veröffentlichungen WO 91/07087, WO 92/10587 und WO 92/10588; und US-Patent Nr. 5,143,854, be schrieben. Bei derartigen Arrays werden unterschiedliche Re zeptoren auf einem Substrat unter Verwendung von photolitho graphischen Techniken synthetisiert. Liganden werden über das Array gewaschen. Entweder ist der Ligand fluoreszierend gekennzeichnet oder es wird ein zusätzlicher, fluoreszierend gekennzeichneter Rezeptor ferner über das Array gewaschen. Das Resultat besteht darin, daß Fluorophore auf den Pixeln festgesetzt werden, wo eine Bindung zwischen dem Liganden und dem Rezeptor(en) stattgefunden hat. Allgemein wird ein chemisches Array mit einer Strahlung beleuchtet, die die Fluorophore erregt. Die Struktur der hellen und dunklen Pixel wird aufgezeichnet. Informationen über den Liganden werden durch Vergleichen dieser Hell-Dunkel-Struktur mit bekannten Strukturen von oberflächengebundenen Rezeptoren verglichen.

Bei vielen Anwendungen, z. B. beim Analysieren des menschli chen Genoms, ist es oft notwendig, eine große Anzahl von Arrayelementen abzutasten. Daher ist die Fähigkeit, ein che misches Array mit einer großen Anzahl von Elementen inner halb einer kurzen Zeit zu lesen, sehr wünschenswert. Es wur den Laser verwendet, um auf chemische Arrayelemente mit ei nem Strahl einer kleinen Fleckgröße und einer hohen Intensi tät aufzutreffen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum schnellen Analysieren von Chemikalien in einem chemischen Array mit einer großen An zahl von Elementen zu schaffen.

Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung zum Analysieren von Chemikalien in einem Array gemäß Anspruch 1, ein Ver fahren zum Analysieren eines chemischen Arrays gemäß An spruch 8 und ein Verfahren zum Analysieren eines chemischen Arrays gemäß Anspruch 16 gelöst.

Die vorliegende Erfindung schafft eine Vorrichtung und eine Technik zum Analysieren von Chemikalien in einem chemischen Array, das abgetastet wird, d. h. durch Bestrahlen und Er fassen jeglicher resultierender Lichtwechselwirkung, wie z. B. der Fluoreszenz in Pixelzeilen, gelesen wird. Es wird vermutet, daß einige der Pixel Zielchemikalien enthalten, die ein fluoreszierendes Material enthalten. Die Vorrichtung umfaßt eine Lichtquelle, eine Steuerung und einen Detektor. Die Lichtquelle wird zum Strahlen eines Lichtstrahls auf die einzelnen Pixel verwendet. Die Lichtquelle kann einen Licht generator, wie z. B. einen Laser, und eine Vorrichtung zum Richten eines Lichtstrahls von dem Lichtgenerator, wie z. B. einen Scanner (= Abtastvorrichtung), enthalten. Die Steue rung steuert die relative Position der Lichtquelle zu der selben der Pixel, derart, daß die Lichtquelle den Licht strahl derart richtet, um Pixel in einem Satz sequentiell in dem Array zu bestrahlen. Die sequentielle Bestrahlung wird auf dem Pixelsatz ein oder mehrere Male wiederholt, bevor ein zweiter Pixelsatz bestrahlt wird, der Pixel enthält, die sich von den Pixeln in dem ersten Pixelsatz unterscheiden. Der erste Pixelsatz weist mehr als ein Pixel, jedoch weniger als die Gesamtzahl der Pixel in dem Array auf. Der Detektor wird zum Erfassen der Fluoreszenz verwendet, die aus der Be strahlung des Arrays resultiert.

Die Vorrichtung und Technik der vorliegenden Erfindung kann vorteilhaft verwendet werden, um chemische Arrays, insbeson dere große chemische Arrays, zu analysieren, die Tausende oder Millionen von kleinen Pixeln enthalten, wenn dieselben abgetastet werden. Durch Ermöglichen einer adäquaten Zeit dazu, daß sich die Farbstoffmoleküle in den Pixeln von den metastabilen Zuständen erholen können, die nicht fluores zieren können, können mehr Signale erhalten werden, um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu verbessern ohne die Erre gungsstrahlintensität zu erhöhen. Es wird jedoch durch Redu zieren der Zeit vor dem Wiederholen der Bestrahlung eines Pixels und des Abstands, der durch den Strahl zwischen den Neubestrahlungen (d. h. dem Wiederholen der Bestrahlung) eines Pixels durchlaufen wird, eine genauere Überlagerung erreicht, die zu zuverlässigeren Daten führt.

Bevorzugte Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung ge mäß der vorliegenden Erfindung;

Fig. 2 eine schematische Darstellung weiterer Details ei ner Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung;

Fig. 3 ein Flußdiagramm, das den Prozeß des Lesens eines chemischen Arrays gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt; und

Fig. 4 eine schematische Darstellung, um einige der Ener gieniveaus eines Farbstoffs darzustellen.

Die vorliegende Erfindung schafft eine verbesserte Technik zum Analysieren eines chemischen Arrays durch Wiederholen der Beleuchtung und Erfassen der resultierenden Fluoreszenz eines Pixelsatzes in dem Array vor dem Bewegen zu einem weiteren Pixelsatz. In jedem Pixelsatz werden alle Pixel sequentiell vor dem Wiederholen beleuchtet. Dies verbessert das Signal-zu-Rausch-Verhältnis durch Ermöglichen einer adä quaten Zeit für den Farbstoff dazu, um sich von den meta stabilen Zuständen zu erholen, bevor derselbe wiederum be leuchtet wird.

Wie hierin verwendet, ist ein "Array" eine Anordnung von Ob jekten im Raum, in dem jedes Objekt eine getrennte, vorbe stimmte, räumliche Position einnimmt. Jedes der Objekte oder Arrayelemente (die viele Pixel enthalten können, wenn die selben mit Lichtpulsen abgetastet werden) in dem Array in einer Vorrichtung dieser Erfindung enthält eine oder mehrere Spezies von chemischen Bindemittelanteilen zum Binden von spezifischen Analytika, derart, daß die physische Position jeder Spezies von Analytika bekannt oder feststellbar ist. "Pixel" sind Flecken eines Arrays, dessen Flecken beleuchtet werden, und das resultierende Licht von den Flecken wird als diskrete Elemente erfaßt, um eine Bildstruktur zu bilden, wenn das Array analysiert wird. Ein "Analytikum" ist ein Molekül, dessen Erfassung in einer Probe erwünscht ist, und das sich selektiv oder spezifisch an einen chemischen Binde mittelanteil bindet, wie z. B. eine molekulare Sonde. Ein Analytikum kann von dem gleichen oder einem anderen Molekül typ wie die molekulare Sonde sein, an die dasselbe gebunden ist.

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zum Analysieren von chemischen Arrays gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 100 enthält eine Lichtquelle (z. B. einen Laser) 102 zum Emittieren eines Lichts einer Wel lenlänge und mit einer ausreichenden Intensität, um eine Fluoreszenz in einem ausgewählten fluoreszierenden Material zu bewirken. Oftmals ist die Erregungslichtintensität aus reichend hoch, derart, daß der Farbstoff, der in dem chemi schen Array 104 verwendet wird, sich einer metastabilen Zu standssättigung nähert, d. h. einige der Farbstoffmoleküle kreuzen in metastabile Zustände. Eine Steuerung 108 richtet das Licht von der Lichtquelle 102, so daß dasselbe auf den Elementen des Arrays ein Pixel nach dem anderen auftrifft. Dies kann beispielsweise unter Verwendung einer Steuerung erreicht werden, um die relative Position der Lichtquelle 102 zu dem chemischen Array 104 zu ändern, z. B. durch Bewe gen des Lichtgenerators (z. B. eines Lasers) in der Licht quelle, durch Bewegen des chemischen Arrays oder durch Steuern eines Lichtstrahls, z. B. unter Verwendung eines Scanners, derart, daß unterschiedliche Pixel zu unterschied lichen Zeitpunkten beleuchtet werden können. Typischerweise wird der Lichtstrahl durch Translation des Arrays auf einem Objekttisch (in Fig. 1 nicht gezeigt) oder durch Abtasten des Lichtstrahls mit einem Strahlscanner gerichtet. Der Farbstoff emittiert, wenn derselbe durch das Erregungslicht von der Lichtquelle 102 erregt wird, eine Fluoreszenz, die durch einen Detektor 110 erfaßt wird. Die Fluoreszenzinten sität kann auch gemessen werden.

Fig. 2 zeigt detaillierter ein Ausführungsbeispiel der Vor richtung von Fig. 1. Die Vorrichtung 200 weist einen Laser 204 auf, der einen Erregungslaserstrahl emittiert. Ein Scan ner 208 richtet den Laserstrahl durch ein optisches System 212 zu einem chemischen Array 216, um eine Fluoreszenz zu bewirken. Das optische System 212 kann beispielsweise eine ausrichtende Optik, wie z. B. Linsen und Prismen, enthalten, um den Laserstrahl auf die Pixel in dem chemischen Array zu fokussieren.

Das fluoreszierende Licht, das von dem Array resultiert, der durch den Laserstrahl bestrahlt wird, wird durch ein opti sches System 220 gesammelt, das z. B. Linsen und Prismen enthalten kann, um das fluoreszierende Licht zu einem Detek tor 224 zu richten. Die optischen Systeme 220 können ferner Filter und Blenden enthalten, um ungewolltes Licht, wie z. B. Erregungslicht, hinauszufiltern. Eine Steuerung 228 ist elektrisch mit dem Detektor 224 zum Sammeln von elektrischen Signalen verbunden, die in dem Detektor als ein Resultat des Fluoreszenzlichts erzeugt werden, das auf den Detektor trifft. Die Steuerung 228 ist mit einem Scanner 208 verbun den, derart, daß jedes Fluoreszenzlichtsignal, das durch den Detektor 224 empfangen wird, zu dem Pixel verfolgt werden kann, von dem das Fluoreszenzlichtsignal erzeugt wird. Die Steuerung 228 ist ferner mit dem Laser 204 verbunden, und dieselbe kann verwendet werden, um den Laser zu steuern, um Lichtpulse einer spezifischen Dauer zu emittieren. Der Scan ner 208 wird verwendet, um den Laserstrahl von einem Pixel zu einem anderen Pixel zwischen Pulsen zu bewegen. Wenn es jedoch erwünscht ist, kann der Laser einen kontinuierlichen Strahl emittieren, sowie der Scanner den Laserstrahl von Pixel zu Pixel richtet. Alternativ kann, statt dem Abtasten, d. h. dem Bewegen, des Erregungsstrahls, das chemische Array 216 gesteuert werden, um zu translatieren, um unterschied liche Pixel unter dem fokussierten Erregungsstrahl zu unter schiedlichen Zeitpunkten zu positionieren. Eine weitere Al ternative besteht darin zu steuern, um physisch den Laser 204 zu bewegen, um den Laserstrahl auf unterschiedliche Pi xel zu richten.

Die Daten von Signalen, die durch die Steuerung 228 empfan gen werden, können verarbeitet werden, um die Anwesenheit oder die Menge von Analytika in den Pixeln zu bestimmen. Um dies zu erreichen, kann die Steuerung 228 einen Mikroprozes sor oder einen Computer enthalten, um die Informationen auf den Pixelpositionen und die Fluoreszenz zu verarbeiten. Die Signale von dem Detektor 224 oder die Informationen von der Steuerung 228 können ferner zu einem weiteren Prozessor 232 für eine weitere Datenverarbeitung und zu einem Speiche rungsgerät 236, wie z. B. einer Platte, Bändern, Kompakt platten und dergleichen, übertragen werden. Die Informatio nen von der Steuerung 228 oder dem Prozessor 232 können fer ner in einem Anzeigegerät 240 angezeigt werden, wie z. B. einer Kathodenstrahlröhre, einem Plotter (= Zeichengerät), einem Drucker und dergleichen. Wenn es erwünscht ist, können unterschiedliche Computer und Mikroprozessoren verwendet werden, um die relative Lichtstrahl/Pixel-Position zu steu ern, und um die Daten der Pixelposition und die Fluoreszenz struktur zu verbinden.

Verfahren zum Lesen des Arrays

Fig. 3 zeigt die Technik zum Analysieren, d. h. Lesen oder Abtasten (d. h. Lesen), von Pixeln in einem chemischen Array gemäß der vorliegenden Erfindung. Typischerweise umfaßt das Array Arrayelemente, die, wenn dieselben durch eine Bestrah lung und Erfassung der Fluoreszenz gelesen werden, zu Pixeln führen, die in Reihen und Spalten angeordnet sind, die je weils als eine Zeile betrachtet werden können. Zur Erläu terung wird eine Reihe eine Zeile genannt. Ein Pixelsatz wird aus dem Array (Schritt 304) ausgewählt. Das erste Pixel in dem Satz wird mit einem Laserstrahl für eine spezifische Dauer, z. B. ein paar Mikrosekunden, bestrahlt, und die re sultierende Fluoreszenz wird erfaßt oder gemessen (Schritt 306). Die anderen Pixel in dem Satz werden ähnlich behan delt, d. h. bestrahlt, und die resultierende Fluoreszenz (Schritt 310) wird sequentiell ein Pixel nach dem anderen erfaßt. Nachdem das letzte Pixel in dem Satz einmal durch Bestrahlen und Erfassen gelesen wurde, werden die Pixel ein mal oder mehrere Male (Schritte 314 und 318) auf eine Art und Weise ähnlich zu dem ersten Lesen noch einmal gelesen. Andere Sätze von Pixeln in dem Array werden ausgewählt und gelesen wie der erste Satz gelesen wurde, bis alle Pixel gelesen wurden (Schritt 322). Allgemein bedeutet dies, daß alle Arrayelemente gelesen wurden.

Vorzugsweise enthält jeder der Sätze Pixel, die physisch nah zueinander sind, derart, daß die Bewegung der Betätigungs vorrichtung, z. B. dem Scanner, zum Bewegen der relativen Position des Lichtstrahls zu den Pixeln nicht umfangreich ist, wenn sich von Pixel zu Pixel bei der Bestrahlung und bei der Neubestrahlung bewegt wird. Beispielsweise kann der Satz eine Anzahl von Pixeln (d. h. ein Teilsatz von Pixeln) in einer Zeile sein. Vorzugsweise ist der Satz eine Zeile (z. B. eine Reihe oder eine Spalte), um die gleichmäßige Bewegung der Abtastvorrichtung zu erleichtern, um sequen tiell die Pixel in dem Satz abzutasten. Wenn es erwünscht ist, kann der Satz einen Abschnitt einer Zeile oder mehr als eine Zeile umfassen. Wie vorher dargelegt, wird die Anzahl der Pixel in einem Satz derart ausgewählt, daß eine adäquate Zeit zum Erholen der Pixel von den metastabilen Zuständen ermöglicht wird.

Auswählen der Zeit vor dem Wiederholen des Bestrahlens eines Pixels

Bei einem Laser-hervorgerufene-Fluoreszenz-Scanner mit einer kleinen Fleckgröße (z. B. etwa 3 µm FWHM Gauß-Strahl (FWHM = Full Width at Half Maximum = Halbwertsbreite)) erregt das Laserlicht die fluorophoren (d. h. Farbstoff-) Moleküle und bewirkt eine Fluoreszenz. Die Fluoreszenz wird erfaßt, um die Anwesenheit der fluorophoren Moleküle und daher die An wesenheit von Analytika anzuzeigen, die an den fluorophoren Molekülen befestigt sind. Fig. 4 ist eine schematische Dar stellung, die den Energieniveauübergang zeigt, wenn ein Farbstoff erregt wird. Wenn ein Farbstoffmolekül Laserlicht (Pfeil E) absorbiert, wird dasselbe von dem Grundzustands energieniveau G zu dem Energieniveau H erregt. Von dem Ener gieniveau H fällt das Farbstoffmolekül zurück zu dem Grund zustand (Pfeil F), der Licht als Fluoreszenz freigibt.

Um bessere Signale zu erzeugen, wird ein Laser mit einer ziemlich hohen Intensität verwendet, da bis zu einem gewis sen Grad ein Erregungslicht mit einer höheren Intensität (d. h. Licht von dem Laser) mehr fluoreszierende Photonen er zeugt. Aufgrund der Intensität des Laserlichts, das auf den Farbstoff auftrifft, können die Farbstoffmoleküle, abhängig von der Natur des speziellen Farbstoffs, in metastabile Zu ständ(e) (oder langlebige quasistabile Zuständ(e), z. B. von dem erregten Energieniveau H) kreuzen, wie z. B. dem Trip lett-Zustand. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Aus druck "metastabiler Zustand" oder "langlebiger quasistabiler Zustand" eines Farbstoffmoleküls auf einen Energiezustand, bei dem das Farbstoffmolekül ein Energieniveau aufweist, das höher ist als das Grundzustandsenergieniveau, jedoch seine Energie verliert, wobei sich dasselbe zu dem Farbstoffgrund zustand eine Größenordnung langsamer als die Singlett-Zu standsfluoreszenz umwandelt. Abhängig von dem speziellen Farbstoff sind viele unterschiedliche metastabile Zustände möglich. Ein wichtiges Beispiel eines metastabilen Zustands ist der Triplett-Zustand. Andere metastabile Zustände um fassen den biradikalen Zustand und den Ionenpaar-Zustand. Obwohl viele metastabile Zustände möglich sein können, sind zugunsten der Klarheit in Fig. 4 die metastabilen Zustände als M gezeigt, zu denen der Übergang von dem Energieniveau H durch den Pfeil L dargestellt ist. In ihren metastabilen Zuständen wandeln sich die Farbstoffmoleküle zurück zu dem Grundzustand wesentlich langsamer um als bei der Singlett- Zustandsfluoreszenz, die durch den Pfeil F gezeigt ist. Von den metastabilen Zuständen aus gibt das fluoreszierende Ma terial (d. h. die Farbstoffmoleküle) kein Licht mit einer gleichen Wellenlänge frei wie dieselbe der Fluoreszenz des Pfeils F. Daher geht jedes Farbstoffmolekül, das zu dem me tastabilen Zustand kreuzt, an die Fluoreszenz verloren. Da ein Farbstoffmolekül in einem metastabilen Zustand nicht fluoreszieren kann, erscheint dieses Phänomen als Sättigung des Fluoreszenzsignals. In dieser Situation wird ein Erhöhen der Laserleistung, d. h. der Beleuchtungsintensität auf ein Arrayelement, nicht die Anzahl der erfaßten Fluoreszenzpho tonen proportional erhöhen.

Bei Systemen, die durch Photonschrotrauschen bezüglich ihrer Leistung begrenzt sind, kann, wenn Sättigung auftritt, das Signal-zu-Rausch-Verhältnis lediglich unwesentlich, wenn überhaupt, durch langsameres Abtasten oder mit einer höheren Beleuchtungsleistung erhöht werden. Bei der vorliegenden Er findung wird ein Satz (oder eine Anzahl) von Pixeln in dem chemischen Array zweimal oder mehrere Male abgetastet, um das signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Außerdem wird eine Zeitdauer gewartet, so daß sich die Moleküle in dem Farbstoff in einem Pixel ausreichend, vorzugsweise wesent lich, von ihren metastabilen Zuständen vor dem Neubestrahlen des Pixels erholen. Schließlich wird ein Satz, d. h. eine Anzahl, von Pixeln sequentiell jeweils für eine kurze Dauer (z. B. ein paar Mikrosekunden) bestrahlt, derart, daß zu dem Zeitpunkt, zu dem das letzte Pixel in dem Satz bestrahlt wird, sich das erste Pixel von dem metastabilen Zustand er holt hat.

Die Zeitdauer (hierin als "Ruhedauer" bezeichnet), die für den Farbstoff in einem Pixel ausgewählt werden soll, derart, daß sich derselbe von den metastabilen Zuständen vor dem Neubestrahlen erholt, hängt von der Natur des Farbstoffs ab. Viele häufig verwendete Farbstoffe weisen Erholungszeit konstanten metastabiler Zustände in dem Bereich von etwa 10^-5 s bis 10^-1 s auf. Aus diesem Grund würde eine Ruhedauer von etwa 10^-5 s bis 10^-1 s adäquat für den Farbstoff in ei nem Pixel sein, so daß sich derselbe wesentlich von seinem metastabilen Zustand erholt. Im Gegensatz dazu befindet sich die Fluoreszenzzeitkonstante in dem Bereich von Nanosekun den. Allgemein ist von wenigen der häufig verwendeten Farb stoffen die Ruhedauer in der Technik bekannt. Die Ruhedauer eines Farbstoffs kann auch durch ein Verfahren bestimmt wer den, wie es im folgenden beschrieben ist. Die Anzahl der Pi xel, die in einem Satz eingeschlossen werden sollen, hängt von der Beleuchtungszeit für ein Pixel und der Erholungszeit (oder der Ruhedauer) des Farbstoffs ab. Allgemein werden hundert oder mehr Pixel, vorzugsweise mehr als tausend Pi xel, in einem Pixelsatz umfaßt, der sequentiell vor der Neu bestrahlung gelesen werden soll.

Um die Ruhedauer eines Farbstoffs zu bestimmen, kann die folgende Technik verwendet werden. Der interessierende Farb stoff wird einem Licht von einer Strahlungsquelle ausge setzt, die schnell relativ zu der Farbstoffruhedauer einge schaltet wird, während die zeitliche Entwicklung (d. h. die Zeitabhängigkeit der fluoreszierenden Intensität) der fluo reszierenden Intensität überwacht wird. Die fluoreszierende Intensität ist anfangs am höchsten, dieselbe fällt jedoch mit der Zeit auf ein niedrigeres Niveau ab. Die Zeit, die erforderlich ist, um das niedrigere Intensitätsniveau zu er reichen, ist eng mit der Farbstoffruhedauer verwandt. Der Abfall der fluoreszierenden Intensität spiegelt das Sätti gungsniveau wieder. Die Daten, die erhalten werden, können an ein mathematisches Modell angepaßt werden, um Zeitkon stanten der Veränderung der Intensität zu erhalten. Model lierverfahren, um Zeitkonstanten zu erhalten, sind in der Technik bekannt. Allgemein wird davon ausgegangen, daß sich der Farbstoff von den metastabilen Zuständen nach etwa einer Zeitkonstante ausreichend erholt hat. Es wird davon ausge gangen, daß sich derselbe von den metastabilen Zuständen nach etwa zwei Zeitkonstanten wesentlich erholt hat.

Beispiele geeigneter Farbstoffe (d. h. von fluoreszierendem Material), die als Kennzeichen für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, umfassen Farbstoffe, die Fachleuten gut bekannt sind, wie z. B. Fluoreszeine, TEXAS RED, Ethi diumbromide, chelatierte Lanthanoide, Rhodamine, Indocyani ne, Carbocyanine, Oxazine, Organometalle und metallische Atomclusterverbindungen. Die Ruhedauer, d. h. die Zeit, die zum Erholen von den metastabilen Zuständen dieser Farbstoffe erforderlich ist, kann mit der oben beschriebenen Technik bestimmt werden.

Eine Vielfalt von geeigneten, lichtemittierenden Bauelemen ten kann als der Lichtgenerator in der Lichtquelle verwendet werden. Derartige lichtemittierende Bauelemente sind in der Technik bekannt. Sie umfassen beispielsweise lichtemittie rende Dioden (LED; LED = Light Emitting Diode) und Laser, wie z. B. Diodenlaser, Gaslaser, z. B. HE-NE-Laser, Ar-Io nenlaser, frequenzverdoppelte Neodym-Glaslaser, Nedium-YAG- Laser, Faserlaser oder andere Festkörperlaser. Die Pixel in dem Array können in einer flachen Struktur angeordnet wer den. Eine Alternative ist das Anordnen der Pixel in einer kreisförmigen Struktur, wie z. B. auf einer zylindrischen Oberfläche. Allgemein werden die Pixel in einer Struktur von Reihen und Spalten gehalten. Da der Ursprung jedes Pixels bekannt ist, sind die chemischen Bindemittelanteile in dem Pixel bekannt. Wenn die Fluoreszenz für das Pixel erfaßt wird, ist die Identität des Analytikums bekannt, das an das Pixel gebunden ist.

Arraylichterfassung

Ein Detektor wird zum Erfassen des Lichts verwendet, das aus der Fluoreszenz in dem Array resultiert. Beispielsweise kann ein optischer Einzelelementdetektor, z. B. eine PNT-Photo vervielfacherröhre, verwendet werden. Da die Zeit, mit der ein Lichtstrahl auf jedes spezielle Pixel gerichtet wird, bekannt ist, und die Beleuchtung von unterschiedlichen Pi xeln zeitweise beabstandet ist, wird die entsprechende, er faßte Fluoreszenz die Anwesenheit eines fluoreszierenden Materials in dem Pixel anzeigen. Ein alternativer Detektor ist ein Arraydetektor, bei dem mehr als ein Detektorelement verwendet wird, um die Zielchemikalien überabzutasten, was die Unterscheidung gegenüber Ungleichmäßigkeiten ermöglicht. Ein Beispiel eines Arraydetektors ist ein Festkörperhalb leiterbauelement, wie z. B. ein ladungsgekoppeltes Bauele ment-Array (CCD-Array; CCD = Charge Coupled Device).

Das Erregungslicht von einer Lichtquelle trifft auf das fluoreszierende Material auf, das an das Analytikum in dem Array gebunden ist, und bewirkt, daß dasselbe Licht als fluoreszierendes Licht emittiert. Lediglich Pixel mit einem fluoreszierenden Material werden Fluoreszenzsignale emit tieren. Die erfaßten fluoreszierenden Signale werden mit einer elektronischen Erregung für Lichtquellen identifiziert und vorzugsweise durch eine elektronische Verarbeitungsein heit, wie z. B. einem Mikroprozessor oder einem Computer, verarbeitet.

Wie vorher erwähnt, kann durch Analysieren der Struktur des Fluoreszenzlichts in dem Array die Identität der Analytika in der Probe bestimmt werden. Das Erfassen der Fluoreszenz mit einem geeigneten Detektor wird zu einer Fluoreszenz struktur führen, in der gewisse Positionen in der Struktur eine Fluoreszenz und gewisse Positionen keine Fluoreszenz zeigen. Die Identität eines Analytikums auf einem speziellen Pixel in dem Array kann durch Erfassen der Position der Fluoreszenz in der Struktur und Verbinden dieser Position mit Daten, die die Identität der chemischen Bindemittelan teile und der Pixelpositionen in dem Array betreffen, be stimmt werden. Es gibt verschiedene Verfahren zum Verbinden derartiger Daten mit dem chemischen Array. Beispielsweise können die Daten physisch auf dem Gehäuse des Arrays codiert oder getrennt in einem Computer gespeichert werden.

Die vorliegende Technik der Bestrahlung und Erfassung weist einen großen Vorteil gegenüber Techniken auf, die eine Neu bestrahlung nach dem Lesen jedes Pixels erfordern, oder le diglich Neubestrahlen, nachdem das gesamte Array gelesen wurde. Wenn die Neubestrahlung eines Pixels unmittelbar da nach durchgeführt wird, nachdem das Pixel bestrahlt wurde, können die Farbstoffmoleküle in dem Pixel möglicherweise nicht genügend Zeit haben, um sich ausreichend von den meta stabilen Zuständen zu erholen, und die Fluoreszenz ist auf grund der Anwesenheit von metastabilen Zuständen, die nicht fluoreszieren, weniger als optimal. Wenn jedoch die Neube strahlung lediglich dann durchgeführt wird, nachdem das ge samte Array oder ein großer Abschnitt, wie z. B. die Hälfte, des Arrays bestrahlt wurde, müßte sich die Betätigungs- oder Strahllenkungsvorrichtung eine wesentliche Strecke bewegen und eine lange Zeit warten, bevor sich dieselbe zurück zu dem ersten Array bewegt. Dies ist insbesondere bei heutigen, großen Arrays (z. B. denselben, die mehr als eintausend oder sogar Tausende von Pixeln in einer Reihe oder Spalte aufwei sen) mit kleinen und unmittelbar benachbarten Pixeldimensio nen wahr. Beispielsweise' kann die Abmessung eines Pixels quer zu demselben bis zu 3 µm klein sein. Beim Durchlaufen einer wesentlichen Strecke und einem Warten einer langen Zeit können die ursprünglichen Pixelpositionen möglicher weise nicht ohne weiteres neu eingerichtet (d. h. überla gert) werden. Beispielsweise könnte sich die Temperatur geändert haben, wodurch bewirkt wird, daß sich das Array in der Größe ändert. Beispielsweise kann eine thermische Aus dehnung auftreten, wenn das Array unterhalb Raumtemperatur vor dem Lesen bei Raumtemperatur gespeichert wurde. Bei der vorliegenden Erfindung wird eine adäquate Zeit für den Farb stoff in einem Pixel vorgesehen, so daß sich derselbe von den metastabilen Zuständen erholt, jedoch nicht so viel Zeit, daß dies wesentlich die Schwierigkeit beim Überlagern des Laserstrahls an den ursprünglichen Positionen erhöht. Das Resultat der Neuabtastungen (d. h. des Neulesens) kann auf der Zeile hinzugefügt oder gemittelt werden, um die Da tenmenge zu reduzieren, die gespeichert werden muß.

Wie vorher erwähnt, kann die Steuerung der Betätigungs- oder der Strahllenkungsvorrichtung, z. B. des Scanners zum Bewe gen des Laserstrahls, des Betätigungssystems zum Bewegen des Arrays oder des Betätigers, der den Laser bewegt, durch ei nen Computer durchgeführt werden. Allgemein kann ein Compu terprogramm oder eine Software implementiert werden, um eine derartige Steuerung sowie die Erfassung und die Messung der Fluoreszenz zu erreichen. Die Steuerung der Betätiger, Scan ner etc. ist in der Technik gut bekannt.

Bei der Analyse der Daten wird die Fluoreszenzintensität je des Lesens eines Pixels in dem Speicher eines Computers (der ferner ein Mikroprozessor sein kann) gespeichert. Nach jedem Neubestrahlen und jeder Neuerfassung wird der Speicher durch Summieren der alten und der neuen Fluoreszenzdaten für jedes Pixel aktualisiert. Bei der Abwesenheit eines Bleichens des Farbstoffs steigen die Signale proportional mit der Anzahl n der wiederholten Lesevorgänge, und das Signal-zu-Rausch-Ver hältnis steigt mit der Quadratwurzel von n.

Das folgende Beispiel ist für Darstellungszwecke angegeben. Fachleute werden jedoch das offenbarte Beispiel auf andere Anwendungen anpassen können. Ein Laser von UNIPHASE (San Jose, Kalifornien), Modell 2211-20SLE, der bei einer Aus gangsleistung von 10 mW, einer Wellenlänge von 488 nm und einem Fokusfleck von einer Halbwertsbreite (FWHM) von 3 µm arbeitet, wird verwendet, um ein chemisches Array mit 5.000 Pixeln in einer Reihe abzutasten. Die Bestrahlungsdauer ist mindestens 5 µs für jedes Pixel, beispielsweise 6 µs. Ein Fluoreszein, das eine Fluoreszenzlebensdauer in der Größen ordnung von Nanosekunden aufweist, ist der Farbstoff für das Kennzeichnen der Analytika. Die Zeit, die zum Erholen von den metastabilen Zuständen des Fluoreszeins erforderlich ist, liegt in der Größenordnung von Millisekunden. Durch Abtasten einer Zeile, d. h. 5.000 Pixeln, vor dem Neube strahlen ist die Zeilenzeit, d. h. die Zeit, die erforder lich ist, um eine Zeile vor dem Wiederholen abzuschließen, mindestens etwa 30 ms, was reichlich für das Fluoreszein ist, um sich von den metastabilen Zuständen zu erholen.

Obwohl die darstellenden Ausführungsbeispiele der Vorrich tung der vorliegenden Erfindung und die Verfahren des Her stellens und Verwendens der Vorrichtung detailliert be schrieben wurden, ist es offensichtlich, daß die oben be schriebenen Ausführungsbeispiele durch Fachleute insbesonde re bezüglich der Größen, der Formen und Kombination von verschiedenen beschriebenen Merkmalen modifiziert werden können, ohne von dem Bereich der Erfindung abzuweichen. Ob wohl von der Theorie, die in der vorliegenden Offenbarung umrissen ist, angenommen wird, daß dieselbe genau ist, hängt die Anmeldung der vorliegenden Erfindung nicht von jeglicher Theorie ab, die hierin beschrieben ist.

Claims

1. Vorrichtung (100) zum Analysieren von Chemikalien in einem Array (104) mit einer Mehrzahl von Arrayelemen ten, von denen bei einigen angenommen wird, daß diesel ben fluoreszierendes Material enthalten, mit folgenden Merkmalen:

(a) einer Lichtquelle (102) zum Strahlen eines Licht strahls auf die Elemente in einzelnen Pixeln, wo bei die Pixel in Zeilen angeordnet sind;
(b) einer Einrichtung zum Steuern (108) der relativen Position der Lichtquelle (102) zu dem Array (104), derart, daß die Lichtquelle den Lichtstrahl rich tet, um eine erste Anzahl von Pixeln in dem Array (104) sequentiell zu bestrahlen, und zum einmali gen oder mehrmaligen Wiederholen der sequentiellen Bestrahlung vor dem Bestrahlen einer zweiten An zahl von Pixeln, wobei sich die Pixel derselben von den Pixeln der ersten Anzahl von Pixeln unter scheiden, wobei die erste Anzahl von Pixeln mehr als ein Pixel und weniger als die Gesamtanzahl der Pixel in dem Array (104) aufweist; und
(c) einem Detektor (110) zum Erfassen einer Fluores zenz, die aus der Bestrahlung resultiert.

2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die Einrichtung zum Steuern (108) angepaßt ist, um den Lichtstrahl zu richten, um die erste Anzahl von Pixeln vor dem Wieder holen zu bestrahlen, derart, daß eine Zeitdauer ver streicht, die für das fluoreszierende Material in einem Pixel adäquat ist, um sich wesentlich von einem meta stabilen Zustand des fluoreszierenden Materials zu er holen, bevor das Pixel neu bestrahlt wird.

3. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, bei der die Einrichtung zum Steuern (108) angepaßt ist, um Licht auf die erste Anzahl von Pixeln zu richten, die vor dem Wiederholen derart bestrahlt werden, daß eine Dauer verstreicht, die für das fluoreszierende Material in einem Pixel adäquat ist, um sich wesentlich von dem erregten Triplett-Zustand desselben zu erholen, bevor das Pixel wiederum bestrahlt wird.

4. Vorrichtung gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, bei der mindestens ein Abschnitt der Lichtquelle (102) bewegbar ist, und bei der die Einrichtung zum Steuern (108) angepaßt ist, um den mindestens einen Abschnitt der Lichtquelle (102) zu bewegen, um den Lichtstrahl von Pixel zu Pixel zu richten, um die Pixel zu bestrahlen.

5. Vorrichtung gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, bei der die Steuerungseinrichtung (108) angepaßt ist, um die Lichtquelle (102) zu steuern, um die Pixel in einer Zeile sequentiell zu bestrahlen, und um eine Zeile nach der anderen von benachbarter Zeile zu be nachbarter Zeile zu wiederholen, ohne eine Zeile zu be strahlen, nachdem eine andere Zeile danach bestrahlt wurde.

6. Vorrichtung gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, die ferner eine Einrichtung zum Summieren der Fluo reszenzsignale aufweist, die von einem Pixel durch den Detektor während der wiederholten Bestrahlung des Pi xels erfaßt werden.

7. Vorrichtung gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, bei der die Lichtquelle (102) angepaßt ist, um ein Licht zu emittieren, daß zum Bewirken einer Fluoreszenz in einem fluoreszierenden Material geeignet ist, das aus den Gruppen ausgewählt ist, die aus Fluoreszeinen, TEXAS RED, Ethidiumbromid, chelatierte Lanthanoide, Rhodamine, Indocyanine, Carbocyanine, Oxazine, Orga nometalle und Metallatomclusterverbindungen bestehen.

8. Verfahren zum Analysieren eines chemischen Arrays (104) mit einer Mehrzahl von Arrayelementen, von denen bei einigen angenommen wird, daß dieselben fluoreszierendes Material enthalten, mit folgenden Schritten:

(a) Sequentielles Bestrahlen einer ersten Anzahl von Pixeln in den Arrayelementen und Erfassen der Fluoreszenz, die aus der Bestrahlung in den Pixeln resultiert, wobei die erste Anzahl der Pixel mehr als ein Pixel und weniger als die Gesamtzahl der Pixel in dem Array ist; und
(b) Wiederholen der Bestrahlung und des Erfassens der ersten Anzahl von Pixeln ein oder mehrere Male vor dem Bestrahlen der Pixel einer zweiten Anzahl von Pixeln, die sich von den Pixeln der ersten An zahl von Pixeln in dem Array unterscheiden.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, das ferner den Schritt des Auswählens der ersten Anzahl von Pixeln aufweist, die vor dem Wiederholen derart bestrahlt werden, daß eine Zeitdauer verstreicht, die für das fluoreszierende Ma terial in einem Pixel adäquat ist, um sich von einem metastabilen Zustand zu erholen, bevor das Pixel wiede rum bestrahlt wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, das ferner den Schritt des Bestimmens der Zeit aufweist, die für das fluoreszierende Material erforderlich ist, um sich von dem metastabilen Zustand zu erholen.

11. Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 8 bis 10, das ferner den Schritt des Auswählens der ersten Anzahl von Pixeln aufweist, die vor dem Wiederholen derart bestrahlt werden, daß eine Zeitdauer ver streicht, die für das fluoreszierende Material in einem Pixel adäquat ist, um sich von dem erregten Triplett- Zustand desselben zu erholen, bevor das Pixel wiederum bestrahlt wird.

12. Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 8 bis 11, das ferner den Schritt des Bewegens eines bestrah lenden Lichtstrahls von Pixel zu Pixel in einer Zeile von Pixeln und des Wiederholens des Bestrahlens der gleichen Zeile mindestens einmal vor dem Weiterbewegen zu einer anderen Zeile von Pixeln aufweist.

13. Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 8 bis 12, bei dem die erste Anzahl von Pixeln die Anzahl von Pixeln in einer ersten Zeile und die zweite Anzahl von Pixeln die Anzahl von Pixeln in einer Zeile benachbart zu der ersten Zeile ist, wobei jede Zeile mehr als hun dert Pixel aufweist.

14. Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 8 bis 13, das ferner den Schritt des sequentiellen Bestrah lens von Pixeln in einer Zeile und des Wiederholens vor dem Bestrahlen einer weiteren Zeile aufweist, wobei für alle Zeilen von Pixeln die Zeilen eine Zeile nach der anderen von einer benachbarten Zeile zu der nächsten Zeile bestrahlt werden, ohne eine Zeile neu zu bestrah len, sobald eine andere Zeile danach bestrahlt wurde.

15. Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 8 bis 14, das ferner den Schritt des Bestrahlens einer adä quaten Anzahl von Pixeln in einer Zeile aufweist, der art, daß 10^-5 s bis 10^-1 s verstrichen sind, bevor ein Pixel neu bestrahlt wird.

16. Verfahren zum Analysieren eines chemischen Arrays (104) mit einer Mehrzahl von Arrayelementen durch Abtasten der Elemente in Zeilen von Pixeln, von denen bei eini gen angenommen wird, daß dieselben fluoreszierendes Ma terial enthalten, mit folgenden Schritten:

(a) Sequentielles Bestrahlen einer Zeile von Pixeln mit einem Laserstrahl in dem Array und Erfassen der Fluoreszenz, die aus der Bestrahlung in den Pixeln resultiert, wobei die Zeile von Pixeln mehr als hundert Pixel und weniger als die Gesamtanzahl der Pixel in dem Array aufweist, wobei die Anzahl der Pixel in einer Zeile ausreichend groß ist, derart, daß eine Zeitdauer verstreicht, die für das fluoreszierende Material in dem Pixel, das zuerst bestrahlt wurde, adäquat ist, um sich von einem metastabilen Zustand zu erholen, bevor die gesamte Zeile bestrahlt wurde;
(b) Wiederholen der Bestrahlung und des Erfassens der ersten Zeile von Pixeln ein oder mehrere Male vor dem Bestrahlen von Pixeln einer zweiten Zeile von Pixeln, derart, daß 10^-5 s bis 10^-1 s verstrichen sind, bevor ein Pixel neu bestrahlt wird; und
(c) Ausführen der Schritte (a) und (b) für alle Ar rayelemente bis alle Arrayelemente bestrahlt wur den, ohne Neubestrahlen jeglicher Zeile von Pixeln nachdem eine weitere Zeile folgend auf die Be strahlung dieser jeglichen Zeile bestrahlt wurde.