DE19814715A1 - Gelatinemembranfilter, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents
Gelatinemembranfilter, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre VerwendungInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Gelatinemembranfilter, die sich durch eine besondere Reinheit auszeichnen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Sammlung von Mikroorganismen aus Gasen und zu deren schnellem Nachweis. DOLLAR A Die erfindungsgemäßen Gelatinemembranfilter werden hergestellt, indem die bereits formulierte Membranziehlösung unter Druck durch eine Mikrofiltrationsmembran filtriert wird. Sie werden dadurch frei von lebenden und toten Mikroorganismen erhalten. Um die Lebensfähigkeit der auf den Gelatinemembranfiltern gesammelten und nachzuweisenden Mikroorganismen zu erhöhen, enthalten die Gelatinemembranfilter osmoprotektive Substanzen, beispielsweise Trimethylammonioacetat (Betain). DOLLAR A Die erfindungsgemäßen Gelatinemembranfilter sind zur Sammlung und zum Nachweis von Mikroorganismen aus gasförmigen Medien, insbesondere aus Luft, in der pharmazeutischen, biotechnologischen und Lebensmittelindustrie, im Umweltschutz, in der Abfallwirtschaft und in medizinischen Einrichtungen zur Bestimmung der Keimzahlbelastung der Medien einsetzbar.
Description
Die Erfindung betrifft Gelatinemembranfilter, die sich durch eine besondere Reinheit
auszeichnen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.
Die erfindungsgemäßen Gelatinemembranfilter sind zur Sammlung und zum Nachweis
von Mikroorganismen aus gasförmigen Medien, insbesondere aus Luft, in der
pharmazeutischen, biotechnologischen und Lebensmittelindustrie, im Umweltschutz, in
der Abfallwirtschaft und in medizinischen Einrichtungen zur Bestimmung der
Keimzahlbelastung der Medien einsetzbar. Sie dienen beispielsweise in Kombination mit
einem Luftkeimsammelgerät zur Sammlung von Bakterien, Sporen, Viren, Hefen und
Pilzen (Mikroorganismen), um deren Konzentration in Räumen bestimmen zu können.
Derartige Überwachungen sind Voraussetzung für die rechtzeitige Einleitung von
Maßnahmen, um Personen und Produkte vor Schädigungen durch zu hohe
Mikroorganismenkonzentrationen zum Beispiel in der Raumluft zu bewahren.
In bestimmten Räumen mit besonderen Anforderungen an die Beschaffenheit der Luft,
wie in klimatisierten Räumen, Reinräumen und Isolatoren, wird die Luft regelmäßig auf
ihren Keimgehalt hin untersucht. Da es sich in der Regel um gefilterte Luft handelt, die
naturgemäß einen geringen Gehalt an Mikroorganismen aufweist, müssen gewöhnlich
große Volumina untersucht werden, um ausreichend Keime für aussagefähige Ergebnisse
zu sammeln. Dazu wird eine Luftprobe beispielsweise mittels eines
Luftkeimsammelgerätes, wie es von der Firma Sartorius AG unter der Bezeichnung
"MD8 airscan" vertrieben wird, durch ein geeignetes Filter filtriert. Als Filter werden für
diesen Zweck sterile Membranfilter mit Porengrößen im Mikrofiltrationsbereich
vorwiegend auf der Basis von Gelatine eingesetzt, wie sie beispielsweise in der
DE-PS 11 73 640 beschrieben sind.
Besonders geeignet sind Gelatinemembranfilter, auf denen die zurückgehaltenen
Mikroorganismen feucht und vermehrungsfähig gehalten werden sollen.
Gelatinemembranen, auf denen die gesammelten Mikroorganismen aufgrund eines
Zusatzes osmoprotektiver Substanzen eine besonders hohe Lebensfähigkeit aufweisen,
sind in der noch nicht veröffentlichten Patentanmeldung DE 197 50 215.6 beschrieben.
Nach der Probenahme können die Gelatinemembranfilter entweder auf einem
Agarnährboden bebrütet werden, wobei aus den einzelnen gesammelten Keimaggregaten
Mikroorganismenkolonien heranwachsen (das Gelatinemembranfilter verflüssigt sich und
verschwindet und die Mikroorganismenkolonien können direkt auf dem Agar gezählt
werden), oder in einer sterilen Lösung, wie einer Pepton-Wasser- oder einer
physiologischen Kochsalzlösung gelöst werden, so daß Teilmengen auf verschiedenen
Nährmedien bebrütet werden können. Allerdings stehen nach diesen Methoden die
Analysenergebnisse erst relativ spät zur Verfügung, weil das Koloniewachstum in der
Regel bis zu 7 Tagen in Anspruch nimmt.
Nach einem mit ChemScan® bezeichneten schnellen mikrobiologischen Analyseverfahren
(Schnelltestsystem für den Nachweis von Mikroorganismen) stehen die Ergebnisse
dagegen bereits nach 30 bis 90 Minuten zur Verfügung, weil bei diesem Verfahren der
einzelne Mikroorganismus detektiert wird und die sonst übliche zeitaufwendige
Mikroorganismen-Vervielfachung im Brutschrank entfällt. Dazu wird eine wässrige, die
lebenden Mikroorganismen enthaltende Probe durch eine 0,22 µm oder 0,45 µm
Analysenmembran filtriert, um die in der Probe enthaltenden Mikroorganismen auf der
Analysenmembran zurückzuhalten. Die Analysenmembran wird für 30 Minuten bei 30°C
auf eine Absorptionsunterlage aufgelegt, die mit einer Markierungsflüssigkeit getränkt
ist. Die Markierungsflüssigkeit besitzt die Fähigkeit mit dem Zellcytoplasma lebender
Mikroorganismen über eine enzymgesteuerte Reaktion unter gelblicher Fluoreszenz in
Wechselwirkung zu treten. Schließlich kann unter einem Mikroskop, vorzugsweise mit
einem Laser-Scan-System, jeder einzelne Mirkoorganismus auf der Analysenmembran
erkannt werden. Man sollte erwarten, daß zur Anwendung dieses schnellen
mikrobiologischen Analyseverfahrens für den Nachweis von Mikroorgansismen in Gasen
die Gelatinemembranfilter, auf denen die Mikroorganismen aus der Luft gesammelt
wurden, lediglich durch Auflösen der Gelatinemembranfilter in einer wässrigen Lösung,
wie zum Beispiel einer Pepton-Wasser-Lösung, in eine Probe zu überführen ist und diese
Probe wie vorstehend beschrieben zu analysieren ist. Es hat sich aber gezeigt, daß man
keine auswertbaren gelblich fluoreszierenden Signale auf der Analysenmembran erkennt
und die Analysenmembran durchgehend rot gefärbt ist.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Gelatinemembranfilter zur Sammlung
von Mikroorganismen aus Gasen vorzuschlagen, die zum schnellen Nachweis von
Mikroorganismen geeignet sind und ein Verfahren zur Herstellung derartiger
Gelatinemembranfilter aufzufinden.
Die Aufgabe wird durch Gelatinemembranfilter gelöst, die frei von Partikeln mit Größen
sind, die durch Mikrofiltrationsmembranen mit einem Porendurchmesser von höchstens
0,45 µm, vorzugsweise von höchstens 0,2 µm zurückgehalten werden. In einer
bevorzugten Ausführungsform sind die Gelatinemembranfilter frei von Mikroorganismen,
einschließlich von toten Mikroorganismen. Um die Lebensfähigkeit der auf den
Gelatinemembranfiltern gesammelten lebenden Mikroorganismen deutlich zu erhöhen,
enthalten die Gelatinemembranfilter in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
osmoprotektive Substanzen, beispielsweise Trimethylammonioacetat (Betain).
Überraschenderweise wurde gefunden, daß es bereits ausreicht, eine von derartigen
Partikeln befreite Gelatine als Ausgangsstoff für die Herstellung der
Gelatinemembranfilter zu verwenden. Vorteilhafterweise filtriert man dazu eine Lösung
handelsüblicher Gelatine durch eine Mikrofiltrationsmembran mit einer Porengröße von
bis zu ungefähr 0,45 µm, vorzugsweise von bis zu ungefähr 0,2 µm und besonders
vorzugsweise von bis zu 0,1 µm. Dabei hat es sich als zweckmäßig erwiesen, die bereits
formulierte Membranziehlösung unter Druck durch eine Mikrofiltrationsmembran der
genannten Porengröße zu filtrieren. Damit wird sichergestellt, daß in einem Arbeitsschritt
aus jeder Komponente, aus der die Membranziehlösung hergestellt wurde, alle Partikel
entfernt werden, die eine Größe besitzen, daß sie von Mikrofiltrationsmembranen der
genannten Porengröße zurückgehalten werden. Die Druckfiltration ist deshalb zu
bevorzugen, weil dabei im Vergleich zur Vakuumfiltration flüchtige Lösungsmittel nicht
abdampfen können und die quantitative Zusammensetzung der Membranziehlösung nicht
verändert wird. Als zur Filtration besonders geeignet hat sich eine hydrophile, vernetzte
0,2 µm Cellulosehydratmembran erwiesen, die unter dem Namen Hydrosart® von der
Sartorius AG, Göttingen auf dem Markt vertrieben wird (DE-PS 44 18 831).
Eine nach dem ChemScan®-Verfahren durchgeführte Analyse handelsüblicher Gelatine
und Gelatinemembranfilter, die daraus direkt ohne den erfindungsgemäßen
Filtrationsschritt gefertigt und sterilisiert wurden, zeigte, daß ein Gramm derartiger
Produkte zwischen ungefähr 10 000 und mehr als 1 000 000 toter Mikroorganismen
enthalten kann. Diese Menge an Mikroorganismen ist offensichtlich dafür verantwortlich,
daß Gelatinemembranfilter selbst nach ihrer Sterilisierung in Schnelltestverfahren, bei
denen Fluoreszenz hervorrufende Markierungsmittel eingesetzt werden, wie in dem
ChemScan®-Verfahren, nicht verwendet werden können. Die bereits im Rohstoff
vorhandenen, insbesondere toten Mikroorganismen verursachen offensichtlich eine
Verfärbung der Analysenmembran und verhindern dadurch das Erkennen der Flureszenz
von lebenden Mikroorganismen.
In den erfindungsgemäß hergestellten Gelatinemembranfiltern konnte dagegen eine so
weitgehende Reduktion der Mikroorganismen festgestellt werden, daß sie sich zur
Sammlung von Mikroorganismen aus Gasen und zum Nachweis der gesammelten
Mikroorganismen als geeignet erwiesen.
Die erfindungsgemäßen Gelatinemembranfilter sind insbesondere für schnelle
mikrobiologische Analyseverfahren zur direkten Bestimmung einzelner
Mikroorganismen, insbesondere lebender Mikroorganismen geeignet, die mit
Markierungsmitteln Fluoreszenz-Signale zeigen. Dazu wird das Gelatinemembranfilter,
auf dem die Mikroorganismen aus Gasen gesammelt wurden, zur Auflösung in eine
wässrige Lösung gebracht, durch eine Analysenmembran mit Porengrößen im Bereich
von etwa 0,2 bis höchstens 0,45 µm filtriert, um die auf dem Gelatinemembranfilter
gesammelten Mikroorganismen auf der Analysenmembran zurückzuhalten. Hierbei ist die
Verwendung von Mikrosieb-Membranentypen, wie sie beispielsweise in der
WO 95/13860 A1 beschrieben werden, insbesondere Kernspurmembranen mit Porengrößen
von etwa 0,2 µm bevorzugt. Die Verwendung derartiger Analysenmembranen ist deshalb
von Vorteil, weil sie sich durch eine enge Porengrößenverteilung und aufgrund des
geraden Porenverlaufs quer zur Membranfläche durch eine hohe
Filtrationsgeschwindigkeit auszeichnen und weil Mikroorganismen vollständig auf der
Oberfläche dieser Membranen zurückbleiben und nicht wie bei herkömmlichen
Mikrofiltrationsmembranen in die Porenstruktur eindringen können. Die
Analysenmembran wird für 30 Minuten bei 30°C auf eine Absorptionsunterlage
aufgelegt, die für Mikroorganismen mit einer Fluoreszenz hervorrufenden
Markierungsflüssigkeit getränkt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die
Markierungsflüssigkeit direkt der zur Auflösung des Gelatinemembranfilters dienenden
wässrigen Lösung zugesetzt und nach einer auszutestenden Markierungszeit werden die
markierten Mikroorganismen auf der Analysenmembran gesammelt. Schließlich werden
unter einem Mikroskop oder vorzugsweise mit einem Laser-Scan-System, die einzelnen
auf der Analysenmembran fluoreszierenden Mirkoorganismus quantitativ erfaßt.
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Gelatinemembranfilter wird im
Einzelnen wie folgt durchgeführt. Es wird zunächst eine wässrige homogene
Membranziehlösung mindestens bestehend aus Gelatine mit einem Anteil von 4,5 bis 5,6%
an der gesamten Membranziehlösung, aus Ethanol mit einem Anteil von 38 bis 46%
an der gesamten Membranziehlösung und wahlweise aus einem Bindemittel mit einem
Gehalt von 0,02 bis 0,1% an der gesamten Membranziehlösung hergestellt. Als
Bindemittel kann beispielsweise Polyvinylalkohol eingesetzt werden. Die
Membranziehlösung wird unter Druck durch eine Mikrofiltrationsmembran mit einer
Porengröße von maximal 0,45 µm, vorzugsweise bis 0,2 µm filtriert. Dann wird ein dünner
Film aus der Membranziehlösung auf einer Unterlage ausgebreitet, und der dünne Film
wird zur Ausbildung einer gelierten Phase Luft ausgesetzt. Die gelierte Phase wird
sodann zur Nachbehandlung in ein Fällbad eingebracht, welches aus Methylacetat
besteht.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Membranziehlösung zusätzlich
wenigstens eine osmoprotektive Substanz mit einem Anteil von 0,005 bis 0,75%
bezogen auf den Gehalt an Gelatine. Als osmoprotektive Substanz kann beispielsweise
Trimethylammonioacetat verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als erstes
Verfestigungsbad Methylacetat mit einem Alkohol, insbesondere Methanol, mit einem
Anteil von 10 bis 20% am gesamten ersten Verfestigungsbad verwendet. Die Membran
verbleibt in diesem ersten Verfestigungsbad über eine Zeitdauer von ein bis drei Stunden
bei Raumtemperatur bevor sie in ein zweites Verfestigungsbad aus reinem Methylacetat
überführt wird. Trocknung und Sterilisierung, vorzugsweise mit Gammastrahlen,
schließen sich an.
Die Erfindung wird anhand des nachstehenden Ausführungsbeispiels erläutert.
Zur Herstellung eines Gelatinemembranfilters werden 200 g handelsübliches
Gelatinepulver und 2 g Polyvinylalkohol als Bindemittel (Mowiol Typ 18-88, Hoechst
AG) unter einstündigem Rühren bei 60°C in 2000 g Wasser gelöst und anschließend mit
1645 g Ethanol und 0,02 g Trimethylammonioacetat als osmoprotektiver Substanz gelöst
in 10 g Wasser versetzt. Diese Membranziehlösung wird im Dead-End-Modus bei einer
Druckdifferenz von 3 bar und einer Temperatur von etwa 40°C durch eine vernetzte
Cellulosehydrat-Membran mit einer Porengröße von 0,2 µm filtriert. Die filtrierte und auf
21°C temperierte Membranziehlösung wird zu einem Film der Stärke 350 µm auf eine
Unterlage ausgebreitet und Luft mit einer relativen Feuchte von etwa 45% bei
Raumtemperatur ungefähr 5 Minuten ausgesetzt. Der gelierte Film wird zusammen mit
der Unterlage in ein erstes Verfestigungsbad, daß aus Methylacetat mit einem Anteil von
14% Methanol besteht, für die Dauer von 3 Stunden und danach in ein zweites
Verfestigungsbad aus reinem Methylacetat für die Dauer von 3 Stunden eingebracht. Der
Gelatinemembranfilter wird von der Unterlage abgezogen, getrocknet und mit
Gamma-Strahlen sterilisiert.
Der so erhaltene Gelatinemembranfilter weist einen Luftdurchfluß von 140 l/min cm2 bar
auf.
Ein nach diesem Beispiel hergestellter Gelatinemembranfilter, der 150 mg Gelatine
enthält, wurde in 50 ml Peptone-Wasser gelöst und mit 100 µl Delvolase Enzym und
Fluoreszenzfarbstoff versetzt. Nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten bei 37°C wurde
die Lösung über eine 0,4 µm Analysenmembran aus Cellulosenitrat filtriert und die
Analysenmembran unter dem Mikroskop ausgewertet. Es konnten keine
Mikroorganismen gefunden werden.
In einem Vergleichsversuch, der analog dem vorstehenden Beispiel durchgeführt wurde,
allerdings mit dem Unterschied, daß auf die Filtration der Membranziehlösung verzichtet
wurde, zeigte nach Behandlung mit dem Fluoreszenzfarbstoff und dem Enzym eine
durchgehend rot gefärbte Analysenmembran, was auf die Anwesenheit einer Vielzahl
toter Mikroorganismen hindeutet.
Die erfindungsgemäßen Gelatinemembranfilter zur Luftkeimsammlung stellen zusammen
mit einem Schnelltestsystem zum Nachweis von Mikroorganismen, wie dem
ChemScan®-System eine extrem genaue Nachweismethode für sehr niedrige Keimzahlen
dar, wodurch sie sich besonders für Qualitätskontrollfragen in der pharmazeutischen
Industrie und Biotechnologie eignen. Durch Erhalt der mikrobiologischen
Analysenresultate in wenigen Minuten wird eine Just-in-time Produktion unterstützt. Es
treten praktisch keine Wartezeiten bei der Freigabe Produktionsräumen auf da
mikrobiologische Verunreinigungen in sehr kurzer Zeit nachweisbar sind und nicht mehr
wie bei herkömmlichen Methoden bis zu einer Woche Inkubationszeiten benötigt
werden, um zum mikrobiologischen Befund zu gelangen. Dadurch wird die
Produktionssicherheit entscheidend erhöht.
Claims (9)
1. Gelatinemembranfilter zur Sammlung von Mikroorganismen aus Gasen,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Gelatinemembranfilter frei von Partikeln sind, die durch Mikrofiltrationsmembranen
mit einer Porengröße von höchstens 0,45 µm, vorzugsweise 0,2 µm zurückgehalten
werden.
2. Gelatinemembranfilter nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Gelatinemembranfilter frei von Mikroorganismen sind.
3. Gelatinemembranfilter nach den Ansprüchen 1 und 2,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Gelatinemembranfilter osmoprotektive Substanzen, vorzugsweise Betain enthalten.
4. Verfahren zur Herstellung von Gelatinemembranfiltern nach Anspruch 1,
indem
- a) eine wässrige homogene Membranziehlösung mindestens bestehend aus Gelatine mit einem Anteil von 4,5 bis 5,6% an der gesamten Membranziehlösung, aus Ethanol mit einem Anteil von 38 bis 46% an der gesamten Membranziehlösung und wahlweise aus einem Bindemittel mit einem Gehalt von 0,02 bis 0,1% an der gesamten Membranziehlösung hergestellt,
- b) ein dünner Film aus der Membranziehlösung auf einer Unterlage ausgebreitet,
- c) der dünne Film zur Ausbildung einer gelierten Phase feuchter Luft ausgesetzt,
- d) die gelierte Phase zur Nachbehandlung in ein Fällbad aus Methylacetat eingebracht und
- e) das Gelatinemembranfilter getrocknet wird,
dadurch gekennzeichnet, daß - f) die Membranziehlösung vor der Ausbreitung des Films durch eine Mikrofiltrationsmembran mit einer Porengröße von bis zu 0,45 µm, vorzugsweise von bis zu 0,2 µm filtriert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß
der zu filtrierenden wässrigen homogenen Membranziehlösung zusätzlich
osmoprotektiven Substanzen mit einem Anteil von 0,005 bis 0,75% bezogen auf den
Gehalt an Gelatine zugesetzt werden.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 4 und 5,
dadurch gekennzeichnet, daß
die gelierte Phase in ein Fällbad eingebracht wird, das aus einem ersten Verfestigungsbad
aus Methylacetat mit einem Anteil von 10 bis 20% eines Alkohols, vorzugsweise
Methanol und aus einem zweiten Verfestigungsbad aus reinem Methylacetat besteht.
7. Verwendung der Gelatinemembranen nach den vorstehenden Ansprüchen zur
Sammlung von Mikroorganismen aus Gasen und zum Nachweis der gesammelten
Mikroorganismen.
8. Verwendung der Gelatinemembranfilter nach Anspruch 7, in dem das
Gelatinemembranfilter mit gesammelten Mikroorganismen in eine wässrige Lösung
eingebracht wird, der ein mit den Mikroorganismen Fluoreszenz hervorrufendes
enzymatisches Markierungsmittel zugegeben wird, die Lösung durch eine
Analysenmembran einer Porengröße im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 0,45 µm filtriert
wird und die auf dieser Analysenmembran verbleibenden fluoreszierenden
Mikroorganismen ausgezählt werden.
9. Verwendung der Gelatinemembranfilter nach Anspruch 8, dadurch
gekennzeichnet, daß
die Analysenmembran ein Mikrosieb, vorzugsweise eine Kernspurmembran, mit einer
Porengröße im Bereich von etwa 0,45 µm bis etwa 0,2 µm darstellt.
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