Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung hochmolekularer biologisch aktiver
immunmodulierender Polysaccharide aus Hefe Saccharomyces Cerevisiae.The invention relates to a method for obtaining high molecular biologically active
immunomodulating polysaccharides from yeast Saccharomyces Cerevisiae.
Die Bedeutung des Immunsystems zur Abwehr von Krankheiten in menschlichen und tierischen
Organismen ist bekannt. Es ist ferner allgemein bekannt, daß es in der Zellwand von Hefe
Polysaccharide gibt, die in tierischen und menschlichen Organismen immunstimulierend wirken
und zur Abwehr von Krankheiten eingesetzt werden können. Diese Polysaccharide sind
Mannan und Glucan. Das Mannan, bestehend aus 1,2-, 1,3- und 1,6-α-glykosidisch
verknüpften Mannose-Einheiten, ist an eine Protein-Matrix gebunden und sitzt auf der äußeren
Zellwand der Hefezelle, während das Glucan 1,3-β-glykosidisch verknüpft ist mit wenigen 1,6-β-
glykosidischen Seitenketten und sich in der inneren Zellwand befindet. Zur Isolierung dieser
beiden Polysaccharide wurden zahlreiche Verfahren entwickelt, bei denen durch Einwirkung
von Säuren und Laugen die beiden Zellwandkomponenten getrennt werden. Bei diesen
herkömmlichen Verfahren sind jedoch viele Verfahrensschritte erforderlich und darüber hinaus
wird die native Struktur der Zellwand-Polysaccharide beschädigt, so daß die
immunabwehrfördernden Effekte beeinträchtigt werden.The importance of the immune system for defense against diseases in human and animal
Organisms is known. It is also well known that it is in the cell wall of yeast
Polysaccharides exist that have an immunostimulating effect in animal and human organisms
and can be used to ward off diseases. These are polysaccharides
Mannan and Glucan. The mannan, consisting of 1,2-, 1,3- and 1,6-α-glycosidic
linked mannose units, is bound to a protein matrix and sits on the outer one
Cell wall of the yeast cell, while the glucan is 1,3-β-glycosidically linked with a few 1,6-β-
glycosidic side chains and is located in the inner cell wall. To isolate this
Both polysaccharides have been developed in numerous processes, by exposure
the two cell wall components are separated from acids and alkalis. With these
However, conventional processes require many process steps and beyond
the native structure of the cell wall polysaccharides is damaged, so that the
immune-promoting effects are impaired.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, das Verfahren der eingangs genannten Art so zu
gestalten, daß bei einer Verminderung der erforderlichen Verfahrensschritte ein optimaler
immunmodulierender Effekt erzielt wird.The object of the invention is to so the method of the type mentioned
design that with a reduction in the required process steps an optimal
immunomodulating effect is achieved.
Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der Aufgabe durch die Merkmale des Anspruchs 1.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung werden in den abhängigen Ansprüchen
beschrieben.According to the invention, the object is achieved by the features of claim 1.
Advantageous embodiments of the invention are set out in the dependent claims
described.
Nach der Erfindung wird gegenüber den herkömmlichen sauren und alkalischen Extraktionen
bei der Isolierung der Polysaccharide eine Degradation vermieden, da durch den Einsatz von
Enzymen extreme pH-Werte vermieden werden. Außerdem wird die Anzahl der erforderlichen
Verfahrensschritte deutlich reduziert. Gemäß der Erfindung werden zunächst über einen
mechanischen Zellaufschluß die Zellwände vom Zellinneren abgetrennt und die erhaltenen
Zellwandabschnitte gereinigt und gefriergetrocknet. Dann erfolgt eine Einwirkung von
technischen Enzymen auf die isolierten Zellwandabschnitte der Hefe Saccharomyces
Cerevisiae, wodurch die Substanzen rein isoliert werden können. Man erhält sowohl Mannan
als auch Glucan, welche direkt für immunstimulierende Zwecke z. B. in Hautcremes eingesetzt
werden können. Da das Glucan in Wasser unlöslich ist, kann es durch chemische
Umsetzungen in wasserlösliche Derivate überführt werden. Hierzu sind zahlreiche
Derivatisierungsmethoden bekannt. Es können spezielle Mannan-Komponenten isoliert werden,
die Molmassen im Bereich von 20.000 bis 400.000 g/mol haben, eine spezifische,
immunmodulierende Reaktion zeigen und dabei aber nicht cytotoxisch wirken. Diese Mannan-
Komponenten können auch zur Bekämpfung von Asthma-Erkrankungen genutzt werden. Zur
Isolierung der Polysaccharide können vorteilhaft Enzyme eingesetzt werden, wie Protease
(SIGMA-ALDRICH), Pronase (MERCK), beide aus Streptomyces griseus, Lyticase, auch
Zymolyase genannt (SIGMA-ALDRICH), wie auch Enzymcocktails aus Helix pomatia und aus
Cytophaga (MERCK). Es ist aber auch die Verwendung anderer geeigneter Enzyme oder
Enzymcocktails möglich.According to the invention compared to the conventional acidic and alkaline extractions
Degradation is avoided in the isolation of the polysaccharides since the use of
Enzymes extreme pH values can be avoided. Also, the number of required
Process steps significantly reduced. According to the invention, first of all
mechanical cell disruption, the cell walls are separated from the cell interior and the obtained ones
Cell wall sections cleaned and freeze-dried. Then there is an action of
technical enzymes on the isolated cell wall sections of the yeast Saccharomyces
Cerevisiae, whereby the substances can be isolated purely. You get both mannan
as well as glucan, which is used directly for immunostimulating purposes e.g. B. used in skin creams
can be. Since the glucan is insoluble in water, it can be chemical
Conversions are converted into water-soluble derivatives. There are many of them
Derivatization methods known. Special Mannan components can be isolated,
which have molar masses in the range from 20,000 to 400,000 g / mol, a specific
Show immunomodulating reaction and are not cytotoxic. This man
Components can also be used to fight asthma diseases. For
Isolation of the polysaccharides, enzymes such as protease can advantageously be used
(SIGMA-ALDRICH), pronase (MERCK), both from Streptomyces griseus, Lyticase, too
Zymolyase called (SIGMA-ALDRICH), as well as enzyme cocktails from Helix pomatia and from
Cytophaga (MERCK). But it is also the use of other suitable enzymes or
Enzyme cocktails possible.
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand der in der Zeichnung schematisch
dargestellten Verfahrensabläufe näher erläutert.In the following, the method according to the invention is shown schematically on the basis of the drawing
illustrated procedures are explained in more detail.
Die Hefezellen 1 werden in der ersten Verfahrensstufe A durch Einwirkung von Scherkräften
mechanisch zerrissen, so daß die Zellwände vom Zellinneren getrennt werden. Hierzu wird ein
Mahlbehälter 2 mit einer Suspension aus Hefezellen und Glasperlen gefüllt und in z. B. einer
Schwingmühle 3 mit hoher Frequenz geschüttelt. Als Glasperlen werden vorzugsweise solche
mit einem Durchmesser von 0,75-1,5 mm verwendet. Die Frequenz der Schwingmühle 3
beträgt z. B. 1600 s-1. Das so gewonnene Zellwandmaterial 4 wird dann in einer weiteren
Verfahrensstufe B durch Zentrifugation gereinigt oder aber an mikroporösen Membranen durch
Waschen gereinigt. Das so aufbereitete Zellwandmaterial 4 wird dann gefriergetrocknet. In der
dann folgenden Verfahrensstufe C wird das Zellwandmaterial 4 einem enzymatischen
Aufschluß unterzogen. Spezifische Enzyme wie Pronase oder Glucanase oder spezifische
Enzymcocktails wie Zymolyase, Cytophaga, Helicase oder Cellulase zerstören in der äußeren
Zellwand des Zellwandmaterials 4 die Proteinmatrix und setzen lösliches Mannan 5 frei. Das
unlösliche Glucan 6 wird durch Zentrifugation abgetrennt und gesondert aufbereitet. Das
Mannan 5 kann durch Dialyse oder chromographisch gereinigt werden.The yeast cells 1 are mechanically torn in the first process stage A by the action of shear forces, so that the cell walls are separated from the cell interior. For this purpose, a grinding container 2 is filled with a suspension of yeast cells and glass beads and in z. B. a vibrating mill 3 shaken at high frequency. Glass beads with a diameter of 0.75-1.5 mm are preferably used. The frequency of the vibratory mill 3 is z. B. 1600 s -1 . The cell wall material 4 obtained in this way is then cleaned in a further process stage B by centrifugation or else is cleaned on microporous membranes by washing. The cell wall material 4 thus prepared is then freeze-dried. In the subsequent process step C, the cell wall material 4 is subjected to an enzymatic digestion. Specific enzymes such as pronase or glucanase or specific enzyme cocktails such as zymolyase, cytophaga, helicase or cellulase destroy the protein matrix in the outer cell wall of the cell wall material 4 and release soluble mannan 5 . The insoluble glucan 6 is separated by centrifugation and processed separately. Mannan 5 can be purified by dialysis or by chromography.
Nachstehend werden zwei Ausführungsbeispiele der Erfindung beschrieben:Two embodiments of the invention are described below:
1. Ausführungsbeispiel1st embodiment
5,0 g Hefezellwände aus dem mechanischen Aufschluß wurden in 115 ml Trispuffer-Lösung
(Tri(hydroxymethyl)aminoethan, mit Salzsäure auf pH = 7,5 eingestellt) suspendiert und auf
37,0°C temperiert. 10,6 mg Pronase E (Streptomyces griseus, Fa. MERCK) wurden in 5 ml
Puffer-Lösung gelöst und zum Reaktionsgemisch hinzugegeben. Nach sechs Stunden wurde
der Feststoff abzentrifugiert und der Überstand dialysiert. Nach Gefriertrocknung erhielt man
Mannan aus dem Überstand, während im Feststoff 2,9 g Glucan zu finden sind.5.0 g of yeast cell walls from the mechanical digestion were placed in 115 ml of Tris buffer solution
(Tri (hydroxymethyl) aminoethane, adjusted to pH = 7.5 with hydrochloric acid) and suspended
37.0 ° C tempered. 10.6 mg Pronase E (Streptomyces griseus, MERCK) were added in 5 ml
Buffer solution dissolved and added to the reaction mixture. After six hours
the solid is centrifuged off and the supernatant dialyzed. After freeze-drying, one obtained
Mannan from the supernatant, while 2.9 g of glucan can be found in the solid.
2. Ausführungsbeispiel2nd embodiment
1,55 g Hefezellwände aus dem mechanischen Aufschluß wurden in 60 ml Trispuffer-Lösung
(Tri(hydroxymethyl)aminoethan, mit Salzsäure auf pH = 7,5 eingestellt) suspendiert und auf
37,0°C temperiert. 462 mg Protease (Streptomyces griseus, Fa. SIGMA) wurden in 5 ml Puffer-
Lösung gelöst und zum Reaktionsgemisch hinzugegeben. Nach 6,5 Stunden wurde der
Feststoff abzentrifugiert und der Überstand dialysiert. Nach Gefriertrocknung erhielt man 352
mg Mannan aus dem Überstand, während im Feststoff 522 mg Glucan zu finden sind.1.55 g of yeast cell walls from the mechanical digestion were placed in 60 ml of Tris buffer solution
(Tri (hydroxymethyl) aminoethane, adjusted to pH = 7.5 with hydrochloric acid) and suspended
37.0 ° C tempered. 462 mg protease (Streptomyces griseus, SIGMA) were in 5 ml buffer
Solution dissolved and added to the reaction mixture. After 6.5 hours the
Centrifuged solid and the supernatant dialyzed. Freeze-drying gave 352
mg of mannan from the supernatant, while 522 mg of glucan can be found in the solid.