DE19841698A1

DE19841698A1 - Composition for accelerating healing of tissue damage in cartilage or wounds, comprises thrombocyte growth factor, fibrin or fibrinogen and polymer

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Publication number: DE19841698A1
Application number: DE19841698A
Authority: DE
Inventors: Zbigniew A Janowicz; Peter Hofmann; Frank Heinz Spillecke
Original assignee: CURATIVE TECHNOLOGIES GmbH
Current assignee: CURATIVE TECHNOLOGIES GmbH
Priority date: 1998-09-11
Filing date: 1998-09-11
Publication date: 2000-03-16
Also published as: WO2000015248A3; WO2000015248A2

Abstract

A composition (I) containing at least one thrombocyte growth factor (II), fibrin (III) or a precursor (preferably fibrinogen) and at least one further polymer (IV) and/or its precursor, is new. An Independent claim is included for the preparation of (I) by mixing components (II) - (IV).

Description

Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Verfügung, die mindestens einen thrombozytären Wachstumsfaktor (Zytokin), Fibrin und/oder eine Vorstufe davon, vorzugsweise Fibrinogen, und mindestens ein weiteres Polymer und/oder eine Vorstufe davon umfaßt. Erfindungsgemäß bindet der thrombozytäre Wachstumsfaktor reversibel an Fibrin und/oder Fibrinogen und das weitere Polymer oder die Vorstufe davon. Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung, wobei diese vor allem zur Behandlung von Schäden in Geweben, die durch geringe Durchblutung und/oder verminderte Regenerationsfähigkeit charakterisiert sind, sowie in Haut- und/oder Weichgewebe, verwendet wird.The present invention provides a composition which at least a platelet growth factor (cytokine), fibrin and / or a precursor thereof, preferably fibrinogen, and at least one further polymer and / or a precursor includes. According to the invention, the thrombocytic growth factor binds reversibly of fibrin and / or fibrinogen and the further polymer or the precursor thereof. The invention further comprises a process for the preparation of the composition, these being mainly used to treat damage in tissues caused by minor Blood flow and / or reduced regenerative capacity are characterized, as well as in Skin and / or soft tissue is used.

Besonders solche Gewebetypen, die eine Stütz- oder Füllfunktion haben, zeichnen sich häufig durch einen reduzierten Metabolismus und ebenfalls durch eine niedrige oder keine Durchblutung aus. Somit weisen diese bradytrophen Gewebe allgemein eine ver ringerte Geweberegenerationsfähigkeit auf. Zu diesen Geweben gehören unter an derem hyaliner, elastischer und Faser-Knorpel sowie Faszien. Wird ein solches Gewebe verletzt, ist die Heilung, falls überhaupt möglich, sehr langwierig, da aufgrund der geringen Durchblutungsrate die notwendigen signalvermittelnden Moleküle und Zellen sowie Metabolite zum Gewebeaufbau nur in geringen Konzentrationen heran transportiert und Abbauprodukte ebenfalls nur langsam abgeleitet werden. Darüber hinaus ist solches Gewebe durch eine verminderte Fähigkeit der Zellen zur Regenera tion sowie eine geringere Zelldichte charakterisiert.In particular, those types of tissue that have a supporting or filling function stand out often by a reduced metabolism and also by a low or no blood flow. Thus, these bradytrophic tissues generally have a ver decreased ability to regenerate tissue. These tissues belong to their hyaline, elastic and fibrous cartilage and fasciae. Will be such a If tissue is injured, the healing process, if at all possible, takes a long time because of it the necessary signal-transmitting molecules and the low blood flow rate Cells and metabolites for tissue building only in low concentrations transported and degradation products are also only slowly discharged. About that In addition, such tissue is characterized by a reduced ability of the cells to regenerate tion and a lower cell density.

Die Häufigkeit der Verletzungen solcher Gewebe, die entweder akut auftreten oder auf Verschleiß zurückzuführen sind, ist sehr groß. So müssen z. B. in der Bundesrepublik Deutschland jährlich ca. 500 000 Patienten alleine an akuten oder degenerativen Schä den am Meniskus - ein aus Faserknorpel bestehender Teil des Kniegelenkes - behan delt werden. The frequency of injuries to such tissues that either occur acutely or upon Wear and tear is very large. So z. B. in the Federal Republic Germany annually approx. 500,000 patients alone from acute or degenerative damage the one on the meniscus - a part of the knee joint made of fiber cartilage - treated be delt.

Der Prozeß der Wundheilung der Haut ist ausführlich untersucht worden, wohingegen über die Heilung anderer Gewebe wie z. B. bradytropher Gewebe nur sehr wenig bekannt ist.The process of skin wound healing has been extensively studied, however about the healing of other tissues such as B. bradytrophic tissue very little is known.

Skin healing

In Untersuchungen zur Wundheilung der Haut - einem Gewebeverband mit einem ak tiven Metabolismus - wurde festgestellt, daß der Heilungsprozeß aus einer Folge mehrerer Schritte besteht, während derer verschiedene zelluläre Infiltrate in das Wund gewebe eindringen. Sofort nach der Verwundung beginnt der Prozeß der Blutgerinnung, welcher sowohl auf humoralen als auch zellulären Reaktionen beruht. Die wichtigste zelluläre Antwort betrifft die Interaktion von Blutplättchen mit Fibrinogen, Thrombin und Kollagen. Nach Abschluß des Gerinnungsprozesses wandern verschiedene Subpopula tionen von Leukozyten in den Wundbereich ein. Fibroblasten, Endothelialzellen und Epithelzellen folgen den Leukozyten. Es bilden sich Kapillargefäße in dem verwundeten Gewebe und es entsteht ein Granulationsgewebe. Die Fibroblasten sind verantwortlich für die Bildung der Gewebematrix, d. h. von Kollagen und Proteoglykanen und zu einem späteren Zeitpunkt von elastischen Fasern. Die biochemischen Zusammenhänge des Wundheilungsprozesses konnten bisher nicht vollständig geklärt werden. Es ist jedoch bekannt, daß eine Reihe von Wachstumsfaktoren (Zytokinen) aufgrund ihrer chemotak tischen und wachstumsstimulierenden Effekte für die Wundheilung unerläßlich sind. Diese Faktoren regulieren ebenfalls die Synthese der Proteine, die die extrazelluläre Matrix aufbauen (Kollagene, Elastin, Proteoglykane). Die ersten Wachstumsfaktoren, die den Wundheilungsprozeß initiieren und kontrollieren, werden in vivo aus Blutplät tchen (Thrombozyten) freigesetzt. Die Blutplättchen gelangen aus den verletzten Blutge fäßen in das Wundgebiet. In den folgenden Phasen der Heilung übernehmen die Wachstumsfaktoren aus Makrophagen, Fibroblasten und Epithelzellen die Regulation des gesamten Prozesses (Bennett et al., Am. J. Surg., 1993, 165, 728-737; Bratigan, Wounds, 1996, 8 (3),78-90; Choucair et al., Adv. Clin. Res., 1997, 15 (1), 4558).In studies of wound healing of the skin - a tissue bandage with an ak tive metabolism - it was found that the healing process is of a consequence consists of several steps during which various cellular infiltrates into the wound penetrate tissue. The blood coagulation process begins immediately after being wounded, which is based on both humoral and cellular responses. The most important cellular response affects the interaction of platelets with fibrinogen, and thrombin Collagen. After the coagulation process is complete, different subpopulations migrate leukocytes into the wound area. Fibroblasts, endothelial cells and Epithelial cells follow the leukocytes. Capillaries are formed in the wounded Tissue and a granulation tissue is created. The fibroblasts are responsible for the formation of the tissue matrix, d. H. of collagen and proteoglycans and into one later date of elastic fibers. The biochemical relationships of the The wound healing process has not yet been fully clarified. However, it is known that a number of growth factors (cytokines) due to their chemotak table and growth-stimulating effects are essential for wound healing. These factors also regulate the synthesis of proteins that make up the extracellular Build up the matrix (collagens, elastin, proteoglycans). The first growth factors which initiate and control the wound healing process are derived from blood platelets in vivo tchen (platelets) are released. The platelets are released from the injured blood vessels get into the wound area. In the following phases of healing, they take over Growth factors from macrophages, fibroblasts and epithelial cells regulate the regulation the entire process (Bennett et al., Am. J. Surg., 1993, 165, 728-737; Bratigan, Wounds, 1996, 8 (3), 78-90; Choucair et al., Adv. Clin. Res., 1997, 15 (1), 4558).

Zu der Gruppe der thrombozytären Wachstumsfaktoren zählen in nicht abschließender Weise z. B. die folgenden Faktoren:
The group of thrombocytic growth factors includes, but is not limited to, z. B. the following factors:

- PDGF-AA; BB and AB form (platelet-derived growth factor forms AA, BB, AB,)
- TGF-α (transforming growth factor α)
- TGF-β (transforming growth factor β)
- PF-4 (platelet factor-4)
- β-TG (β-thromboglobin)
- PD-ECGF (platelet-derived endothelial cell growth factor),
- aFGF (acidic fibroblast growth factor)
- bFGF (basic fibroblast growth factor)
- IGF (insulin-like growth factor)
- EGF (Epidermal Growth Factor)
- KGF (keratinocyte growth factor)
- SPARK
- RANTES
- Gro- [s1] α

Einzelne Wachstumsfaktoren wie PDGF, EGF oder bFGF wurden bereits daraufhin un tersucht, ob sie in der Lage sind einen vollständigen Wundverschluß bei Hautwunden zu erzielen. Erste Untersuchungen mit einzelnen rekominanten Wachstumsfaktoren wie PDGF und bFGF ergaben, daß diese in gewissem Maß die Wundheilung stimulieren können, daß die vollständige Wundheilung jedoch schwierig zu erreichen war. Die An wendung von thrombozytären Wachstumsfaktoren in der Heilung von chronischen Hautwunden wird z. B. in Glover J.L. et al., 1997, Adv. Wound Care, 10 (1), 33-38 und EP 202 298 beschrieben.Individual growth factors such as PDGF, EGF or bFGF were then un examines whether they are capable of a complete wound closure in skin wounds to achieve. First studies with individual recombinant growth factors such as PDGF and bFGF were found to stimulate wound healing to some extent However, complete wound healing was difficult to achieve. The An application of platelet growth factors in the healing of chronic ones Skin wounds are z. B. in Glover J.L. et al., 1997, Adv. Wound Care, 10 (1), 33-38 and EP 202 298 described.

Healing of cartilage tissue

Es ist seit langem bekannt, daß geschädigtes Knorpelgewebe nur sehr selten spontan abheilt. Dies ist möglicherweise darauf zurückzuführen, daß sich die knorpelbildenden Chondrozyten nur extrem langsam vermehren sowie in den späteren Differenzierung sphasen eine sehr geringe metabolische Aktivität zeigen (Worn et al., Bone and Carti- laginous Tissue in Wound Healing, Herausgeber Cohen, Lindblad Sanders Com pany, 1992). Es war überraschend, daß mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung gute Heilungsraten in diesem Gewebetyp erzielt werden konnten.It has long been known that damaged cartilage tissue rarely occurs spontaneously heals. This is possibly due to the fact that the cartilage-forming Chondrocytes multiply extremely slowly as well as in the later differentiation phases show very little metabolic activity (Worn et al., Bone and Carti Laginous Tissue in Wound Healing, edited by Cohen, Lindblad Sanders Com pany, 1992). It was surprising that with the composition according to the invention good healing rates could be achieved in this tissue type.

Healing of fibrous cartilage - example meniscus

Im Fall der Meniskusverletzungen (Faserknorpel) treten die meisten Risse im Faser knorpelbereich des Vorderhorns, des Hinterhorns oder in der Längsrichtung auf (Fig. 1). Der Faserknorpel ist ein zellarmes Geflecht dichter, sich kreuzender Kollagenfaser schichten und Proteoglykanen. Auf Grund seiner mechanischen Eigenschaften dient er zur Reduktion von im Gelenk auftretenden Reibungen und zur Abfederung stoßartiger Bewegungen. Seine Ernährung erfolgt hauptsächlich durch Diffusion, da er nur ein be grenzt ausgebautes Blutgefäßsystem enthält. Die Zelldichte von Chondrozyten /Fibrochondrocyten ist gering. Das elastische Meniskusgewebe besteht zu 70% aus Wasser und zu ca. 30% aus Protein. Die Proteinhauptbestandteile, die überwiegend von Chondrozyten gebildet werden, sind:
In the case of meniscus injuries (fiber cartilage), most of the cracks occur in the fiber cartilage area of the anterior horn, the posterior horn or in the longitudinal direction ( Fig. 1). The fiber cartilage is a cell-poor network of dense, intersecting layers of collagen fibers and proteoglycans. Due to its mechanical properties, it serves to reduce friction occurring in the joint and to cushion jerky movements. It is nourished mainly by diffusion, since it only contains a limitedly developed blood vessel system. The cell density of chondrocytes / fibrochondrocytes is low. The elastic meniscus tissue consists of 70% water and approx. 30% protein. The main protein components, which are predominantly formed by chondrocytes, are:

- Collagens (especially collagen type I and smaller amounts of collagen types II, III, V and VI)
- elastin
- various proteoglycans
- other matrix proteins, such as B. fibronectin and thrombospondin

Mit zunehmendem Alter nimmt die Regenerationsfähigkeit des Meniskusgewebes dramatisch ab.With increasing age, the regenerative capacity of the meniscus tissue decreases dramatically.

Für die Behandlung von entstandenen Meniskusschäden stehen bis heute ver schiedene Therapieverfahren zur Verfügung, die je nach Schweregrad der Verletzung eingesetzt werden:
For the treatment of meniscus damage that has arisen, various therapy methods are still available today, which are used depending on the severity of the injury:

- Refixation of the meniscus tears (suturing)
- Partial resection (partial removal of the meniscus)
- Total resection (removal of the entire meniscus)

Es besteht der begründete Verdacht, daß es zumindest bei den zwei letztgenannten chirurgischen Maßnahmen häufig zu Arthrosen innerhalb des Kniegelenkes kommt. Wird der Meniskus entfernt, so bedeutet das eine Reduktion der Kontaktfläche und damit eine deutliche Erhöhung des Druckes auf die verbliebene Knorpel-/Knochen fläche. Die Folge ist häufig eine Versteifung des Gelenkes. Zusammensetzungen zur erfolgreichen Behandlung von Schäden dieses Gewebetyps standen bisher nicht zur Verfügung.There is well-founded suspicion that at least the latter two surgical measures often lead to osteoarthritis within the knee joint. If the meniscus is removed, this means a reduction in the contact area and thus a significant increase in the pressure on the remaining cartilage / bone area. The result is often a stiffening of the joint. Compositions for successful treatment of damage to this type of tissue has not yet been possible Disposal.

Healing of the hyaline cartilage

Bei der Heilung des hyalinen Knorpels (z. B. femuraler Knorpel) treten die gleichen, vor stehend für die Heilung des Faserknorpels (Meniskus) ausgeführten Probleme auf. Diese Probleme führen ebenfalls dazu, daß in der Regel keine Heilung des Defekts stattfindet.When the hyaline cartilage (e.g. femural cartilage) heals, the same occurs standing for the healing of the fibrous cartilage (meniscus) carried out on problems. These problems also mean that there is usually no healing of the defect takes place.

Die konventionellen operativen Behandlungsmaßnahmen umfassen die Total- oder Teil- Entfernung des defekten hyalinen Knorpels oder die Implantation künstlicher Gelenks teile aus Kunststoff oder Metall.The conventional surgical treatment measures include total or partial Removal of the defective hyaline cartilage or the implantation of artificial joints parts made of plastic or metal.

Seit kurzem wird versucht, das hyaline Knorpelgewebe durch Reimplantation körperei gener Chondrozyten zu regenerieren. Dafür werden dem Patienten gesunde Zellen ent nommen, in Zellkultur vermehrt und wieder in den Defekt appliziert. Um die zellhaltige Flüssigkeit korrekt aufzutragen, muß jedoch zuerst in einem komplizierten chirurgischen Eingriff eine Tasche aus Knochenhaut gebildet werden, die die Wunde abdeckt (Britt berg et al., New Engl. J. of Medicine, 1994, 331, 14, 879-875). Dieses Verfahren ist bisher jedoch nur in wenigen Fällen erfolgreich angewendet worden und hat die Nach teile, daß eine komplizierte vorbereitende Operation durchgeführt werden muß, die Zell suspension oft nicht in der Gewebetasche verbleibt, die Zahl der Zellen, die tatsächlich in der Wunde anwachsen, nicht ausreichend ist und dieses Verfahren außerdem mit einem sehr hohen Kostenaufwand verbunden ist. Zusammensetzungen zur Behandlung von Schäden in diesem Gewebetyp stehen bisher nicht zur Verfügung. Recently attempts have been made to reimplant the hyaline cartilage tissue gener chondrocytes to regenerate. For this purpose, healthy cells are developed for the patient taken, propagated in cell culture and re-applied to the defect. To the cellular However, applying fluid correctly must first go through a complicated surgical procedure Surgery, a pocket can be formed from periosteum that covers the wound (Britt berg et al., New Engl. J. of Medicine, 1994, 331, 14, 879-875). This procedure is So far, however, it has only been used successfully in a few cases and has followed share that a complicated preparatory operation must be performed on the cell suspension often does not remain in the tissue pocket, the number of cells actually grow in the wound is not sufficient and this procedure also with is associated with a very high cost. Treatment compositions of damage in this type of tissue are not yet available.

Healing of fascia tissue

Die Behandlung von Faszienbrüchen, sogenannten Hernien, z. B. das Reißen von Fasziengewebe der Leiste, stellt ein zum Teil ähnliches Problem wie die Behandlung von Meniskusrissen dar. Makroskopisch und funktionell gibt es deutliche Unterschiede zum Meniskusgewebe. Im Hinblick auf seine biochemischen, metabolischen und mikro strukturellen Eigenschaften ähneln sich beide Gewebetypen aber stark. Faszien sind dünne, aber feste Membranen, die aus einer relativ geringen Zahl an Zellen (Fibro blasten) und extrazellulärer Matrix (Proteinfasern) und Wasser bestehen. Das Gewebe ist kompakt und elastisch und enthält fast keine Blutgefäße. Die Regenerationseigen schaften sind eingeschränkt, vor allem die schlechte Qualität des Narbengewebes führt häufig zu Wiederbrüchen (Rezidiven).The treatment of fasciae fractures, so-called hernias, e.g. B. the tearing of Fascia tissue of the groin poses a problem that is partly similar to that of the treatment of meniscus tears. Macroscopically and functionally there are clear differences to the meniscus tissue. In terms of its biochemical, metabolic and micro Structural properties, however, are very similar to both types of tissue. Fascia are thin but firm membranes made up of a relatively small number of cells (fibro blasts) and extracellular matrix (protein fibers) and water. The mesh is compact and elastic and contains almost no blood vessels. The regeneration own properties are limited, especially the poor quality of the scar tissue results often to recurrences (recurrences).

Ein Leistenbruch wird herkömmlicherweise durch mechanisches Zurückdrängen der ausgetretenen Organe und anschließendes Nähen der Bruchstelle behandelt. Dabei werden heutzutage oft flexible netzartige Implantate in die Naht eingearbeitet, um die Stabilität des Wundverschlusses zu erhöhen und ein Wiederaufbrechen zu verhindern. Diese Methode birgt jedoch das Problem, daß es oft zur Bildung von Seromen (Flüssig keitsansammlungen) an der Implantatstelle und anderen Komplikationen kommt. Im all gemeinen wurde beobachtet, daß das Narbengewebe nicht selten nur eine geringe Sta bilität aufweist und bei mechanischer Belastung häufig wieder aufreißt. Eine Zusammen setzung zur Behandlung von Wunden in diesem Gewebetyp ist bisher nicht bekannt.An inguinal hernia is conventionally achieved by mechanically pushing back the treated organs and subsequent suturing of the fracture site. Included Nowadays, flexible, reticulated implants are often incorporated into the suture to protect the Increase the stability of the wound closure and prevent reopening. However, this method has the problem that it often leads to the formation of seromas (liquid accumulations) at the implant site and other complications. In space It has generally been observed that the scar tissue not infrequently has only a slight sta and often tears open again when subjected to mechanical stress. One together A setting for the treatment of wounds in this type of tissue is not yet known.

Aus der Literatur ist eine Zusammensetzung zur Wundheilung von Weichteilwunden, insbesondere kutaner, dermaler, Schleimhaut- oder Epithelwunden in Vertebraten bekannt (EP-B1-0 243 179). Es wird darin eine Zusammensetzung umfassend fibrilläres Kollagen, 0,1% bis 10% (v/v bezogen auf Kollagen) Heparin oder Heparin-artiges Glykosaminoglykan oder Gemische davon, und eine wirksame Menge eines chemotak tischen, Wachstums- oder Differenzierungs-Faktors offenbart. Als bevorzugte Faktoren werden PDGF, FGF oder Gemische davon beschrieben. EP-B1-0 243 179 gibt keinen Hinweis auf die Verwendung von Fibrin oder Fibrinogen. Darüber hinaus sind die Er gebnisse, die im Zusammenhang mit der Behandlung von Weichteilwunden erhalten werden, nicht übertragbar auf die hierin vorzugsweise behandelten bradytrophen Gewebe.A composition for wound healing of soft tissue wounds is from the literature, especially cutaneous, dermal, mucosal or epithelial wounds in vertebrates known (EP-B1-0 243 179). There is a composition comprising fibrillar therein Collagen, 0.1% to 10% (v / v based on collagen) heparin or heparin-like Glycosaminoglycan or mixtures thereof, and an effective amount of a chemotak table, growth or differentiation factor disclosed. As preferred factors PDGF, FGF or mixtures thereof are described. EP-B1-0 243 179 is none Indication of the use of fibrin or fibrinogen. In addition, the He Results obtained in connection with the treatment of soft tissue wounds are not transferable to the bradytrophs preferably treated herein Tissue.

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung anzuge ben, die es ermöglicht, Schäden in weichen Geweben, Hautgeweben, insbesondere jedoch in Geweben mit geringer Durchblutung und/oder geringer Regenerationsfähigkeit rasch und dauerhaft zu beheben.It is therefore an object of the present invention to provide a composition ben that allows damage in soft tissues, skin tissues, in particular however, in tissues with low blood flow and / or low regenerative capacity to be resolved quickly and permanently.

Diese Aufgabe wird durch eine Zusammensetzung gelöst, die mindestens einen throm bozytären Wachstumsfaktor, Fibrin und/oder eine Vorstufe davon, vorzugsweise Fi brinogen, und mindestens ein weiteres Polymer oder eine Vorstufe davon umfaßt. Vor zugsweise ist der thrombozytäre Wachstumsfaktor reversibel an Fibrin und/oder Fi brinogen und/oder das weitere Polymer und/oder eine Vorstufe davon gebunden.This object is achieved by a composition that has at least one throm Bocytic growth factor, fibrin and / or a precursor thereof, preferably Fi brinogenic, and at least one further polymer or a precursor thereof. Before preferably the platelet growth factor is reversible to fibrin and / or Fi brinogen and / or the further polymer and / or a precursor thereof bound.

Als Gewebe, die durch eine geringere Regenerationsfähigkeit charakterisiert sind, wer den im folgenden alle Gewebe bezeichnet, die im Körper vor allem eine strukturelle und mechanische Rolle besitzen und sich durch geringere Zelldichte, geringere oder keine Durchblutung und/oder dichte Fasernmasse auszeichnen, insbesondere elastischer, hyaliner und Faser-Knorpel sowie Fasziengewebe.As tissues that are characterized by a lower ability to regenerate, who which in the following refers to all tissues that are primarily structural and in the body Have a mechanical role and are characterized by lower cell density, lower or none Distinguish blood circulation and / or dense fiber mass, especially elastic, hyaline and fibrous cartilage as well as fascia tissue.

In einer bevorzugten Ausführungsform bilden Fibrin und/oder Fibrinogen, das weitere Polymer und/oder die Vorstufe davon, eine Matrix aus. Eine besonders wichtige Funk tion derselben besteht darin, daß sie als "provisorische" Matrix für die Einwanderung der Zellen dient. Die Matrix erleichtert die Kolonisierung des Defektes durch die Zellen. Somit erlaubt das weitere Polymer zusammen mit dem Fibrin das Ansiedeln von Zellen in dem Wundbereich und begünstigt somit die Heilungsvorgänge.In a preferred embodiment, fibrin and / or fibrinogen form the other Polymer and / or the precursor thereof, a matrix. A particularly important funk tion of the same consists in using them as a "provisional" matrix for immigration serves the cells. The matrix facilitates colonization of the defect by the cells. Thus, the further polymer, together with the fibrin, allows cells to colonize in the wound area and thus promotes the healing process.

Das weitere Polymer dient auch zusammen mit dem Fibrin als Matrix für Wachstumsfak toren und eventuell weitere, in der Zusammensetzung enthaltene Substanzen, die re versibel an die Gerüststruktur binden können. Die Matrix-Struktur stabilisiert weiterhin die Wachstumsfaktoren, insbesondere noch Einbringen in die Wunde, u. a. dadurch, daß sie den Angriff von Proteasen auf die Wachstumsfaktoren verhindert bzw. herab setzt.The further polymer also serves, together with the fibrin, as a matrix for growth factors gates and possibly other substances contained in the composition that re be able to bind reversibly to the framework structure. The matrix structure continues to stabilize the growth factors, in particular their introduction into the wound, among others. through this, that it prevents or reduces the attack of proteases on the growth factors puts.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat die Matrix eine Schwamm-, Clot-, Granulat-, Stab-, Film- und/oder Membran-Form. Die Erfindung umfaßt auch Zusam mensetzungen, deren Matrix mehrere Formen nebeneinander aufweist. So können beispielsweise Membranen verschiedener Dicke, unterschiedlich poröse Schwämme oder Granulate in bekannter Weise hergestellt werden, um so die Freisetzungsrate der Wachstumsfaktoren wunschgemäß zu beeinflussen.In a further preferred embodiment, the matrix has a sponge, clot, Granulate, rod, film and / or membrane form. The invention also includes togetherness compositions whose matrix has several forms next to each other. So can for example membranes of different thicknesses, differently porous sponges or granules are produced in a known manner, so as to reduce the rate of release of the To influence growth factors as desired.

Im Fall eines Meniskus-Defektes, der meistens rißförmig ist, können z. B. dünne Mem branen mit guten Adhäsionseigenschaften verwendet werden, bei Faszienbrüchen dagegen können eher dickere Membranen verwendet werden. Bei Schäden des femu ralen Knorpels ist ein Schwammträger optimal.In the case of a meniscus defect, which is mostly crack-shaped, z. B. thin meme Branches with good adhesion properties can be used for fasciae fractures on the other hand, thicker membranes can be used. If the femu ral cartilage, a sponge carrier is ideal.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß der Zusatz von Fibrin und/oder der Vorstufe davon, vorzugsweise Fibrinogen zu dem weiteren Polymer und/oder der Vorstufe davon die Eigenschaften des weiteren Polymers vorteilhaft modifiziert. Gemischte Zusammen setzungen umfassend Fibrin und/oder die Vorstufe davon, vorzugsweise Fibrinogen, und das weiteren Polymer oder die Vorstufe davon in Membran-Form, sind poröser als reine Polymer-Membranen, welches u. a. eine effektivere Einwanderung von Zellen in das Produkt ermöglicht. Weiterhin sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen weniger empfindlich gegenüber vorzeitiger Biodegradation. Fibrin und/oder Fibrinogen beeinflussen ebenfalls die Stärke der Bindung des thrombozytären Wachstumsfaktors an die Matrix der erfindungsgemäßen Zusammensetzung.Surprisingly, it has been found that the addition of fibrin and / or the precursor thereof, preferably fibrinogen to the further polymer and / or the precursor thereof the properties of the further polymer are advantageously modified. Mixed together compositions comprising fibrin and / or the precursor thereof, preferably fibrinogen, and the further polymer or precursor thereof in membrane form are more porous than pure polymer membranes, which inter alia. a more effective migration of cells into the product enables. The compositions according to the invention are also less sensitive to premature biodegradation. Fibrin and / or fibrinogen also affect the strength of the binding of the platelet growth factor to the matrix of the composition according to the invention.

Das weitere Polymer kann ein beliebiges, für pharmazeutische Zusammensetzungen zulässiges Polymer sein, wobei jedoch biologisch abbaubare Biopolymere bevorzugt sind.The further polymer can be of any desired type for pharmaceutical compositions be permitted polymer, but biodegradable biopolymers are preferred are.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfaßt weiterhin einen thrombozytären Wachstumsfaktor, der vorzugsweise humanen oder tierischen Ursprungs ist. Der Aus druck "Wachstumsfaktor" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutungsgleich zu dem Ausdruck "Zytokin" verwendet.The composition of the invention further comprises a platelet Growth factor, which is preferably of human or animal origin. The out pressure "growth factor" is synonymous in the context of the present invention used to the term "cytokine".

Dabei können die Wachstumsfaktoren nach ihrer Isolierung und Reinigung (siehe Bei spiel 1) chemisch oder enzymatisch modifiziert werden, z. B. durch Änderungen des Glykosylierungsmusters, Bildung von monomeren oder polymeren Formen der Wachs tumsfaktoren, chemische Modifizierung der Seitenketten.After their isolation and purification (see at game 1) modified chemically or enzymatically, e.g. B. by changing the Glycosylation pattern, formation of monomeric or polymeric forms of the wax factors, chemical modification of the side chains.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der thrombozytäre Wachstumsfaktor ein autologer Wachstumsfaktor aus dem Eigenblut des Patienten. Durch Verwendung eines körpereigenen Wachstumsfaktors werden potentielle Abwehrreaktionen gegen die er findungsgemäße Zusammensetzung vermieden, vor allem aber wird die mit den Fremdblutprodukten verbundene Infektionsgefahr drastisch reduziert. Die autologen Faktoren können gewonnen werden, indem dem jeweiligen Patienten eine Blutprobe entnommen wird und die Blutplättchen daraus isoliert werden. Nach weiterer Aufreini gung der Zellpräparation werden die Blutplättchen zur Degranulation stimuliert, so daß sie thrombozytäre Wachstumsfaktoren und andere regulatorische Substanzen freiset zen. Ein Präparat mit diesen Faktoren kann dem Patienten wieder zugesetzt werden.In a preferred embodiment, the platelet growth factor is a autologous growth factor from the patient's own blood. Using a the body's own growth factor will have potential defense reactions against it inventive composition avoided, but especially with the The risk of infection associated with foreign blood products is drastically reduced. The autologous Factors can be obtained by giving each patient a blood sample is removed and the platelets are isolated therefrom. After further clarification During the preparation of the cells, the platelets are stimulated to degranulate, so that it releases platelet growth factors and other regulatory substances Zen. A preparation with these factors can be added back to the patient.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der thrombozytäre Wachstumsfaktor ein rekombinanter Wachstumsfaktor, der zusätzlich durch Deletionen, Additionen, In versionen, Insertionen oder Punktmutationen in seiner Aminosäuresequenz verändert sein kann.In a further preferred embodiment, the thrombocytic growth factor is a recombinant growth factor, which is additionally produced by deletions, additions, In versions, insertions or point mutations changed in its amino acid sequence can be.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine bevorzugte Zusammensetzung zur Ver fügung, in der der thrombozytäre Wachstumsfaktor ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend PDGF, TGF-α, TGF-β, PF-4, β-TG, PD-ECGF, aFGF, bFGF, IGF, EGF, KGF, SPARK, RANTES, Gro-alpha und/oder ein entsprechendes Vorläufermolekül. Da bei kann einer der genannten Wachstumsfaktoren alleine oder in Verbindung mit an deren Faktoren in der Zusammensetzung enthalten sein. The present invention further provides a preferred composition for ver in which the platelet growth factor is selected from the group including PDGF, TGF-α, TGF-β, PF-4, β-TG, PD-ECGF, aFGF, bFGF, IGF, EGF, KGF, SPARK, RANTES, Gro-alpha and / or a corresponding precursor molecule. There one of the growth factors mentioned can be used alone or in conjunction with an whose factors are included in the composition.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die erfindungsgemäße Zusam mensetzung eine Mischung mehrerer thrombozytärer Wachstumsfaktoren.In a further preferred embodiment, the composition according to the invention comprises composition is a mixture of several platelet growth factors.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfaßt vorzugsweise den thrombozytären Wachstumsfaktor im Bereich von 10 bis 500 µg, bezogen auf 100 mg Trockenmaße des fertigen Endproduktes.The composition according to the invention preferably comprises the platelet Growth factor in the range from 10 to 500 µg, based on 100 mg dry weight of the finished end product.

Eine besonders bevorzugte Mischung ist eine Mischung mehrerer thrombozytärer Wachstumsfaktoren, die durch Degranulierung von Granula von Blutplättchen und nachfolgende Lyse der Granula aus diesen freigesetzt werden (siehe Beispiel 1). Im folgenden wird diese Mischung von Wachstumsfaktoren als REL (platelet releasate) bezeichnet.A particularly preferred mixture is a mixture of several platelets Growth factors produced by degranulation of granules of platelets and subsequent lysis of the granules are released from them (see example 1). in the following this mixture of growth factors is called REL (platelet release) designated.

Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung dieser Erfindung enthält eine Mischung der thrombozytären Wachstumsfaktoren von 1 bis 500 ng PDGF/ml REL, 1 bis 1000 ng TGF-β/ml REL, 1 bis 400 µg PF-4/ml REL, 1 bis 400 µg β-TG/ml REL, 1 bis 2000 ng bFGF/ml REL und 1 bis 500 ng PD-ECGF/ml REL.A particularly preferred composition of this invention contains a mixture of the platelet growth factors from 1 to 500 ng PDGF / ml REL, 1 to 1000 ng TGF-β / ml REL, 1 to 400 µg PF-4 / ml REL, 1 to 400 µg β-TG / ml REL, 1 to 2000 ng bFGF / ml REL and 1 to 500 ng PD-ECGF / ml REL.

Eine überaus bevorzugte Zusammensetzung enthält die Mischung von 5 bis 100 ng PDGF/ml REL, 5 bis 200 ng TGF-β/ml REL, 10 bis 80 µg PF-4/ml REL, 10 bis 80 µg β-TG/ml REL, 10 bis 400 ng bFGF/ml REL und 5 bis 200 ng PD-ECGF/ml REL.A highly preferred composition contains the mixture from 5 to 100 ng PDGF / ml REL, 5 to 200 ng TGF-β / ml REL, 10 to 80 µg PF-4 / ml REL, 10 to 80 µg β-TG / ml REL, 10 to 400 ng bFGF / ml REL and 5 to 200 ng PD-ECGF / ml REL.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung zeigt überraschenderweise einen hervor ragenden Effekt insbesondere auf die Heilung von bradytrophen Geweben (siehe Beispiele 5, 6, 7).The composition according to the invention surprisingly shows one excellent effect in particular on the healing of bradytrophic tissues (see Examples 5, 6, 7).

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfaßt ferner Fibrin und/oder eine Vorstufe davon, vorzugsweise Fibrinogen.The composition according to the invention further comprises fibrin and / or a precursor thereof, preferably fibrinogen.

Vorzugsweise ist das Fibrin und/oder Fibrinogen humanen oder tierischen Ursprungs. The fibrin and / or fibrinogen is preferably of human or animal origin.

Dabei können das Fibrin und/oder das Fibrinogen nach ihrer Isolierung und Reinigung (siehe Beispiel 1) chemisch oder enzymatisch modifiziert werden, z. B. durch Bindung von monomeren oder polymeren Formen der Wachstumsfaktoren.The fibrin and / or the fibrinogen can be used after their isolation and purification (see Example 1) can be modified chemically or enzymatically, e.g. B. by binding of monomeric or polymeric forms of growth factors.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fibrin und/oder Fibrinogen autologer Herkunft, d. h. es stammt aus dem Eigenblut des Patienten. Durch Verwendung körper eigenen Fibrins und/oder Fibrinogens werden potentielle Abwehrreaktionen gegen die hier beschriebene Zusammensetzung vermieden, vor allem wird aber die mit den Fremdblutprodukten verbundene Infektionsgefahr drastisch reduziert. Die autologen Faktoren können gewonnen werden, indem dem jeweiligen Patienten eine Blutprobe entnommen wird und gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren Fibrinogen isoliert wird. So erhaltenes Fibrin und/oder Fibrinogen kann dem Patienten wieder zugesetzt werden.In a preferred embodiment, the fibrin and / or fibrinogen is more autologous Origin, d. H. it comes from the patient's own blood. By using body own fibrins and / or fibrinogen are potential defense reactions against the The composition described here is avoided, but above all the one with the The risk of infection associated with foreign blood products is drastically reduced. The autologous Factors can be obtained by giving each patient a blood sample is removed and fibrinogen is isolated according to methods known to the person skilled in the art will. Fibrin and / or fibrinogen obtained in this way can be added back to the patient will.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Fibrin und/oder Fibrinogen rekombinantes Fibrin und/oder Fibrinogen, das zusätzlich durch Deletionen, Additionen, Insertionen, Inversionen oder Punktmutationen in seiner Aminosäuresequenz verändert sein kann.In a further preferred embodiment, the fibrin and / or fibrinogen is recombinant fibrin and / or fibrinogen, which is additionally produced by deletions, additions, Insertions, inversions or point mutations changed in its amino acid sequence can be.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfaßt vorzugsweise 0,1 bis 99 mg Fibrin und/oder Fibrinogen, bezogen auf 100 mg Trockenmasse des Endproduktes.The composition according to the invention preferably comprises 0.1 to 99 mg of fibrin and / or fibrinogen, based on 100 mg dry matter of the end product.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Zusammen setzung 20 bis 50 mg Fibrin und/oder Fibrinogen.In a preferred embodiment, the composition according to the invention contains setting 20 to 50 mg of fibrin and / or fibrinogen.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das weitere Polymer ein anderes Biopolymer als Fibrin oder die nicht-polymere Vorstufe davon. Das weitere Polymer di ent dabei zusammen mit dem erfindungsgemäßen Fibrin-Zusatz u. a. der mechanischen Unterstützung der Wundstelle, der Einführung von aktiven Komponenten in die Gewebslücke und zum Ausfüllen der Gewebelücke. In a further preferred embodiment, the further polymer is a different one Biopolymer as fibrin or the non-polymeric precursor thereof. The other polymer di ent together with the fibrin additive according to the invention, inter alia. the mechanical Support of the wound site, the introduction of active components into the Tissue gap and to fill the tissue gap.

Die Erfindung stellt verschiedene Arten von Zusammensetzungen mit den gewünschten biologischen und mechanischen Eigenschaften zur Verfügung. Diese Eigenschaften hängen von der medizinischen Indikation bzw. Anwendung ab. Das Hauptmerkmal der Erfindung ist, daß für jede spezielle medizinische Anwendung eine optimale Zusam mensetzung angeboten werden kann. Gleichzeitig bietet die Erfindung ein einfaches Verfahren, um die verschiedenen Formen der Zusammensetzung herzustellen. Die bi ologischen und mechanischen Eigenschaften der verschiedenen Zusammensetzungen können durch Variation der folgenden Parameter beeinflußt werden:
The invention provides various types of compositions having the desired biological and mechanical properties. These properties depend on the medical indication or application. The main feature of the invention is that an optimal composition can be offered for each special medical application. At the same time, the invention provides a simple method for preparing the various forms of the composition. The biological and mechanical properties of the various compositions can be influenced by varying the following parameters:

- Substances that are used as another polymer, e.g. B. collagen or PGA
- Structure of the further polymer (e.g. sponge or membrane structure)
- Pore size of the further polymer
- Amount ratio of fibrin to the further polymer
- quantitative ratio of growth factors to the further polymer and fibrin
- The manufacturing process used for the final product (e.g. freeze-drying or Air drying)

Einer der wichtigsten Parameter bei der Bestimmung der Eigenschaften des Produktes ist die Menge des im Endprodukt vorhandenen Fibrins. Die Menge des eingesetzten Fibrins und die Form des Endproduktes (poröser Schwamm oder Membran) beein flussen stark die Diffusionsraten der Wachstumsfaktoren. So sind z. B. Endprodukte in Form eines Schwamms, welche Kollagen und Fibrin in einem Verhältnis von 5 : 1 enthal ten, durch eine relativ schnelle Diffusion der Wachstumsfaktoren aus dem Präparat in das umgebende Gewebe charakterisiert. Dieses Endprodukt ist ebenfalls durch eine schnelle Biodegradation gekennzeichnet, wodurch es gut geeignet für die Anwendung in Geweben mit relativ aktiven Stoffwechsel ist. Ein vergleichbares Endprodukt in Form eines Schwammes, das mehr Fibrin enthält (Verhältnis von Kollagen zu Fibrin 1 : 1) zeigt eine geringere Diffusionsrate und eine langsamere Biodegradation im Vergleich mit dem oben beschriebenen Endprodukt. Solch eine Zusammensetzung ist daher gut geeignet für dis Behandlung von Knorpeldefekten, da die Heilung von Knorpelgewebe eine lang anhaltende Stimulation mit Wachstumsfaktoren benötigt. One of the most important parameters in determining the properties of the product is the amount of fibrin present in the final product. The amount of used Fibrins and the shape of the end product (porous sponge or membrane) the diffusion rates of the growth factors flow strongly. So are z. B. end products in Form of a sponge, which contains collagen and fibrin in a ratio of 5: 1 th, due to a relatively rapid diffusion of the growth factors from the preparation into characterizes the surrounding tissue. This end product is also through a rapid biodegradation, which makes it well-suited for use in Tissues with relatively active metabolism is. A comparable end product in shape of a sponge that contains more fibrin (ratio of collagen to fibrin 1: 1) a lower diffusion rate and slower biodegradation compared to that end product described above. Such a composition is therefore well suited for dis treatment of cartilage defects, since the healing of cartilage tissue takes a long time sustained stimulation with growth factors is required.

Allgemein sind Endprodukte in Form von Membranen durch extrem kleine Poren, feste Struktur, geringe Diffusionsrate, langsame Biodegradation und langsame Kolonisation mit Zellen im Gegensatz zu schwammförmigen Endprodukten charakterisiert. Im Falle von Zusammensetzungen in Membranform können die biologischen und mechanischen Eigenschaften ebenfalls durch Variation der Fibrinmenge beeinflußt werden.In general, end products in the form of membranes with extremely small pores are solid Structure, low rate of diffusion, slow biodegradation and slow colonization characterized with cells as opposed to spongy end products. In the event of of compositions in membrane form can be biological and mechanical Properties can also be influenced by varying the amount of fibrin.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Matrix der erfindungsgemäßen Zusam mensetzung, die von Fibrin und/oder Fibrinogen und dem weiteren Polymer und/oder der Vorstufe davon ausgebildet wird, abhängig von der Indikation in unterschiedlicher Form bereitgestellt.In a preferred embodiment, the matrix of the composition according to the invention composition that of fibrin and / or fibrinogen and the further polymer and / or the preliminary stage of which is trained, depending on the indication in different Form provided.

Die Membran-Form zeigt im allgemeinen eine niedrigere Freisetzungsrate der Wachstumsfaktoren im Vergleich zu der gleichen Zusammensetzung in Schwamm- Form.The membrane shape generally shows a lower rate of release of the Growth factors compared to the same composition in sponge Shape.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das weitere Polymer als Biopolymer Kol lagen, Polyhyaluronsäure, Polyglykolsäure und/oder Polylactatsäure und/oder Mischun gen davon. Als besonders geeignet hat sich dabei die Verwendung von flüssigem Kolla gen des Atelopeptid-Typs erwiesen, da dieses Kollagen fast keine Immunabwehrreak tionen hervorruft. Je nach Wahl des Biopolymers und Wahl des Herstellungsverfahrens wird dabei die Porengröße der Matrix, ihre Dichte und folglich die Rate an aktiven Sub stanzen, die pro Zeiteinheit freigesetzt werden, bestimmt.In a preferred embodiment, the further polymer comprises as a biopolymer col layers, polyhyaluronic acid, polyglycolic acid and / or polylactic acid and / or mixtures gen of it. The use of liquid colla has proven to be particularly suitable Genes of the atelopeptide type proved that this collagen has almost no immune response causes. Depending on the choice of biopolymer and the choice of manufacturing process the pore size of the matrix, its density and consequently the rate of active sub punch that are released per unit of time, determined.

Erfindungsgemäß bevorzugt liegt das weitere Polymer und/oder die Vorstufe davon im Bereich von 1 bis 99 mg pro 100 mg Trockenmasse des Endproduktes.According to the invention, the further polymer and / or the precursor thereof is preferably in Range from 1 to 99 mg per 100 mg dry matter of the final product.

Besonders bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfassend 10 bis 500 µg thrombozytärer Wachstumsfaktor, 20 bis 50 mg Fibrinogen und 50 bis 80 mg weitere Polymer pro 100 mg Trockenmasse des Endproduktes. Ein besonders bevor zugtes weitere Polymer ist Kollagen.A composition according to the invention comprising 10 to 10 is particularly preferred 500 µg of platelet growth factor, 20 to 50 mg of fibrinogen and 50 to 80 mg additional polymer per 100 mg dry matter of the end product. One especially before Another added polymer is collagen.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine bevorzugte Zusammensetzung zur Ver fügung, die einen Katalysator umfaßt, der die Polymerisation von Fibrinogen katalysiert. The present invention further provides a preferred composition for ver Addition comprising a catalyst that catalyzes the polymerization of fibrinogen.

Dieser Katalysator kann z. B. Thrombin, Calciumionen, Gerinnungsfaktor XIII oder eine Mischung davon sein. Dabei ist Thrombin ausreichend, um durch Spaltung von Fibrino gen zu Fibrin die Polymerisation desselben einzuleiten, durch die Zugabe von Calcium ionen und Faktor XIII wird das Fibrin-Polymer und das Endprodukt jedoch zusätzlich stabilisiert.This catalyst can e.g. B. thrombin, calcium ions, coagulation factor XIII or a Be a mix of them. Thrombin is sufficient to break down fibrino gen to fibrin to initiate the polymerisation of the same by the addition of calcium However, ions and factor XIII will add to the fibrin polymer and the end product stabilized.

Es wird eine weitere bevorzugte Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die einen weiteren Faktor zum Unterstützen von Gewebeheilungsprozessen umfaßt. Ein bevor zugter Faktor zum Unterstützen solcher Prozesse ist Fibronektin, Thrombospondin, Al bumin, Heparin/ Heparane oder Mischungen davon. Dabei unterstützen Fibronektin und Thrombospondin die strukturgebende Wirkung der Matrixpolymere und beein flussen weiterhin die Bindung von Wachstumsfaktoren und deren Stabilität. Heparin/ Heparane verhindern die Bildung von Blutgerinnseln an der Wundstelle und beein flussen die Bindung und Wirkung von Wachstumsfaktoren, während Albumin der Stabi lisierung der Proteinkomponenten dient.Another preferred composition is provided which has a further factor for supporting tissue healing processes. A before A preferred factor to support such processes is fibronectin, thrombospondin, Al bumin, heparin / heparans, or mixtures thereof. Fibronectin support this and thrombospondin the structure-giving effect of the matrix polymers and affect The binding of growth factors and their stability continue to flow. Heparin / Heparans prevent the formation of blood clots at the wound site and affect flow the binding and effect of growth factors, while albumin is the stabilizer lization of the protein components is used.

Eine wie oben beschriebene Zusammensetzung kann gemäß der vorliegenden Erfin dung ein Arzneimittel oder ein Kosmetikum sein. Dabei kann die Zusammensetzung je nach gewünschtem Applikationsmodus weitere geeignete Hilfs- und Trägerstoffe, wie z. B. Puffer, Antibiotika, Desinfektionsmittel, Stabilisatoren, Plastifikatoren, Farbstoffe umfassen.A composition as described above can be used according to the present invention a medicine or a cosmetic. The composition can vary According to the desired mode of application, other suitable auxiliaries and carriers, such as z. B. buffers, antibiotics, disinfectants, stabilizers, plasticizers, dyes include.

Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zum Herstellen der oben beschriebenen Zusammensetzung, wobei mindestens ein thrombozytärer Wachstums faktor mit Fibrin und/oder einer Vorstufe davon, vorzugsweise Fibrinogen und dem weiteren Polymer und/oder der nicht-polymeren Vorstufe gemischt werden. Die Mischung der Komponenten kann gleichzeitig erfolgen. Es kann jedoch ebenfalls vorteilhaft sein, das vorgefertigte weitere Polymer in vorgegebener Form (z. B. als Schwamm, Membran etc.) mit einer Lösung umfassend Fibrinogen und die vorstehend beschriebenen aktiven Faktoren über einen längeren Zeitraum vorzuinkubieren, so daß sich die Zwischenräume des weiteren Polymers langsam mit Fibrinogen und den weiteren aktiven Komponenten der Zusammensetzung auffüllen. Die Polymerisations reaktion des Fibrinogens kann dann durch Hinzufügen von Calcium-Ionen und/oder Thrombin und/oder Calcium erfolgen.The present invention further includes a method of making the above composition described, wherein at least one platelet growth factor with fibrin and / or a precursor thereof, preferably fibrinogen and the further polymer and / or the non-polymeric precursor are mixed. the Mixing of the components can take place at the same time. However, it can also It may be advantageous to use the prefabricated further polymer in a given form (e.g. as Sponge, membrane, etc.) with a solution comprising fibrinogen and the above preincubate the active factors described for a longer period of time so that the interstices of the further polymer slowly with fibrinogen and the Top up with other active components of the composition. The polymerization reaction of the fibrinogen can then be achieved by adding calcium ions and / or Thrombin and / or calcium take place.

Ist die Herstellung der Zusammensetzung in Film- oder Membran-Form gewünscht, so kann dies unter Verwendung des "mold casting" (In-Form-Gießens) durchgeführt wer den. Die Formen bestehen hierbei aus inertem Material wie Teflon oder Polypropylen. Verwendbare Lösungen/Suspensionen haben eine Konzentration von 2-10% (w/v) Polymer oder nicht-polymerer Vorstufe in einem geeigneten Lösungsmittel. Die Lösung kann weiterhin Plastifikatoren (Zucker, Glycerin) und/oder Substanzen enthalten, die die Trocknungsrate erhöhen wie z. B. Alkohole. Die Suspension wird in die Form gegossen. Man läßt die Suspension in einem sterilen Luftstrom bei 1°C bis 20°C trocknen. Der thrombozytäre Wachstumsfaktor und das Fibrinogen können vor oder nach dem Trock nen hinzugefügt werden.If the preparation of the composition in film or membrane form is desired, so this can be done using "mold casting" the. The molds are made of inert material such as Teflon or polypropylene. Usable solutions / suspensions have a concentration of 2-10% (w / v) Polymer or non-polymer precursor in a suitable solvent. The solution can also contain plasticizers (sugar, glycerine) and / or substances that affect the Increase drying rate such as B. Alcohols. The suspension is poured into the mold. The suspension is allowed to dry in a stream of sterile air at 1 ° C to 20 ° C. Of the Platelet growth factor and the fibrinogen can be used before or after the dry can be added.

Sollen Produkte in Schwamm-Form entsprechend der gewünschten Applikation in un terschiedlicher Stärke und Porengröße hergestellt werden, so können diese gemäß dem Fachmann bekannten Lyophilisationsverfahren unter gleichzeitiger Zugabe von weite rem Polymer, Fibrinogen, Wachstumsfaktoren und Katalysator erhalten werden. Alter nativ können die Wachstumsfaktoren und das Fibrinogen zu der vorgefertigten porösen Form hinzugefügt werden. Das Gemisch kann sodann, wie vorstehend beschrieben, luftgetrocknet oder nochmals lyophilisiert werden. Alternativ kann das Gemisch in feuch tem "nassem" Zustand (als sogenannter "Clot") belassen werden und vor der Verwen dung bei niedrigen Temperaturen, vorzugsweise -80°C, gelagert werden.Should products be in sponge form according to the desired application in un Different strength and pore size are produced, so these can be according to the Lyophilization processes known to those skilled in the art with simultaneous addition of wide rem polymer, fibrinogen, growth factors and catalyst can be obtained. Age The growth factors and the fibrinogen can natively be added to the pre-made porous Shape to be added. The mixture can then, as described above, air-dried or lyophilized again. Alternatively, the mixture can be wet can be left in the "wet" state (as a so-called "clot") and before use can be stored at low temperatures, preferably -80 ° C.

Stab-Formen und andere Formen des Produktes können durch bekannte Verfahren erhalten werden. Die Lösung oder Suspension mit den Vorstufen des Produktes können in unterschiedlichen Gießformen, die die gewünschten Formen aufweisen, vorliegen und nachträglich lyophilisiert oder luftgetrocknet werden. Zusätzlich kann die Form des ferti gen Produktes durch Pressen in eine Form oder durch Stanzen optimiert werden.Rod shapes and other shapes of the product can be made by known methods can be obtained. The solution or suspension with the precursors of the product can in different casting molds that have the desired shapes, and subsequently lyophilized or air-dried. In addition, the shape of the ferti The product can be optimized by pressing it into a shape or by punching.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Polymerisation des Fi brinogens und Bindung an das weitere Polymer oder die Vorstufe in vivo durchgeführt. In a preferred embodiment of the process, the polymerization of Fi brinogens and binding to the further polymer or the precursor carried out in vivo.

Dabei wird durch Zusetzen des Katalysators zu Fibrinogen an der Wundstelle ein schnelles Abbinden der flüssigen Mischung erzeugt und auf diese Weise ein Wundver schluß erzielt, der exakt der Form der Wunde angepaßt ist.By adding the catalyst, fibrinogen is created at the wound site rapid setting of the liquid mixture generated and in this way a wound conclusion achieved, which is exactly adapted to the shape of the wound.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der thrombozytäre Wachstumsfaktor entweder vor oder während der Polymerisation mit den Vorstufen oder nach erfolgter Polymerisation mit Fibrin und dem weiteren Polymer in Kontakt ge bracht.In a further preferred embodiment of the invention, the thrombocytic Growth factor either before or during polymerization with the precursors or after the polymerization with fibrin and the further polymer in contact ge brings.

Eine bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung stellt die Be handlung von Schäden in Geweben mit geringer Regenerationsfähigkeit und/oder ge ringer Durchblutung dar.A preferred use of the composition according to the invention is the Be treatment of damage in tissues with low regenerative capacity and / or ge poor blood flow.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Behandlung von Schäden des Knorpels verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dient die Zusammensetzung der Behandlung von Schäden im Faser knorpel des Meniskus und Defekten des elastischen und hyalinen Knorpels (z. B. Knie gelenk, Femuralknorpel).In a preferred embodiment, a composition according to the invention used to treat damage to cartilage. In a particularly preferred one Embodiment, the composition is used to treat damage in the fiber cartilage of the meniscus and defects of the elastic and hyaline cartilage (e.g. knee joint, femoral cartilage).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung zur Be handlung von Schäden des Fasziengewebes verwendet. Besonders bevorzugt dabei ist die Behandlung von Schäden des Fasziengewebes der Leiste (Leistenbruch).In a further preferred embodiment, the composition for Be treatment of damage to the fascia tissue used. It is particularly preferred the treatment of damage to the fascia tissue of the groin (inguinal hernia).

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung einer oben beschriebenen Zusammensetzung zur Behandlung von schlecht heilenden, chronischen Wunden der Haut und des Weichgewebes. Hierbei ist die Schwammform eine besonders bevorzugte Form des Produktes. Abhängig von dem Typ und der Form der Wunde kann sich der Schwamm der lokalen Wundsituation anpassen. Wie bei der Heilung von Knorpel- und Fasziengewebe ist auch hier die langsame Abgabe (Depot-Effekt) von Wachstumsfak toren erwünscht. Darüber hinaus erleichtert die Matrixstruktur des Produktes die Kolo nialisierung der Gewebelücke durch Zellen. The present invention also relates to the use of one described above Composition for the treatment of poorly healing, chronic wounds of the Skin and soft tissue. The sponge shape is a particularly preferred one here Shape of the product. Depending on the type and shape of the wound, the Adjust the sponge to the local wound situation. As with the healing of cartilage and Here, too, fascia tissue is the slow release (depot effect) of growth factors goals desired. In addition, the matrix structure of the product facilitates colo nialization of the tissue gap by cells.

Bei den zu behandelnden Schäden handelt es sich in einer bevorzugten Ausführungs form der Erfindung vor allem um chronische und schwer heilende Hautwunden und Weichgewebewunden folgender Genese: Diabetis, chronisch venöse Insuffizienz, ar terielle Verschlußkrankheit, Dekubitus, Patienten mit Supression des Immunsystems. Eine weitere Anwendung stellen die nicht heilenden postoperativen Wunden der Haut und des Weichgewebes, wie z. B. die schwer heilenden Wunden nach Laparotomie, dar.The damage to be treated is in a preferred embodiment form of the invention mainly around chronic and difficult to heal skin wounds and Soft tissue wounds of the following origin: diabetes, chronic venous insufficiency, ar terial occlusive disease, pressure ulcers, patients with suppression of the immune system. Another application is the non-healing postoperative skin wounds and soft tissue, such as B. the hard-to-heal wounds after laparotomy.

Die folgende Figur und die Beispiele erläutern die Erfindung.The following figure and the examples illustrate the invention.

Fig. 1 Darstellung des Meniskus und der am häufigsten auftretenden Meniskusver letzungen. Fig. 1 representation of the meniscus and the most common meniscus injuries.

Examples 1. Isolation of platelet growth factors (REL) from platelets

Aus dem mit Citrat (ACD, acid citrat dextrose) versetzten Blut wird REL wie folgt isoliert.The blood added with citrate (ACD, acid citrate dextrose) becomes REL as follows isolated.

Das Blut wird 20 Min bei 190 × g zentrifugiert, Temperatur 2 bis 6°C. Die obere Phase, das sogenannte PRP (platelet rich plasma; Bluttplättchen-reiches Plasma), das die Blutplättchen beinhaltet, wird dann bei 2000 × g, 10 min bei 2 bis 6°C zen trifugiert. Das Plättchen-Pellet (Sediment) wird in einem isotonischen Puffer sus pendiert. Als isotonischer Puffer kann PBS (physiologische Kochsalzlösung in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,1) oder HBS (physiologische Kochsalzlösung in 5 mM HEPES-Puffer, pH 6,8) dienen. Die Plättchen werden durch wiederholtes (2×) Suspendieren und Zentrifugieren gewaschen. Die Plättchen werden dann in dem PBS- oder HBS-Puffer suspendiert, so daß vorzugsweise eine Suspension von 0,1 bis 2,0 × 10⁹ Plättchen pro Milliliter entsteht (Messung z. B. mit Thrombocounter der Firma Coulter). Mit Hilfe von Thrombin oder anderen Agenzien werden die Plättchen degranuliert (Freisetzung des Inhalts der Granula). Vorzugsweise wer den pro Milliliter Suspension 0,1 bis 2,0 Einheiten Thrombin (internationale Ein heiten definiert als 15 Sek. Clotting-Zeit bei 37°C mit einer NIH-Einheit Fibrinogen gemäß der Referenz Baughman D.J., 1970, Methods in Enzymol. 19, 145-157) eingesetzt.The blood is centrifuged at 190 × g for 20 minutes, temperature 2 to 6 ° C. The upper phase, the so-called PRP (platelet rich plasma), which contains the blood platelets, is then centrifuged at 2000 × g for 10 min at 2 to 6 ° C. The platelet pellet (sediment) is suspended in an isotonic buffer. PBS (physiological saline solution in 10 mM phosphate buffer, pH 7.1) or HBS (physiological saline solution in 5 mM HEPES buffer, pH 6.8) can serve as the isotonic buffer. The platelets are washed by repeated (2x) suspension and centrifugation. The platelets are then suspended in the PBS or HBS buffer, so that preferably a suspension of 0.1 to 2.0 × 10 ⁹ platelets per milliliter is formed (measurement, for example, with a thrombocounter from Coulter). With the help of thrombin or other agents, the platelets are degranulated (release of the contents of the granules). Preferably, 0.1 to 2.0 units of thrombin (international units defined as 15 sec. Clotting time at 37 ° C. with one NIH unit of fibrinogen according to the reference Baughman DJ, 1970, Methods in Enzymol. 19 , 145-157) are used.

Nach 10 min wird das Präparat nochmals suspendiert und bei 2000 × g 10 min bei 2 bis 6°C zentrifugiert. Der Überstand beinhaltet thrombozytäre Wachstumsfak toren und andere thrombozytäre Faktoren und wird als REL bezeichnet.After 10 min, the preparation is suspended again and at 2000 × g for 10 min Centrifuged 2 to 6 ° C. The supernatant contains platelet growth factors tors and other platelet factors and is known as REL.

2. Preparation of a polymer and polymer / growth factor mixtures 2.1 Production of a REL containing fibrin membrane (F / REL-M) and one REL-containing fibrin sponges (F / REL-S)

Mit Hilfe der Cryopräzipitationsmethode wurde Fibrinogen aus 10 ml menschli chem Blut, das mit Citrat versetzt war, gewonnen nach Siedentop et al., Arch. Otolar. Head Neack Surg. 121 (1995), 769-772); Cama et al., Naturwiss. Band 48 (1961), 574. Die PPP-Plasmaprobe (platelet poor plasma PPP; Blutplättchen ar mes Plasma) wurde mit 8% Ethanol bei 0°C für 2 Stunden inkubiert und anschließend stark abzentrifugiert. Das Fibrinogensediment wurde in 2 ml Wasser gelöst. Thrombozytäre Wachstumsfaktoren (REL) wurden aus 50 ml derselben Blutprobe durch Degranulierung der isolierten Blutplättchenfraktion mit Thrombin gewonnen (vgl. Beispiel 1). Nach Entfernung von Zelitrümmern und anderen Fak toren enthielt die REL-Mischung 30 µg des Zytokin-Leitmarkers β-TG pro Milliliter.With the aid of the cryoprecipitation method, fibrinogen was made from 10 ml of human chem blood, which was mixed with citrate, obtained according to Siedentop et al., Arch. Otolar. Head Neack Surg. 121: 769-772 (1995); Cama et al., Natural Sciences. Volume 48 (1961), 574. The PPP plasma sample (platelet poor plasma PPP; blood platelets ar mes plasma) was incubated with 8% ethanol at 0 ° C for 2 hours and then strongly centrifuged off. The fibrinogen sediment was in 2 ml of water solved. Platelet growth factors (REL) were obtained from 50 ml of the same Blood sample by degranulating the isolated platelet fraction with thrombin obtained (see example 1). After removal of cell debris and other fac toren, the REL mixture contained 30 µg of the cytokine marker β-TG per milliliter.

1 ml REL in 5 mM HEPES-Puffer (HBS), pH 6,8 und 1 ml an Fibrinogenlösung (2 mg/ml) wurden gemischt und Glycerin wurde auf eine Endkonzentration von 0,5% (w/v) zugesetzt. Die Lösung wurde in eine Teflonform gegossen, Calcium chlorid wurde auf eine Endkonzentration von 5 mM zugesetzt und die Lösung wurde 1 Stunde bei 15°C inkubiert. Das resultierende Polymer wurde luftgetrock net, so daß eine elastische feste Membran (F/REL-M) entstand.1 ml REL in 5 mM HEPES buffer (HBS), pH 6.8 and 1 ml of fibrinogen solution (2 mg / ml) were mixed and glycerin was added to a final concentration of 0.5% (w / v) added. The solution was poured into a Teflon mold, calcium chloride was added to a final concentration of 5 mM and the solution was incubated at 15 ° C for 1 hour. The resulting polymer became air-dried net, so that an elastic solid membrane (F / REL-M) was created.

Weiterhin wurde aus der gleichen REL-Ausgangsmischung eine Schwammform (F/REL-S) hergestellt durch Einfrieren des Fibrin-Polymers bei -80°C in einer Geschwindigkeit von 2°C/min. Sodann wurde das Fibrin-Polymer bei -5°C lyophili siert. Im Vergleich zur Membran-Form ist die entsprechende Schwammform sowohl voluminöser als auch poröser.Furthermore, the same REL starting mixture became a sponge shape (F / REL-S) produced by freezing the fibrin polymer at -80 ° C in a Speed of 2 ° C / min. The fibrin polymer was then lyophilized at -5 ° C sated. Compared to the membrane shape, the corresponding sponge shape both bulkier and more porous.

2.2 Production of a PGA / Fibrin / REL membrane (F / PGA / REL-M)

Konventionell erhältliche Polyglykolsäurematrix (PGA, 2 cm²; z. B. von B. Braun, Melsungen, Deutschland) wurde mit einer Mischung aus 0,2 ml Fibrinogen (2 mg/ml) und 0,2 ml REL, wie vorstehend beschrieben, getränkt und das Fibrinogen polymerisiert. Das Produkt wurde ebenfalls luftgetrocknet.Conventionally available polyglycolic acid matrix (PGA, 2 cm ² ; e.g. from B. Braun, Melsungen, Germany) was treated with a mixture of 0.2 ml fibrinogen (2 mg / ml) and 0.2 ml REL, as described above, soaked and the fibrinogen polymerized. The product was also air dried.

Eine PGA/Kollagen/Fibrin/REL-Membran (PGA/C/F/REL-M) kann wie oben unter Zusatz von 0,2 ml Kollagen I (2 mg/ml) hergestellt werden.A PGA / collagen / fibrin / REL membrane (PGA / C / F / REL-M) can be made as above under Addition of 0.2 ml of collagen I (2 mg / ml) can be prepared.

2.3 Production of a collagen sponge (C / REL-S) and a collagen membrane (CIREL-M)

Eine 5-%ige Lösung (w/v) aus Rinderkollagen Typ I (Boehringer Mannheim) wurde auf pH 4,0 eingestellt, und 3 ml dieser Lösung wurden mit 3 ml einer REL-Lösung (s. Beispiel 1) gemischt. Glycerin wurde auf eine Endkonzentration von 0,05% zugesetzt, die Mischung in eine Form gegossen und auf -85°C (2°C/Min.) abge kühlt. Die gefrorene Lösung wurde bei -5°C lyophilisiert. Der resultierende REL- enthaltende Schwamm (C/REL-S) war porös und flexibel.A 5% solution (w / v) of bovine collagen type I (Boehringer Mannheim) was used adjusted to pH 4.0, and 3 ml of this solution were mixed with 3 ml of a REL solution (see example 1) mixed. Glycerin was reduced to a final concentration of 0.05% added, the mixture poured into a mold and cooled to -85 ° C (2 ° C / min.) cools. The frozen solution was lyophilized at -5 ° C. The resulting REL containing sponge (C / REL-S) was porous and flexible.

Dieselbe Mischung kann ebenfalls zur Herstellung einer Kollagenmembran (C/REL-M) verwendet werden; anstatt durch Gefriertrocknung wird die Zusam mensetzung dazu, wie unter 2.1 für Fibrin beschrieben, luftgetrocknet. Gleichwer tige Zusammensetzungen wurden auch mit Kollagen aus Schweinen und Kollagen Typ II erzielt.The same mixture can also be used to make a collagen membrane (C / REL-M) can be used; instead of freeze drying, the composition is Composition for this, as described under 2.1 for fibrin, air-dried. Equiv Term compositions were also made with porcine collagen and collagen Type II achieved.

2.4 Production of a mixed collagen / fibrin sponge (C / F / REL-S) and a mixed collagen / fibrin membrane (C / F / REL-M)

REL wurde wie vorstehend in Beispiel 1 µg/ml. Der Kollagen-Schwamm wurde wie vorstehend beschrieben aus 50 ml einer Citrat-Blutprobe eines einzigen Spenders hergestellt. Die β-TG Konzentration betrug 30 in Beispiel 2.3 beschrieben durch Lyophilisation von Kollagen hergestellt. Der Schwamm wies eine Stärke von 0,4 cm auf und enthielt ungefähr 2.5 mg Kollagen/cm². 0,2 ml der rohen Fibrinogen- Lösung (2 mg/ml, hergestellt wie vorstehend beschrieben) wurde mit 0,2 ml REL gemischt, auf 2°C abgekühlt und mit Glycerin (Endkonzentration: 0,5%), Calcium chlorid (Endkonzentration: 5 mM) und 5 Einheiten Thrombin versetzt. Zwei Quad ratzentimeter des Kollagen-Schwammes wurden in die vorstehend genannte Lösung eingetaucht und über 1 h bei 15°C inkubiert. Ein Teil der Präparation wurde unter Bildung eines Kollagen/Fibrin-Schwammes (F/C/REL-S) lyophilisiert. Ein anderer Teil der Präparation wurde unter Bildung einer Kollagen/Fibrin- Membran (F/C/REL-M) luftgetrocknet.REL was as in Example 1 ug / ml above. The collagen sponge was prepared as described above from 50 ml of a citrate blood sample from a single donor. The β-TG concentration was 30 described in Example 2.3 produced by lyophilization of collagen. The sponge was 0.4 cm thick and contained approximately 2.5 mg collagen / cm ² . 0.2 ml of the crude fibrinogen solution (2 mg / ml, prepared as described above) was mixed with 0.2 ml REL, cooled to 2 ° C. and treated with glycerol (final concentration: 0.5%), calcium chloride (final concentration : 5 mM) and 5 units of thrombin added. Two square centimeters of the collagen sponge was immersed in the above solution and incubated for 1 hour at 15 ° C. Part of the preparation was lyophilized to form a collagen / fibrin sponge (F / C / REL-S). Another part of the preparation was air dried to form a collagen / fibrin membrane (F / C / REL-M).

In Tabelle 1 ist die Menge an Wachstumsfaktor, die aus den hier beschriebenen Zusammensetzungen über einen Zeitraum von zwei Tagen austritt, aufgeführt.In Table 1 is the amount of growth factor obtained from those described here Compositions leaking over a period of two days, listed.

3. Leakage of growth factors from different compositions

Die unter Beispiel 2 beschriebenen Produkte wurden bei 4°C oder 37°C in 4 ml eines geeigneten Puffers (vorzugsweise PBS mit 2% HSA (Humanes Serum Al bumin) inkubiert. In bestimmten Zeitabständen wurden Proben entnommen und durch die folgenden Tests auf ihren Gehalt an Wachstumsfaktoren untersucht:The products described under Example 2 were at 4 ° C or 37 ° C in 4 ml a suitable buffer (preferably PBS with 2% HSA (Human Serum Al bumin) incubated. Samples were taken at certain time intervals and examined for their growth factor content by the following tests:

3.1 Proliferation Test

Stimulierende Effekte der Wachstumsfaktoren auf die Zellproliferation wurden in einem Proliferationstest wie von Porstmann et al., J. Immunol. Meth. 82 (1985), (169-179) beschrieben, durchgeführt. Dazu wurden zu Kulturen von humanen Hautfibroblasten die oben beschriebenen Proben zugesetzt. Die Stimulierung der Zellproliferation wird durch den verstärkten Einbau von nicht-radioaktivem De oxyuracilderivat (BrdU) in die zelluläre DNA widergespiegelt. Für die Detektion des in die DNA eingebauten BrdUs wurde ein hoch sensitiver auf der ELISA-Technik basierender Chemolumineszenztest (Boehringer) eingesetzt. Die Inkorporation wurde in einem Mikroplattenluminometer gemessen. Dieser Test wurde ebenfalls eingesetzt, um die Stimulierung der Zellproliferation auf andere Zelltypen wie Keratinozyten und Chondrozyten zu messen. Stimulatory effects of growth factors on cell proliferation have been shown in a proliferation test as described by Porstmann et al., J. Immunol. Meth. 82 (1985), (169-179). To do this, cultures of human The samples described above were added to skin fibroblasts. Stimulating the Cell proliferation is caused by the increased incorporation of non-radioactive De oxyuracil derivative (BrdU) is reflected in cellular DNA. For the detection of the BrdUs built into the DNA became highly sensitive on the ELISA technique based chemiluminescence test (Boehringer) used. The incorporation was measured in a microplate luminometer. This test was also used to stimulate cell proliferation on other cell types like Measure keratinocytes and chondrocytes.

3.2 Chemotactic test

Die chemotaktischen Eigenschaften der Wachstumsfaktoren wurden unter Ver wendung des Monozyten-Migrationstests gemessen (Falk et al., J. Immunol. Meth. 33 (1980), 239-247). Dazu wurden menschliche Monozyten aus der PBMC (Peri phere Blut-Mononukleäre Zellen)-Fraktion aus "Buffy Coats" von menschlichen Blutspendern isoliert. Für den Test wurde eine kommerziell erhältliche Chemotaxis- Kammer (Costar) benutzt. In diesem Gerät sind zwei Kammern vorhanden, die durch eine geeignete Membran getrennt werden. Die eine Kammer enthält Mono zyten, die andere ein stimulierendes Agens. Die Migration von Monozyten in die Richtung des Stimulus wird durch Messung der Menge an Monozyten, die durch die Membran hindurchgewandert sind, bestimmt. Die Messung wird unter Verwen dung eines sensitiven Densitometers durchgeführt.The chemotactic properties of the growth factors have been reviewed under Ver using the monocyte migration test (Falk et al., J. Immunol. Meth. 33: 239-247 (1980)). For this purpose, human monocytes were extracted from the PBMC (Peri phere blood mononuclear cells) fraction from "Buffy Coats" of human Blood donors isolated. A commercially available chemotaxis was used for the test Chamber (Costar) used. In this device there are two chambers that be separated by a suitable membrane. One chamber contains mono cytes, the other a stimulating agent. The migration of monocytes into the Direction of the stimulus is determined by measuring the amount of monocytes passing through migrated through the membrane. The measurement is used A sensitive densitometer was used.

3.3 ELISA for REL components

Die quantitative Messung von Wachstumsfaktoren und anderen Komponenten der REL-Mischung wurde mit Hilfe der ELISA-Technik und kommerziell erhältlichen Antikörpern gemessen (z. B. R Systems, Deutschland).The quantitative measurement of growth factors and other components of the REL mix was made using the ELISA technique and is commercially available Antibodies measured (e.g. R Systems, Germany).

TABELLE 1A TABLE 1A

TABELLE 1B TABLE 1B

Die Ergebnisse aus Tabellen 1A und 1B zeigen deutlich, daß die getesteten Wachstumsfaktoren reversibel an das Polymer und/oder Fibrin binden. Die Bindungs- und Freisetzungsraten hängen von der Zusammensetzung der Po lymere und ihrer Form ab. So sind die Freisetzungsraten für Wachstumsfaktoren aus Schwämmen größer und der Depot-Effekt entsprechend kleiner als bei den entsprechenden Membranen. Mischpolymere, z. B. Kollagen/Fibrin-Polymere, zei gen kleinere Freisetzungsraten im Vergleich zu Fibrin-freien Polymeren. Die aus den Polymeren freigesetzten Wachstumsfaktoren waren biologisch aktiv, wie an hand des Proliferations- und Chemotaxistests überprüft werden konnte.The results from Tables 1A and 1B clearly show that the tested Reversibly bind growth factors to the polymer and / or fibrin. the Binding and release rates depend on the composition of the buttocks polymers and their shape. So are the release rates for growth factors from sponges larger and the depot effect correspondingly smaller than with the corresponding membranes. Mixed polymers, e.g. B. collagen / fibrin polymers, zei gen lower release rates compared to fibrin-free polymers. From Growth factors released from the polymers were biologically active, as on could be checked by means of the proliferation and chemotaxis test.

4. Points system for assessing wound healing

Zur Beurteilung der Wundheilungsergebnisse auf histologischer und klinischer Ebene wurde gemäß Standardverfahren ein Punktesystem eingeführt. Die zu grundeliegenden Kriterien sind nachstehend aufgeführt:To assess the wound healing results on histological and clinical At the 1st level, a points system was introduced in accordance with standard procedures. The too The basic criteria are listed below:

Block I (clinical picture of the healed organ) Macroscopic assessment of the scar tissue

Größe des NarbengewebesThe size of the scar tissue Punkte: 0-4Points: 0-4 Textur des Narbengewebes (fest, elastisch, sanft/glatt, etc.)Texture of the scar tissue (firm, elastic, gentle / smooth, etc.) Punkte: 0-6Points: 0-6 Einheitlichkeit des NarbenmaterialsUniformity of the scar material Punkte: 0-7Points: 0-7 Adhäsion des Narbengewebes an das umgebende gesunde Gewebe:Adhesion of the scar tissue to the surrounding healthy tissue: Punkte: 0-5Points: 0-5 allgemeiner Eindruck:general impression: Punkte: 0-4Points: 0-4

Die Befunde wurden unabhängig voneinander von drei Experten untersucht.The findings were examined independently by three experts.

Eine Punktzahl von 1-10 ist ein schlechtes Ergebnis, eine Punktzahl von 11-20 ein durchschnittliches Ergebnis, eine Punktzahl von 21-26 ein gutes Ergebnis.A score of 1-10 is a bad result, a score of 11-20 is a bad result average score, a score of 21-26 a good result.

Block II (histological assessment)

Gewebematerial aus der Mitte der Narbe, aus dem Grenzbereich zwischen Narbe und normalem Gewebe und aus normalem Gewebe wurden gemäß bekannter histogischer Standardverfahren entnommen.Tissue material from the center of the scar, from the border area between the scar and normal tissue and from normal tissue have become known according to taken from standard histogical procedures.

Es wurden Gewebeschnitte hergestellt, die mit Hämatoxylin/Eosin für die Lichtmikroskopie gefärbt wurden. Weiterhin wurden Gewebeschnitte durch Gold- und/oder Platin-Bedampfung für die Elektronenmikroskopie hergestellt.Tissue sections were prepared that were treated with hematoxylin / eosin for the Stained light microscopy. Furthermore, tissue sections through gold and / or platinum vapor deposition for electron microscopy.

Zelldichte im Vergleich zu gesundem GewebeCell density compared to healthy tissue Punkte: 0-5Points: 0-5 Anzahl der Kollagenfasern (in der elektronenmikroskopischen Aufnahme) im Vergleich zu gesundem GewebeNumber of collagen fibers (in the electron micrograph) compared to healthy tissue Punkte: 0-5Points: 0-5 Zell-Form im Vergleich zu gesundem GewebeCell shape compared to healthy tissue Punkte: 0-5Points: 0-5 Allgemeiner Eindruck/Gewebe-Organisation:General impression / tissue organization: Punkte: 0-7Points: 0-7

Die Schnitte wurden unabhängig voneinander von drei Experten untersucht. Eine Punktzahl von 1-8 ist ein schlechtes Ergebnis, eine Punktzahl von 9-15 ist ein durchschnittliches Ergebnis und eine Punktzahl von 16-25 ist ein gutes Ergebnis.The sections were examined independently by three experts. One A score of 1-8 is a bad result, a score of 9-15 is a average score and a score of 16-25 is a good result.

Block III (physical examination)

Die Stärke der Narbe wurde mit der Stärke des normalen Gewebes unter Ver wendung der Materialtest-Maschine gemäß dem von Roeddecker et al. beschrie benen Verfahren (Roeddecker et al., Theor. Surg. 8 (1993), 136-142) verglichen.The strength of the scar was compared with the strength of normal tissue under Ver application of the material test machine according to the Roeddecker et al. described benen method (Roeddecker et al., Theor. Surg. 8 (1993), 136-142) compared.

Das Punktesystem war wie nachstehend ausgeführt: The point system was as follows:

Reißfestigkeit vergleichbar mit normalem Gewebe (± 10%):Tear strength comparable to normal fabric (± 10%): Punkte: 10Points: 10 70-90% der Reißfestigkeit von normalem Gewebe70-90% of the tear strength of normal tissue Punkte: 7Points: 7 50-69% der Reißfestigkeit von normalem Gewebe50-69% of the tear strength of normal fabric Punkte: 5Points: 5 30-49% der Reißfestigkeit von normalem Gewebe30-49% of the tear strength of normal tissue Punkte: 3Points: 3 10-29% der Reißfestigkeit von normalem Gewebe10-29% of the tear strength of normal tissue Punkte: 2Points: 2 ungefähr 5-9% der Reißfestigkeit von normalem Gewebeabout 5-9% of the tear strength of normal fabric Punkte: 1Points: 1 weniger als 5% der Reißfestigkeit von normalem Gewebeless than 5% of the tear strength of normal tissue Punkte: 0Points: 0

Eine Punktzahl von 7-10 ist ein sehr gutes Ergebnis, eine Punktzahl von 3-5 ist ein durchschnittliches Ergebnis, eine Punktzahl von 1-2 ist ein schlechtes Ergebnis und eine Punktzahl von 0 ist ein sehr schlechtes Ergebnis.A score of 7-10 is a very good result, a score of 3-5 is a average result, a score of 1-2 is a bad result and a score of 0 is a very bad result.

5. Healing of torn meniscus with REL-containing compositions

Die Experimente wurden mit Menisci von Kaninchen gemäß den in Roeddecker et al., J. of Surg. Res., 1994, 56, 20-27 und lshimura et al., J. of Arthr. and Rel. Surg., 1997, 13 (5), 551-557 beschriebenen Techniken durchgeführt und ausgewertet. Dazu wurde eine Läsion von 3 mm Länge mit einem Skalpell in Zone II des Me niskus appliziert. In den Riß wurde ein REL-enthaltendes Fibrin/Kollagen-Polymer (C/F/REL-M) von ca. 1,5 mm Länge eingeführt. In den Kontrollexperimenten wurde entweder selbsthergestellte Fibrinogenlösung (vgl. Beispiel 2.1) mit Thrombin und Calciumchlorid (4 mg/ml Fibrinogen; 100 Einheiten Thrombin, 5 mM CaCl₂) ver mischt und sofort in die Läsion eingeführt oder die Läsion wurde gar nicht behan delt. Die Heilung wurde nach 12 Wochen beurteilt. Das Narbengewebe und das umgebende Gewebe wurden standardhistologischen Tests unterworfen und seine morphologischen und makroskopischen Eigenschaften beurteilt.The experiments were carried out with menisci from rabbits according to the methods described in Roeddecker et al., J. of Surg. Res., 1994, 56, 20-27 and Ishimura et al., J. of Arthr. and Rel. Surg., 1997, 13 (5), 551-557 performed and evaluated. For this purpose, a lesion 3 mm in length was applied with a scalpel in zone II of the meniscus. A REL-containing fibrin / collagen polymer (C / F / REL-M) about 1.5 mm in length was introduced into the crack. In the control experiments, either self-made fibrinogen solution (see Example 2.1) was mixed with thrombin and calcium chloride (4 mg / ml fibrinogen; 100 units thrombin, 5 mM CaCl ₂ ) and immediately introduced into the lesion or the lesion was not treated at all. Healing was assessed after 12 weeks. The scar tissue and the surrounding tissue were subjected to standard histological tests and its morphological and macroscopic properties were assessed.

Sowohl die mechanischen als auch die histologischen Analyseergebnisse der mit C/F/REL-behandelten Gruppe zeigten bessere Heilung (höhere Punktezahl in der vorstehenden Beurteilung) der Menisci als beide Kontrollgruppen. Das Polymer wurde resorbiert. Both the mechanical and the histological analysis results of the mit C / F / REL-treated group showed better healing (higher score in the above assessment) of the menisci as both control groups. The polymer was absorbed.

TABELLE 2 TABLE 2

6. Healing of inguinal hernias with PGA-REL membranes

Die Versuchstiere (Ratten) wurden in drei Gruppen aufgeteilt. 1,5 × 1,5 cm Stan dardschnitte wurden in die Bauchleiste der Tiere eingeführt und ein Polyglucon säurenetz eingenäht. In der Kontrollgruppe wurde ein Polygluconsäurenetz im plantiert, in der Verum-Gruppe wurden PGA/F/REL-M und PGA/C/F/REL-M-Poly mere verwendet. Nach 3 und 12 Wochen wurde das Ergebnis der Wundheilung bewertet, wobei die Hauptkriterien das makroskopische Bild der Wunde, die ex vivo mechanische Narbenstärke (Riß der Narbe unter Druck) und die histologische Bewertung (z. B. Kollagenanordnung, Fibroblastenanzahl) waren. Das Narben gewebe und umgebendes Gewebe wurde unter Verwendung der vorstehend aus geführten standardhistologischen Techniken getestet und die morphologischen und makroskopischen Eigenschaften gemäß den vorstehenden Kriterien bewertet. Die Ergebnisse dieser Versuche demonstrieren signifikant höhere Resistenz der Narbe gegen ex vivo Leistenbruch in beiden Verum-Gruppen im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Interessanterweise zeigte die histologische Analyse, daß Ver suchstiere der Verum-Gruppen eine höhere Dichte an Fibroblasten und Kollagen fasern und eine definiertere, teilweise mit der Situation des gesunden Gewebes vergleichbare Anordnung der Fasern aufweisen. The test animals (rats) were divided into three groups. 1.5 × 1.5 cm stan Dardschnitte were introduced into the abdominal ridge of the animals and a polyglucon sewn in acid net. In the control group, a polygluconic acid network was used planned in the verum group were PGA / F / REL-M and PGA / C / F / REL-M-Poly mere used. After 3 and 12 weeks the result of wound healing was assessed, the main criteria being the macroscopic appearance of the wound, the ex vivo mechanical scar strength (tear of the scar under pressure) and the histological Rating (e.g. collagen arrangement, number of fibroblasts). The scars tissue and surrounding tissue were determined using the above guided standard histological techniques and tested the morphological and macroscopic properties are evaluated according to the above criteria. The results of these experiments demonstrate significantly higher resistance of the Scar against ex vivo inguinal hernia in both verum groups compared to that Control group. Interestingly, the histological analysis showed that Ver The verum groups look for a higher density of fibroblasts and collagen fibers and a more defined, partly with the situation of the healthy tissue have a comparable arrangement of the fibers.

TABELLE 3 TABLE 3

7. Cartilage healing with REL containing compositions

Der Effekt von REL enthaltenden Polymeren auf die Heilung von Knorpelgewebe wurde in Kaninchenmodellen untersucht. Dem Knorpel im Kniegelenk (Femur knochen) wurde ein Defekt zugefügt und in die so entstandene Wunde wurde ein REL-enthaltendes Polymer implantiert (C/F-REL-S) und das Knorpelgewebe bis zu 20 Wochen nach der Operation beobachtet. Das Narbengewebe und umgebende Gewebe wurde in den vorstehend ausgeführten histologischen Standardverfahren getestet und in Hinblick auf morphologische und makroskopische Eigenschaften bewertet. Die Analyse dieser Ergebnisse zeigte einen signifikant besseren Hei lungsverlauf in der Gruppe, die mit einem REL nthaltenden Polymer behandelt wurde.The effect of REL containing polymers on cartilage tissue healing was studied in rabbit models. The cartilage in the knee joint (femur bone) a defect was added and the resulting wound became a REL-containing polymer implants (C / F-REL-S) and the cartilage tissue up to Observed 20 weeks after surgery. The scar tissue and surrounding Tissue was prepared using the standard histological procedures outlined above tested and in terms of morphological and macroscopic properties rated. Analysis of these results showed a significantly better Hei progress in the group treated with a REL-containing polymer became.

TABELLE 4 TABLE 4

Claims

1. A composition comprising at least one platelet growth factor tor, fibrin and / or a precursor thereof, preferably fibrinogen, and at least another polymer and / or a precursor thereof.

2. Composition according to claim 1, characterized in that the throm Bocytic growth factor reversible to fibrin and / or fibrinogen and the rest Polymer and / or the precursor thereof is bound.

3. Composition according to claim 1 or 2, characterized in that the Fibrin and / or fibrinogen and the further polymer and / or the precursor thereof form a matrix.

4. Composition according to claim 3, characterized in that the matrix Has sponge, clot, granulate, rod, film and / or membrane form.

5. Composition according to at least one of claims 1 to 4, characterized characterized in that the platelet growth factor is of human origin.

6. Composition according to at least one of claims 1 to 4, characterized characterized in that the platelet growth factor is of animal origin.

7. Composition according to at least one of claims 1 to 6, characterized characterized in that the platelet growth factor is an autologous one Is a growth factor.

8. Composition according to at least one of claims 1 to 6, characterized characterized in that the platelet growth factor is a recombinant Is a growth factor.

9. Composition according to at least one of claims 1 to 8, characterized characterized in that the platelet growth factor is selected from A group comprising PDGF (platelet derived growth factor), TGF-α (transforming growth factor α), TGF-β (transforming growth factor tor β), PF-4 (platelet factor-4), β-TG (β-thromboglobin), PD-ECGF (from platelet derived, endothelial cell growth factor), aFGF (acidic fibroblasts Growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor), IGF (insulin similar growth factor), EGF (Epidermal Growth Factor), KGF (Keratinocyte growth factor), SPARK, RANTES, Gro-alpha and / or an ent speaking precursor molecule.

10. Composition according to at least one of claims 1 to 9, characterized characterized as being a mixture of several platelet growth factors gates included.

11. Composition according to at least one of claims 1 to 10, characterized characterized in that the platelet growth factor ranges from 10 to 500 µg per 100 mg dry matter of the end product is.

12. The composition according to claim 10, characterized in that the Mixture of several platelet growth factors REL (from blood platelets released mixture of growth factors).

13. Composition according to claim 12, characterized in that REL can be obtained by degranulating granules from platelets.

14. Composition according to at least one of claims 10 to 13, characterized characterized in that the mixture of platelet growth factors 1 to 500 ng PDGF / ml REL, 1 to 1000 ng TGF-β / ml REL, 1 to 400 µg PF-4 / ml REL, 1 up to 400 µg β-TG / ml REL, 1 to 2000 ng bFGF / ml REL and 1 to 500 ng PD- ECGF / ml REL includes.

15. Composition according to claim 14, characterized in that the Mixture of platelet growth factors 5 to 100 ng PDGF / ml REL, 5 up to 200 ng TGF-β / ml REL, 10 to 80 µg PF-4 / ml REL, 10 to 80 µg β-TG / ml REL, 10 to 400 ng bFGF / ml REL and 5 to 200 ng PD-ECGF / ml REL.

16. Composition according to at least one of claims 1 to 15, characterized characterized in that the composition comprises fibrinogen.

17. Composition according to at least one of claims 1 to 16, characterized characterized in that the fibrinogen is autologous fibrinogen.

18. Composition according to at least one of claims 1 to 17, characterized characterized in that the fibrinogen ranges from 0.1 to 99 mg per 100 mg Dry matter of the end product.

19. Composition according to claim 18, characterized in that the fibrino genes in the range from 20 to 50 mg per 100 mg dry matter of the end product lies.

20. Composition according to at least one of claims 1 to 19, characterized characterized in that the further polymer is a biopolymer other than fibrin or is its non-polymeric precursor.

21. Composition according to claim 20, characterized in that the bio polymer is selected from collagen, polyhyaluronic acid, polyglycolic acid and Polylactic acid.

22. Composition according to at least one of claims 1 to 20, characterized characterized in that the further polymer and / or its precursor is in the range of 1 to 99 mg per 100 mg dry matter of the end product.

23. Composition according to at least one of claims 1 to 22, characterized characterized in that it further comprises a catalyst which the Polymerisa tion of fibrinogen catalyzed.

24. Composition according to claim 23, characterized in that the kata lysator is thrombin, calcium ions and / or coagulation factor XIII.

25. Composition according to at least one of claims 1 to 24, characterized characterized in that the composition further includes a factor to the sub support of tissue healing processes.

26. Composition according to claim 25, characterized in that the factor to support tissue healing processes fibronectin, thrombospondin, Is albumin and / or heparin.

27. Composition according to at least one of claims 1 to 26 as a medicament.

28. Composition according to at least one of claims 1 to 26 as Kos metikum.

29. A method for producing a composition according to at least one of Claims 1 to 20, characterized in that at least one thrombocytic Growth factor with fibrin and / or a precursor thereof, preferably fibrino gen, and at least one further polymer or the precursor thereof mixed will.

30. The method according to claim 29, characterized in that the polymerizing the preliminary stage takes place in vivo.

31. The method according to claim 29 or 30, characterized in that the throm Bocytic growth factor before or during polymerization with the precursors or is brought into contact with the polymers after the polymerization has taken place.

32. Use of a composition according to at least one of claims 1 to 28 for the treatment of damage in tissues with poor regenerative capacity and / or low blood flow.

33. Use of a composition according to claim 32 for the treatment of Damage to the cartilage.

34. Use of a composition according to claim 33 for the treatment of Damage to the elastic cartilage, hyaline cartilage or fibrous cartilage of the Meniscus.

35. Use of a composition according to claim 32 for the treatment of Damage to the fascia tissue.

36. Use of a composition according to claim 35 for the treatment of Damage to the fascia tissue of the groin.

37. Use of a composition according to at least one of claims 1 to 28 for the treatment of acute and / or chronic damage in skin and / or Soft tissues.

38. Use of a composition according to claim 37 for the treatment of Damage with the following origins: diabetes, chronic venous insufficiency, arterial Occlusive disease, pressure ulcers, suppression of the immune system and / or lapa rotomy.