DE19853242A1

DE19853242A1 - Derivatisierung von Trägeroberflächen

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Publication number: DE19853242A1
Application number: DE19853242A
Authority: DE
Inventors: Markus Beier
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1998-11-18
Filing date: 1998-11-18
Publication date: 2000-05-25
Anticipated expiration: 2018-11-19
Also published as: DE19853242B4; AU1856300A; US6905724B1; WO2000029373A3; ATE300516T1; EP1131281A2; EP1131281B1; DE59912342D1; WO2000029373A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Derivatisieren von Trägern, wobei eine funktionelle Gruppe auf einer Trägeroberfläche durch Umsetzung mit einem Aktivierungsreagenz aktiviert wird und nachfolgend mit einer Amin-Komponente umgesetzt wird. Weiter betrifft die Erfindung einen Träger mit Dendrimerstruktur an seiner Oberfläche sowie die Verwendung eines erfindungsgemäß hergestellten Trägers zur Anbindung von Biopolymeren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Derivatisierung von Träg eroberflächen sowie dadurch derivatisierte Trägeroberflächen.

Die Anbindung von Biopolymeren, insbesondere Nukleinsäuren, an feste Träg eroberflächen wird bis heute im allgemeinen durch folgende Alternativen er reicht:

1. Aufbringen von Biopolymeren (z. B. Nukleinsäuren) auf Oberflächen: Hier finden vor allem poly-L-Lysin gecoatete Glasträger und Nylon-Mem branen Verwendung. Dabei werden die Biopolymere durch Ladung an den Träger gebunden. Nachteilig bei der Verwendung poly-L-Lysin gecoateter Glasträger ist, daß keine kovalente Anknüpfung zwischen der beschichte ten Oberfläche und dem Biopolymer stattfindet. Der Träger kann nur einmalig verwendet werden. Weiter gibt es so gut wie keine Möglichkei ten zur Optimierung des Abstandes zwischen Biopolymer und Träger. Nachteilig bei der Verwendung von Nylonmembranen ist, daß die Biopoly mere größtenteils auch nur durch Ladung gebunden werden. Der Träger kann zwar mehrmalig verwendet werden, aber es ist auch keine Optimie rung des Abstandes zwischen Biopolymer und Träger möglich.
2. In-situ Aufbau von Biopolymere (z. B. Nukleinsäuren) auf Oberflächen: Hier finden gebräuchliche Linkersysteme, die von der Biopolymersynthese an porösen CPG-Materialien herrühren, Verwendung. Bei den verwendeten Linker-Molekülen handelt es sich meist um Polyethylenglykol, insbesonde re Tetra- oder Hexaethylenglykol. Die Linkermoleküle werden üblicherwei se durch kostenintensive Reagenzien analog der Phosphoramidit-Chemie aufgebracht. Es kann leider keine Massenherstellung stattfinden und das Aufbringen von Ladungen ist nicht möglich.

Weiter haben diese Verfahren alle den Nachteil, daß es ihnen an Flexibilität man gelt, und die Biopolymere können auf der Oberfläche nur in einer sehr begrenz ten Anzahl aufgebracht werden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, ein Verfahren bereitz stellen, das eine optimale Anbindung von einer großen Anzahl Biopolymeren an Trägeroberflächen erlaubt. Die Aufgabe besteht weiter darin, eine Trägerober fläche bereitzustellen, deren Bindungskapazität auf ein Vielfaches durch Durch führen einer Oberflächenmodifikation gesteigert worden ist.

Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der Patentansprüche gelöst.

Insbesondere wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, bei dem eine funktionelle Gruppe auf einer Trägeroberfläche durch ein Aktivierungsreagenz aktiviert und nachfolgend mit einer Amin-Komponente umgesetzt wird.

Dem erfindungsgemäßen Verfahren liegen bevorzugt folgende Synthese-Prinzi pien zugrunde:

wobei R₁ und R₂ gleich oder verschieden sein können. Die Bedeutungen von R₁ und R₂ unterliegen keiner Beschränkung und können H oder jeglicher organischer Rest sein (z. B. ein gerader oder verzweigter Alkylrest mit 1-30 Kohlenstoff atomen, ein gerader oder verzweigter Alkenylrest mit 2 bis 30 Kohlenstoff atomen, ein mono- oder polyzyklischer Alkylrest mit 3 bis 30 Kohlenstoffatomen oder ein mono- oder polyzyklischer Alkenylrest mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen oder einen mono- oder polyzyklischen Rest mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen, wobei die Reste ggf. durch einen oder mehrere Substituenten (z. B. OH, Carbox yl, Carbonyl, Phosphat-) substituiert sein können). Die Base kann jegliche basi sche Verbindung sein, z. B. Diisopropylethylamin.

Es kann jeder beliebige gerade oder verzweigte C_1-30-Alkylrest verwendet wer den. Beispiele hierfür sind Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, tert.-Butyl-, n-Butyl-, n-Hexyl-, 2-Methylpentyl-, 2,3-Dimethylbutyl-, n-Heptyl-, 2-Methylhexyl-, 2,2-Dimethylpentyl-, 3,3-Dimethylpentyl-, 3-Ethylpentyl-, n- Octyl-, 2,2-Dimethylhexyl-, 3,3-Dimethylhexyl-, 3-Methyl-3-ethylpentylgruppen. Bevorzugt sind kurze Alkylketten, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Isopropyl-.

Es kann jeder beliebige gerade oder verzweigte C_2-30-Alkenylrest verwendet werden. Beispiele hierfür sind Vinyl-, Propenyl-, Isopropenyl-, Allyl-, 2-Methylal lyl-, Butenyl- oder Isobutenyl-, Hexenyl- oder Isohexenyl-, heptenyl- oder Isohep tenyl-, Octenyl- oder lsooctenylgruppen. Bevorzugt sind Vinyl-, Propenyl- und Isopropenyl-.

Der Cycloalkylrest mit 3 bis 30 Kohlenstoffatomen kann jeder beliebige Cycloal kylrest sein. Beispiele hierfür sind eine Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl- oder Cyclohexyl-, Cycloheptyl-, Cxclooctyl-, Cyclononyl- oder Cyclodecylgrup pen. Bevorzugt sind Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl- und Cyclohexyl-.

Der Cycloalkenylrest mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen kann jeder beliebige Cycloalkenylrest sein. Beispiele hierfür sind eine Cyclobutenyl-, Cyclopentenyl- oder Cyclohexenyl-, Cycloheptenyl-, Cxclooctenyl-, Cyclononenyl- oder Cyclode cenylgruppen. Bevorzugt sind Cyclobutenyl-, Cyclopentenyl- oder Cyclohexenyl.

Beispiele für polyzyklische Alkyl- bzw. Alkenylreste umfassen Norbornan, Adam antan oder Benzvalen.

R₁ und R₂ können ferner beliebige mono- oder polycyclische C6-30-Arylreste sein. Beispiele hierfür sind ein carbocyclischer, monocyclischer Rest, beispiels weise die Phenylgruppe, ein heterocyclischer, monocyclischer Rest, beispiels weise die Gruppen Thienyl, Furyl, Pyranyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Pyridyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Furazannyl, Pyrrolinyl, Imidazolinyl, Pyrazolinyl, Thiazolinyl, Triazolyl, Tetrazolyl, sowie die Positions isomeren des oder der Heteroatome, die diese Gruppen umfassen können.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren entstehen an der Trägeroberfläche mehr oder weniger vernetzte Linkersysteme, die die Anbindung einer ggf. großen Anzahl von Biopolymeren an die Trägeroberfläche erlauben. Bevorzugte Biopoly mere sind DNA, RNA, Nucleinsäureanaloga, Peptide, Proteine, Antikörper etc.

Erfindungsgemäß soll unter einer funktionellen Gruppe eine auf einer Trägerober fläche befindliche chemische Gruppierung, wie z. B. eine Amino-Gruppe, Hydrox yl-Gruppe, Carboxyl-Gruppe, Carbonyl-Gruppe, Thiol-, Amid- oder Phosphat- Gruppe verstanden werden.

Erfindungsgemäß ist jegliche(r) auf diesem Gebiet übliche Träger bzw. Matrix einsetzbar. Dies sind insbesondere Glas, Folien bzw. Membranen aus Polypropy len, Nylon, Cellulose, Cellulosederivate (z. B. Celluloseacetat, Cellulose-Misch ester), Polyethersulfonen, Polyamiden, Polyvinylchlorid, Polyvinylidenfluorid, Polyester, Teflon oder Polyethylen.

Erfindungsgemäß soll unter einem Aktivierungsreagenz ein Reagenz verstanden werden, das auf der Trägeroberfläche befindliche funktionelle Gruppen in einen ankopplungsbereiten Zustand versetzt. Bevorzugte Aktivierungsreagenzien sind 4-Nitrophenyl-Chloroformiat ( = Chlorameisensäure-4-nitrophenylester), Carbo nyldiimidazol, Acryloylchlorid (Acrylsäurechlorid), Phenylchloroformiat, Phosgen, Diphosgen, Triphosgen, EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid hydrochlorid), N,N'-Diisopropyl-carbodiimid, Dicylohexyl-carbodümid, Disuccin imidyl-carbonat, Disuccinimidyl-oxalat, Dimethylsuberimidatdihydrochlorid oder Phenylendiisothiocyanat, wobei die drei erstgenannten am bevorzugtesten sind.

Erfindungsgemäß sollen unter einer Amin-Komponente Monoamine, Bis-Amine oder Polyamine verstanden werden. Bevorzugte Monoamine sind 2-Aminoethan ol, 6-Amino-1-hexanol, 2-(4-Aminophenyl)-ethanol, 5-Amino-n-valeriansäure, 2- (2-Aminoethoxy)ethanol, 3-Amino-1,2-propandiol; bevorzugte Bis-Amine sind 1,4-Bis(3-aminopropoxy)butan, O,O'-Bis(2-aminopropyl)polyethylenglykol 500 ( = Jeffamin 500), O,O'-Bis(2-aminopropyl)polyethylenglykol 130 ( = Jeffamin 130); 4,7,10-Trioxa-1.13-tridecanamin, Ethylendiamin, N-Methylimidazol, Di isopropylethylamin; und bevorzugte Polyamine sind Tetraethylenpentamin, Spermin, Spermidin, 4,7,10-Trioxa-1.13-tridecandiamin, 4-Aminomethyl-1,8- octandiamin. Durch den Einbau von Aminen können bevorzugt positive Ladun gen in das Linkersystem implementiert werden, da diese im physiologischen Bereich protoniert vorliegen. Durch die Wahl des entsprechenden Amins läßt sich der Grad der Ladung der Oberfläche steuern. Postive Ladungen ihrerseits bewir ken eine leichtere Annäherung von negativ geladenen Biopolymeren (z. B. Nu kleinsäuren) und erleichtern dadurch Hybridisierungen auf den erfindungsgemäß behandelten Trägeroberflächen. Bei der Verwendung von Bis-Aminen oder Polyaminen kann die Kettenlänge, d. h. die Länge des Linker-Systems, durch die Länge des Amins und die Anzahl des wiederholten Durchlaufens der nachfolgend angegebenen Synthese-Prinzipien gesteuert werden. Durch die Wahl des Amins kann der inviduelle Charakter des Linker-Systems gesteuert werden, d. h. ob es eher hydrophob oder hydrophil ist. Durch die Wahl des Amins können neben Amingrupperierungen natürlich auch andere funktionelle Gruppen (z. B. Hydroxyl-, Phosphat-, Carboxyl-, Carbonyl-) auf der Oberfläche präsentiert werden. So ist es beispielsweise für die Einführung eines OH-Gruppen tragenden Linkers vor teilhaft die Umsetzung mit einem Aminalkohol durchzuführen. Bei Verwendung eines bifunktionellen Amins erfolgt eine lineare Verlängerung der Kette. Durch polyfunktionelle Amin-Reagentien werden in das Linkersystem Verzweigungen eingebaut. Dadurch werden sogenannte Dendrimer-Strukturen aufgebaut (s. Fig. 1 und 2). Unter einer Dendrimer-Struktur soll erfindungsgemäß verstanden wer den, daß von einem definierten Startpunkt ausgehende mehr als einmal ver zweigte Strukturen entstehen. Dies hat vor allem den Vorteil, daß bei Trägerma terialien mit ansonsten geringer Beladungskapazität (z. B. Glas) die Beladung gezielt erhöht werden kann und somit größere Mengen an Biopolymeren aufge bracht werden können. So können bei der Verwendung von polyfunktionellen Aminen (m = Anzahl der Amino-Funktionen) nach n Runden (1 Runde = Zyklus aus Aktivierung und Umsetzung mit Amin) x Positionen (Funktionen) für eine Anbindung von Biopolymeren genutzt werden:

x = (m-1)ⁿ (im Falle der Aktivierung mit 4-Nitrophenyl-Chlorofor miat oder Carbonyldiimidazol)
x = mⁿ (im Falle der Aktivierung mit Acryloylchlorid)

Rechenbeispiel: Tetraethylenpentamin (m = 5), 3 Runden (n = 3), Acryloyl chlorid als Aktivierungsmittel ---< 5³ = 125, d. h. 125-fache Beladungs kapazität des Trägers

Um auf der Trägeroberfläche zu einem mehr oder weniger vernetzten Linkersy stem zu kommen, werden die obigen Reaktionen gezielt wiederholt. Hierdurch wird der Abstand zwischen Trägermaterial und dem anzubindenden Biopolymer gesteuert und auch die physikalischen Eigenschaften des Linkers bestimmt. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird ein flexibles Linkersystem geschaf fen. Flexibel insofern, daß für jegliche Anwendung (z. B. Anbindung von DNA, RNA, Proteine, Antikörper) ideal vorbereitete Trägeroberflächen zur Verfügung gestellt werden. Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren dazu, für die DNA-/Bio-Chip-Technologie geeignete Oberflächen (Träger) bereit zustellen. Der Grad der positiven Ladung auf der Oberfläche läßt sich durch die Anzahl der protonierbaren Amin-Funktionen, vor allem durch den Einbau von Polyaminen, steuern. So wird das Ziel der Erhöhung der Beladungsdichte vor zugsweise durch den Einbau von Verzweigungsstellen (z. B. Polyaminen) reali siert; die Erhöhung der positiven Oberflächenladung kann beispielsweise durch den Einbau protonierbarer Amino-Funktionen geschehen; die Variation der Distanz zwischen Biomolekül und Oberfläche kann durch die Verwendung Amine verschiedener Kettenlänge gesteuert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Oberflächenmodifizierung zeichnet sich durch folgende Schritte aus. Die zu derivatisierenden Trägermaterialien werden in einem Reaktionsgefäß mit 5-100 ml (je nach Größe), bevorzugt 10-30 ml, ganz bevorzugt 20 ml, wasserfreiem Lösungsmittel (z. B. Dichlorethan, Tetra chlorkohlenstoff, THF, DMF, DMSO, HMPT ( = HMPA), Dichlorethan, Acetonitril) mit ca. 0,5 bis 5 mmol, bevorzugt 1-3 mmol, ganz bevorzugt 1 mmol, Aktivie rungsreagenz (z. B. Acryloylchlorid, 4-Nitrophenyichloroformiat, Carbonyldii midazol) versetzt. Die Umsetzung wird im Falle von Acryloylchlorid und 4-Nitro phenylchloroformiat durch Zugabe von ca. 0,5 bis 5 mmol, bevorzugt 1-3 mmol, ganz bevorzugt 1 mmol, Diisopropylethylamin (oder einer anderen nicht nukleophilen Base, wie Triethylamin, Pyridin, Collidin, Lutidin oder Triisopropyla min) gestartet. Nach 1 bis 4 Stunden, bevorzugt 2 Stunden, Schwenken auf einem Schüttler werden die Träger gründlich mit einem wasserfreien Lösungs mittel (z. B. Dichlorethan, Tetrachlorkohlenstoff, etc.) gewaschen und trocknen gelassen, vorzugsweise mit Stickstoff trockengeblasen. Zur Überprüfung der Reaktion wird eine Qualitätskontrolle durchgeführt. Beispielsweise wird das oben erwähnte aminierte PP-Kontrollstück dem nachfolgend beschriebenen Brom phenolblau-Test unterzogen. Ist keine Blaufärbung im Vergleich zu einer nicht umgesetzten Probe zu erkennen, ist die Aktivierung erfolgreich verlaufen. Tritt eine Blaufärbung auf, wird die Umsetzung wiederholt. Die nun aktivierten Träger materialien werden in ca. 5-100 ml (je nach Größe), bevorzugt 10-50 ml, ganz bevorzugt 20 ml eines amin- und wasserfreien Lösungsmittels (z. B. DMF, Aceto nitril, THF, DMSO, HMPT (HMPA) oder Dichlormethan) mit ca. 0,5-5 mmol, bevorzugt 1-3 mmol, bevorzugt 1 mmol, Amin-Komponente versetzt und ca. 5- 20 Stunden, bevorzugt über Nacht, geschwenkt. Man wäscht gründlich, z. B. nacheinander mit DMF, Methanol und Dichlorethan, und läßt die nun derivatisier ten Träger trocknen bzw. bläst vorzugsweise mit Stickstoff trocken. Im Falle von mit Acryloylchlorid aktivierten Trägern empfiehlt sich eine auf 1,5 bis 2,5 Tage, bevorzugt 2 Tage, verlängerte Reaktionszeit. Zur Überprüfung der Reaktion wird eine Qualitätskontrolle durchgeführt, beispielsweise wird das oben erwähnte PP- Kontrollstück dem nachfolgend beschriebenen Bromophenolblau-Test unter zogen. Ist die Blaufärbung im Vergleich zu einer aktivierten Probe des letzten Schritts zu erkennen, ist die Umsetzung erfolgreich verlaufen. Bei keiner oder sehr schwacher Blaufärbung wird die Umsetzung wiederholt. Die nun einmal derivatisierten Träger können bereits so verwendet werden oder noch ein- oder mehrmals dem beschriebenen Zyklus unterzogen werden.

Zur Qualitätsüberprüfung der Trägerderivatisierung eignet sich beispielsweise ein Verfahren basierend auf der Blaufärbung von Aminofunktionen durch Bromphen olblau, d. h. die Detektion erfolgt über das Verschwinden bzw. Vorhandensein der Blaufärbung bei Aktivierung bzw. Umsetzung mit Aminen. Dazu wird jedem Reaktionsgefäß zusätzlich zu den zu derivatisierenden Trägermaterialien ein Stück aminierte Polypropylen-Folie (PP-Kontrollstück) beigefügt, an der stellver tretend für alle in dem Reaktionsgefäß befindlichen Trägermatierialien der Erfolg des jeweiligen Reaktionsschritts überprüft wird. Hierzu wird nach jeder Reaktion ein Stück des Kontrollstreifens entnommen und 2 Minuten in einer 1% Brom phenolblau-Lösung in aminfreiem DMF geschwenkt und dann mit Ethanol gewa schen. Amino-Funktionen und andere basische Gruppen ergeben hierbei eine intensive adsorptive Blaufärbung. Nach der Durchführurig der Aktivierungs reaktionen (z. B. mit Acryloylchlorid, 4-Nitrophenylchloroformiat, Carbonyldii midazol) wird auf Verschwinden der Blaufärbung detektiert. Eine Quantifizierung der Oberflächenbeladung ist über UV-Spektroskopie möglich. Hierbei wird die ad sorptive Blaufärbung z. B. mit einer 10%-igen Piperidin-Lösung in DMF von Träger abgelöst und UV-spektroskopisch vermessen.

Die Linker an der Trägeroberfläche weisen lineare Strukturen oder Dendrimer- Strukturen auf. Die Strukturen haben folgenden Aufbau:

- bevorzugte Struktur nach Aktivierung mit Acryloylchlorid
X = O, NHR₁
Y, Z = können gleich oder verschieden sein und können ausgewählt sein aus
-CH₂)_n-
-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂
-(CH₂CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂CH₂- usw.
R₁-R₅ = können gleich oder verschieden sein analog R1 und R2 vorstehend
n = 1-50, bevorzugt 1-20, ganz bevorzugt 1-10
oder
- bevorzugte Struktur nach Aktivierung mit Chlorameisensäure-nitro phenylester bzw. Carbonyldiimidazol
X = O, NHR₁
Y, Z = können gleich oder verschieden sein und können ausgewählt sein aus
-(CH₂)_n
-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂
-(CH₂CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂CH₂- usw.
R₁-R₅ = können gleich oder verschieden sein analog R₁ und R₂ vorstehend
n = 1-50, bevorzugt 1-20, ganz bevorzugt 1-10

Bei der Fixierung von Biopolymeren an die mit dem Linkersystem derivatisierten Trägeroberfläche können prinzipiell 2 Fälle (a) und (b) unterschieden werden:

a) In situ-Synthese von Biopolymeren (am Beispiel der Oligonukleotidsyn these):
Die derivatisierten Träger-Oberflächen mit endständigen Amino- oder Hydroxyl- Funktionen bedürfen keiner weiteren Modifizierung zur Anbindung des 1. Oligo nucleotidbausteins nach der Phosphoramidit- oder auch Phosphortriester-Metho de. Es werden nach der Reaktion des 1. Nucleotid-Reagenzes mit der aminierten Oberfläche Bindungen vom Phosphoramidat-Typ erzeugt. Hydroxylierte Ober flächen führen zu Bindungen vom Phosphodiester-Typ.
Phosphoramidit-Methode
Phosohortriester-Methode
R₁-R₃ = analog R₁ und R₂ vorstehend

Werden Bindungen vom Phosphodiester-Typ angestrebt, genügt es beim letzten Schritt innerhalb der Linker-System-Synthese kein Bis-Amin, sondern einen Amino-Alkohol zur Reaktion zu bringen.

a) Anbindung von "vorgefertigten" Biopolymeren:
Die Anbindung des Biopolymeren sieht die Generierung einer kovalenten (dau erhaften) chemischen Verknüpfung des Biomoleküls mit der Trägeroberfläche vor: Hierzu muß eine chemische Bindung zwischen dem Biomolekül und der Oberfläche erzeugt werden. Um diese Bindung zu erzeugen, kommt beispiels weise folgendes Vorgehen in Frage:
- 1. (A) Zugabe eines Förderungsmittels
- 2. (B) Aktivierung einer der beiden Reaktanden (Biomolekül oder Oberfläche). Allerdings ist eine Aktivierung der Trägerober fläche gegenüber einer Aktivierung des Biomoleküls vorzuzie hen, da bei der Aktivierung des Biomoleküls selbst uner wünschte Kreuzreaktionen zwischen den aktivierten Biomole külen - aufgrund des meist polyfunktionellen Charakters des Biomoleküls - nicht auszuschliessen sind. Diese Aktivierung der Oberfläche erfolgt vorzugsweise mittels Crosslinker.

(A) Anbindung des Biopolymeren unter Zuhilfenahme eines Förderungsmittels

Die Möglichkeit ein Förderungsmittel (Katalysator) zur Erzeugung der kovalenten Bindung zwischen Oberfläche und Biomolekül zu benutzen, stellt im wesentli chen eine 3-Komponenten-Reaktion dar. Werden wie in der vorliegenden Erfin dung Möglichkeiten angestrebt, die es erlauben sollen, hochparallel eine grosse Anzahl von Biopolymeren an exakt vorbestimmten Positionen auf einem Träger zu fixieren, kann dies aufgrund von Kreuz-Kontamination nur erschwert mit einem 3-Komponenten-System an ebenen Oberflächen (Folien, Glas o. ä.) gelin gen. Daher stellt die Förderungsmittel-Methode einen Spezial-Fall zur kovalenten Anknüpfung von Biopolymeren auf Oberflächen vom Membran-Typ dar. Einzig hier kann das Förderungsmittel in den Poren der Membran lokal dem zu binden den Biomolekül zur Verfügung gestellt werden, ohne daß mit Kreuz-Kontami nation zu rechnen ist (vgl. Beispiel 4). Als Förderungsmittelmittel eignen sich bei spielsweise Reagentien vom Carbodiimid-Typ, wie Diisopropylcarbodiimid, EDC oder DCC (Dicyclohexylcarbodiimid). Desweiteren sollten die endständigen Gruppen auf dem Träger und am Biomolekül bevorzugt orthogonal zueinander sein, d. h. diese sollten sinnvoll eine chemische Bindung eingehen können. Hierbei ergeben sich vorzugsweise folgende Kombinationen der zu reagierenden Endgruppen:

Da die reaktiven Gruppen (Amin-, Hydroxyl-, Phosphat- oder Carboxyl-) mehr oder weniger vom Biomolekül vorgegeben sind, empfiehlt es sich daher für jeden Biomolekül-Typ einen entsprechenden orthogonalen Oberflächen-Typ zur Verfügung zu haben. Um die Träger-Oberflächen-Derivatisierung mit dem Linkersystem für alle oben aufgeführten Kombination von Endgruppen verfüg bar zu machen, wurden Methoden zur Um-Derivatisierung der Oberfläche von endständigen Amino-Funktionen (oder auch Hydroxyl) auf endständige Hy droxyl-, Carboxyl- und Phosphat-Gruppen entwickelt (vgl. Beispiele 5, 6, 7).

Um-Derivatisierung auf End-Hydroxyl

Um-Derivatisierung auf End-Carboxyl

Um-Derivatisierung auf End-Phosphat:

(B) Anbindung des Biopolymeren mittels Crosslinker

Unter einer kovalenten Oberflächen-Aktivierung ist eine solche zu verstehen, bei der Crosslinker quasi als End-Gruppe auf das erfindungsgemäß vorher aufgebaute Linker-System (Flexible Linker-System) aufgepropft wurden. Bei diesen handelt es sich vor allem um aktivierte Ester-, Aldehyd-, lmidoester- oder Isothiocyanat-Funktionen, die in der Lage sind, ohne weitere chemische Eingriffe, mit in wässrigen Systemen gelösten Biopolymeren eine kovalente Bindung einzugehen. Als Reagentien der Wahl sind hier v.a. Dissuccinimidyl carbonat, Dissuccinimidyl-oxalat, Glutaraldehyd, Dimethylsuberimidat-Dihydro chlorid oder Phenylendiisothiocyanat zu nennen. Die Umsetzung erfolgt bevor zugt unter basischen Bedingungen, d. h. unter Zusatz von Diisopropylethylamin oder NaCO₃.

Prinzip

Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:

Fig. 1: Generierung von Dendrimerstrukturen nach Aktivierung mit Acrylo ylchlorid

Fig. 2: Generierung von Dendrimerstrukturen nach Aktivierung mit 4-Nitro phenylchloroformiat

Die Erfindung wird weiter anhand der Beispiele beschrieben.

Beispiel 1: Derivatisierung eines Glasträgers

Ausgegangen wird von aminierten Glasträgern (40 × 48 mm), der entweder kommerziell erhältlich ist oder nach den üblichen Methoden der Silanisierung darstellbar ist. Zur Aktivierung der Aminofunktionen werden die aminierten Glas träger in 20 ml wasserfreies Dichlorethan mit 200 mg 4-Nitrophenyl-chloro formiat (1 mmol) und 171 µl Diisopropylethylamin (1 mmol) gelegt und für 2 Stunden auf dem Schüttler geschwenkt. Der BPB-Kontrolltest zeigt keine Blau färbung. Die Glasträger werden über Nacht in 20 ml amin-freiem DMF mit 223 µl Tetraethylenpentamin (1 mmol) umgesetzt. Der BPB-Kontrolltest zeigt eine Blaufärbung. Zum Starten eines neuen Zyklus' werden die Glasträger in 20 ml wasserfreies Dichlorethan mit 200 mg 4-Nitrophenyl-chloroformiat (1 mmol) und 171 µl Diisopropylethylamin (1 mmol) gelegt und für 2 Stunden auf dem Schütt ler geschwenkt. Der BPB-Kontrolltest zeigt keine Blaufärbung. Die Glasträger werden über Nacht in 20 ml amin-freiem DMF mit 140 µl 1,4-Bis(3-aminopropyl oxy)-butan (1 mmol) umgesetzt. Der BPB-Test zeigt eine Blaufärbung.

Die so derivatisierten Glasträger verfügen an ihrer Oberfläche jetzt über Linker an die Biopolymere (z. B. Nukleinsäuren) gekoppelt werden können.

Beispiel 2: Derivatisierung eines Glasträgers

Ausgegangen wird von einem aminierten Glasträger (40 × 48 mm), der entweder kommerziell erhältlich oder nach den üblichen Methoden über Silanisierung darstellbar ist. Zur Aktivierung der Aminofunktionen werden die aminierten Glas träger in 20 ml wasserfreies Dichlorethan mit 81 µl Acryloylchlorid (1 mmol) und 171 µl Diisopropylethylamin (1 mmol) gefegt und für 2 Stunden auf dem Schütt ler geschwenkt. Der BPB-Kontrolltest zeigt keine Blaufärbung. Die Glasträger werden über 2 Nächte in 20 ml amin-freiem DMF mit 223 µl Tetraethylenpenta min (1 mmol) umgesetzt. Der BPB-Kontrolltest zeigt eine Blaufärbung. Zum Starten eines neuen Zyklus' werden die Glasträger in 20 ml wasserfreies Di chlorethan mit 81 µl Acryloylchlorid (1 mmol) und 171 µl Diisopropylethylamin (1 mmol) gelegt und für 2 Stunden auf dem Schüttler geschwenkt. Der BPB-Kon trolltest zeigt keine Blaufärbung. Die Glasträger werden über 2 Nächte in 20 ml amin = freiem DMF mit 140 µl 1,4-Bis(3-aminopropoxy)-butan (1 mmol) umge setzt. Der BPB-Test zeigt eine Blaufärbung.

Beispiel 3: Derivatisierung von Polypropylenmembranen

Ausgegangen wird von einer käuflichen hydrophilisierten Polypropylenmembran (8 × 12 cm). Zur Aktivierung wird die Membran mit 324 µl Acryloylchlorid (4 mmol) und 684 µl Diisopropylethylamin (4 mmol) in 30 ml wasserfreiem Di chlorethan auf dem Rüttler zur Reaktion gebracht. Nach 2 Std. wird von der Reaktionslösung abdekantiert und mehrmals sorgfältig mit Dichlorethan gewa schen und getrocknet. Der Bromphenolblau-Test (BPB-Test) zeigt keine Blaufär bung. Nachfolgend wird die aktivierte Membran 2 Tage mit 892 µl Tetraethylen pentamin (4 mmol) in 30 ml aminfreiem DMF auf dem Rüttler geschwenkt. Dann wird die Reaktionslösung abdekantiert und die Membran mehrmals sorgfältig mit DMF und dann mit Dichlorethan gewaschen und getrocknet. Der Bromphen olblau-Test zeigt Blaufärbung. Zur weiteren Aktivierung wird die nun aminierte Membran erneut mit 324 µl Acryloylchlorid (4 mmol) und 684 µl Diisopropy lethylamin (4 mmol) in 30 ml wasserfreiem Dichlorethan auf dem Rüttler zur Reaktion gebracht. Nach 2 Std. wird von der Reaktionslösung dekantiert und mehrmals sorgfältig mit Dichlorethan gewaschen und getrocknet. Der Bromphen olblau-Test (BPB-Test) zeigt keine Blaufärbung. Nachfolgend wird die aktivierte Membran 2 Tage mit 560 µl 1,6-Bis(3-aminopropyloxy)-butan (4 mmol) in 30 mol aminfreiem DMF auf dem Rüttler geschwenkt. Dann wird die Reaktions lösung abdekantiert und die Membran mehrmals sorgfältig mit DMF und dann mit Dichlorethan gewaschen und getrocknet. Der Bromphenolblau-Test (BPB- Test) zeigt Blaufärbung.

Beispiel 4: Anbindung von Nukleinsäuren auf Polypropylenmembranen

Eine gemäß Beispiel 3 derivatisierte Polypropylenmembran (8 × 12 cm) wird auf einem Whatman-Filterpapier 5 Min. mit einer Lösung aus 54 mg N-(3-Dimethyl aminopropyl)-N'-ethyl-carbodümidhydrochloridund 24 ml N-Methylimidazol in 10 ml Wasser inkubiert. Die Reaktionslösung wird abdekantiert. Die so aktivierte, noch feuchte Polypropylen-Membran kann nun zum kovalenten Aufbringen von Biopolymeren verwendet werden. Nach dem Aufbringen der Biopolymere (z. B. durch Spotting-Robotter oder Nano-Plotter) werden die Proben durch 2 hr Inkubieren bei 65°C auf der Membran fixiert; anschliessend wird die Membran sorgfältig mit Wasser gewaschen.

Beispiel 5: Synthese endständiger Hydroxyl-Gruppen a) Aktivierung mit Chlorameisensäure-4-nitrophenylester

Eine amino-funktionalisierte Polypropylen-Membran (Omnitray-Grösse) gemäß Beispiel 3 wird in 30 ml wasserfreiem Dichlorethan mit 400 mg Chlorameisen säure-4-nitrophenylester (2 mmol) und 342 µl Diisopropylethylamin (2 mmol) für 2 hr auf dem Schüttler geschwenkt. Man wäscht 2 × je 5 min mit 50 ml Dichlor methan und trocknet im Stickstoffstrom. Die so aktivierte PP-Membran wird nun mit 200 ml 2-(2-Aminoethoxy)ethanol (2 mmol) in 30 ml aminfreiem DMF 30 min auf dem Schüttler geschwenkt, worauf die Reaktionslösung abdekantiert wird. Nach kurzem Waschem mit DMF wird die PP-Membran erneut mit 200 µl 2-(2-Aminoethoxy)ethanol (2 mmol) in 30 ml aminfreiem DMF versetzt und über Nacht auf dem Schüttler geschwenkt. Von der Reaktionslösung wird abdekan tiert, und die PP-Membran 2x je 5 min mit 50 ml DMF und dann 2 × mit 50 ml Aceton gewaschen und getrocknet.

b) Aktivierung mit Acryloylchlorid

Eine amino-funktionalisierte Polypropylen-Membran (Omnitray-Grösse) gemäß Beispiel 3 wird in 30 ml wasserfreiem Dichlorethan mit 162 µl Acryloylchlorid (2 mmol) und 342 µl Diisopropylethylamin (2 mmol) für 2 hr auf dem Schüttler geschwenkt. Man wäscht 2 × je 5 min mit 50 ml Dichlormethan und trocknet im Stickstoffstrom. Die so aktivierte PP-Membran wird nun mit 200 µl 2-(2-Amino ethoxy)ethanol (2 mmol) in 30 ml aminfreiem DMF 30 min auf dem Schüttler geschwenkt, worauf die Reaktionslösung abdekantiert wird. Nach kurzem Waschem mit DMF wird die PP-Membran erneut mit 200 µl 2-(2-Aminoet hoxy)ethanol (2 mmol) in 30 ml aminfreiem DMF versetzt und über Nacht auf dem Schüttler geschwenkt. Von der Reaktionslösung wird abdekantiert, und die PP-Membran 2x je 5 min mit 50 ml DMF und dann 2 × mit 50 ml Aceton gewa schen und getrocknet.

Beispiel 6: Synthese endständiger Carboxyl-Gruppen

Eine amino-funktionalisierte Polypropylen-Membran (Omnitray-Grösse) gemäß Beispiel 3 wird in 30 ml trockenem Dichlorethan mit 400 mg Bernsteinsäurean hydrid (4 mmol), 1 ml Pyridin (24 mmol) und 488 mg DMAP (4 mmol) über Nacht auf dem Schüttler zur Reaktion gebracht. Nachfolgend wird die Reaktions lösung abdekantiert und die PP-Membran nacheinander mit 30 ml Dichlormethan, 30 ml Aceton, 30 ml 1% HCl, 2 × 30 ml Wasser und 2 × mit 30 ml Aceton jeweils 5 min. gewaschen und getrocknet.

Beispiel 7: Synthese endständiger Phosphat-Gruppen

Unter Eisbadkühlung werden 0.42 ml POCl₃ (4 mmol) in 40 ml trockenem Pyridin gelöst. Nachfolgend werden 828 mg 1,2,4-Triazol (12 mmol) zugefügt. Nach 10 min wird die hydroxyl-funtionalisierte Polypropylen-Membran gemäß Beispiel 4 zugefügt und weitere 10 min unter Eisbadkühlung auf dem Rüttler ge schwenkt. Anschliessend wird das Eisbad entfernt und noch 45 min ge schwenkt. Die Reaktionslösung wird abdekantiert und vorsichtig mit 50 ml eines Gemisch aus Triethylamin / Dioxan / Wasser hydrolisiert. Man wäscht sorgfältig nacheinander 2× mit 50 ml Wasser, kurz mit 50 ml 1% HCl, 2 × mit 50 ml Wasser und 2× 5 min mit 50 ml Aceton und trocknet im Stickstoff-Strom.

Beispiel 8: Oberflächen-Aktivierung mit Disuccinimidylcarbonat

7 amino-funktionalisierte Glas-Objektträger werden in 30 ml wasserfreiem Acetonitril mit 256 mg Disuccinimidylcarbonat (2 mmol) und 513 µl Diisopro pylethylamin (3 mmol) für 4 hr auf dem Schüttler geschwenkt. Man wäscht mit 50 ml Acetonitril, dann mit 50 ml Dichlorethan und trocknet im Stickstoffstrom.

Claims

1. Verfahren zum Derivatisieren von Trägern, wobei eine funktionelle Gruppe auf einer Trägeroberfläche durch Umsetzung mit einem Akti vierungsreagenz aktiviert wird und nachfolgend mit einer Amin-Kom ponente umgesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Träger ausgewählt sind aus Glas, Folien bzw. Membranen aus Polypropylen, Nylon, Cellulose, Cellulosederivate (z. B. Celluloseacetat, Cellulose-Mischester), Poly ethersulfonen, Polyamiden, Polyvinylchlorid, Polyvinylidenfluorid, Polyester, Polyethylen oder Teflon.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die funktionelle Gruppe eine Amin-, Hydroxyl-, Phosphat-, Carboxyl-, Carbonyl-, Thiol- oder Amid- Gruppe ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Aktivierungs reagenz Acryloylchlorid, 4-Nitrophenylchloroformiat, Carbonyldiimida zol, Phenylchloroformiat, Phosgen, Diphosgen, Triphosgen, EDC (N-(3- dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid-hydrochlorid), N,N'-Dii sopropyl-carbodiimid, Dicylohexyl-carbodiimid, Disuccinimidyl-carbo nat, Disuccinimidyl-oxalat, Dimethylsuberimidat-Dihydrochlorid oder Phenylendiisothiocyanat ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Amin-Komponen te ausgewählt ist aus Monoaminen, Bis-Aminen oder Polyaminen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Mono-Amin 2-Aminoethanol, 6-Amino-1-hexanol, 2-(4-Aminophenyl)-ethanol, 5-Amino-n-valerian säure, 2-(2-Aminoethoxy)ethanol oder 3-Amino-1,2-propandiol ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Bis-Amin 1,4-Bis(3-aminopro poxy)butan, O,O'-Bis(2-aminopropyl)polyethylenglykol 500 ( = Jeffa min 500), O,O'-Bis(2-aminopropyllpolyethylenglykol 130 ( = Jeffamin 130), 4,7,10-Trioxa-1.13-tridecanamin, oder Ethylendiamin ist.

8. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Polyamin Tetraethylenpenta min. Spermin, Spermidin, 4,7,10-Trioxa-1.13-tridecandiamin oder 4- Aminomethyl-1,8-octandiamin ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Schritte der Umsetzung mit einem Aktivierungsreagenz und einer Amin-Komponen te mehrmals durchgeführt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei es zum Aufbau von Dendrimer- Strukturen an der Trägeroberfläche kommt.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es zum gesteuerten Aufbau von positiver Ladung an der Trägeroberfläche kommt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, wobei zusätzlich die ge mäß einem Ansprüche 1-11 derivatisierte Trägeroberfläche vor dem Anbinden von Biopolymeren aktiviert wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei als Aktivierungsmittel Disuccini midylcarbonat, Disuccinimidyloxalat, Glutaraldehyd, Dimethyl-Dihydro chlorid oder Phenylendiisothiocyanat verwendet wird.

14. Träger geeignet zur Anbindung von Biopolymeren, wobei der Träger an seiner Oberfläche Linker mit folgender Struktur aufweist:
X = O, NHR₁
Y, Z = können gleich oder verschieden sein und ausgewählt sein aus
-(CH₂)_n-
-(CH₂CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂(CH₂CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂CH₂- usw.
R₁-R₅ = können gleich oder verschieden sein und ausgewählt sein aus gerader oder verzweigter Alkylrest mit 1-30 Kohlenstoffatomen, gerader oder verzweigter Alken ylrest mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen, mono- oder polyzyklischer Alkylrest mit 3 bis 30 Kohlenstoffato men oder mono- oder polyzyklischer Alkenylrest mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen oder mono- oder polyzykli schen Rest mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen, wobei die Reste ggf. durch einen oder mehrere Substituenten (z. B. OH, Carboxyl, Carbonyl, Phosphat-) substituiert sein können)
n = 1-50 oder
X = O, NHR₁
Y, Z = können gleich oder verschieden sein und ausgewählt sein aus
-(CH₂)_n-
-(CH₂CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂(CH₂CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂CH₂- usw.
R₁-R₅ = können gleich oder verschieden sein und können aus gewählt sein aus gerader oder verzweigter Alkylrest mit 1-30 Kohlenstoffatomen, gerader oder verzweigter Alkenylrest mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen, mono- oder polyzyklischer Alkylrest mit 3 bis 30 Kohlenstoff atomen oder mono- oder polyzyklischer Alkenylrest mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen oder mono- oder polyzyklischen Rest mit 6 bis 30 Kohlenstoffato men, wobei die Reste ggf. durch einen oder mehrere Substituenten (z. B. OH, Carboxyl, Carbonyl, Phosphat, substituiert sein können)
n = 1-50

15. Träger geeignet zur Anbindung von Biopolymeren, wobei dieser an seiner Oberfläche Linker in Form von Dendrimer-Strukturen aufweist.

16. Verwendung eines nach einem der Ansprüche 1-11 hergestellten Trägers oder eines Trägers nach Anspruch 14 oder 15 zur Anbindung von Biopolymeren.

17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Biopolymere aus DNA, RNA, Nukleotidanaloga; Peptiden, Proteinen oder Antikörpern ausge wählt sind.