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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Derivatisierung
von Trägeroberflächen sowie
dadurch derivatisierte Trägeroberflächen.
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Die
Anbindung von Biopolymeren, insbesondere Nukleinsäuren, an
feste Trägeroberflächen wird
bis heute im allgemeinen durch folgende Alternativen erreicht:
- 1) Aufbringen von Biopolymeren (z.B. Nukleinsäuren) auf
Oberflächen:
Hier finden vor allem poly-L-Lysin gecoatete Glasträger und
Nylon-Membranen Verwendung. Dabei werden die Biopolymere durch Ladung an
den Träger
gebunden. Nachteilig bei der Verwendung poly-L-Lysin gecoateter
Glasträger
ist, daß keine kovalente
Anknüpfung
zwischen der beschichteten Oberfläche und dem Biopolymer stattfindet.
Der Träger kann
nur einmalig verwendet werden. Weiter gibt es so gut wie keine Möglichkeiten
zur Optimierung des Abstandes zwischen Biopolymer und Träger. Nachteilig
bei der Verwendung von Nylonmembranen ist, daß die Biopolymere größtenteils
auch nur durch Ladung gebunden werden. Der Träger kann zwar mehrmalig verwendet
werden, aber es ist auch keine Optimierung des Abstandes zwischen
Biopolymer und Träger möglich.
- 2) In-situ Aufbau von Biopolymere (z.B. Nukleinsäuren) auf
Oberflächen:
Hier finden gebräuchliche
Linkersysteme, die von der Biopolymersynthese an porösen CPG-Materialien
herrühren,
Verwendung. Bei den verwendeten Linker-Molekülen handelt es sich meist um
Polyethylenglykol, insbesondere Tetra- oder Hexaethylenglykol. Die
Linkermoleküle
werden üblicherweise
durch kostenintensive Reagenzien analog der Phosphoramidit-Chemie aufgebracht.
Es kann leider keine Massenherstellung stattfinden und das Aufbringen
von Ladungen ist nicht möglich.
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Weiter
haben diese Verfahren alle den Nachteil, daß es ihnen an Flexibilität mangelt,
und die Biopolymere können
auf der Oberfläche
nur in einer sehr begrenzten Anzahl aufgebracht werden.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, ein Verfahren
bereitzstellen, das eine optimale Anbindung von einer großen Anzahl
Biopolymeren an Trägeroberflächen erlaubt.
Die Aufgabe besteht weiter darin, eine Trägeroberfläche bereitzustellen, deren
Bindungskapazität
auf ein Vielfaches durch Durchführen
einer Oberflächenmodifikation
gesteigert worden ist.
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Diese
Aufgaben werden durch die Gegenstände der Patentansprüche gelöst.
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Insbesondere
wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, bei dem eine funktionelle
Gruppe auf einer Trägeroberfläche durch
ein Aktivierungsreagenz aktiviert und nachfolgend mit einer Amin-Komponente umgesetzt
wird.
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Dem
erfindungsgemäßen Verfahren
liegen bevorzugt folgende Synthese-Prinzipien zugrunde:
wobei
R
1 und R
2 gleich
oder verschieden sein können.
Die Bedeutungen von R
1 und R
2 unterliegen
keiner Beschränkung
und können
H oder jeglicher organischer Rest sein (z.B. ein gerader oder verzweigter
Alkylrest mit 1-30 Kohlenstoffatomen, ein gerader oder verzweigter
Alkenylrest mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen, ein mono- oder polyzyklischer
Alkylrest mit 3 bis 30 Kohlenstoffatomen oder ein mono- oder polyzyklischer
Alkenylrest mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen oder einen mono- oder
polyzyklischen Rest mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen, wobei die Reste
ggf. durch einen oder mehrere Substituenten (z.B. OH, Carboxyl,
Carbonyl, Phosphat-) substituiert sein können). Die Base kann jegliche
basische Verbindung sein, z.B. Diisopropylethylamin.
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Es
kann jeder beliebige gerade oder verzweigte C1-30 Alkylrest
verwendet werden. Beispiele hierfür sind Methyl-, Ethyl-, Propyl-,
Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, tert.-Butyl-, n-Butyl-, n-Hexyl-,
2-Methylpentyl-, 2,3-Dimethylbutyl-, n-Heptyl-, 2-Methylhexyl-,
2,2-Dimethylpentyl-, 3,3-Dimethylpentyl-, 3-Ethylpentyl-, n-Octyl-, 2,2-Dimethylhexyl-,
3,3-Dimethylhexyl-, 3-Methyl-3-ethylpentylgruppen. Bevorzugt sind
kurze Alkylketten, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Isopropyl-.
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Es
kann jeder beliebige gerade oder verzweigte C2-30-Alkenylrest
verwendet werden. Beispiele hierfür sind Vinyl-, Propenyl-, Isopropenyl-,
Allyl-, 2-Methylal-lyl-,
Butenyl- oder Isobutenyl-, Hexenyl- oder Isohexenyl-, heptenyl-
oder Isoheptenyl-, Octenyl- oder Isooctenylgruppen. Bevorzugt sind
Vinyl-, Propenyl- und Isopropenyl-.
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Der
Cycloalkylrest mit 3 bis 30 Kohlenstoffatomen kann jeder beliebige
Cycloalkylrest sein. Beispiele hierfür sind eine Cyclopropyl-, Cyclobutyl-,
Cyclopentyl- oder
Cyclohexyl-, Cycloheptyl-, Cxclooctyl-, Cyclononyl- oder Cyclodecylgruppen.
Bevorzugt sind Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl- und Cyclohexyl-.
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Der
Cycloalkenylrest mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen kann jeder beliebige
Cycloalkenylrest sein. Beispiele hierfür sind eine Cyclobutenyt-,
Cyclopentenyl- oder
Cyclohexenyl-, Cycloheptenyl-, Cxclooctenyl-, Cyclononenyl- oder
Cyclodecenylgruppen. Bevorzugt sind Cyclobutenyl-, Cyclopentenyl-
oder Cyclohexenyl.
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Beispiele
für polyzyklische
Alkyl- bzw. Alkenylreste umfassen Norbornan, Adamantan oder Benzvalen.
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R1 und R2 können ferner
beliebige mono- oder polycyclische C6-30- Arylreste sein. Beispiele
hierfür sind
ein carbocyclischer, monocyclischer Rest, beispielsweise die Phenylgruppe,
ein heterocyclischer, monocyclischer Rest, beispielsweise die Gruppen
Thienyl, Furyl, Pyranyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Pyridyl,
Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Furazannyl,
Pyrrolinyl, Imidazolinyl, Pyrazolinyl, Thiazolinyl, Triazolyl, Tetrazolyl,
sowie die Positionsisomeren des oder der Heteroatome, die diese
Gruppen umfassen können.
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Durch
das erfindungsgemäße Verfahren
entstehen an der Trägeroberfläche mehr
oder weniger vernetzte Linkersysteme, die die Anbindung einer ggf.
großen
Anzahl von Biopolymeren an die Trägeroberfläche erlauben. Bevorzugte Biopolymere
sind DNA, RNA, Nucleinsäureanaloga,
Peptide, Proteine, Antikörper
etc.
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Erfindungsgemäß soll unter
einer funktionellen Gruppe eine auf einer Trägeroberfläche befindliche chemische Gruppierung,
wie z.B. eine Amino-Gruppe, Hydroxyl-Gruppe, Carboxyl-Gruppe, Carbonyl-Gruppe, Thiol-,
Amid- oder Phosphat-Gruppe
verstanden werden.
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Erfindungsgemäß ist jegliche(r)
auf diesem Gebiet übliche
Träger
bzw. Matrix einsetzbar. Dies sind insbesondere Glas, Folien bzw.
Membranen aus Polypropylen, Nylon, Cellulose, Cellulosederivate
(z.B. Celluloseacetat, Cellulose-Mischester), Polyethersulfonen,
Polyamiden, Polyvinylchlorid, Polyvinylidenfluorid, Polyester, Teflon
oder Polyethylen.
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Erfindungsgemäß soll unter
einem Aktivierungsreagenz ein Reagenz verstanden werden, das auf
der Trägeroberfläche befindliche
funktionelle Gruppen in einen ankopplungsbereiten Zustand versetzt.
Bevorzugte Aktivierungsreagenzien sind 4-Nitrophenyl-Chloroformiat
(= Chlorameisensäure-4-nitrophenylester),
Carbonyldiimidazol, Acryloylchlorid (Acrylsäurechlorid), Phenylchloroformiat,
Phosgen, Diphosgen, Triphosgen, EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimidhydrochlorid),
N,N'-Diisopropyl-carbodiimid,
Dicylohexyl-carbodiimid, Disuccinimidyl-carbonat, Disuccinimidyl-oxalat,
Dimethylsuberimidatdihydrochlorid oder Phenylendiisothiocyanat,
wobei die drei erstgenannten am bevorzugtesten sind.
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Erfindungsgemäß sollen
unter einer Amin-Komponente Monoamine, Bis-Amine oder Polyamine
verstanden werden. Bevorzugte Monoamine sind 2-Aminoethanol, 6-Amino-1-hexanol,
2-(4-Aminophenyl)-ethanol, 5-Amino-n-valeriansäure, 2-(2-Aminoethoxylethanol, 3-Amino-1,2-propandiol;
bevorzugte Bis-Amine sind 1,4-Bis(3-aminopropoxy)butan, O,O'-Bis(2-aminopropyl)polyethylenglykol
500 (= Jeffamin 500), O,O'-Bis(2-aminopropyl)polyethylenglykol
130 (= Jeffamin 130), 4,7,10-Trioxa-1.13-tridecanamin, Ethylendiamin,
N-Methylimidazol, Diisopropylethylamin; und bevorzugte Polyamine
sind Tetraethylenpentamin, Spermin, Spermidin, 4,7,10-Trioxa-1.13-tridecandiamin,
4-Aminomethyl-1,8-octandiamin.
Durch den Einbau von Aminen können
bevorzugt positive Ladungen in das Linkersystem implementiert werden,
da diese im physiologischen Bereich protoniert vorliegen. Durch
die Wahl des entsprechenden Amins läßt sich der Grad der Ladung der
Oberfläche
steuern. Postive Ladungen ihrerseits bewirken eine leichtere Annäherung von
negativ geladenen Biopolymeren (z.B. Nukleinsäuren) und erleichtern dadurch
Hybridisierungen auf den erfindungsgemäß behandelten Trägeroberflächen. Bei
der Verwendung von Bis-Aminen oder Polyaminen kann die Kettenlänge, d.h.
die Länge
des Linker-Systems, durch die Länge
des Amins und die Anzahl des wiederholten Durchlaufens der nachfolgend
angegebenen Synthese-Prinzipien gesteuert werden. Durch die Wahl
des Amins kann der inviduelle Charakter des Linker-Systems gesteuert
werden, d.h. ob es eher hydrophob oder hydrophil ist. Durch die
Wahl des Amins können
neben Amingrupperierungen natürlich
auch andere funktionelle Gruppen (z.B. Hydroxyl-Phosphat-, Carboxyl-, Carbonyl-) auf
der Oberfläche
präsentiert
werden. So ist es beispielsweise für die Einführung eines OH-Gruppen tragenden
Linkers vor teilhaft die Umsetzung mit einem Aminalkohol durchzuführen. Bei
Verwendung eines bifunktionellen Amins erfolgt eine lineare Verlängerung
der Kette. Durch polyfunktionelle Amin-Reagentien werden in das
Linkersystem Verzweigungen eingebaut. Dadurch werden sogenannte
Dendrimer-Strukturen aufgebaut (s.
1 und
2).
Unter einer Dendrimer-Struktur soll erfindungsgemäß verstanden
werden, daß von
einem definierten Startpunkt ausgehende mehr als einmal verzweigte Strukturen
entstehen. Dies hat vor allem den Vorteil, daß bei Trägermaterialien mit ansonsten
geringer Beladungskapazität
(z.B. Glas) die Beladung gezielt erhöht werden kann und somit größere Mengen
an Biopolymeren aufgebracht werden können. So können bei der Verwendung von
polyfunktionellen Aminen (m = Anzahl der Amino-Funktionen) nach
n Runden (1 Runde = Zyklus aus Aktivierung und Umsetzung mit Amin) × Positionen
(Funktionen) für
eine Anbindung von Biopolymeren genutzt werden:
x =
(m – 1)n | (im
Falle der Aktivierung mit 4-Nitrophenyl-Chloroformiat oder Carbonyldiimidazol) |
x =
mn | (im
Falle der Aktivierung mit Acryloylchlorid) |
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Rechenbeispiel:
Tetraethylenpentamin (m = 5), 3 Runden (n = 3), Acryloylchlorid
als Aktivierungsmittel ----> 53 = 125, d.h. 125-fache Beladungskapazität des Trägers
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Um
auf der Trägeroberfläche zu einem
mehr oder weniger vernetzten Linkersystem zu kommen, werden die
obigen Reaktionen gezielt wiederholt. Hierdurch wird der Abstand
zwischen Trägermaterial
und dem anzubindenden Biopolymer gesteuert und auch die physikalischen
Eigenschaften des Linkers bestimmt. Durch das erfindungsgemäße Verfahren
wird ein flexibles Linkersystem geschaffen. Flexibel insofern, daß für jegliche Anwendung
(z.B. Anbindung von DNA, RNA, Proteine, Antikörper) ideal vorbereitete Trägeroberflächen zur Verfügung gestellt
werden. Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren
dazu, für
die DNA-/Bio-Chip-Technologie geeignete Oberflächen (Träger) bereit zustellen. Der Grad
der positiven Ladung auf der Oberfläche läßt sich durch die Anzahl der
protonierbaren Amin-Funktionen, vor allem durch den Einbau von Polyaminen,
steuern. So wird das Ziel der Erhöhung der Beladungsdichte vorzugsweise
durch den Einbau von Verzweigungsstellen (z.B. Polyaminen) realisiert;
die Erhöhung
der positiven Oberflächenladung
kann beispielsweise durch den Einbau protonierbarer Amino-Funktionen
geschehen; die Variation der Distanz zwischen Biomolekül und Oberfläche kann
durch die Verwendung Amine verschiedener Kettenlänge gesteuert werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Oberflächenmodifizierung
zeichnet sich durch folgende Schritte aus. Die zu derivatisierenden
Trägermaterialien
werden in einem Reaktionsgefäß mit 5-100
ml (je nach Größe), bevorzugt
10-30 ml, ganz bevorzugt 20 ml, wasserfreiem Lösungsmittel (z.B. Dichlorethan,
Tetrachlorkohlenstoff, THF, DMF, DMSO, HMPT (= HMPA), Dichlorethan,
Acetonitril) mit ca. 0,5 bis 5 mmol, bevorzugt 1-3 mmol, ganz bevorzugt
1 mmol, Aktivierungsreagenz (z.B. Acryloylchlorid, 4-Nitrophenylchloroformiat,
Carbonyldiimidazol) versetzt. Die Umsetzung wird im Falle von Acryloylchlorid
und 4-Nitrophenyl-chloroformiat durch Zugabe von ca. 0,5 bis 5 mmol,
bevorzugt 1-3 mmol, ganz bevorzugt 1 mmol, Diisopropylethylamin
(oder einer anderen nicht nukleophilen Base, wie Triethylamin, Pyridin,
Collidin, Lutidin oder Triisopropylamin) gestartet. Nach 1 bis 4
Stunden, bevorzugt 2 Stunden, Schwenken auf einem Schüttler werden
die Träger
gründlich
mit einem wasserfreien Lösungsmittel
(z.B. Dichlorethan, Tetrachlorkohlenstoff, etc.) gewaschen und trocknen
gelassen, vorzugsweise mit Stickstoff trockengeblasen. Zur Überprüfung der
Reaktion wird eine Qualitätskontrolle
durchgeführt.
Beispielsweise wird das oben erwähnte
aminierte PP-Kontrollstück
dem nachfolgend beschriebenen Bromphenolblau-Test unterzogen. Ist
keine Blaufärbung
im Vergleich zu einer nicht umgesetzten Probe zu erkennen, ist die
Aktivierung erfolgreich verlaufen. Tritt eine Blaufärbung auf,
wird die Umsetzung wiederholt. Die nun aktivierten Trägermaterialien
werden in ca. 5-100 ml (je nach Größe), bevorzugt 10-50 ml, ganz
bevorzugt 20 ml eines amin- und wasserfreien Lösungsmittels (z.B. DMF, Acetonitril,
THF, DMSO, HMPT (HMPA) oder Dichlormethan) mit ca. 0,5-5 mmol, bevorzugt
1-3 mmol, bevorzugt 1 mmol, Amin-Komponente versetzt und ca. 5-20 Stunden, bevorzugt über Nacht,
geschwenkt. Man wäscht
gründlich,
z.B. nacheinander mit DMF, Methanol und Dichlorethan, und läßt die nun
derivatisierten Träger
trocknen bzw. bläst
vorzugsweise mit Stickstoff trocken. Im Falle von mit Acryloylchlorid
aktivierten Trägern
empfiehlt sich eine auf 1,5 bis 2,5 Tage, bevorzugt 2 Tage, verlängerte Reaktionszeit.
Zur Überprüfung der
Reaktion wird eine Qualitätskontrolle durchgeführt, beispielsweise
wird das oben erwähnte
PP-Kontrollstück dem nachfolgend
beschriebenen Bromophenolblau-Test unterzogen. Ist die Blaufärbung im
Vergleich zu einer aktivierten Probe des letzten Schritts zu erkennen,
ist die Umsetzung erfolgreich verlaufen. Bei keiner oder sehr schwacher
Blaufärbung
wird die Umsetzung wiederholt. Die nun einmal derivatisierten Träger können bereits
so verwendet werden oder noch ein- oder mehrmals dem beschriebenen
Zyklus unterzogen werden.
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Zur
Qualitätsüberprüfung der
Trägerderivatisierung
eignet sich beispielsweise ein Verfahren basierend auf der Blaufärbung von
Aminofunktionen durch Bromphenolblau, d.h. die Detektion erfolgt über das
Verschwinden bzw. Vorhandensein der Blaufärbung bei Aktivierung bzw.
Umsetzung mit Aminen. Dazu wird jedem Reaktionsgefäß zusätzlich zu
den zu derivatisierenden Trägermaterialien
ein Stück
aminierte Polypropylen-Folie (PP-Kontrollstück) beigefügt, an der stellvertretend
für alle
in dem Reaktionsgefäß befindlichen
Trägermatierialien
der Erfolg des jeweiligen Reaktionsschritts überprüft wird. Hierzu wird nach jeder
Reaktion ein Stück
des Kontrollstreifens entnommen und 2 Minuten in einer 1 % Bromphenolblau-Lösung in
aminfreiem DMF geschwenkt und dann mit Ethanol gewaschen. Amino-Funktionen
und andere basische Gruppen ergeben hierbei eine intensive adsorptive
Blaufärbung.
Nach der Durchführung
der Aktivierungsreaktionen (z.B. mit Acryloylchlorid, 4-Nitrophenylchloroformiat,
Carbonyldiimidazol) wird auf Verschwinden der Blaufärbung detektiert.
Eine Quantifizierung der Oberflächenbeladung
ist über
UV-Spektroskopie möglich.
Hierbei wird die adsorptive Blaufärbung z.B. mit einer 10%-igen
Piperidin-Lösung
in DMF von Träger
abgelöst
und UV-spektroskopisch vermessen.
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Die
Linker an der Trägeroberfläche weisen
lineare Strukturen oder Dendrimer-Strukturen auf. Die Strukturen haben
folgenden Aufbau:
- – bevorzugte Struktur nach
Aktivierung mit Acryloylchlorid X = O,
NHR1
Y, Z = können gleich oder verschieden
sein und können
ausgewählt
sein aus
-(CH2)n-
-(CH2CH2O)n-CH2CH2
-(CH2CH2CH2O)n-CH2CH2CH2- usw.
R1-R5 = können
gleich oder verschieden sein analog R1 und
R2 vorstehend
n = 1-50, bevorzugt 1-20,
ganz bevorzugt 1-10
oder
- – bevorzugte
Struktur nach Aktivierung mit Chlorameisensäure-nitrophenylester bzw. Carbonyldiimidazol X = O, NHR1
Y,
Z = können
gleich oder verschieden sein und können ausgewählt sein aus
-(CH2)n-
-(CH2CH2O)n-CH2CH2
-(CH2CH2CH2O)n-CH2CH2CH2- usw.
R1-R5 = können
gleich oder verschieden sein analog R1 und
R2 vorstehend
n = 1-50, bevorzugt 1-20,
ganz bevorzugt 1-10
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Bei
der Fixierung von Biopolymeren an die mit dem Linkersystem derivatisierten
Trägeroberfläche können prinzipiell
2 Fälle
(a) und (b) unterschieden werden
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(a) In situ-Synthese von
Biopolymeren (am Beispiel der Oligonukleotidsynthese):
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Die
derivatisierten Träger-Oberflächen mit
endständigen
Amino- oder Hydroxyl-Funktionen
bedürfen keiner
weiteren Modifizierung zur Anbindung des 1. Oligonucleotidbausteins
nach der Phosphoramidit- oder auch Phosphortriester-Methode. Es
werden nach der Reaktion des 1. Nucleotid-Reagenzes mit der aminierten Oberfläche Bindungen
vom Phosphoramidat-Typ erzeugt. Hydroxylierte Oberflächen führen zu
Bindungen vom Phosphodiester-Typ. Phosphoramidit-Methode
Phosphortriester-Methode
R
1-R
3 = analog R
1 und R
2 vorstehend
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Werden
Bindungen vom Phosphodiester-Typ angestrebt, genügt es beim letzten Schritt
innerhalb der Linker-System-Synthese kein Bis-Amin, sondern einen
Amino-Alkohol zur Reaktion zu bringen.
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(b) Anbindung von "vorgefertigten" Biopolymeren:
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Die
Anbindung des Biopolymeren sieht die Generierung einer kovalenten
(dauerhaften) chemischen Verknüpfung
des Biomoleküls
mit der Trägeroberfläche vor.
Hierzu muß eine
chemische Bindung zwischen dem Biomolekül und der Oberfläche erzeugt
werden. Um diese Bindung zu erzeugen, kommt beispielsweise folgendes
Vorgehen in Frage:
- – (A) Zugabe eines Förderungsmittels
- – (B)
Aktivierung einer der beiden Reaktanden (Biomolekül oder Oberfläche). Allerdings
ist eine Aktivierung der Trägeroberfläche gegenüber einer
Aktivierung des Biomoleküls
vorzuziehen, da bei der Aktivierung des Biomoleküls selbst unerwünschte Kreuzreaktionen
zwischen den aktivierten Biomolekülen – aufgrund des meist poly-funktionellen
Charakters des Biomoleküls – nicht
auszuschliessen sind. Diese Aktivierung der Oberfläche erfolgt
vorzugsweise mittels Crosslinker.
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(A) Anbindung des Biopolymeren
unter Zuhilfenahme eines Förderungsmittels
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Die
Möglichkeit
ein Förderungsmittel
(Katalysator) zur Erzeugung der kovalenten Bindung zwischen Oberfläche und
Biomolekül
zu benutzen, stellt im wesentlichen eine 3-Komponenten-Reaktion
dar. Werden wie in der vorliegenden Erfindung Möglichkeiten angestrebt, die
es erlauben sollen, hochparallel eine grosse Anzahl von Biopolymeren
an exakt vorbestimmten Positionen auf einem Träger zu fixieren, kann dies
aufgrund von Kreuz-Kontamination nur erschwert mit einem 3-Komponenten-System
an ebenen Oberflächen
(Folien, Glas o.ä.)
gelingen. Daher stellt die Förderungsmittel-Methode
einen Spezial-Fall zur kovalenten Anknüpfung von Biopolymeren auf
Oberflächen
vom Membran-Typ dar. Einzig hier kann das Förderungsmittel in den Poren der
Membran lokal dem zu bindenden Biomolekül zur Verfügung gestellt werden, ohne
daß mit
Kreuz-Kontamination zu rechnen ist (vgl. Beispiel 4). Als Förderungsmittelmittel
eignen sich beispielsweise Reagentien vom Carbodiimid-Typ, wie Diisopropylcarbodiimid,
EDC oder DCC (Dicyclohexylcarbodiimid). Desweiteren sollten die
endständigen
Gruppen auf dem Träger
und am Biomolekül
bevorzugt orthogonal zueinander sein, d.h. diese sollten sinnvoll
eine chemische Bindung eingehen können. Hierbei ergeben sich
vorzugsweise folgende Kombinationen der zu reagierenden Endgruppen:
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Da
die reaktiven Gruppen (Amin-, Hydroxyl-, Phosphat- oder Carboxyl-)
mehr oder weniger vom Biomolekül
vorgegeben sind, empfiehlt es sich daher für jeden Biomolekül-Typ einen
entsprechenden orthogonalen Oberflächen-Typ zur Verfügung zu
haben. Um die Träger-Oberflächen-Derivatisierung
mit dem Linkersystem für
alle oben aufgeführten
Kombination von Endgruppen verfüg bar
zu machen, wurden Methoden zur Um-Derivatisierung der Oberfläche von
endständigen
Amino-Funktionen (oder auch Hydroxyl) auf endständige Hydroxyl-, Carboxyl-
und Phosphat-Gruppen entwickelt (vgl. Beispiele 5, 6, 7). Um-Derivatisierung
auf End-Hydroxyl:
Um-Derivatisierung
auf End-Carboxyl:
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Um-Derivatisierung
auf End-Phosphat:
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(B) Anbindung des Biopolymeren
mittels Crosslinker
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Unter
einer kovalenten Oberflächen-Aktivierung
ist eine solche zu verstehen, bei der Crosslinker quasi als End-Gruppe
auf das erfindungsgemäß vorher
aufgebaute Linker-System (Flexible Linker-System) aufgepropft wurden.
Bei diesen handelt es sich vor allem um aktivierte Ester-, Aldehyd-,
Imidoester- oder
Isothiocyanat-Funktionen, die in der Lage sind, ohne weitere chemische
Eingriffe, mit in wässrigen
Systemen gelösten Biopolymeren
eine kovalente Bindung einzugehen. Als Reagentien der Wahl sind
hier v.a. Dissuccinimidylcarbonat, Dissuccinimidyl-oxalat, Glutaraldehyd,
Dimethylsuberimidat-Dihydrochlorid oder Phenylendiisothiocyanat
zu nennen. Die Umsetzung erfolgt bevorzugt unter basischen Bedingungen,
d.h. unter Zusatz von Diisopropylethylamin oder NaCO3.
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Die
Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:
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1:
Generierung von Dendrimerstrukturen nach Aktivierung mit Acryloylchlorid
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2;
Generierung von Dendrimerstrukturen nach Aktivierung mit 4-Nitrophenylchloroformiat
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Die
Erfindung wird weiter anhand der Beispiele beschrieben.
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Beispiel 1: Derivatisierung
eines Glasträgers
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Ausgegangen
wird von aminierten Glasträgern
(40 × 48
mm), der entweder kommerziell erhältlich ist oder nach den üblichen
Methoden der Silanisierung darstellbar ist. Zur Aktivierung der
Aminofunktionen werden die aminierten Glasträger in 20 ml wasserfreies Dichlorethan
mit 200 mg 4-Nitrophenyl-chloroformiat (1 mmol) und 171 μl Diisopropylethylamin
(1 mmol) gelegt und für
2 Stunden auf dem Schüttler
geschwenkt. Der BPB-Kontrolltest zeigt keine Blaufärbung. Die
Glasträger
werden über
Nacht in 20 ml amin-freiem DMF mit 223 μl Tetraethylenpentamin (1 mmol)
umgesetzt. Der BPB-Kontrolltest zeigt eine Blaufärbung. Zum Starten eines neuen
Zyklus' werden die
Glasträger
in 20 ml wasserfreies Dichlorethan mit 200 mg 4-Nitrophenyl-chloroformiat
(1 mmol) und 171 μl
Diisopropylethylamin (1 mmol) gelegt und für 2 Stunden auf dem Schüttler geschwenkt.
Der BPB-Kontrolltest zeigt keine Blaufärbung. Die Glasträger werden über Nacht
in 20 ml amin-freiem DMF mit 140 μl
1,4-Bis(3-aminopropyloxy)-butan (1 mmol) umgesetzt. Der BPB-Test
zeigt eine Blaufärbung.
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Die
so derivatisierten Glasträger
verfügen
an ihrer Oberfläche
jetzt über
Linker an die Biopolymere (z.B. Nukleinsäuren) gekoppelt werden können.
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Beispiel 2: Derivatisierung
eines Glasträgers
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Ausgegangen
wird von einem aminierten Glasträger
(40 × 48
mm), der entweder kommerziell erhältlich oder nach den üblichen
Methoden über
Silanisierung darstellbar ist. Zur Aktivierung der Aminofunktionen werden
die aminierten Glasträger
in 20 ml wasserfreies Dichlorethan mit 81 μl Acryloylchlorid (1 mmol) und 171 μl Diisopropylethylamin
(1 mmol) gelegt und für
2 Stunden auf dem Schüttler
geschwenkt. Der BPB-Kontrolltest zeigt keine Blaufärbung. Die
Glasträger
werden über
2 Nächte
in 20 ml amin-freiem DMF mit 223 μl Tetraethylenpentamin
(1 mmol) umgesetzt. Der BPB-Kontrolltest zeigt eine Blaufärbung. Zum
Starten eines neuen Zyklus' werden
die Glasträger
in 20 ml wasserfreies Dichlorethan mit 81 μl Acryloylchlorid (1 mmol) und 171 μl Diisopropylethylamin
(1 mmol) gelegt und für
2 Stunden auf dem Schüttler
geschwenkt. Der BPB-Kontrolltest zeigt keine Blaufärbung. Die
Glasträger
werden über
2 Nächte
in 20 ml amin-freiem DMF mit 140 μl 1,4-Bis(3-aminopropoxy)-butan
(1 mmol) umgesetzt. Der BPB-Test zeigt eine Blaufärbung.
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Die
so derivatisierten Glasträger
verfügen
an ihrer Oberfläche
jetzt über
Linker an die Biopolymere (z.B. Nukleinsäuren) gekoppelt werden können.
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Beispiel 3: Derivatisierung
von Polypropylenmembranen
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Ausgegangen
wird von einer käuflichen
hydrophilisierten Polypropylenmembran (8 × 12 cm). Zur Aktivierung wird
die Membran mit 324 μl
Acryloylchlorid (4 mmol) und 684 μl
Diisopropylethylamin (4 mmol) in 30 ml wasserfreiem Dichlorethan
auf dem Rüttler
zur Reaktion gebracht. Nach 2 Std. wird von der Reaktionslösung abdekantiert
und mehrmals sorgfältig
mit Dichlorethan gewaschen und getrocknet. Der Bromphenolblau-Test
(BPB-Test) zeigt keine Blaufärbung.
Nachfolgend wird die aktivierte Membran 2 Tage mit 892 μl Tetraethylenpentamin
(4 mmol) in 30 ml aminfreiem DMF auf dem Rüttler geschwenkt. Dann wird
die Reaktionslösung
abdekantiert und die Membran mehrmals sorgfältig mit DMF und dann mit Dichlorethan
gewaschen und getrocknet. Der Bromphenolblau-Test zeigt Blaufärbung. Zur
weiteren Aktivierung wird die nun aminierte Membran erneut mit 324 μl Acryloylchlorid
(4 mmol) und 684 μl
Diisopropylethylamin (4 mmol) in 30 ml wasserfreiem Dichlorethan
auf dem Rüttler
zur Reaktion gebracht. Nach 2 Std. wird von der Reaktionslösung dekantiert
und mehrmals sorgfältig
mit Dichlorethan gewaschen und getrocknet. Der Bromphenolblau-Test
(BPB-Test) zeigt keine Blaufärbung.
Nachfolgend wird die aktivierte Membran 2 Tage mit 560 μl 1,6-Bis(3-aminopropyloxy)-butan
(4 mmol) in 30 mol aminfreiem DMF auf dem Rüttler geschwenkt. Dann wird
die Reaktionslösung
abdekantiert und die Membran mehrmals sorgfältig mit DMF und dann mit Dichlorethan
gewaschen und getrocknet. Der Bromphenolblau-Test (BPB-Test) zeigt Blaufärbung.
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Beispiel 4: Anbindung
von Nukleinsäuren
auf Polypropylenmembranen
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Eine
gemäß Beispiel
3 derivatisierte Polypropylenmembran (8 × 12 cm) wird auf einem Whatman-Filterpapier
5 Min. mit einer Lösung
aus 54 mg N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimidhydrochlorid und 24
ml N-Methylimidazol in 10 ml Wasser inkubiert. Die Reaktionslösung wird
abdekantiert. Die so aktivierte, noch feuchte Polypropylen-Membran
kann nun zum kovalenten Aufbringen von Biopolymeren verwendet werden.
Nach dem Aufbringen der Biopolymere (z.B. durch Spotting-Robotter
oder Nano-Plotter) werden die Proben durch 2 hr Inkubieren bei 65 °C auf der
Membran fixiert; anschliessend wird die Membran sorgfältig mit Wasser
gewaschen.
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Beispiel 5: Synthese endständiger Hydroxyl-Gruppen
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a) Aktivierung mit Chlorameisensäure-4-nitrophenylester:
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Eine
amino-funktionalisierte Polypropylen-Membran (Omnitray-Grösse) gemäß Beispiel
3 wird in 30 ml wasserfreiem Dichlorethan mit 400 mg Chlorameisen säure-4-nitrophenylester
(2 mmol) und 342 μl
Diisopropylethylamin (2 mmol) für
2 hr auf dem Schüttler
geschwenkt. Man wäscht
2 × je
5 min mit 50 ml Dichlormethan und trocknet im Stickstoffstrom. Die
so aktivierte PP-Membran wird nun mit 200 ml 2-(2-Aminoethoxy)ethanol
(2 mmol) in 30 ml aminfreiem DMF 30 min auf dem Schüttler geschwenkt,
worauf die Reaktionslösung
abdekantiert wird. Nach kurzem Waschem mit DMF wird die PP-Membran
erneut mit 200 μl
2-(2-Aminoethoxy)ethanol (2 mmol) in 30 ml aminfreiem DMF versetzt
und über
Nacht auf dem Schüttler
geschwenkt. Von der Reaktionslösung
wird abdekantiert, und die PP-Membran 2 × je 5 min mit 50 ml DMF und
dann 2 × mit
50 ml Aceton gewaschen und getrocknet.
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b) Aktivierung mit Acryloylchlorid:
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Eine
amino-funktionalisierte Polypropylen-Membran (Omnitray-Grösse) gemäß Beispiel
3 wird in 30 ml wasserfreiem Dichlorethan mit 162 μl Acryloylchlorid
(2 mmol) und 342 μl
Diisopropylethylamin (2 mmol) für 2
hr auf dem Schüttler
geschwenkt. Man wäscht
2 × je
5 min mit 50 ml Dichlormethan und trocknet im Stickstoffstrom. Die
so aktivierte PP-Membran wird nun mit 200 μl 2-12-Aminoethoxy)ethanol (2
mmol) in 30 ml aminfreiem DMF 30 min auf dem Schüttler geschwenkt, worauf die
Reaktionslösung
abdekantiert wird. Nach kurzem Waschem mit DMF wird die PP-Membran
erneut mit 200 μl
2-(2-Aminoethoxy)ethanol (2 mmol) in 30 ml aminfreiem DMF versetzt
und über
Nacht auf dem Schüttler
geschwenkt. Von der Reaktionslösung
wird abdekantiert, und die PP-Membran 2 × je 5 min mit 50 ml DMF und
dann 2 × mit
50 ml Aceton gewaschen und getrocknet.
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Beispiel 6: Synthese endständiger Carboxyl-Gruppen
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Eine
amino-funktionalisierte Polypropylen-Membran (Omnitray-Grösse) gemäß Beispiel
3 wird in 30 ml trockenem Dichlorethan mit 400 mg Bernsteinsäureanhydrid
(4 mmol), 1 ml Pyridin (24 mmol) und 488 mg DMAP (4 mmol) über Nacht
auf dem Schüttler
zur Reaktion gebracht. Nachfolgend wird die Reaktions lösung abdekantiert
und die PP-Membran nacheinander mit 30 ml Dichlormethan, 30 ml Aceton,
30 ml 1 % HCl, 2 × 30
ml Wasser und 2 × mit
30 ml Aceton jeweils 5 min. gewaschen und getrocknet.
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Beispiel 7: Synthese endständiger Phosphat-Gruppen
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Unter
Eisbadkühlung
werden 0.42 ml POCl3 (4 mmol) in 40 ml trockenem
Pyridin gelöst.
Nachfolgend werden 828 mg 1,2,4-Triazol (12 mmol) zugefügt. Nach
10 min wird die hydroxyl-funtionalisierte Polypropylen-Membran gemäß Beispiel
4 zugefügt
und weitere 10 min unter Eisbadkühlung
auf dem Rüttler
geschwenkt. Anschliessend wird das Eisbad entfernt und noch 45 min
geschwenkt. Die Reaktionslösung
wird abdekantiert und vorsichtig mit 50 ml eines Gemisch aus Triethylamin/Dioxan/Wasser
hydrolisiert. Man wäscht
sorgfältig nacheinander
2 × mit
50 ml Wasser, kurz mit 50 ml 1 % HCl, 2 × mit 50 ml Wasser und 2 × 5 min
mit 50 ml Aceton und trocknet im Stickstoff-Strom.
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Beispiel 8: Oberflächen-Aktivierung
mit Disuccinimidylcarbonat
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7
amino-funktionalisierte Glas-Objektträger werden in 30 ml wasserfreiem
Acetonitril mit 256 mg Disuccinimidylcarbonat (2 mmol) und 513 μl Diisopropylethylamin
(3 mmol) für
4 hr auf dem Schüttler
geschwenkt. Man wäscht
mit 50 ml Acetonitril, dann mit 50 ml Dichlorethan und trocknet
im Stickstoffstrom.