DE19906757A1

DE19906757A1 - Optical arrangement with spectrally selective element for use in the beam path of a light source suitable for stimulation of fluorescence, pref. a confocal laser-scanning microscope

Info

Publication number: DE19906757A1
Application number: DE1999106757
Authority: DE
Inventors: Johann Engelhardt; Heinrich Ulrich; Joachim Bradl
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1999-02-17
Publication date: 1999-12-02
Anticipated expiration: 2019-02-18
Also published as: DE19906757B4

Abstract

The arrangement has at least one spectrally selective element (4) for coupling the stimulation light from at least one light source (2) into the microscope and for stopping the stimulation light reflected and scattered at the object (10) and the stimulation wavelengths from the light passing from the object over the detection beam path (12). Stimulation light of different wavelengths can be stopped by the spectrally selective element.

Description

Die Erfindung betrifft eine optische Anordnung im Strahlengang einer zur Fluores zenzanregung geeigneten Lichtquelle, vorzugsweise im Strahlengang eines konfo kalen Laser-Scanning-Mikroskops, mit mindestens einem spektral selektiven Ele ment zum Einkoppeln des Anregungslichts mindestens einer Lichtquelle in das Mi kroskop und zum Ausblenden des am Objekt gestreuten und reflektierten Anre gungslichts bzw. der Anregungswellenlänge aus dem über den Detektionsstrahlen gang vom Objekt kommenden Licht.The invention relates to an optical arrangement in the beam path of a fluorescent suitable light source, preferably in the beam path of a conf kalen laser scanning microscope, with at least one spectrally selective el ment for coupling the excitation light of at least one light source into the Mi microscope and to hide the stimulus scattered and reflected on the object light or the excitation wavelength from the above the detection beams light coming from the object.

Sowohl bei der konventionellen wie auch bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikro skopie werden in den Strahlengang einer für Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle Farbstrahlteiler mit einer ganz besonderen Transmissions- und Refle xionscharakteristik verwendet. Dabei handelt es sich ganz überwiegend um dichroi tische Strahlteiler. Mit einem solchen Element wird die Fluoreszenzanregungswel lenlänge λ_ill1 (bzw. λ_ill2, λ_ill3 λ_illn bei der Verwendung von mehreren Lasern) in den Beleuchtungsstrahlengang reflektiert, um die Fluoreszenzverteilung im Objekt anzu regen und dann zusammen mit dem am Objekt gestreuten und reflektierten Anre gungslicht den Strahlengang bis hin zum Farbstrahlteiler zu durchlaufen. Das Anre gungslicht mit den Wellenlängen λ_ill1, λ_ill2, λ_ill3, . . ., λ_illn wird am Farbstrahlteiler zu rück in den Laser reflektiert, nämlich aus dem Detektionsstrahlengang heraus. Das Fluoreszenzlicht mit den Wellenlängen λ_fluo1, λ_fluo2, λ_fluo3, . . ., λ_fluon passiert den Farbstrahlteiler und wird - gegebenenfalls nach weiterer spektraler Aufteilung - detektiert.In both conventional and confocal laser scanning microscopy, color beam splitters with a very special transmission and reflection characteristic are used in the beam path of a light source suitable for fluorescence excitation. Most of these are dichroic beam splitters. With such an element, the fluorescence excitation wavelength λ _ill1 (or λ _ill2 , λ _ill3 λ _illn when using several lasers) is reflected in the illumination beam path in order to stimulate the fluorescence distribution in the object and then together with the excitation scattered and reflected on the object light to pass through the beam path to the color beam splitter. The excitation light with the wavelengths λ _ill1 , λ _ill2 , λ _ill3,. . ., λ _illn is reflected back into the laser at the color _{beam splitter} , namely out of the detection _{beam path} . The fluorescent light with the wavelengths λ _fluo1 , λ _fluo2 , λ _fluo3,. . ., λ _fluon passes the color _{beam splitter} and is detected - if necessary after further spectral division.

Farbstrahlteiler sind üblicherweise durch ein Interferenzfilter realisiert und werden je nach den verwendeten Wellenlängen für die Anregung bzw. für die Detektion gezielt bedampft. An dieser Stelle sei angemerkt, daß gemäß voranstehender Beschrei bung des Standes der Technik unter einem Dichroit ein Wellenlängen-separierbares Element verstanden wird, welches das Licht unterschiedlicher Wellenlänge aufgrund der Wellenlänge und nicht aufgrund der Polarisation trennt.Color beam splitters are usually realized by an interference filter and are each targeted for the excitation or for the detection according to the wavelengths used steamed. At this point it should be noted that according to the above description Exercise of the prior art under a dichroic a wavelength separable Element is understood which is due to the light of different wavelengths the wavelength and not due to polarization.

In der Praxis ist die Verwendung von Farbstrahlteilern zunächst einmal insoweit nachteilig, als es sich hierbei um in der Herstellung aufwendige und daher teure op tische Bausteine handelt. Des weiteren ist nachteilig, daß Farbstrahlteiler eine feste Wellenlängencharakteristik aufweisen und daher nicht mit beliebiger Flexibilität hin sichtlich der Wellenlänge des Anregungslichts verwendet werden können. Bei einem Wechsel der Wellenlänge des Anregungslichts müssen auch die Farbstrahlteiler ausgewechselt werden, so beispielsweise bei einer Anordnung mehrerer Farbstrahlteiler in einem Filterrad. Dies ist abermals aufwendig und daher teuer und erfordert im übrigen eine ganz besondere Justage der einzelnen Farbstrahlteiler.In practice, the use of color beam splitters is first of all disadvantageous when it comes to complex and therefore expensive op table building blocks. Another disadvantage is that the color beam splitter is a fixed one Have wavelength characteristics and therefore not with any flexibility clearly the wavelength of the excitation light can be used. At a The color beam splitter must also change the wavelength of the excitation light can be replaced, for example in the case of an arrangement of several Color beam splitter in a filter wheel. Again, this is complex and therefore expensive and also requires a very special adjustment of the individual color beam splitters.

Die Verwendung eines Farbstrahlteilers bringt den weiteren Nachteil mit sich, daß durch Reflexion bedingte Lichtverluste auftreten, insbesondere Lichtverluste von Fluoreszenzlicht, welches gerade detektiert werden soll. Der spektrale Transmissi ons-/Reflexionsbereich ist bei Farbstrahlteilern recht breit (λ_ill ± 20 nm) und keines wegs ideal "steil". Folglich läßt sich das Fluoreszenzlicht aus diesem spektralen Be reich nicht ideal detektieren.The use of a color beam splitter has the further disadvantage that light losses due to reflection occur, in particular light losses from fluorescent light which is about to be detected. The spectral transmission / reflection range for color beam splitters is quite wide (λ _ill ± 20 nm) and in no way ideally "steep". Consequently, the fluorescent light from this spectral range cannot be ideally detected.

Bei Verwendung von Farbstrahlteilern ist die Anzahl der gleichzeitig einkoppelbaren Laser begrenzt, nämlich beispielsweise auf die Anzahl der in einem Filterrad ange ordneten und kombinierbaren Farbstrahlteiler. Üblicherweise werden maximal drei Laser in den Strahlengang eingekoppelt. Wie bereits zuvor ausgeführt, müssen sämtliche Farbstrahlteiler, also auch die in einem Filterrad angeordneten Farbstrahlteiler, exakt justiert werden, was einen ganz erheblichen Aufwand in der Handhabung mit sich bringt Alternativ können geeignete Neutralstrahlteiler einge setzt werden, die das Fluoreszenzlicht gemeinsam mit dem am Objekt gestreu ten/reflektierten Anregungslicht effizient zum Detektor leiten. Die Verluste bei der Lasereinkopplung sind dabei jedoch erheblich.When using color beam splitters, the number of those that can be coupled in at the same time Laser limited, namely, for example, the number of in a filter wheel arranged and combinable color beam splitter. Usually a maximum of three Laser coupled into the beam path. As stated earlier, must all color beam splitters, including those arranged in a filter wheel Color beam splitter, can be adjusted exactly, which is a very considerable effort in the Handling entails Alternatively, suitable neutral beam splitters can be used that are used to scatter the fluorescent light together with that on the object Lead / reflected excitation light efficiently to the detector. The losses at the However, laser coupling is considerable.

Zur Dokumentation des Standes der Technik wird lediglich beispielhaft auf die DE 196 27 568 A1 verwiesen, die eine optische Anordnung zur konfokalen Mikroskopie zeigt. Dabei handelt es sich im Konkreten um eine Anordnung zur zeitgleichen kon fokalen Beleuchtung einer Objektebene mit einer Vielzahl geeignet divergierender Leuchtpunkte sowie zugehörigen Abbildungsgliedern und einer Vielzahl von Pinho les zur konfokalen kontrastreichen Abbildung in einem Beobachtungsgerät, wobei es sich dabei um ein Mikroskop handeln kann. Die Einkopplung mehrerer Lichtquellen erfolgt dort über ein diffraktives Element. Mehrere optische Teilerelemente bzw. Farbstrahlteiler sind im Detektionsstrahlengang angeordnet, wodurch sich ein ganz erheblicher apparativer Aufwand ergibt.For documentation of the prior art, reference is only made to DE 196 27 568 A1 as an example referenced an optical arrangement for confocal microscopy shows. In concrete terms, this is an arrangement for simultaneous con focal illumination of an object plane with a variety of suitably divergent ones Illuminated dots as well as associated picture elements and a variety of Pinho les to confocal high-contrast imaging in an observation device, where it can be a microscope. The coupling of several light sources takes place there via a diffractive element. Several optical divider elements or Color beam splitters are arranged in the detection beam path, whereby a whole considerable equipment expenditure results.

Hinsichtlich der Verwendung aktiver optischer Elemente im Strahlengang eines La ser-Scanning-Mikroskops wird ergänzend auf die US 4,827,125 und die US 5,410,371 verwiesen, wobei diese Druckschriften die grundsätzliche Verwendung eines AOD (Acousto-Optical-Deflector) und eines AOTF (Acousto-Optical-Tunable- Filter) zeigen, und zwar stets mit dem Zweck, einen Strahl abzulenken oder abzu schwächen.With regard to the use of active optical elements in the beam path of a La This scanning microscope is supplementary to US 4,827,125 and US 5,410,371, these publications the basic use an AOD (Acousto-Optical-Deflector) and an AOTF (Acousto-Optical-Tunable- Filters) always with the purpose of deflecting or deflecting a beam weaknesses.

Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, eine optische Anord nung im Strahlengang einer zur Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle, vor zugsweise im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops, derart auszugestalten und weiterzubilden, daß das Einkoppeln des Anregungslichts unter schiedlicher Anregungswellenlänge möglich ist, ohne bei einem Wechsel der Wel lenlänge des Anregungslichts einen Wechsel oder eine besondere Justage der dort verwendeten optischen Elemente vornehmen zu müssen. Des weiteren soll die An zahl der erforderlichen optischen Elemente weitestmöglich reduziert sein. Schließlich soll eine ideale Detektion des Fluoreszenzlichts möglich sein.The present invention is based on the object of an optical arrangement in the beam path of a light source suitable for fluorescence excitation preferably in the beam path of a confocal laser scanning microscope, such To design and develop that the coupling of the excitation light under different excitation wavelength is possible without changing the wel length of the excitation light a change or a special adjustment of there to make optical elements used. Furthermore, the An number of the required optical elements must be reduced as much as possible. Finally ideal detection of the fluorescent light should be possible.

Die erfindungsgemäße optische Anordnung im Strahlengang einer zur Fluoreszenz anregung geeigneten Lichtquelle, vorzugsweise im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops, löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale der nebengeordneten Patentansprüche 1 und 2. Danach ist eine gattungsgemäße optische Anordnung dadurch gekennzeichnet, daß durch das spektral selektive Ele ment Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlängen ausblendbar sowie entspre chend einkoppelbar ist. Alternativ ist die optische Anordnung dadurch gekennzeich net, daß das spektral selektive Element auf die auszublendende Anregungswellen länge einstellbar ist.The optical arrangement according to the invention in the beam path for fluorescence suitable light source, preferably in the beam path of a confocal Laser scanning microscope, solves the above task through the features of the independent claims 1 and 2. After that is a generic Optical arrangement characterized in that the spectrally selective Ele excitation light of different wavelengths can be faded out as well can be coupled accordingly. Alternatively, the optical arrangement is characterized net that the spectrally selective element on the excitation waves to be hidden length is adjustable.

Erfindungsgemäß ist erkannt worden, daß man im Strahlengang einer zur Fluores zenzanregung geeigneten Lichtquelle, insbesondere im Strahlengang eines konfo kalen Laser-Scanning-Mikroskops, den dort bislang verwendeten Farbstrahlteiler durch ein ganz besonderes spektral selektives Element ersetzen kann, nämlich durch ein spektral selektives Element, welches geeignet ist, Anregungslicht unter schiedlicher Wellenlängen auszublenden oder einzublenden bzw. einzukoppeln. Dieses spektral selektive Element dient einerseits zum Einkoppeln des Anregungs lichts mindestens einer Lichtquelle in das Mikroskop und andererseits zum Ausblen den des am Objekt gestreuten und reflektierten Anregungslichts bzw. der entspre chenden Anregungswellenlänge aus dem über den Detektionsstrahlengang vom Objekt kommenden Licht. Insoweit kommt dem spektral selektiven Element eine Doppelfunktion zu, wobei beide Funktionen quasi zwangsgekoppelt sind.According to the invention it has been recognized that one in the beam path to the fluorescence suitable light source, especially in the beam path of a conf kalen laser scanning microscope, the color beam splitter previously used there can be replaced by a very special spectrally selective element, namely by a spectrally selective element, which is suitable for taking excitation light fade out or fade in or couple in different wavelengths. This spectrally selective element is used on the one hand to couple the excitation light at least one light source into the microscope and on the other hand for fading that of the excitation light scattered and reflected on the object or the equivalent appropriate excitation wavelength from the over the detection beam path from Object coming light. In this respect, the spectrally selective element comes into play Double function, whereby both functions are quasi-coupled.

Alternativ zu der Fähigkeit des spektral selektiven Elements, Anregungslicht unter schiedlicher Wellenlängen ausblenden zu können, ist das spektral selektive Element auf die jeweils einzublendende oder auszublendende Anregungswellenlänge ein stellbar ist. Auch insoweit ist aufgrund der voranstehend geschilderten Doppelfunk tion eine Zwangskopplung auf einfache Weise gewährleistet, nämlich dadurch, daß mit Hilfe des spektral selektiven Elements das Anregungslicht in den Beleuchtungs strahlengang einkoppelbar und daß exakt die Wellenlänge des Anregungslichts, nämlich die Anregungswellenlänge, aufgrund der hier vorgesehenen Einstellbarkeit aus dem über den Detektionsstrahlengang vom Objekt kommenden Licht ausblend bar ist, so daß zur Detektion das vom Objekt kommende Detektionslicht (=Fluores zenzlicht) verbleibt.Alternatively to the ability of the spectrally selective element to take excitation light To be able to hide different wavelengths is the spectrally selective element to the excitation wavelength to be faded in or out is adjustable. In this respect too, due to the dual radio described above tion ensures a positive coupling in a simple manner, namely that with the help of the spectrally selective element, the excitation light in the lighting beam path can be coupled and that exactly the wavelength of the excitation light, namely the excitation wavelength, due to the adjustability provided here fades out the light coming from the object via the detection beam path bar, so that the detection light coming from the object (= fluores zenzlicht) remains.

In vorteilhafter Weise kann es sich bei dem spektral selektiven Element - zur Be günstigung der voranstehend erörterten Doppelfunktion - um ein passives Element bzw. Bauteil handeln. Dazu könnte das spektral selektive Element als transparentes optisches Gitter oder als holographisches Element ausgeführt sein. Ebenso ist es denkbar, das spektral selektive Element als passiven AOD (Acousto-Optical-Deflec tor) oder als passiven AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) auszuführen.Advantageously, the spectrally selective element - for example Favoring the dual function discussed above - by a passive element or act component. In addition, the spectrally selective element could be transparent optical grating or as a holographic element. It is the same conceivable, the spectrally selective element as passive AOD (Acousto-Optical-Deflec tor) or as a passive AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter).

In ganz besonders vorteilhafter Weise, nämlich zur konkreten Realisierung der Ein stellbarkeit des spektral selektiven Elements auf die auszublendende Anregungs wellenlänge, kann es sich bei dem spektral selektiven Element um ein aktives Bau teil handeln, so bspw. um ein akustooptisch und/oder elektrooptisch arbeitendes Ele ment. Im Konkreten kommt hier als spektral selektives Element ein AOD (Acousto- Optical-Deflector) oder ein AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) in Frage. In a particularly advantageous manner, namely for the concrete realization of the one adjustability of the spectrally selective element to the excitation to be hidden wavelength, the spectrally selective element can be an active construction act part, for example, an acousto-optic and / or electro-optically working Ele ment. Specifically, an AOD (Acousto- Optical Deflector) or an AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) in question.

Anstelle des im Stand der Technik üblichen Farbstrahlteilers wird hier ein aktives spektral selektives Element verwendet, so beispielsweise ein AOD oder ein AOTF. Die Aufgabe dieser aktiven Bauteile besteht darin, das Anregungslicht der Licht quelle bzw. des Lasers oder der Laser λ_ill1, λ_il12, λ_ill3, . . ., λ_illn in den Beleuchtstrah lengang und somit in das Mikroskop einzukoppeln, um danach per Beam-Scanning die Fluoreszenzverteilung im Objekt anzuregen. Bei der Detektion kann das vom Objekt kommende Fluoreszenzlicht nahezu ungestört das aktive spektral selektive Element passieren. Dabei wird das vom Objekt gestreute oder reflektierte Licht mit den Anregungswellenlängen der Lichtquelle bzw. des Lasers oder der Laser aus dem Detektionsstrahlengang weitgehend herausreflektiert.Instead of the color beam splitter customary in the prior art, an active spectrally selective element is used here, for example an AOD or an AOTF. The task of these active components is to _generate the excitation light from the light source or the laser or lasers λ _ill1 , λ _il12 , λ _ill3,. . ., λ _{illn to be coupled} into the illuminating beam path and thus into the microscope, in order to then use beam scanning to excite the fluorescence distribution in the object. During detection, the fluorescent light coming from the object can pass through the active spectrally selective element almost undisturbed. The light scattered or reflected by the object is largely reflected out of the detection beam path with the excitation wavelengths of the light source or the laser or the lasers.

Zur Einkopplung einer Lichtquelle bzw. eines Lasers oder mehrerer Laser mit ver schiedenen Wellenlängen λ_ill1, λ_ill2, . . ., λ_illn kann ein AOD mit entsprechenden Fre quenzen ν₁, ν₂, . . ., ν_n vorzugsweise simultan beschaltet werden, so daß die ver schiedenen Laserstrahlen nach dem Durchgang durch den AOD koaxial mit der op tischen Achse verlaufen. Hinsichtlich der Verwendung des AOD ist wesentlich, daß dort eine Frequenz ν_n eine Wellenlänge λ_illn selektiert, die aus dem eigentlichen Strahlengang abgelenkt wird. Der Ablenkungswinkel Φ ist dabei durch die Formel
For coupling a light source or a laser or several lasers with _different wavelengths λ _ill1 , λ _ill2,. . ., λ _illn can be an AOD with corresponding frequencies ν ₁ , ν ₂ ,. . ., ν _{n are} preferably connected simultaneously, so that the different laser beams run coaxially with the optical axis after passing through the AOD. _With regard to the use of the AOD, it is essential that a frequency ν _n selects a wavelength λ _illn which is deflected from the actual beam _path . The deflection angle Φ is given by the formula

Φ = λ_illn ν_n/2f
Φ = λ _illn ν _n / 2f

definiert, wobei f die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Schallwelle im AOD ist. Das zu detektierende Fluoreszenzlicht mit einer spektralen Verteilung um die Wellenlän gen λ_fluo1, λ_fluo2, . . ., λ_fluon zusammen mit dem am Objekt gestreuten bzw. reflektierten Anregungslicht mit den Wellenlängen λ_ill1, λ_ill2, . . ., λ_illn durchläuft nun den AOD in umgekehrter Richtung. Jedoch wird gemäß der Umkehrbarkeit des Lichtwegs das Anregungslicht mit den Wellenlängen λ_ill1, λ_ill2, . . ., λ_illn wegen der spezifischen Ein stellung des AOD aus dem Detektionsstrahlengang in Richtung des Lasers abge lenkt (1. Ordnung). Somit kann das "spektral verbleibenden Fluoreszenzlicht um die Wellenlängen λ_fluo1, λ_fluo2, . . ., λ_fluon - verglichen mit einem herkömmlichen Farbstrahl teiler - auf verbesserte Weise detektiert werden (0. Ordnung). Dadurch läßt sich je denfalls die Justage der Einkopplung unterschiedlicher Laser einfacher als im Stand der Technik (dort unter Anwendung herkömmlicher Farbstrahlteiler in einem Filter rad) vornehmen. defined, where f is the velocity of propagation of the sound wave in the AOD. The fluorescent light to be detected with a spectral distribution around the wavelengths λ _fluo1 , λ _fluo2,. . ., λ _fluon together with the excitation light scattered or reflected on the object with the wavelengths λ _ill1 , λ _ill2,. . ., λ _illn now runs through the AOD in the opposite direction. However, according to the reversibility of the light path, the excitation light with the wavelengths λ _ill1 , λ _ill2,. . ., λ _{illn deflected} due to the specific _{setting of} the AOD from the detection beam path in the direction of the laser (1st order). Thus, the "spectrally remaining fluorescent light around the wavelengths λ _fluo1 , λ _fluo2 , _... , Λ _fluon - compared to a conventional color beam splitter - can be detected in an improved manner (0th order). This makes it possible to adjust the coupling at any rate make different lasers easier than in the prior art (there using conventional color beam splitters in a filter wheel).

In weiter vorteilhafter Weise könnte ein Nachschalten weiterer AOTF die einzelnen Wellenlängen in ihrer Leistung nach der Strahlzusammenführung selektiv regeln.In a further advantageous manner, a further AOTF could be added to the individual Selectively regulate wavelengths in their power after beam combining.

Zur Einkopplung einer Laserlichtquelle mit verschiedenen Wellenlängen λ_fill1, λ_fill2, . . ., λ_filln kann ein AOTF mit entsprechenden Frequenzen ν₁, ν₂, . . ., ν_n simultan geschal tet sein, so daß die verschiedenen Wellenlängen in ihrer Anregungsleistung variie ren und auf die Anwendung hin optimierbar sind. Die Zuführung des Laserlichts kann mittels Lichtleitfaser erfolgen.For coupling a laser light _source with different wavelengths λ _fill1 , λ _fill2,. . ., λ _filln can an AOTF with corresponding frequencies ν ₁ , ν ₂ ,. . ., ν _{n be switched} simultaneously, so that the different wavelengths vary in their excitation power and can be optimized for the application. The laser light can be supplied by means of optical fibers.

Jedenfalls wird die Lichtquelle bzw. der Laser koaxial aus der Richtung der 1. Ord nung des Kristalls eingekoppelt. Das zu detektierende Fluoreszenzlicht mit einer spektralen Verteilung um die Wellenlängen λ_fluo1, λ_fluo2, . . ., λ_fluon gemeinsam mit dem am Objekt gestreuten bzw. reflektierten Anregungslicht mit den Wellenlängen λ_fill1, λ_fill2, . . ., λ_filln durchlaufen nun den AOTF in umgekehrte Richtung. Gemäß der Um kehrbarkeit des Lichtwegs wird das Anregungslicht mit den Wellenlängen λ_fill1, λ_fill2, . . ., λ_filln wegen der spezifischen Einstellung des AOTF aus dem Detektionsstrahlen gang in Richtung der Lichtquelle bzw. des Lasers abgelenkt. Somit kann auch hier bei das "spektral verbleibende" Fluoreszenzlicht um die Wellenlängen λ_fluo1, λ_fluo2, . . ., λ_fluon in einer - verglichen zum herkömmlichen Farbstrahlteiler - verbesserten Weise detektiert werden (0. Ordnung).In any case, the light source or the laser is coupled coaxially from the direction of the 1st order of the crystal. The fluorescent light to be detected with a spectral distribution around the wavelengths λ _fluo1 , λ _fluo2,. . ., λ _fluon together with the excitation light scattered or reflected on the object with the wavelengths λ _fill1 , λ _fill2,. . ., λ _filln now run through the AOTF in the opposite direction. According to the reversibility of the light path, the excitation light with the wavelengths λ _fill1 , λ _fill2,. . ., λ _{filln deflected} due to the specific setting of the AOTF from the detection beam path in the direction of the light source or the laser. Thus, here too, the "spectrally remaining" fluorescent light around the wavelengths λ _fluo1 , λ _fluo2,. . ., λ _fluon can be detected in an improved manner (0th order) compared to the conventional color _{beam splitter} .

Sowohl unter Verwendung eines AOD oder AOTF als auch unter Verwendung eines transparenten Gitters wird sich das Fluoreszenzlicht nach dem Durchgang durch das jeweilige aktive Element aufgrund der auftretenden Dispersion spektral auffächern. Insoweit ist es von Vorteil, ein oder mehrere entsprechende "inversell Elemente nachzuschalten, so daß die ungewünschte spektrale Auffächerung wieder rückgän gig gemacht wird. Auch ist es denkbar, weitere optische Elemente zur Fokussierung oder zum Ausblenden unerwünschter Strahlanteile dem jeweiligen Element (AOD, AOTF oder transparentes Gitter) vor- bzw. nachzuschalten. Der dadurch wiederver einigte Detektionsstrahl kann dann in herkömmlicher Weise durch nachgeschaltete Farbstrahlteiler spektral zerlegt und auf die verschiedenen Detektoren abgebildet werden. Both using an AOD or AOTF and using one After passing through the transparent grid, the fluorescent light will turn off Fan each active element spectrally due to the dispersion that occurs. In this respect, it is advantageous to use one or more corresponding "inversely elements to connect, so that the unwanted spectral fanning out again gig is made. It is also conceivable to use further optical elements for focusing or to hide unwanted beam components the respective element (AOD, AOTF or transparent grid) upstream or downstream. The reverted Unified detection beam can then be connected in a conventional manner Color beam splitter spectrally disassembled and imaged on the various detectors become.

Grundsätzlich ist eine Anordnung im Sinne eines "Multibanddetektor" denkbar. Hierzu wird auf die Patentanmeldung DE 43 30 347.1-42 verwiesen, deren Inhalt hier ausdrücklich hinzugezogen und insoweit als bekannt vorausgesetzt wird. Zwi schen der Scan-Einheit und dem AOD bzw. dem transparenten Gitter (bei mehreren Lichtquellen bzw. Lasern mehrerer Wellenlängen) bzw. dem AOTF (bei einer Licht quelle bzw. einem Laser mit verschiedenen Wellenlängen) ist das Anregungs- Pinhole angeordnet, wobei dieses identisch mit dem Detektions-Pinhole ist. In vor teilhafter Weise wird dabei die Eigenschaft des Kristalls, den Lichtstrahl der 0. Ord nung durch den Prismeneffekt spektral aufzufächern, zur Detektion genutzt. Das dispersive Element des Multibanddetektors ist dabei mit dem Farbstrahlteiler zu einem Bauteil vereinigt, wodurch alle weiteren, dem herkömmlichen Detektions strahlengang nachgeordneten und mit weiteren Verlusten in der Fluoreszenzinten sität behafteten Farbstrahlteiler entfallen.In principle, an arrangement in the sense of a "multiband detector" is conceivable. For this, reference is made to the patent application DE 43 30 347.1-42, the content thereof here expressly consulted and insofar as it is assumed to be known. Two the scanning unit and the AOD or the transparent grid (if there are several Light sources or lasers of several wavelengths) or the AOTF (for one light source or a laser with different wavelengths) is the excitation Pinhole arranged, which is identical to the detection pinhole. In front the property of the crystal, the light beam of the 0th ord the spectral spread by the prism effect, used for detection. The dispersive element of the multiband detector is closed with the color beam splitter one component combined, making all other, the conventional detection downstream and with further losses in the fluorescent ink The color beam splitter, which has a lot of

In ganz besonders vorteilhafter Weise kann die voranstehend erörterte Technik in Kombination mit einer in der Wellenlänge variabel durchstimmbaren Laserlichtquelle - z. B. Farbstofflaser, OPO (optisch parametrisierter Oszillator), Elektronenstrahlkolli sionslichtquelle - äußerst flexible Fluoreszenzmikroskopie-Anwendungen ermögli chen. Die Einstellung bzw. Kontrolle der Anregungswellenlänge kann direkt mit der Ansteuereinheit eines der zuvor beschriebenen spektral selektiven Elemente gekop pelt sein, so daß nur diese Anregungswellenlänge koaxial in den Anregungsstrah lengang des Mikroskops eingekoppelt und wiederum nur diese Wellenlänge aus dem Detektionsstrahlengang ausgeblendet wird. Die Kopplung bzw. Zwangskopp lung der Lichtquelle mit dem strahlteilenden Element kann entweder manuell oder automatisch oder gar nach einer vorgebbaren Vorschrift erfolgen, wobei diese Mög lichkeit dem jeweiligen Anforderungsprofil anzupassen ist. Beispielsweise kann nach jeder gescannten Bildebene die Anregungswellenlänge sowie der Strahlteiler in ge eigneter Weise verändert werden. Somit lassen sich Mehrfarbenfluoreszenzobjekte detektieren. Eine zeilenweise Umschaltung ist ebenso denkbar.In a particularly advantageous manner, the technique discussed above can be found in Combination with a laser light source with variable tunability - e.g. B. dye laser, OPO (optically parameterized oscillator), electron beam colli ion light source - extremely flexible fluorescence microscopy applications possible chen. The setting or control of the excitation wavelength can be done directly with the Control unit Kopop one of the spectrally selective elements described above be pelt, so that only this excitation wavelength coaxially into the excitation beam coupled into the microscope and again only this wavelength the detection beam path is hidden. The coupling or forced coupling The light source with the beam splitting element can either be operated manually or take place automatically or even according to a specifiable regulation, this possibility is to be adapted to the respective requirement profile. For example, after each scanned image plane the excitation wavelength and the beam splitter in ge appropriately changed. This allows multicolor fluorescent objects detect. A line-by-line switchover is also conceivable.

Zusammenfassend lassen sich die Vorteile der erfindungsgemäßen Lehre nebst vorteilhafter Ausgestaltung wie folgt zusammenfassen:In summary, the advantages of the teaching according to the invention can be found summarize advantageous embodiment as follows:

Die spektral selektiven Elemente sind für alle Wellenlängen außer für die selektier ten Anregungswellenlängen λ_ill1, λ_ill2, . . ., λ_illn "transparent". Der "spektrale Verlust" ist minimal, da vom spektral selektiven Element nur der selektierte spektrale Bereich von typischerweise λ_illn ± 2 nm abgelenkt wird. Dadurch wird der spektrale Bereich für die Detektion vergrößert. Somit können nahezu beliebig viele unterschiedliche Wellenlängenbereiche simultan eingekoppelt und genutzt werden. Die spektral "ver lorene Fluoreszenzintensität", die durch die spektral selektiven Elemente bedingt ist, ist geringer als bei herkömmlichen Farbstrahlteilern. Mit anderen Worten liegen hier reduzierte Intensitätsverluste im interessierenden Bereich vor. Die aktiven spektral selektiven Elemente sind flexibel einstellbar, so daß prinzipiell beliebig viele Licht quellen bzw. Laser mit unterschiedlichen Wellenlängen auch simultan in das Mikro skop einkoppelbar sind. Dies ermöglicht die verbesserte Anwendung bei Multi-Color FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung). Folglich ist dann nur noch eine Limitie rung der spektralen Aufspaltung des Fluoreszenzlichts, bspw. durch "Cross-Talk", gegeben. Herkömmliche Sperrfilter können komplett entfallen, so daß weitere Verlu ste von Fluoreszenzlicht in der Detektion vermieden sind.The spectrally selective elements are for all wavelengths except for the selected excitation wavelengths λ _ill1 , λ _ill2,. . ., λ _illn "transparent". The "spectral loss" is minimal since only the selected spectral range of typically λ _illn ± 2 nm is deflected by the spectrally selective element. This increases the spectral range for detection. This means that almost any number of different wavelength ranges can be simultaneously coupled in and used. The spectrally "lost fluorescence intensity", which is caused by the spectrally selective elements, is lower than in conventional color beam splitters. In other words, there are reduced intensity losses in the area of interest. The active spectrally selective elements are flexibly adjustable, so that in principle any number of light sources or lasers with different wavelengths can also be coupled simultaneously into the microscope. This enables improved application in multi-color FISH (fluorescence in situ hybridization). Consequently, there is then only a limitation of the spectral splitting of the fluorescent light, for example by "cross talk". Conventional blocking filters can be completely dispensed with, so that further losses of fluorescent light in the detection are avoided.

Schließlich ist es auch denkbar, daß ein anderes aktives holographisches Element dem spektral selektiven Element nachgeschaltet ist und dabei die Aufgabe des Strahlscanners ausübt. Beide Elemente können zu einem einzigen Bauteil zusam mengefaßt sein.Finally, it is also conceivable that another active holographic element is connected downstream of the spectrally selective element and thereby the task of Beam scanners. Both elements can be combined into a single component be quantitative.

Grundsätzlich lassen sich unterschiedliche Lichtquellen verwenden, solange sie zur Fluoreszenzanregung geeignet sind. So kommt bspw. eine Weißlichtquelle, eine Lichtquelle zur Verwendung eines optisch parametrisierten Oszillators, eine Elektro nenstrahlkollisionslichtquelle oder eine Laserlichtquelle in Frage, wobei die Laser lichtquelle in der Wellenlänge variabel durchstimmbar sein kann. Laserlichtquellen mit verschiedenen Wellenlängen oder eine mehrere Laser umfassende Lichtquelle ist bzw. sind verwendbar.Basically, different light sources can be used as long as they are used Fluorescence excitation are suitable. So comes a white light source, for example Light source for using an optically parameterized oscillator, an electric collision light source or a laser light source in question, the laser light source can be variably tunable in the wavelength. Laser light sources with different wavelengths or a light source comprising several lasers is or can be used.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die den Patentansprüchen 1 und 2 nachgeordneten Patentansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele der Erfindung an hand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzug ten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im all gemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigenThere are now several ways to teach the present invention advantageous to design and develop. This is on the one hand on the the claims 1 and 2 subordinate claims, on the other hand the following explanation of preferred embodiments of the invention to reference the drawing. In connection with the explanation of the preferred th embodiments of the invention with reference to the drawing are also in all general preferred refinements and developments of the teaching explained. In show the drawing

Fig. 1 in einer schematischen Darstellung eine gattungsbildende opti sche Anordnung im Strahlengang eines konfokalen Laser- Scanning-Mikroskops zur Dokumentation des der Erfindung zu grundeliegenden Standes der Technik, Fig. 1 is a schematic representation of a generic opti cal arrangement in the beam path of a confocal laser scanning microscope for the documentation of the invention is based the prior art,

Fig. 2 in einer schematischen Darstellung ein erstes Ausführungsbei spiel einer erfindungsgemäßen optischen Anordnung im Strahlen gang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops, wobei dort ein Laser mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen einkoppelbar ist, Fig. 2 is a schematic representation of a first Ausführungsbei play an optical arrangement according to the invention in the beam path of a confocal laser scanning microscope, there being a laser having different excitation wavelengths can be coupled,

Fig. 3 in einer schematischen Darstellung ein zweites Ausführungsbei spiel einer erfindungsgemäßen optischen Anordnung im Strahlen gang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops, wobei dort drei Laser mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen einkop pelbar sind, Fig. 3 is a schematic representation of a second Ausführungsbei play an optical arrangement according to the invention in the beam path of a confocal laser scanning microscope, there being three lasers with different excitation wavelengths are einkop Pelbar,

Fig. 4 in einer schematischen Darstellung ein drittes Ausführungsbei spiel einer erfindungsgemäßen optischen Anordnung im Strahlen gang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops, wobei dort die Einkopplung von drei Laserlichtquellen über ein transparentes Gitter erfolgt, Fig. 4 is a schematic representation of a third Ausführungsbei play an optical arrangement according to the invention in the beam path of a confocal laser scanning microscope, there occurs the coupling of three laser light sources on a transparent grid,

Fig. 5 in schematischer Darstellung, vergrößert und teilweise, den Be leuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang, wobei dem aktiven spektral selektiven Element zur Strahlzusammenführung dienende Mittel nachgeschaltet sind, Figure 5 is a schematic representation, enlarged. And partly to Be leuchtungsstrahlengang and the detection beam path, wherein the active spectrally selective element are connected downstream of the beam combining means serving,

Fig. 6 in schematischer Darstellung, vergrößert und teilweise, den Be leuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang, wobei dort eine Dispersionskorrektur erfolgt, Figure 6 is a schematic representation, enlarged. And partly to Be leuchtungsstrahlengang and the detection beam path, there being a dispersion correction is made,

Fig. 7 in einer schematischen Darstellung die prinzipielle Funktionsweise eines AOD oder AOTF, Fig. 7 is a schematic representation of the basic mode of operation of an AOD or AOTF

Fig. 8 in einer schematischen Darstellung ein weiteres Ausführungsbei spiel einer erfindungsgemäßen optischen Anordnung, wobei dort eine zusätzliche spektrale Auffächerung vor einem Multibandde tektor stattfindet und Fig. 8 is a schematic representation of another Ausführungsbei game of an optical arrangement according to the invention, where there is an additional spectral fanning in front of a multiband detector and

Fig. 9 in einer schematischen Darstellung das Ausführungsbeispiel aus Fig. 8, wobei dort im Detektionsstrahlengang vor dem Multiband detektor ein variables Spaltfilter angeordnet ist.A variable gap filter is Fig. 9 is a schematic representation of the embodiment of FIG. 8, wherein there detector in the detection beam path upstream of the multi-band disposed.

Fig. 1 dokumentiert den Stand der Technik und zeigt dabei eine herkömmliche opti sche Anordnung im Strahlengang einer zur Fluoreszenzanregung geeigneten Licht quelle, wobei es sich hier um eine optische Anordnung im Strahlengang eines kon fokalen Laser-Scanning-Mikroskops handelt. Der Laserscanner 1 ist dabei lediglich symbolisch dargestellt. Bei der den Stand der Technik betreffenden Darstellung sind als Lichtquellen insgesamt drei Laser 2 vorgesehen, die mit ihrem Anregungslicht 3 über spektral selektive Elemente 4 in den Beleuchtungsstrahlengang 5 des Mikro skops einkoppeln. Bei den spektral selektiven Elementen 4 handelt es sich im Kon kreten um einen Spiegel 6 sowie um Farbstrahlteiler 7. Jedenfalls wird das Anre gungslicht 3 in den Beleuchtungsstrahlengang 5 eingekoppelt und gelangt über ei nen weiteren Spiegel 8 als Anregungslicht 9 zum Laserscanner 1. Fig. 1 documents the prior art and shows a conventional optical arrangement in the beam path of a light source suitable for fluorescence excitation, which is an optical arrangement in the beam path of a confocal laser scanning microscope. The laser scanner 1 is only shown symbolically. In the representation relating to the prior art, a total of three lasers 2 are provided, which couple with their excitation light 3 via spectrally selective elements 4 into the illumination beam path 5 of the microscope. The spectrally selective elements 4 are specifically a mirror 6 and color beam splitter 7 . In any case, the excitation light 3 is coupled into the illumination beam path 5 and passes via a further mirror 8 as an excitation light 9 to the laser scanner 1 .

Das von dem ebenfalls lediglich symbolisch dargestellten Objekt 10 zurückkom mende Licht - hier handelt es sich um das am Objekt gestreute und reflektierte An regungslicht 9 einerseits und um das vom Objekt 10 ausgesandte Fluoreszenzlicht 11 - gelangt über den Spiegel 8 zu dem spektral selektiven Element 4, wobei es sich hier um den Farbstrahlteiler 7 handelt. Von dort aus wird das Anregungslicht 9 bzw. die Anregungswellenlänge aus dem über den Detektionsstrahlengang 12 vom Objekt 10 kommenden Licht 13 ausgeblendet und gelangt als zurückkommendes Anregungslicht 9 zurück zu den Lasern 2. Das durch den Farbstrahlteiler 7 nicht ab gelenkte Detektionslicht 14 gelangt unmittelbar zu dem Detektor 15.The light coming back from the object 10, which is also only shown symbolically - here it is the scattered and reflected on the object to excitation light 9 on the one hand and the fluorescent light 11 emitted by the object 10 - reaches the spectrally selective element 4 via the mirror 8 , which is the color beam splitter 7 . From there, the excitation light 9 or the excitation wavelength is masked out from the light 13 coming from the object 10 via the detection beam path 12 and returns to the lasers 2 as a returning excitation light 9 . The detection light 14 which is not deflected by the color beam splitter 7 arrives directly at the detector 15 .

Erfindungsgemäß ist durch das spektral selektive Element 4 zurückkommendes An regungslicht 3 unterschiedlicher Wellenlängen ausblendbar. Dies ist insbesondere in Fig. 4 dargestellt.According to the invention, returning to the excitation light 3 of different wavelengths can be suppressed by the spectrally selective element 4 . This is shown in particular in FIG. 4.

Alternativ - in ebenfalls erfindungsgemäßer Weise - ist das spektral selektive Ele ment 4 auf die auszublendende Anregungswellenlänge einstellbar. Dies läßt sich den Ausführungsbeispielen aus den Fig. 2, 3 und 8, 9 besonders gut entnehmen.Alternatively - in a manner also according to the invention - the spectrally selective element 4 can be adjusted to the excitation wavelength to be masked out. This can be seen particularly well from the exemplary embodiments from FIGS. 2, 3 and 8, 9.

Bei dem in Fig. 2 gezeigten Ausführungsbeispiel ist lediglich ein Laser 2 vorgese hen, dessen Anregungslicht 3 unterschiedliche Wellenlängen aufweisen kann. Je denfalls gelangt das Anregungslicht 3 über einen Spiegel 6 und über ein zusätzli ches optisches Element, nämlich über eine Linse 16 zu einem AOTF 17, der als spektral selektives Element arbeitet. Von dort aus gelangt das Anregungslicht 3 wie derum über ein zusätzliches optisches Element - im hier gewählten Ausführungsbei spiel eine Linse 18 - und über einen Spiegel 8 zum Laserscanner 1. Vom Objekt 10 reflektiert, gelangt das zurückkommende Licht - reflektiertes Anregungslicht 9 und Detektionslicht 11 - über den Spiegel 8 und die Linse 18 zurück in den AOTF 17 und wird dort entsprechend der Beschaltung des AOTF 17 teilweise ausgeblendet. Im Konkreten wird nämlich das Detektionslicht bzw. Fluoreszenzlicht 11 über den Detektionsstrahlengang 12 zum Detektor 15 geführt (0. Ordnung). Das zurückkom mende Anregungslicht 9 wird dagegen über die Linse 16 und den Spiegel 6 zurück zum Laser 2 geführt und ist somit aus dem Detektionsstrahlengang 12 ausgeblen det.In the embodiment shown in FIG. 2, only a laser 2 is provided, the excitation light of which can have 3 different wavelengths. In each case, the excitation light 3 passes through a mirror 6 and via an additional optical element, namely via a lens 16, to an AOTF 17 , which works as a spectrally selective element. From there, the excitation light 3 arrives again via an additional optical element - in the embodiment selected here, a lens 18 - and via a mirror 8 to the laser scanner 1 . Reflected by the object 10 , the returning light - reflected excitation light 9 and detection light 11 - returns via the mirror 8 and the lens 18 into the AOTF 17 and is partially hidden there according to the wiring of the AOTF 17 . Specifically, the detection light or fluorescent light 11 is guided to the detector 15 via the detection beam path 12 (0th order). The coming back excitation light 9 , on the other hand, is guided back to the laser 2 via the lens 16 and the mirror 6 and is thus deflected out of the detection beam path 12 .

Ähnlich verhält es sich bei dem in Fig. 3 gezeigten Ausführungsbeispiel, wobei dort gleichzeitig drei Laser 2 über zusätzliche optische Elemente, hier Linsen 16, ihr An regungslicht 3 über ein AOD 19, eine weitere nachgeschaltete Linse 18 und einen Spiegel 8 in den Beleuchtungsstrahlengang 5 ein koppeln. Von dort aus gelangt das Anregungslicht 3 zum Laserscanner 1 und zum Objekt 10.The situation is similar in the exemplary embodiment shown in FIG. 3, with three lasers 2 simultaneously via additional optical elements, here lenses 16 , their excitation light 3 via an AOD 19 , a further downstream lens 18 and a mirror 8 in the illumination beam path 5 a pair. From there, the excitation light 3 reaches the laser scanner 1 and the object 10 .

Das vom Objekt kommende Licht 13 umfaßt bei dem voranstehend genannten Aus führungsbeispiel Fluoreszenzlicht 11 und zurückkommendes Anregungslicht 9, wo bei dort der AOD 19 das zurückkommende Fluoreszenzlicht als Detektionslicht 14 zu dem Detektor 15 führt. Das zurückkommende Anregungslicht 9 wird ausgeblendet und gelangt über Linsen 16 zu den jeweiligen Lasern 2.The light 13 coming from the object comprises, in the exemplary embodiment mentioned above, fluorescent light 11 and returning excitation light 9 , where the AOD 19 leads the returning fluorescent light as detection light 14 to the detector 15 . The returning excitation light 9 is faded out and reaches the respective lasers 2 via lenses 16 .

Das in Fig. 4 gezeigte Ausführungsbeispiel umfaßt als spektral selektives Element 4 ein transparentes Gitter 20, wobei über das transparente Gitter 20 gleichzeitig drei Laser 2 ihr Anregungslicht 3 in den Beleuchtungsstrahlengang 5 des Mikroskops einkoppeln. Wesentlich ist hier jedenfalls, daß das transparente Gitter 20 das vom Objekt 10 zurückkommende Anregungslicht 9 aus dem Detektionsstrahlengang aus blendet, so daß dieses Licht zurück zu den Lasern 2 gelangt. Das zu detektierende Fluoreszenzlicht 11 gelangt über den Detektionsstrahlengang 12 zum Detektor 15.The exemplary embodiment shown in FIG. 4 comprises a transparent grating 20 as the spectrally selective element 4 , three lasers 2 simultaneously coupling their excitation light 3 into the illumination beam path 5 of the microscope via the transparent grating 20 . In any case, it is essential here that the transparent grating 20 dazzles the excitation light 9 coming back from the object 10 from the detection beam path, so that this light returns to the lasers 2 . The fluorescent light 11 to be detected arrives at the detector 15 via the detection beam path 12 .

Fig. 5 zeigt die Möglichkeit einer Dispersionskorrektur, wobei das vom Objekt zu rückkommende Licht 13 in den AOTF 17 oder AOD 19 gelangt. Dort wird das zurück kommende Detektionslicht 14 - zwangsweise - spektral aufgefächert und über nachgeschaltete Elemente - AOD/AOTF - parallelisiert und schließlich konvergiert. Das spektral vereinigte Detektionslicht 14 gelangt von dort zu dem in Fig. 5 nicht gezeigten Detektor 15. Fig. 5 shows the possibility of a dispersion correction, which passes from the object to light coming back 13 in the AOTF 17 or AOD 19th There the returning detection light 14 is - forcibly - spectrally fanned out and parallelized via downstream elements - AOD / AOTF - and finally converged. From there, the spectrally combined detection light 14 reaches the detector 15 ( not shown in FIG. 5).

Bei der in Fig. 6 gezeigten Dispersionskorrektur wird das vom Objekt kommende Licht 13 mittels AOD 17/AOTF 19 aufgefächert, wobei das aufgefächerte Detekti onslicht 14 über ein weiteres passives spektral selektives Element 4 - AOTF 17 oder AOD 19 - über eine Linse 21 mit Feldkorrektur konvertiert und durch ein Detektions pinhole 22 oder durch einen Detektionsspalt zum Detektor 15 gelangt.In the dispersion correction shown in FIG. 6, the light 13 coming from the object is fanned out using AOD 17 / AOTF 19 , the fanned detection light 14 via a further passive spectrally selective element 4 - AOTF 17 or AOD 19 - via a lens 21 with field correction converted and reaches the detector 15 through a detection pinhole 22 or through a detection gap.

Gemäß der Darstellung in Fig. 7 handelt es sich bei dem spektral selektiven Element 4 um ein AOTF 17 oder ein AOD 19, wobei diese Elemente einen speziellen Kristall mit dispersionsfreier 0. Ordnung umfassen. Dieser Kristall bzw. dieses spektral se lektive Element wird über ein Piezoelement 23 angeregt bzw. beaufschlagt. Fig. 7 zeigt besonders deutlich, daß das vom Objekt kommende Licht 13 in dem AOTF 17 bzw. AOD 19 aufgespalten wird, wobei das Detektionslicht 14 als dispersionsfreies Licht 0. Ordnung ungehindert durch den Kristall läuft. Das vom Objekt zurückkom mende Anregungslicht 9 wird dagegen als Licht 1. Ordnung abgelenkt und zurück zu den hier nicht gezeigten Lasern geführt.According to the illustration in FIG. 7, the spectrally selective element 4 is an AOTF 17 or an AOD 19 , these elements comprising a special crystal with zero-order dispersion. This crystal or this spectrally selective element is excited or acted upon via a piezo element 23 . Fig. 7 shows particularly clearly that the light coming from the object 13 in the AOTF AOD is split 19 or 17, wherein the detection light 14 runs as a free dispersion 0th order light unhindered through the crystal. In contrast, the excitation light 9 coming back from the object is called light 1 . Order distracted and led back to the lasers not shown here.

Fig. 8 zeigt eine spezielle Detektion unter Ausnutzung der spektralen Auffächerung des spektral selektiven Elements 4, wobei hier im Konkreten ein AOTF 17 verwendet ist. Das vom Objekt 10 kommende Licht 13 wird im AOTF 17 spektral aufgespalten, wobei das Detektionslicht 14 über eine Linse 16 und einen Spiegel 6 zu einem Mul tibanddetektor 24 bzw. Spektrometer gelangt. Der Spiegel 6 führt zu einer Verlänge rung der Strecke, so daß eine Auffächerung des zurückkommenden Detektionslichts 14 bis hin zum Multibanddetektor 24 begünstigt wird. FIG. 8 shows a special detection using the spectral fanning out of the spectrally selective element 4 , an AOTF 17 being used here in concrete terms. The light 13 coming from the object 10 is spectrally split in the AOTF 17 , the detection light 14 passing through a lens 16 and a mirror 6 to a multi-band detector 24 or spectrometer. The mirror 6 leads to an extension of the route, so that a fanning out of the returning detection light 14 up to the multiband detector 24 is favored.

Das im AOTF 17 ausgeblendete Anregungslicht 9 gelangt über die Linse 16 und den Spiegel 8 zurück zum Laser 2.The excitation light 9 hidden in the AOTF 17 passes back to the laser 2 via the lens 16 and the mirror 8 .

Schließlich zeigt Fig. 9 in einer schematischen Darstellung das Ausführungsbeispiel aus Fig. 8, wobei dort - in Ergänzung - im Detektionsstrahlengang vor dem Multi banddetektor 24 ein variables Spaltfilter 25 angeordnet ist. Dieses Spaltfilter 25 ist im Detektionsstrahlengang 12 unmittelbar vor dem Detektor 15 angeordnet und im Detektionsstrahlengang positionierbar. Desweiteren ist der Spalt 26 des Spaltfilters 25 variabel, so daß auch insoweit eine spektrale Selektion des Detektionslichts 14 möglich ist.Finally, FIG. 9 shows a schematic illustration of the exemplary embodiment from FIG. 8, a variable gap filter 25 being arranged there in addition to the multi-band detector 24 in the detection beam path. This gap filter 25 is arranged in the detection beam path 12 directly in front of the detector 15 and can be positioned in the detection beam path. Furthermore, the slit 26 of the slit filter 25 is variable, so that a spectral selection of the detection light 14 is also possible in this respect.

Hinsichtlich weiterer Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Lehre, die den Figu ren nicht zu entnehmen sind, wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den all gemeinen Teil der Beschreibung und die dort geschilderte Funktionsweise der Lehre und der vorteilhaften Ausgestaltungen verwiesen. With regard to further refinements of the teaching according to the invention, which the Figu to avoid repetitions on the all general part of the description and the functioning of the teaching described there and the advantageous refinements.

Reference list

11

Laserscanner
Laser scanner

22nd

Laser (Lichtquelle)
Laser (light source)

33rd

Anregungslicht
Excitation light

44th

spektral selektives Element
spectrally selective element

55

Beleuchtungsstrahlengang
Illumination beam path

66

Spiegel
mirror

77

Farbstrahlteiler
Color beam splitter

88th

Spiegel
mirror

99

Anregungs- und Detektionslicht
Excitation and detection light

1010th

Objekt
object

1111

Fluoreszenzlicht (Detektionslicht)
Fluorescent light (detection light)

1212th

Detektionsstrahlengang
Detection beam path

1313

(vom Objekt kommendes) Licht
Light (coming from the object)

1414

Detektionslicht (nicht abgelenktes Detektionslicht)
Detection light (undeflected detection light)

1515

Detektor
detector

1616

Linse
lens

1717th

AOTF
AOTF

1818th

Linse
lens

1919th

AOD
AOD

2020th

transparentes Gitter
transparent grid

2121

Linse (mit Feldkorrektur)
Lens (with field correction)

2222

Detektions-Pinhole
Detection pinhole

2323

Piezoelement
Piezo element

2424th

Multibanddetektor (Spektrometer)
Multiband detector (spectrometer)

2525th

(variables) Spaltfilter
(variable) gap filter

2626

Spalt (von Gap (from

2525th

)
)

Claims

1. Optical arrangement in the beam path of a light source suitable for fluorescence excitation, preferably in the beam path of a confocal laser scanning microscope, with at least one spectrally selective element ( 4 ) for coupling the excitation light ( 3 ) at least one light source ( 2 ) into the microscope and for masking out the excitation light ( 3 ) scattered and reflected on the object ( 10 ) or the excitation wavelength from the light ( 13 ) coming from the object ( 10 ) via the detection beam path ( 12 ), characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) excitation light ( 3 , 9 ) of different wavelengths can be suppressed.

2. Optical arrangement in the beam path of a light source suitable for fluorescence excitation, preferably in the beam path of a confocal laser scanning microscope, with at least one spectrally selective element ( 4 ) for coupling the excitation light ( 3 ) at least one light source ( 2 ) into the microscope and for masking out the excitation light ( 3 ) scattered and reflected on the object ( 10 ) or the excitation wavelength from the light ( 13 ) coming from the object ( 10 ) via the detection beam path ( 12 ), characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) can be set to the excitation wavelength to be masked out.

3. Optical arrangement according to claim 1, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) is a passive component.

4. Optical arrangement according to claim 3, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) is designed as a transparent optical grating ( 20 ).

5. Optical arrangement according to claim 3, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) is designed as a holographic element.

6. Optical arrangement according to claim 3, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) as a passive AOD (Acousto-Optical Deflector) ( 19 ) or passive AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) ( 17 ) is executed .

7. Optical arrangement according to claim 1 or 2, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) is an active component.

8. Optical arrangement according to claim 7, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) works acousto-optically and / or electro-optically.

9. Optical arrangement according to claim 8, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) is designed as an AOD (Acousto-Optical Deflector) ( 19 ).

10. Optical arrangement according to claim 9, wherein a plurality of light sources with different wavelengths can be coupled in, characterized in that the AOD ( 19 ) is preferably connected simultaneously with corresponding frequencies, so that the different light beams after the passage of the AOD ( 19 ) coaxially with the optical axis of the illumination beam path ( 5 ).

11. Optical arrangement according to claim 8, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) as AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) ( 17 ) is performed.

12. Optical arrangement according to claim 11, wherein a light source with different union wavelengths can be coupled, characterized in that the AOTF ( 17 ) can be connected to corresponding frequencies simultaneously.

13. Optical arrangement according to one of claims 7 to 12, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) is constructed such that a spectral fanning of the detection light ( 11 ) is at least largely avoided.

14. Optical arrangement according to one of claims 1 to 13, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) is followed by at least one further active or spectrally selective element for power-specific control of individual wavelengths.

15. Optical arrangement according to claim 14, characterized in that the further spectrally selective element is an AOD ( 19 ).

16. Optical arrangement according to claim 14, characterized in that the further spectrally selective element is an AOTF ( 17 ).

17. Optical arrangement according to one of claims 7 to 16, wherein the spectrally selective element ( 4 ) comprises a control unit, characterized in that the setting / control of the excitation wavelength is forcibly coupled to the control unit, so that only this excitation wavelength is preferably coaxial in the illumination beam path ( 5 ) the microscope can be coupled in and only this wavelength can be masked out of the detection beam path ( 12 ).

18. Optical arrangement according to one of claims 1 to 17, characterized in that the control of the light source ( 2 ) with the spectrally selective element ( 4 ) is carried out manually or automatically.

19. Optical arrangement according to claim 18, characterized in that the control of the light source ( 2 ) with the spectrally selective element ( 4 ) is carried out according to a freely definable regulation.

20. Optical arrangement according to one of claims 1 to 19, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) is connected upstream and / or downstream of at least one further optical element.

21. Optical arrangement according to claim 20, characterized in that one in the illuminating beam path ( 5 ) the spectrally selective element ( 4 ) switched nachge activated holographic element serves as a beam scanner.

22. Optical arrangement according to claim 21, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) and the downstream holographic element are combined to form a functional component.

23. Optical arrangement according to claim 20, characterized in that the further optical element is a beam matching means or a means for compensating for the spectral spreading caused by the spectrally selective element ( 4 ).

24. Optical arrangement according to claim 23, characterized in that the beam adjustment means is designed as a lens ( 16 ).

25. Optical arrangement according to claim 23, characterized in that the Beam adjustment means is designed as a prism.

26. Optical arrangement according to claim 23, characterized in that the Beam adjustment means as an aperture, preferably as an aperture or slot aperture, is executed.

27. Optical arrangement according to claim 23, characterized in that the Beam adjustment means as a filter, preferably as a blocking filter.

28. Optical arrangement according to claim 27, characterized in that the filter is arranged directly in front of the detector ( 15 ).

29. Optical arrangement according to claim 23, characterized in that the Beam adjustment means is designed as a focusing means.

30. Optical arrangement according to one of claims 20 to 29, characterized records that as a further optical element, a color beam splitter for further spectral decomposition is provided.

31. Optical arrangement according to one of claims 20 to 30, characterized in that at least one AOTF ( 17 ) is provided as a further optical element.

32. Optical arrangement according to claim 31, characterized in that the AOTF ( 17 ) can be used as a passive element.

33. Optical arrangement according to one of claims 20 to 32, characterized records that combinations of other optical elements are provided.

34. Optical arrangement according to one of claims 1 to 33, characterized in that in the detection beam path ( 12 ) means for multiple reflection are arranged which bring about an angular increase in the fanning out of the detection beam.

35. Optical arrangement according to one of claims 1 to 34, characterized in that a gap filter ( 25 ) is arranged in the detection beam path ( 12 ), preferably immediately before the detector ( 15 ).

36. Optical arrangement according to claim 35, characterized in that the gap filter ( 25 ) in the detection beam path ( 12 ) can be positioned.

37. Optical arrangement according to claim 35 or 36, characterized in that the gap ( 26 ) of the gap filter ( 25 ) is variable.

38. Optical arrangement according to one of claims 1 to 37, characterized in that in the detection beam path ( 12 ) after the spectrally selective element ( 4 ) a spectrometer for detecting the spectral fanning is arranged.

39. Optical arrangement according to claim 37, characterized in that the spectrometer is designed as a multi-band detector ( 24 ).

40. Optical arrangement according to one of claims 1 to 39, characterized in that the masked excitation wavelengths are deflected in the direction of the light sources ( 2 ) from the detection beam path ( 12 ).

41. Optical arrangement according to one of claims 1 to 40, characterized in that the light source ( 2 ) is designed as a white light source.

42. Optical arrangement according to one of claims 1 to 40, characterized in that the light source ( 2 ) is designed as an optically parameterized oscillator (OPO).

43. Optical arrangement according to one of claims 1 to 40, characterized in that the light source ( 2 ) leads out as an electron beam collision light source.

44. Optical arrangement according to one of claims 1 to 40, characterized in that the light source ( 2 ) is designed as a laser light source.

45. Optical arrangement according to claim 44, characterized in that the La serlichtquelle is variably tunable in the wavelength.

46. Optical arrangement according to claim 44 or 45, characterized in that the laser light source comprises a laser with different wavelengths.

47. Optical arrangement according to claim 44, characterized in that the light source comprises a plurality of lasers ( 2 ) with different wavelengths.

48. Optical arrangement according to one of claims 44 to 47, characterized in that the laser ( 2 ) is designed as a dye laser.