DE19930253A1

DE19930253A1 - Chamber for two-dimensional electrophoresis using stacked horizontal includes at least two guide members for inserting an isolating element for temporarily separating two gels

Info

Publication number: DE19930253A1
Application number: DE1999130253
Authority: DE
Inventors: Brigitte Wittmann-Liebold; Christian Scheler; Christian Wurzel; Andreas Reuter
Original assignee: Wita Wittmann Inst Of Tec GmbH
Current assignee: WITA PROTEOMICS AG, 14513 TELTOW, DE
Priority date: 1999-06-25
Filing date: 1999-06-25
Publication date: 2000-12-28

Abstract

Combination chamber for two-dimensional electrophoresis using stacked horizontal gels comprises a back plate and a cover plate between which are located at least two guide members for inserting an isolating element. Independent claims are also included for the following: (1) a process for performing two-dimensional electrophoresis in a combination chamber, comprising: (a) arranging an isoelectric focussing (IEF) gel horizontally in the chamber and rehydrating the gel with buffer; (b) loading the IEF gel with a sample and performing electrophoresis in the first dimension; (c) introducing a sodium dodecyl sulfate (SDS) gel into the chamber so that its is horizontally isolated from the IEF gel, and polymerizing the SDS gel; and (d) when IEF electrophoresis is complete, removing the isolation, introducing a contact gel into the resulting space, adding a buffer solution, performing SDS electrophoresis in the second dimension, and developing and staining the gels; (2) a process for performing one-dimensional electrophoresis, comprising inserting a comb into an SDS gel, polymerizing the gel, removing the comb, introducing samples into the resulting wells, and performing one-dimensional electrophoresis; (3) a hydrated IEF gel produced by: casting and polymerizing a low-pK immobilin gel on a film; casting and polymerizing an acrylamide gel on the immobilin gel; casting and polymerizing a high-pK immobilin gel on the acrylamide gel; and rehydrating the IEF gel with a buffer containing 1-4% of ampholines (not defined) providing a pH of 2-11; and (4) a dry gel produced by: (a) casting and polymerizing a low-pK immobilin gel on a film; (b) casting and polymerizing an acrylamide gel on the immobilin gel; and (c) casting and polymerizing a high-pK immobilin gel on the acrylamide gel.

Description

Die Erfindung betrifft eine Kombinationskammer und Verfahren zur Trennung von Biomolekülen oder anderen Stoffgemischen und ist anwendbar insbesondere bei der ein- oder zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen in Gelen durch Elektrophorese in einer Elektrophoreseapparatur, beispielsweise der Auftrennung von Proteinen, Glycoproteinen, Lipoproteinen, Nukleinsäuren oder Zellkomplexen in Gelen.The invention relates to a combination chamber and Methods of separating biomolecules or others Mixtures of substances and is particularly applicable to one or two-dimensional separation of biomolecules in gels by electrophoresis in one Electrophoresis equipment, for example separation of proteins, glycoproteins, lipoproteins, Nucleic acids or cell complexes in gels.

Aus der DE 198 31 210 ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zur zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen in Gelen durch Elektrophorese in einer Elektrophoreseapparatur bekannt, welche insbesondere der Auftrennung von beispielsweise Proteinen, Glycoproteinen, Lipoproteinen, Nukleinsäuren oder Zellkomplexen dienen. Die dort beschriebene Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, daß eine Elektrophorese- Kombikammer einen Kern mit Kühlelementen aufweist, wobei die Kühlelemente unter den beidseitig des Kerns durch innere Platten und äußere Platten im Zusammenwirken mit entfernbaren oder schaltbaren Isolierelementen gebildeten Gelkammern und Puffergefäßen angeordnet sind.DE 198 31 210 describes one method and one Device for two-dimensional separation of Biomolecules in gels by electrophoresis in one Electrophoresis apparatus known, which in particular the separation of proteins, for example, Glycoproteins, lipoproteins, nucleic acids or Serve cell complexes. The device described there is characterized in that an electrophoresis Combination chamber has a core with cooling elements, with the cooling elements under the both sides of the core through inner plates and outer plates in the Interact with removable or switchable Isolation elements formed gel chambers and Buffer vessels are arranged.

Das Verfahren basiert darauf, daß in der Elektrophorese-Kombikammer senkrecht nebeneinander angeordnete Gele bearbeitet werden. The process is based on the fact that Electrophoresis combination chamber vertically next to each other arranged gels can be processed.

Eine Behandlung von waagerecht übereinander angeordneten Gelen ist mit der beschriebenen Lösung nicht möglich.A treatment of horizontally one above the other arranged gels is with the solution described not possible.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Kombinationskammer und ein Verfahren zur Trennung von Biomolekülen zu schaffen, mit welchen mit einfachen Mitteln in einer einzigen Apparatur mit selbstgegossenen Gelen und/oder getrockneten Fertig gelen effektive Gelelektrophoresen der ersten und zwei ten Dimension vollautomatisch durchgeführt werden können. Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung, spezifische Fertiggele anzugeben.The invention has for its object a Combination chamber and a method for separating To create biomolecules with which with simple Averaging in a single apparatus self-cast gels and / or dried ready effective gel electrophoresis of the first and two th dimension can be carried out fully automatically can. It is a further object of the invention specify specific pre-filled gels.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Merkmale in den Ansprüchen 1, 10, 19 und 20.This object is achieved by the Features in claims 1, 10, 19 and 20.

Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen enthalten.Advantageous embodiments of the invention are in the Subclaims included.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß eine Vollautomatisierung der gesamten 2DE einfach durchgeführt werden kann, indem die Gele für die Trennung in der ersten Dimension und die Gele für die Trennung in der zweiten Dimension waagerecht zueinander, also übereinander angeordnet werden.A particular advantage of the invention is that full automation of the entire 2DE is easy can be done by using the gels for the Separation in the first dimension and the gels for that Separation in the second dimension horizontally to each other, so to be arranged one above the other

Diese waagerechte Anordnung wird dadurch ermöglicht, daß die Isolierelemente zwischen den Gelen der ersten Dimension und den Gelen der zweiten Dimension ebenfalls in einem definierten Bereich waagerecht verlaufen, gleichwohl jedoch über Umlenkelemente zur Führung nach obenhin aus der Kombinationskammer herausgezogen werden können. This horizontal arrangement is made possible by that the insulating elements between the gels of the first Dimension and the gels of the second dimension also run horizontally in a defined area, nevertheless, however, via deflection elements for guidance be pulled out of the combination chamber can.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß mit der gleichen Kombinationskammer auch die ein- dimensionale Trennung durchgeführt werden kann, indem anstelle des Gels für die Trennung in der ersten Dimension sowie des Isolierelementes ein Kamm mit Probentaschen für verschiedene Proben in das SDS-Gel eingesetzt und dieses auspolymerisiert wird, der Kamm nach dem Auspolymerisieren entfernt, die Proben in die entstandenen Aussparungen eingebracht und nachfolgend die ein-dimensionale Elektrophorese durchgeführt wird.Another advantage of the invention is that with the same combination chamber also the dimensional separation can be done by instead of the gel for the separation in the first Dimension and the insulating element with a comb Sample bags for various samples in the SDS gel used and this is polymerized, the comb After polymerizing, the samples are removed into the created cutouts and subsequently the one-dimensional electrophoresis is performed.

Hierzu wird auf den Einsatz des Isolierelementes verzichtet und statt dessen ein Kamm mit Probentaschen beim Auspolymerisieren des SDS-Geles mit eingesetzt, der nach Auspolymerisierung des Geles herausgenommen wird, so daß nunmehr multiple Ports für das Auftragen verschiedener Proben im Gel enthalten sind. Diese können alle parallel zueinander in der ein- dimensionalen Elektrophorese getrennt werden. Die Konstruktion der Kombinationskammer bleibt also erhalten und es können sowohl ein-dimensionale wie zwei-dimensionale Gele im gleichen Kammersystem durchgeführt werden. Vorteilhaft ist auch, daß lange Laufstrecken, z. B. 32 cm lange ein-dimensionale Gele, durchgeführt werden können.For this purpose, the use of the insulating element dispenses with and instead a comb with sample bags used when polymerizing the SDS gel, which is removed after the gel has polymerized is, so that now multiple ports for the application different samples are contained in the gel. These can all be parallel to each other in the dimensional electrophoresis are separated. The The construction of the combination chamber remains get and it can be both one-dimensional like two-dimensional gels in the same chamber system be performed. It is also advantageous that long Running routes, e.g. B. 32 cm long one-dimensional gels, can be carried out.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Es zeigen die Fig. 1 bis 5:
eine Prinzipdarstellung der Kombinationskammer in den einzelnen Komplettierungsstufen.The invention will be explained in more detail below with reference to exemplary embodiments shown in the figures. In the drawings figures 1 to. 5:
a schematic diagram of the combination chamber in the individual completion stages.

Die Kombinationskammer besteht aus zwei Teilen, die übereinander angeordnet sind, dem oberen IEF-Teil für die Durchführung der IEF-Elektrophorese in der ersten Dimension und dem unteren Teil für die Durchführung der SDS-Elektrophorese in der zweiten Dimension.The combination chamber consists of two parts, the are arranged one above the other, the upper IEF part for performing IEF electrophoresis in the first Dimension and the lower part for carrying out the SDS electrophoresis in the second dimension.

Die Kombinationskammer besteht aus mehreren Bestandteilen, die beispielsweise durch Verschraubung oder Klemmen zusammengesetzt werden. Die Rückwandplatte 28A bildet mit dem oberen Pufferreservoir 29 der zweiten Dimension sowie den Gießgefäßen 30 zum Gießen der zweiten Dimension, dem Puffergefäß 31 zum Einfüllen des Puffers der zweiten Dimension eine Einheit. Die als Glasplatte ausgebildete Deckplatte 28B wird mit der Rückwandplatte 28A und dem oberen Pufferreservoir 29 z. B. durch Verschraubung verbunden. Flache Dichtungen 23 rechts und links dichten nach außen ab und legen die Dicke der Gele zwischen den Platten 28A und 28B fest. Die Platte 28B hat eine Höhe, die sich aus der Höhe der Platte 28A und der Höhe des oberen Pufferreservoirs 29 ergibt. Die Platten 28A, 28B können transparent sein. Insbesondere die obere Deckplatte 28B sollte durchsichtig sein, um die einzelnen Verfahrensschritte beobachten zu können.The combination chamber consists of several components that are assembled, for example, by screwing or clamping. The rear wall plate 28 A forms a unit with the upper buffer reservoir 29 of the second dimension and the casting vessels 30 for casting the second dimension, the buffer vessel 31 for filling the buffer of the second dimension. The formed as a glass plate, cover plate 28 is B z with the rear wall plate 28 A and the upper buffer reservoir 29th B. connected by screw. Flat seals 23 on the right and left seal outwards and define the thickness of the gels between the plates 28 A and 28 B. The plate 28 B has a height that results from the height of the plate 28 A and the height of the upper buffer reservoir 29 . The plates 28 A, 28 B can be transparent. In particular, the top cover plate 28 B should be transparent so that the individual process steps can be observed.

Zwischen den Umlenkelementen 22 befindet sich U-förmig ein im vorliegenden Ausführungsbeispiel als Schlauchdichtung ausgebildetes Isolierelement 24, daß das Gel 25 der ersten Dimension vom Gel 36 der zweiten Dimension trennt. Neben den Umlenkelementen 22 befinden sich die Elektroden 26 und 27 für die Elektrophorese der ersten Dimension.Between the deflecting elements 22 there is an U-shaped insulating element 24 , designed as a hose seal in the present exemplary embodiment, which separates the gel 25 of the first dimension from the gel 36 of the second dimension. In addition to the deflection elements 22, there are the electrodes 26 and 27 for the electrophoresis of the first dimension.

Die zusammengesetzte Konstruktion aus den Platten 28A, 28B und den oberen Reservoirs wird in den unteren Puffertank 32 der zweiten Dimension gestellt. Dort befindet sich eine Dichtung 33, die z. B. pneumatisch angehoben werden kann (Zustand 33a), um den Leerraum zwischen den Platten 28A und 28B nach unten abzudichten, damit das Gel 36 der zweiten Dimension über eine Verbindung (z. B. einen Schlauch) aus dem Gießgefäß 30 gegossen werden kann. Das Pufferfüllgefäß 31 dient dem Füllen des unteren Puffertanks 32. In dem Puffergefäß 29 und dem Puffertank 32 befinden sich die Elektroden 38 und 39 der zweiten Dimension.The composite construction of the plates 28 A, 28 B and the upper reservoirs is placed in the lower buffer tank 32 of the second dimension. There is a seal 33 which, for. B. can be lifted pneumatically (state 33 a) to seal the empty space between the plates 28 A and 28 B down so that the gel 36 of the second dimension is poured out of the casting vessel 30 via a connection (for example a hose) can be. The buffer filling vessel 31 serves to fill the lower buffer tank 32 . The electrodes 38 and 39 of the second dimension are located in the buffer vessel 29 and the buffer tank 32 .

Nachfolgend soll das Zusammensetzen der Kombinationskammer beschrieben werden.The assembly of the Combination chamber are described.

Zur Vorbereitung der 2DE werden auf eine Glasplatte 28B, aus der zwei Umlenkelemente 22, z. B. Bolzen, herausragen, rechts und links jeweils Flachdichtungen 23 als Spacer aus Kunststoff gelegt (vgl. Fig. 1). Die Bereiche der ersten und zweiten Dimension sind lediglich durch ein Isolierelement 24, hier einen dehnbaren Kunststoffschlauch voneinander getrennt, der U-förmig zwischen den zwei Umlenkelementen 22 so angeordnet ist, daß sich eine gerade Abgrenzung nach unten ergibt. Er ragt an beiden Enden der oberen Kammer heraus und läßt sich leicht herausziehen. Zwischen den Umlenkelementen 22 wird im vorliegenden Ausführungsbeispiel ein IEF-Fertiggelstreifen 25 positioniert (weiße waagerechte Fläche) und in direkten Kontakt mit den beiden Elektroden 26, 27 gebracht, die bei den Umlenkelementen 22 durch die Glasplatte 28B ragen und die Elektrophorese in der ersten Dimension ermöglichen. Dann wird die obere Glasplatte 28B aufgelegt (Fig. 2) und im vorliegenden Ausführungsbeispiel mittels Klammern mit der unteren Rückwandplatte 28A und dem oberen Pufferreservoirs 29 zusammengehalten. Das Glasplattensandwich wird darauf in den Puffertank 32 gestellt (Fig. 3). Das Gießgefäß 30 dient zum Gießen des SDS-PAGE-Geles und das Reservoir 29 und der Puffertank 32 als Pufferreservoir für die SDS-PAGE, wobei der Puffertank 32 über eine Verbindungsleitung aus Pufferfüllgefäß 31 gefüllt wird.To prepare the 2DE are on a glass plate 28 B, from which two deflecting elements 22 , z. B. bolts, protrude, right and left each flat seals 23 placed as a spacer made of plastic (see. Fig. 1). The areas of the first and second dimensions are only separated from one another by an insulating element 24 , here an expandable plastic tube, which is arranged in a U-shape between the two deflecting elements 22 in such a way that there is a straight delimitation downwards. It protrudes from both ends of the upper chamber and is easy to pull out. In the present exemplary embodiment, an IEF finished gel strip 25 is positioned between the deflecting elements 22 (white horizontal surface) and brought into direct contact with the two electrodes 26 , 27 , which protrude through the glass plate 28 B in the deflecting elements 22 and electrophoresis in the first dimension enable. Then the upper glass plate 28 B is placed ( FIG. 2) and held together in the present exemplary embodiment by means of clips with the lower rear wall plate 28 A and the upper buffer reservoirs 29 . The glass plate sandwich is then placed in the buffer tank 32 ( Fig. 3). The pouring vessel 30 serves for pouring the SDS-PAGE gel and the reservoir 29 and the buffer tank 32 as a buffer reservoir for the SDS-PAGE, the buffer tank 32 being filled from a buffer filling vessel 31 via a connecting line.

Im Puffertank 32 befindet sich eine Dichtung 33, die beim Abdichten den Schlitz zwischen den beiden Glasscheiben 28A, 28B an der Unterseite verschließen kann. In Fig. 3 ist sie im nicht-abdichtenden Zustand dargestellt.In the buffer tank 32 there is a seal 33 which, when sealing, can close the slot between the two glass panes 28 A, 28 B on the underside. In Fig. 3 it is shown in the non-sealing state.

Die Vorbereitung und Durchführung der Elektrophorese verläuft im vorliegenden Ausführungsbeispiel wie folgt:The preparation and implementation of electrophoresis proceeds in the present exemplary embodiment as follows:

Das IEF-Gel 25 wird zur Rehydratisierung mit Rehydratisierungspuffer zwischen den Glasplatten 28A, 28B im Raum 34 überschichtet und rehydratisiert. Nach der Rehydratisierung (<2 h) wird der überschüssige Puffer entfernt. Dann wird die Probe in eine Aussparung 35 eingebracht, deren Platz durch Einbringung eines Spacer-Einsatzes während der Rehydratisierung ausgespart blieb. Dann wird die Elektrophorese durch Anlegen einer Spannung zwischen den Elektroden 26, 27 durchgeführt. Nach der Durchführung der IEF- Elektrophorese wird das IEF-Gel 25 durch Zusatz von Reequilibrierungspuffer, der in Raum 34 eingebracht wird, umgepuffert (30 min. bei pH 6,9).For rehydration, the IEF gel 25 is overlaid with rehydration buffer between the glass plates 28 A, 28 B in room 34 and rehydrated. After rehydration (<2 h) the excess buffer is removed. The sample is then introduced into a recess 35 , the space of which was saved by introducing a spacer insert during the rehydration. Then electrophoresis is carried out by applying a voltage between the electrodes 26 , 27 . After the IEF electrophoresis has been carried out, the IEF gel 25 is re-buffered (30 min. At pH 6.9) by adding re-equilibration buffer which is introduced into room 34 .

Das SDS-Gel 36 für die zweite Dimension wird vor, nach oder während der Durchführung der ersten Dimension gegossen, indem die Gellösung über das Gießgefäß 30 eingefüllt wird und durch eine Leitung nach unten zwischen die Glasplatten 28A, 28B geleitet wird (Fig. 4). In diesem Zustand dichtet die Dichtung 33A das Glasplatten-Sandwich nach unten ab, so daß die Gellösung nicht auslaufen kann. Das Gel 36 wird zwischen den Glasplatten 28A, 28H für mindestens zwei Stunden polymerisiert. Danach wird die Abdichtung durch die Dichtung 33A wieder aufgehoben und es resultiert die Dichtung 33.The SDS gel 36 for the second dimension is poured before, after or during the implementation of the first dimension by pouring the gel solution into the pouring vessel 30 and passing it down through a line between the glass plates 28 A, 28 B ( FIG. 4). In this state, the seal 33 A seals the glass plate sandwich downwards, so that the gel solution cannot leak. The gel 36 is polymerized between the glass plates 28 A, 28 H for at least two hours. Then the seal is released by the seal 33 A and the seal 33 results.

Nach Beendigung der IEF-Elektrophorese und erfolgter Umpufferung des Gelstreifens 25 wird der Reequilibrierungspuffer aus dem Raum 34 entfernt, der Kunststoffschlauch 24 aus der Apparatur seitlich nach oben z. B. mit einem Schrittmotor herausgezogen und der entstehende Zwischenraum 37 zwischen erster und zweiter Dimension mit Kontaktgel (z. B. Agarose-Sammelgel) befüllt (Fig. 5). Dann wird Puffer in das Pufferreservoir 29 und den Puffertank 32 eingefüllt und über ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden 38, 39 der zweiten Dimension in den mit Puffer gefüllten Puffergefäßen 29, 32 die SDS-Elektrophorese in der zweiten Dimension durchgeführt. Nach Ende der Elektrophorese wird das Platten-Sandwich herausgenommen, das Gel abgehoben und nach bekannten Methoden entwickelt, z. B. mit Silbernitratlösung oder Coomassielösung angefärbt.After the end of the IEF electrophoresis and the buffering of the gel strip 25 , the reequilibration buffer is removed from the space 34 , and the plastic tube 24 is removed laterally from the apparatus, e.g. B. pulled out with a stepper motor and the resulting space 37 between the first and second dimensions filled with contact gel (z. B. agarose stacking gel) ( Fig. 5). Then, the buffer in the buffer reservoir 29 and the buffer tank is filled 32 and via an electric field between the electrodes 38, 39 of the second dimension in the filled buffer buffer vessels 29, 32 the SDS gel electrophoresis performed in the second dimension. At the end of the electrophoresis, the plate sandwich is removed, the gel is lifted off and developed according to known methods, e.g. B. stained with silver nitrate solution or Coomassie solution.

Die Kühlung beider Elektrophorese-Dimensionen erfolgt durch Eintauchen der Gelsandwiche in thermostatisierte Pufferlösung der zweiten Dimension, die sich in dem Puffertank 32 befindet, oder es werden die Kammersandwiche durch an die Glasplatten 28A, 28B angelegte Kühlkammern gekühlt.Both electrophoresis dimensions are cooled by immersing the gel sandwiches in thermostated buffer solution of the second dimension, which is located in the buffer tank 32 , or the chamber sandwiches are cooled by cooling chambers applied to the glass plates 28 A, 28 B.

Eine andere vorteilhafte Ausführung des Isolierelementes 24 besteht darin, daß es sich um einen Schlauch handelt, welcher zur Erhöhung der Abdichtungseigenschaften zwischen den beiden Gelen mittels eines Fluides aufgepumpt werden kann und um die Entfernung des Schlauches nach der Durchführung der ersten Dimension zu erleichtern evakuiert werden kann. Eine weitere vorteilhafte Ausführung besteht darin, daß ein dünnwandiger Schlauch als Isolierelement verwendet wird. Der Schlauch kann in einer Rille in den Platten 28A und/oder 28B geführt sein und wird nach der Durchführung der ersten Dimension evakuiert und verbleibt aber in der Kombinationskammer. Der durch die Evakuierung freiwerdende Raum zwischen den beiden Gelen wird mit einem Kontaktgel befüllt. Der sonstige Ablauf der zwei-dimensionalen Elektrophorese verläuft analog dem beschriebenen.Another advantageous embodiment of the insulating element 24 is that it is a tube which can be inflated by means of a fluid to increase the sealing properties between the two gels and can be evacuated to facilitate removal of the tube after the first dimension has been carried out . Another advantageous embodiment is that a thin-walled hose is used as an insulating element. The hose can be guided in a groove in the plates 28 A and / or 28 B and is evacuated after the first dimension has been carried out and remains in the combination chamber. The space between the two gels that is evacuated is filled with a contact gel. The other course of the two-dimensional electrophoresis is analogous to that described.

Gegenstand der Erfindung sind auch neue IEF-Gele (isoelektrische Fokussierungsgele) gemäß der Ansprüche 20 bis 25, die einen hervorragenden Trenneffekt für Biomoleküle bieten, insbesondere für Proteine, und einen erweiterten Auftrennungsbereich auf der sauren und basischen Trennseite. Nachfolgend werden ausgewählte Rezepte von Gelen dokumentiert.The invention also relates to new IEF gels (Isoelectric focusing gels) according to the claims 20 to 25, which is an excellent separation effect for Biomolecules offer, especially for proteins, and an expanded separation area on the acid and basic separating side. Be below selected recipes of gels documented.

Standard recipes Ready-made ampholine gels (hydrated gel)

3.5-4% Acrylamidgel mit 9 M Harnstoff mit minimal 2% Ampholinen (WITA Ampholyte), pH-Bereich pH 2.0 bis 11.0 (mit oder ohne Zusatz von Detergenzien und Thioharnstoff).3.5-4% acrylamide gel with 9 M urea with a minimum of 2% Ampholines (WITA ampholytes), pH range pH 2.0 to 11.0 (with or without the addition of detergents and Thiourea).

Ampholin Immobilon Ready Gels (hydrated gel)

3.5-4% Acrylamidgel mit 9 M Urea mit minimal 2% Ampholinen (WITA Ampholyte), pH-Bereich pH 2.0 bis 11.0 (mit oder ohne Zusatz von Detergenzien und Thioharnstoff)
seitliche Immobilingele: 10% Acrylamidgel unter Zusatz von 50 mM bis 100 mM Immobilinen.3.5-4% acrylamide gel with 9 M urea with a minimum of 2% ampholines (WITA ampholytes), pH range pH 2.0 to 11.0 (with or without the addition of detergents and thiourea)
lateral immobilization gels: 10% acrylamide gel with the addition of 50 mM to 100 mM immobilines.

SDS gel, 2nd dimension

SDS-PAGE mit 15% Acrylamid, 0,1% SDS, Tris/HCl-Puffer, pH 8,8. SDS-PAGE with 15% acrylamide, 0.1% SDS, Tris / HCl buffer, pH 8.8.

Rehydration buffer

9 M Harnstoff, 2-4% Ampholine, pH Bereich 2-11 (mit oder ohne Zusatz von Detergenzien und Thioharnstoff).9 M urea, 2-4% ampholines, pH range 2-11 (with or without the addition of detergents and thiourea).

Re-equilibration buffer

3% SDS, 70 mM DTT, Tris/Phosphat, pH 6,8.3% SDS, 70mM DTT, Tris / Phosphate, pH 6.8.

Agarose stacking gel

0,1% SDS, 1% Agarose, Tris/Phosphat, pH 6,8.0.1% SDS, 1% agarose, tris / phosphate, pH 6.8.

Electrophoresis buffer 1st dimension

Puffer A: 4% (v/v) Phosphorsäure
Puffer B: 5% (v/v) Ethylendiamin.Buffer A: 4% (v / v) phosphoric acid
Buffer B: 5% (v / v) ethylenediamine.

Electrophoresis buffer 2nd dimension

SDS-Laufpuffer: 192 mM Glycin, 25 mM Tris-Base, 0,1% SDS.SDS running buffer: 192 mM glycine, 25 mM Tris base, 0.1% SDS.

Running conditions 1st dimension

1 h1 h 100 V100 V 1 h1 h 200 V200 V 17,5 h17.5 h 400 V400 V. 1 h1 h 600 V600 V 0.5 h0.5 h 800 V800 V. 10 min10 min 1500 V1500 V 5 min5 min 2000 V2000 V.

2nd dimension

30 min30 min 40 mM40 mM 6 h6 h 80 mM80 mM

Die Erfindung ist nicht beschränkt auf die hier darge stellten Ausführungsbeispiele. Vielmehr ist es möglich, durch Kombination und Modifikation der genannten Mittel und Merkmale weitere Ausführungsvarianten zu realisie ren, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. The invention is not limited to the Darge here presented embodiments. Rather, it is possible by combining and modifying the means mentioned and features to realize other design variants ren without departing from the scope of the invention.

Reference symbol list

2222

Umlenkelement
Deflecting element

2323

Dichtung
poetry

2424th

Isolierelemente
Insulating elements

2525th

Gel der ersten Dimension
First dimension gel

2626

Elektrode der ersten Dimension
First dimension electrode

2727th

Elektrode der ersten Dimension
First dimension electrode

2828

A Rückwandplatte
A back panel

2828

B Deckplatte
B cover plate

2929

oberes Pufferreservoir der zweiten Dimension
upper buffer reservoir of the second dimension

3030th

Gießgefäß der zweiten Dimension
Watering vessel of the second dimension

3131

Pufferfüllgefäß
der zweiten Dimension
Buffer filling vessel
the second dimension

3232

unterer Puffertank der zweiten Dimension
second dimension lower buffer tank

3333

Dichtung (kann z. B. pneumatisch angehoben werden)
Seal (can be lifted pneumatically, for example)

3333

A Dichtung (ist z. B. pneumatisch angehoben)
A seal (e.g. pneumatically raised)

3434

Raum zwischen Platten (Space between plates (

2828

A, A,

2828

B) über der Schlauch (B) over the hose (

2424th

), der zur Rehydratisierung und Umpufferung des Gels der ersten Dimension mit Puffer gefüllt wird
), which is filled with buffer to rehydrate and re-buffer the gel of the first dimension

3535

Aussparung im Gel der ersten Dimension für Probenauftrag
Gap in the first dimension for sample application

3636

Gel der zweiten Dimension
Second dimension gel

3737

Zwischenraum zwischen Platten (Space between plates (

2828

A, A,

2828

B), der mit Kontaktgel gefüllt wird
B), which is filled with contact gel

3838

Elektrode im oberen Puffergefäß für Elektrophorese der zweiten Dimension
Electrode in the upper buffer vessel for second dimension electrophoresis

3838

Elektrode im unteren Puffergefäß für Elektrophorese der zweiten Dimension
Electrode in the lower buffer vessel for second dimension electrophoresis

Claims

1. Combination chamber for two-dimensional separation of biomolecules or other substance mixtures in horizontally stacked gels by electrophoresis with a rear wall plate (28 A) and a cover plate (28 B), whereby between the rear wall plate (28 A) and cover plate (28 B) at least two deflection elements ( 22 ) are arranged for guiding insulating elements ( 24 ).

2. Combination chamber according to claim 1, characterized in that the chamber arrangement consists of an upper IEF part for carrying out IEF electrophoresis in the first dimension and a lower part for carrying out SDS electrophoresis in the second dimension and the gels ( 25 ) and ( 36 ) are arranged horizontally one above the other.

3. Combination chamber according to claim 1, characterized in that the plates ( 28 A, 28 B) are sealed to the outside by seals ( 23 ) and the design of the seals ( 23 ) determines the thickness of the gels ( 25 , 36 ).

4. Combination chamber according to claim 1, characterized in that in addition to the deflecting elements ( 22 ) electrodes ( 26 , 27 ) for the electrophoresis of the first dimension are embedded.

5. Combination chamber according to claim 1, characterized in that the plate ( 28 A) consists of ceramic or glass and the plate ( 28 B) is a transparent plate.

6. Combination chamber according to claim 1, characterized in that the rear wall plate ( 28 A) with the upper buffer reservoir ( 29 ) of the second dimension and the casting vessel ( 30 ) and the buffer filling vessel ( 31 ) forms a unit.

7. Combination chamber according to claim 1, characterized in that the composite construction of the plates ( 28 A, 28 B) and the upper buffer reservoir ( 29 ), the casting vessel ( 30 ) and the buffer filling vessel ( 31 ) in the lower buffer tank ( 32 ) is arranged arranged.

8. Combination chamber according to claim 7, characterized in that a seal ( 33 ) is arranged which is designed to be raised.

9. Combination chamber according to claim 7, characterized in that in the upper buffer reservoir ( 29 ) and in the lower buffer tank ( 32 ) electrodes ( 38 , 39 ) for the electrophoresis of the second dimension are arranged.

10. Process for the two-dimensional separation of biomolecules or other substance mixtures in gels or polymer carriers by electrophoresis in an electrophoresis combination chamber, wherein

an IEF gel is arranged horizontally in the combination chamber and overlaid with rehydration buffer for rehydration,
- subsequently a biomolecule or mixture of substances is introduced onto the IEF gel or attached to the IEF gel and the electrophoresis of the first dimension is carried out,
before, after or during the implementation of the first dimension, an SDS gel for carrying out the second dimension is introduced horizontally to the IEF gel and insulated therefrom into the combination chamber and the SDS gel is polymerized,
- After the end of the IEF electrophoresis, the insulation is removed, contact gel is introduced into the resulting spaces, buffer solution is added and the SDS electrophoresis is carried out in the second dimension and the gels are then developed and stained according to known methods.

11. The method according to claim 10, characterized in that after rehydration of the IEF gel excess buffer solution is removed.

12. The method according to claim 10, characterized in that the recess in the IEF gel by inserting a Spacer insert during rehydration is produced.

13. The method according to claim 10, characterized in that add the IEF gel after electrophoresis is re-buffered by re-equilibration buffer.

14. The method according to claim 10, characterized in that the insulation by removing one Plastic hose by pulling out with a stepper motor is canceled.

15. The method according to claim 10, characterized in that the isolation by evacuating one Plastic hose is lifted, the Plastic tube optionally then removed is or remains in the combination chamber.

16. The method according to claim 10, characterized in that the cooling of both electrophoresis dimensions Immersing the gel sandwiches in thermostatted Buffer solution of the second dimension takes place.

17. The method according to claim 10, characterized in that the cooling of both electrophoresis dimensions cooling chambers arranged in the combination chamber is realized.

18. The method according to claim 10, characterized in that the biomolecule or mixture of substances into one Recess is made in the IEF gel.

19. Process for the one-dimensional separation of biomolecules or other substance mixtures by electrophoresis, characterized in that

- Instead of the gel for the separation in the first dimension and the insulating element, a comb with sample pockets for different samples is inserted into the SDS gel and the latter is polymerized,
- the comb is removed after polymerisation,
- the samples are placed in the resulting recesses and
- The one-dimensional electrophoresis is then carried out.

20. Hydrated IEF gel made by pouring of a low pK immobilin gel on one Gel polymerization film and its polymerization, Pour an acrylamide gel on the immobilin gel and its polymerization, casting one Immobilin gels with high pK on the acrylamide gel and its polymerization and subsequent Rehydrate using a rehydration buffers containing 1-4% of such ampholines which have a pH range within 2-11 enable.

21. IEF gel according to claim 20, characterized in that the immobilin gels from 6-10%, preferably 10%, Acrylamide with the addition of 50-200 mM, preferably 50-100 mM immobilin are made.

22. IEF gel according to claim 20, characterized in that the acrylamide gel from 3.5-4.5%, preferably 3.5-4%, Acrylamide is made.

23. IEF gel according to claim 20, characterized in that the rehydration buffer of 5-9.5 M, preferably 9 M, urea and optionally Detergents, preferably Tween 20, Chaps or Triton X-100 contains.

24. IEF gel according to claim 20, characterized in that if necessary, before rehydration Washing steps are carried out and dried becomes.

25. Dry gel made by pouring one Low pK immobilin gels on one Gel polymerization film and its polymerization, Pour an acrylamide gel on the immobilin gel and its polymerization, casting one Immobilin gels with high pK on the acrylamide gel and its polymerization.