Die Erfindung betrifft die Untersuchung von humanem CTLA-4 (cytotoxisches T Lymphozyten-Antigen-4 oder CD152), das einen essentiellen Rezeptor darstellt, welcher bei der negativen Regulation der T-Zellaktivierung beteiligt ist. Insbesondere beruht sie auf der Identifizierung eines Antigens, das für das humane CTLA-4-Molekül spezifisch ist. Sie betrifft auch einen Antikörper, inklusive eines vollständig humanen monoklonalen Antikörpers, der spezifisch an dieses Antigen bindet. Die Erfindung betrifft auch verschiedene Verwendungen des Antikörpers wie die Detektion und Reagenzien zur Isolation.The The invention relates to the study of human CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte antigen-4 or CD152), which is an essential receptor which is involved in the negative regulation of T cell activation is involved. In particular, it is based on the identification of a Antigen, specific for the human CTLA-4 molecule is. It also affects an antibody, including one fully human monoclonal antibody, which specifically binds to this antigen. The invention relates Also, various uses of the antibody such as Detection and reagents for isolation.

Laufende Studien über das Zusammenspiel der Wechselwirkungen zwischen T-Zellen und Antigen präsentierenden Zellen (APCs) führten zur Vorhersage von dramatischen Veränderungen, die in bestimmter Hinsicht therapeutische Ziele und medizinisches Potential offenbart haben. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass die spezialisierte und dynamische molekulare Maschinerie, die in der engen Verbindung gebildet wird, die durch Wechselwirkung zwischen einer T-Zelle und einer APC entsteht, Immunantworten reguliert ( Dustin, 2002 ; Grakoui et al., 1999 ; Qi et al., 2001 ). Es wurde auch geschlussfolgert, dass diese Maschinerie, die als immunologische Synapse bezeichnet wird, mit einem hohen Grad an interzellulärer Kommunikation korreliert und ungleichartige biologische Vorgänge kontrolliert ( Davis und Dustin, 2004 ). Eine Anzahl an Molekülen befinden sich nur an der immunologischen Synapse, sodass ihre vorübergehende Expression und Wechselwirkung zur richtigen Zeit und am richtigen Platz sichergestellt ist. Die Summe und die Integration von Signalen sind daher für das Hervorrufen geeigneter T-Zell-Antworten von Bedeutung. Die als „immunologischen Synapse" bezeichnete begrenzte und m-förmige Region ist voller Moleküle, die miteinander in Wechselwirkung stehen. Darunter wurde CTLA-4 als verantwortlich für die Hemmung von T-Zell-Antworten identifiziert, und zwar in einer T-Zellrezeptor (TCR) abhängigen Weise ( Chikuma und Bluestone, 2002 ; Egen und Allison, 2002 ).Ongoing studies of the interaction of T cells with antigen presenting cells (APCs) have led to the prediction of dramatic changes that have revealed therapeutic goals and medical potential in some respects. For example, it has been shown that the specialized and dynamic molecular machinery formed in the tight junction that results from interaction between a T cell and an APC regulates immune responses ( Dustin, 2002 ; Grakoui et al., 1999 ; Qi et al., 2001 ). It was also concluded that this machinery, termed the immunological synapse, correlates with a high degree of intercellular communication and controls disparate biological processes ( Davis and Dustin, 2004 ). A number of molecules are located only at the immunological synapse, ensuring their transient expression and interaction at the right time and in the right place. The sum and integration of signals are therefore important in eliciting appropriate T cell responses. The finite and m-shaped region termed "immunological synapse" is full of interacting molecules, among which CTLA-4 has been identified as being responsible for the inhibition of T cell responses, in a T cell receptor (TCR ) dependent manner ( Chikuma and Bluestone, 2002 ; Egen and Allison, 2002 ).

Die Kartierung humanen CTLA-4s ordnete ihm eine Bande q33 des Chromosoms 2 zu. Es wurde in die Gruppe von immunmodulatorischen Rezeptoren klassifiziert, die kollektiv als CD28 Superfamilie bezeichnet werden ( Sharpe und Freeman, 2002 ). Die gesamte cDNA-Sequenz des humanen CTLA-4 (Isoform A), in 1 gezeigt, hat die Genbank-Datennummer L15006 und seine Struktur hat die Datenbanknummer 1AH1 in der Molecular Modeling-Datenbank (MMDB) der Strukturdatenbank des NCBI. Die Region der Aminosäuren –35 bis 0 ist das Signalpeptid, Aminosäuren 1–126 die extrazelluläre V-ähnliche Domäne, Aminosäuren 123–151 die Transmembrandomäne und Aminosäuren 152–188 die cytoplasmatische Domäne. Es gilt als gesichert, dass die beiden Mitglieder dieser Superfamilie, CD28 und CTLA-4, gegensätzliche Funktionen haben. CTLA-4 stellt einen der wesentlichen inhibitorischen Rezeptoren dar und ist bei costimulatorischen Signalwegen beteiligt, die sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten regulieren ( Krummel und Allison, 1996 ; Linsley et al., 1991 ; Pioli et al., 2000 ). Die Mehrzahl an Untersuchungen deutet darauf hin, dass CD28 direkte Verstärkungssignale bereitstellt. Dazu zählen eine Hochregulation/Stabilisierung der Transkription von Cytokin-Genen, eine erhöhte Überlebensrate der Zellen, eine geringere Aktivierungsschwelle und Wirkungen auf das Cytoskelett. Die Kenntnis der Funktion von CTLA-4 ist jedoch noch sehr beschränkt. Der überzeugendste Hinweis auf eine inhibitorische Rolle vom CTLA-4 stammt bislang von Untersuchungen an Knockout-Mäusen (CTLA-4^–/–) ( Tivol et al., 1995 ). Diese Mäuse leiden unter einer fatalen T-Zell-lymphoproliferativen Störung mit Milzvergrößerung (Splenomegalie), Lymphadenopathie (Lymphknotenerkrankung) und hyperresponsiver Infiltration in verschiedenen Organen wie dem Herzen, was sich vier Wochen nach der Geburt zeigt. Diese fötale Störung ist vermutlich auf Reaktivitäten auf verschiedene Autoantigene zurückzuführen, da die Expression eines einzigen transgenen TCR diese Krankheit verhindert. Die TCR abhängige Aktivierung in diesen Knockout-Mäusen scheint eine CD28-Costimulation zu erfordern, da CTLA-4^–/–CD28^–/–-Mäuse nicht unter der lympho-proliferativen Störung leiden. Auch wird eine solche Krankheit durch eine perinatale Behandlung dieser Mäuse mit löslichen CTLA-4-Antikörper effektiv verhindert. Dieser Antikörper verdrängt die Ligandenbindung an CTLA-4 auf der Zelloberfläche. Der Mechanismus der CTLA-4-Wirkung ist dennoch nach wie vor ungeklärt, mit noch fehlender offensichtlicher zentralen Aufgabe.The mapping of human CTLA-4s assigned a band q33 of chromosome 2 to him. It has been classified into the group of immunomodulatory receptors collectively referred to as the CD28 superfamily ( Sharpe and Freeman, 2002 ). The entire cDNA sequence of human CTLA-4 (isoform A), in 1 shown, the Genbank data number L15006 and its structure has the database number 1AH1 in the Molecular Modeling Database (MMDB) of the structure database of the NCBI. The region of amino acids -35 to 0 is the signal peptide, amino acids 1-126 the extracellular V-like domain, amino acids 123-151 the transmembrane domain, and amino acids 152-188 the cytoplasmic domain. It is certain that the two members of this superfamily, CD28 and CTLA-4, have conflicting functions. CTLA-4 is one of the major inhibitory receptors and is involved in co-stimulatory signaling pathways that regulate both humoral and cellular immune responses ( Krummel and Allison, 1996 ; Linsley et al., 1991 ; Pioli et al., 2000 ). The majority of studies suggest that CD28 provides direct amplification signals. These include upregulation / stabilization of transcription of cytokine genes, increased cell survival, lower activation threshold, and effects on the cytoskeleton. However, the knowledge of the function of CTLA-4 is still very limited. The most convincing evidence of an inhibitory role of CTLA-4 has so far been derived from studies on knockout mice (CTLA-4 ^{- / -} ) ( Tivol et al., 1995 ). These mice suffer from a fatal T-cell lymphoproliferative disorder with spleen enlargement (splenomegaly), lymphadenopathy (lymphadenopathy), and hyperresponsive infiltration into various organs such as the heart, which appears four weeks after birth. This fetal disorder is believed to be due to reactivities to various autoantigens, as expression of a single transgenic TCR prevents this disease. TCR-dependent activation in these knockout mice appears to require CD28 costimulation since CTLA-4 ^{- / -} CD28 ^{- / -} mice do not suffer from the lymphoproliferative disorder. Also, such disease is effectively prevented by perinatal treatment of these mice with soluble CTLA-4 antibodies. This antibody displaces ligand binding to CTLA-4 on the cell surface. The mechanism of CTLA-4 action is still unclear, however, with no obvious central task left.

Begrifflich stellt die Wechselwirkung von CD28 auf einer Lymphozyte mit B7-Proteinen auf einer APC ein erforderliches costimulatorisches zweites Signal dar, das bewirkt, dass eine T-Zelle auf ein Antigen voll antworten kann. Die ursprünglichen Familienmitglieder in diesem Signaltransduktionsweg bestehen aus zwei B7-Liganden, CD80 (B7-1) und CD86 (B7-2). Diese haben Spezifitäten für die beiden Rezeptoren CD28 und CTLA-4. CD28 wird auf der Oberfläche von T-Zellen konstitutiv exprimiert, während die Oberflächenexpression von CTLA-4 in einem begrenzten Umfang nach der T-Zellaktivierung schnell hochreguliert wird. Auch die Kinetiken der Expression von CD80 und CD86 sind verschieden. CD86 wird auf ineinander greifenden Dendritenzellen, Langerhanszellen, Dendritenzellen des peripheren Bluts, B-Gedächtniszellen und B-Zellen des Keimzellzentrums konstitutiv exprimiert. Des Weiteren ist CD86 auf niedrigem Niveau auf Monozyten exprimiert. Durch IFN-γ-Stimulation wird es dort jedoch schnell hochreguliert, was zu der Hypothese geführt hat, dass CD86 primär eine Rolle beim Initiieren einer Immunantwort einnimmt. Andererseits kann CD80, das später exprimiert wird, bei der Verstärkung oder Regulation der Antwort eine Rolle spielen. Neu identifizierte Familienmitglieder verwandter Moleküle sind zum Beispiel: das induzierbare kostimulatorische Molekül ICOS (engl. inducible costimulatory molecule), der PD-1 Rezeptor, also der Rezeptor des Apoptose-induzierenden Proteins PD-1 (Programmed Death 1), das B- und T-Lymphozyten dämpfende BTLA (engl. B and T lymphocyte attenuator), B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, PD-1 Ligand 1 (PD-L1) und PD-L2 ( Wang und Chen, 2004 ). Die neuen Wechselwirkungen zwischen diesen Familienmitgliedern unterstreichen zusätzlich die Komplexität dieses costimulatorischen Signalweges beim Bewirken einer angemessenen Immunantwort.Conceptually, the interaction of CD28 on a lymphocyte with B7 proteins on an APC is a required costimulatory second signal that causes a T cell to fully respond to an antigen. The original family members in this signal transduction pathway consist of two B7 ligands, CD80 (B7-1) and CD86 (B7-2). These have specificities for the two receptors CD28 and CTLA-4. CD28 is constitutively expressed on the surface of T cells, while the surface expression of CTLA-4 is rapidly upregulated to a limited extent after T cell activation. The kinetics of expression of CD80 and CD86 are also different. CD86 is constitutively expressed on interdigitated dendritic cells, Langerhans cells, peripheral blood dendritic cells, B memory cells and germinal cell B cells. Furthermore, CD86 is expressed at a low level on monocytes. However, it is rapidly up-regulated by IFN-γ stimulation, leading to the hypothesis that CD86 plays a primary role in initiating an immune response. On the other hand, CD80, which is later expressed, may play a role in enhancing or regulating the response. Newly identified family members of related molecules include: the inducible costimulatory molecule (ICOS), the PD-1 receptor, the receptor of the apoptosis-inducing protein PD-1 (Programmed Death 1), B and T Lymphocyte attenuating BTLA (B and T lymphocyte attenuator), B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, PD-1 ligand 1 (PD-L1), and PD-L2 ( Wang and Chen, 2004 ). In addition, the novel interactions between these family members underscore the complexity of this costimulatory pathway in inducing an adequate immune response.

Durch RT-PCR-Klonierung von nichtaktivierten T-Zellen in Tieren sowie Menschen wurde eine kürzere lösliche Form von CTLA-4 erzeugt, der die Transmembranregion fehlt ( Magistrelli et al., 1999 , Oaks et al., 2000 ). Lösliches CTLA-4 (sCTLA-4, CTLA-4-Isoform B; 1) scheint ein vollständig funktionsfähiger CD80- und CD86-Rezeptor zu sein. Es ist daher wahrscheinlich, dass es auf T-Zell-Antworten in einer parakrinen Weise wirkt. Immunreaktives sCTLA-4 kann des Weiteren in Serum von 14/64-gesunden Patienten nachgewiesen werden. Eine hohe Konzentration von sCTLA-4 wurde ferner in Seren von Patienten mit Autoimmunthyreoiditis wie der Basedowschen Krankheit nachgewiesen ( Oaks und Hallet, 2000 ). Jüngere Untersuchungen zeigen schließlich, dass sCTLA-4-Werte in Patienten mit Immunkrankheiten erhöht sind, wie bei Typ-1-Diabetes ( Nistico et al., 1996 ), der diffusen kutanen Form der systemischen Sklerose (dSSc) ( Sato et al., 2004 ), systemischem Lupus erythematodes ( Wong et al., 2005, Rheumatology 44: 989 ) und allergischem Asthma ( Wong et al., 2005, Clinical Experimental Immunology 141: 122 ). Es wurde gezeigt, dass aktivierte T-Zellen die Expression von sCTLA-4 mRNA unterdrücken und dass sie bevorzugter Weise die membrangebundene Volllängen-Form von CTLA-4 (flCTLA-4) mRNA exprimieren ( Gough et al., 2005 ). Das Verhältnis von sCTLA-4 zu flCTLA-4 kann somit eine bedeutende Rolle bei der Regulation des Immungleichgewichts haben. Die alternativen Transkripte oder Spleißvarianten von sCTLA-4, denen die Transmembrankodierenden Regionen fehlen, wurden erstmals 1997 in der GenBank-Sequenzdatenbank für Menschen, Mäuse und Ratten hinterlegt (Datenbanknummer U90273, U90270 und U90271). Es folgte die Beschreibung dergleichen Transkripte in Menschen, wo sie durch nichtstimulierte humane T-Zellen exprimiert werden. Die endogene lösliche Form von 174 Aminosäuren, die als Isoform B bezeichnet wurde, kann unter der Datenbanknummer NP 001032720 abgerufen werden.By RT-PCR cloning of unactivated T cells in animals and humans, a shorter soluble form of CTLA-4 lacking the transmembrane region was generated ( Magistrelli et al., 1999 . Oaks et al., 2000 ). Soluble CTLA-4 (sCTLA-4, CTLA-4 isoform B; 1 ) appears to be a fully functional CD80 and CD86 receptor. It is therefore likely to act on T cell responses in a paracrine manner. Immunoreactive sCTLA-4 can also be detected in serum from 14/64 healthy patients. A high concentration of sCTLA-4 has also been demonstrated in sera from patients with autoimmune thyroiditis such as Basedow's disease ( Oaks and Hallet, 2000 ). Finally, recent studies show that sCTLA-4 levels are elevated in patients with immune-related diseases, as in type 1 diabetes ( Nistico et al., 1996 ), the diffuse cutaneous form of systemic sclerosis (dSSc) ( Sato et al., 2004 ), systemic lupus erythematosus ( Wong et al., 2005, Rheumatology 44: 989 ) and allergic asthma ( Wong et al., 2005, Clinical Experimental Immunology 141: 122 ). Activated T cells have been shown to suppress the expression of sCTLA-4 mRNA and preferentially express the full length membrane-bound form of CTLA-4 (flCTLA-4) mRNA ( Gough et al., 2005 ). The ratio of sCTLA-4 to flCTLA-4 may thus play an important role in the regulation of immune imbalance. The alternative transcripts or splice variants of sCTLA-4 lacking the transmembrane-encoding regions were first deposited in 1997 in the GenBank sequence database for humans, mice, and rats (database numbers U90273, U90270, and U90271). This was followed by the description of such transcripts in humans where they are expressed by unstimulated human T cells. The endogenous soluble form of 174 amino acids, designated isoform B, can be found at database number NP 001032720.

Dem Fachmann ist auch bekannt, dass die Immunreaktivität durch verschiedene Typen regulatorischer T-Zellen (T_reg-Zellen) kontrolliert wird ( Sakaguchi, 2005 ). So sind regulatorische T-Zellen in der Lage, die Aktivierung von anderen T-Zellen zu unterdrücken. T_reg-Zellen können allgemein in zwei Gruppen unterteilt werden und zwar die natürlichen T_reg-Zellen von CD4⁺CD25⁺-Phänotyp, die 5–10% der peripheren T-Zellen ausmachen sowie die durch Stimulation induzierten (oder adaptiven) T_reg-Zellen, die in verschiedenen Modellen der Entzündung, Alloreaktivität oder Autoimmunität identifiziert wurden ( Prud'homme, 2004 ). Jüngere Befunde legen nahe, dass das suppressive Potenzial von natürlichen CD4⁺CD25⁺ T_reg-Zellen in Bezug auf andere aktivierte Effektor-T-Zellen dadurch vermittelt wird, dass die frühe Proliferation begrenzt wird, sowie durch eine Anti-Effektorfunktion in entzündetem Geweben ( von Boehmer, 2005 ). Es wurde vorgeschlagen, dass das Transkriptionsfaktor-Gen FOXP3 (forkhead box P3) der Forkhead-Familie, das den Scurfin-Transkriptionsregulator (GenBank- Datenbanknummer EF534714, NCBI-Proteindatenbanknummer A3Q15210) kodiert, bei der Entwicklung und Funktion natürlicher T_reg-Zellen eine Rolle spielt ( Hori et al., 2003 ). In Tiermodellen führten Mutationen von FOXP3 zur Entwicklung von Autoimmun- und lymphoproliferativen Erkrankungen. Ein Verlust der T_reg-Population durch eine spontane Mutation in FOXP3 (scurfy-Mutation) führte auf Grund einer entzündliche Störung mehrerer Organe, ähnlich der CTLA-4 oder TGF-β-Defizienz, zum Tod der Mäuse nach 3 bis 4 Wochen ( Brunkow et al., 2001 ). Es wurde gezeigt, dass FOXP3 als ein Transkriptionsrepressor fungiert, der auf zusammengesetzte NF-AT/AP-1-Stellen in Promotern von Cytokingenen wirkt. Die Region, die für die NF-AT-Hemmung verantwortlich ist, wurde als im Aminoterminus befindlich kartiert ( Lopes et al., 2006 ; Wu et al., 2006 ).It is also known to the person skilled in the art that the immunoreactivity is controlled by various types of regulatory T cells (T _reg cells) ( Sakaguchi, 2005 ). Thus, regulatory T cells are able to suppress the activation of other T cells. T _reg cells can generally be divided into two groups, the natural T _reg cells of the CD4 ⁺ CD25 ⁺ phenotype, which account for 5-10% of the peripheral T cells, and the stimulation-induced (or adaptive) T _reg - Cells identified in different models of inflammation, alloreactivity or autoimmunity ( Prud'homme, 2004 ). Recent findings suggest that the suppressive potential of natural CD4 ⁺ CD25 ⁺ T _reg cells is mediated with respect to other activated effector T cells by limiting early proliferation, as well as by anti-effector function in inflamed tissues ( by Boehmer, 2005 ). It has been suggested that the Forkhead family transcription factor gene FOXP3 (forkhead box P3), which encodes the scurfin transcriptional regulator (GenBank database number EF534714, NCBI protein database number A3Q15210), has been implicated in the development and function of natural T _reg cells plays ( Hori et al., 2003 ). In animal models, mutations of FOXP3 have led to the development of autoimmune and lymphoproliferative diseases. A loss of the T _reg population by a spontaneous mutation in FOXP3 (scurfy mutation) led to death of the mice after 3 to 4 weeks due to an inflammatory disorder of several organs, similar to CTLA-4 or TGF-β deficiency ( Brunkow et al., 2001 ). FOXP3 has been shown to act as a transcriptional repressor acting on composite NF-AT / AP-1 sites in cytokine gene promoters. The region responsible for NF-AT inhibition has been mapped as being in the amino terminus ( Lopes et al., 2006 ; Wu et al., 2006 ).

Konventionelle Techniken zur Isolierung dieser seltenen Population an T_reg-Zellen beinhalten im Prinzip oft ein zweistufiges Verfahren der Selektion mannigfaltiger Antikörper (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland; BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA). Kurz gesagt wird zunächst ein Cocktail monoklonaler Antikörper verwendet, der andere CD-Antigene erkennt, die auf Erythrozyten, Plättchen, Monozyten und peripheren Leukozyten usw. exprimiert werden. CD4⁺-Lymphozyten, die nicht an diesen Cocktail binden, werden dadurch zurückbehalten. Anschließend selektiert ein monoklonaler anti-humaner CD25 Antikörper positiv die CD25⁺-Zellen aus den angereicherten CD4⁺-Zellen, was CD4⁺CD25⁺-T_reg-Zellen ergibt. Jedoch lässt sich nicht vermeiden, dass während des Verfahrens eine Exposition auf Umweltpathogene eintritt. Dadurch wird die herkömmliche Effektor-T-Zell-Aktivierung ausgelöst und folglich auch die Expression von CD25 auf humanen CD4⁺-Zellen. Dadurch wird die Identifizierung der Population der T_reg-Zellen eine schwierige Aufgabe. Darüber hinaus wurden sogar natürliche CD4^–CD8⁺ T_reg-Zellen von Xystrakis et al. gefunden ( (2004) Blood 104: 3294–3301 ), was darauf hinweist, dass T_reg-Zellen eine heterogene Population darstellen. Obwohl bei T_reg-Zellen überwiegend eine FOXP3-Expression gefunden wird, macht dessen intrazellulare nukleare Lokalisation eine direkte Detektion in lebenden Zellen unmöglich. Die Charakterisierung und die Verwendung von T_reg-Zellen wurden somit durch einen Mangel von spezifischen Markermolekülen auf der Oberfläche der T_reg-Zellen erschwert. Um dieses spezielle Problem zu umgehen, wurde ein komplexeres Vorgehen entworfen, bei dem gereinigte mononuklearer CD4⁺CD25⁺-Zellen des peripheren Bluts mit Reagenzien wie Ionomycin weiter aktiviert werden. Die T_reg-Zellen werden hier basierend auf der Bindung an CTLA-4 blockierende monoklonaler Antikörper isoliert ( Birebent et al., 2004 ). Ein sogar noch komplizierteres Vorgehen wurde entwickelt, bei dem zusätzliche Oberflächenmarker wie CD45RA und CD127 eingesetzt werden ( WO 2007/117602 ).Conventional techniques for isolating this rare population of T _reg cells, in principle, often involve a two-step method of multi-antibody selection (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany, BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA). Briefly, a cocktail of monoclonal antibodies that recognize other CD antigens expressed on erythrocytes, platelets, monocytes, and peripheral leukocytes, etc., is used first. CD4 ⁺ lymphocytes that do not bind to this cocktail are thereby retained. Then, a monoclonal anti-human CD25 antibodies selected positive CD25 ⁺ cells from the enriched CD4 ⁺ cells, which results in CD4 ⁺ CD25 ⁺ T _reg cells. However, exposure to environmental pathogens during the process is unavoidable. This triggers conventional effector T-cell activation and, consequently, the expression of CD25 on human CD4 ⁺ cells. This makes identifying the population of T _reg cells a difficult task. About that In addition, even natural CD4 ^- CD8 ⁺ T _reg cells of Xystrakis et al. found ( (2004) Blood 104: 3294-3301 ), indicating that T _reg cells represent a heterogeneous population. Although predominantly FOXP3 expression is found in T _reg cells, its intracellular nuclear localization makes direct detection in living cells impossible. The characterization and use of T _reg cells was thus hampered by a lack of specific marker molecules on the surface of the T _reg cells. To circumvent this particular problem, a more complex approach has been devised in which purified peripheral blood mononuclear CD4 ⁺ CD25 ⁺ cells are further activated with reagents such as ionomycin. The T _reg cells are isolated here based on binding to CTLA-4 blocking monoclonal antibodies ( Birebent et al., 2004 ). An even more complicated approach has been developed using additional surface markers such as CD45RA and CD127 ( WO 2007/117602 ).

Die Assoziation und der potentielle Synergismus zwischen der suppressiven Funktion von T_reg-Zellen und der CTLA-4-Expression ist ferner von Interesse. Für nichtaktivierte T-Zellen unüblich, exprimieren T_reg-Zellen konstitutiv CTLA-4 ( Takahashi et al., 2000 ). Ein Blockieren von CTLA-4 auf T_reg-Zellen durch einen spezifischen blockierenden monoklonalen Antikörper kann die suppressive Aktivität der Zellen hemmen, was zur Entwicklung einer Autoimmunkrankheit in vivo führt ( Read et al., 2006 ). Des Weiteren wurde beobachtet, dass nicht nur die beschriebenen natürlichen CD4^–CD8⁺ T_reg-Zellen CTLA-4 exprimieren ( Xystrakis et al., 2004 ), sondern das auch CD4⁺CD25⁺-Zellen, die auf der Basis der Wiedergewinnung von CTLA-4 gereinigt wurden, in Hinblick auf die Suppression sehr viel potenter sind ( Birebent et al., 2004 ). Insbesondere wurde auf dem 2007-Kongress der British Society for Immunology die Tatsache offenbart, dass induzierbare T_reg-Zellen die dominante Quelle von sCTLA-4 sind ( Ward und Barker, 2007 ). Insgesamt indizieren diese Befunde eine starke Korrelation zwischen der Expression von CTLA-4 und der suppressiven regulatorischen Funktion, was das Konzept stützt, das CTLA-4 für T_reg-Zellen funktionell von Bedeutung ist.The association and potential synergism between the suppressive function of T "_reg" cells and CTLA-4 expression is also of interest. For non-activated T cells unusual, T _reg cells constitutively express CTLA-4 ( Takahashi et al., 2000 ). Blocking of CTLA-4 on T _reg cells by a specific blocking monoclonal antibody can inhibit the suppressive activity of the cells, leading to the development of an autoimmune disease in vivo ( Read et al., 2006 ). Furthermore, it was observed that not only the natural CD4 described ^- CD8 ⁺ T _reg cells expressing CTLA-4 ( Xystrakis et al., 2004 ) but also CD4 ⁺ CD25 ⁺ cells purified on the basis of CTLA-4 recovery are much more potent in terms of suppression ( Birebent et al., 2004 ). In particular, the fact that inducible T _reg cells are the dominant source of sCTLA-4 was revealed at the 2007 Congress of the British Society for Immunology ( Ward and Barker, 2007 ). Taken together, these findings indicate a strong correlation between the expression of CTLA-4 and the suppressive regulatory function, supporting the concept that CTLA-4 is functionally important for T _reg cells.

Da T_reg-Zellen, zusammen mit sCTLA-4, beim Verhindern der Transplantatabstoßung und der Transplantat-Wirt-Reaktion (auch Graft-versus-Host-Reaktion genannt) beteiligt sind und eine dominierende Wirkung bei der Kontrolle der Autoimmunität und dem Bewahren der peripheren Toleranz haben, können spezifische Immuntherapien, die darauf abzielen, sie zu isolieren und dann zu expandieren, den klinischen Verlauf verschiedener T-Zell-vermittelter Pathologien verbessern. Da CTLA-4 die wichtigsten hemmenden costimulatorischen Signale bereitstellt, kann vom Fachmann angenommen werden, dass diese Moleküle neue Ziele für die Immuntherapie und Diagnose darstellen.Because T _reg cells, along with sCTLA-4, are involved in preventing graft rejection and graft-versus-host reaction, and have a dominant effect in controlling autoimmunity and preserving the peripheral Tolerance, specific immunotherapies that aim to isolate and then expand them may improve the clinical course of various T-cell mediated pathologies. Since CTLA-4 provides the major inhibitory costimulatory signals, it will be appreciated by those skilled in the art that these molecules are novel targets for immunotherapy and diagnosis.

Untersuchungen der physiologischen Funktion und der praktische Einsatz von CTLA-4 wurden durch die Gewinnung von monoklonalen Antikörpern (mAbs) möglich. Der erste beschriebene anti-humane CTLA-4 mAb aus Maus (Klon 11D4) ließ vermuten, dass ein Blockieren von CTLA-4-Signalwegen ein positives Signal darstellen könnte, das mit jenem synergistisch wirkt, das durch CD28 bewirkt wird ( Linsley et al., 1992 ). Die immunverstärkende Wirkung des CTLA-4-Antagonismus hat somit die Möglichkeit für eine leicht verfügbare Tumorimmuntherapie eröffnet, die auf der vorübergehenden Beseitigung der CTLA-4 vermittelten Inhibition mittels antagonistischer Antikörper beruht ( Egen et al., 2002 ). Obgleich die Mechanismen, durch die CTLA-4 die T-Zellantworten reguliert, noch nicht vollständig verstanden sind, stellt das Blockieren seiner Aktivität mit einem antagonistischen oder blockierenden monoklonalen Antikörper einen neuen Ansatz dar, der für die Immuntherapie vielversprechend ist. Die Tatsache, dass der CTLA-4-Blockade um Antitumorantworten stark zu fördern, ein hohes therapeutisches Potenzial beigemessen wird, wird durch eine Reihe von US-Patenten unterstrichen wie Nr. 5,811,097 , Nr. 5,855,887 , Nr. 6,051,227 , Nr. 6,207,156 und Nr. 7,229,628 .Studies of physiological function and practical use of CTLA-4 have been made possible by obtaining monoclonal antibodies (mAbs). The first described mouse anti-human mouse CTLA-4 mAb (clone 11D4) suggested that blocking CTLA-4 signaling pathways could be a positive signal synergistic with that caused by CD28 ( Linsley et al., 1992 ). The immunoenhancing effect of CTLA-4 antagonism has thus opened up the possibility of readily available tumor immunotherapy based on the transient elimination of CTLA-4 mediated inhibition by antagonist antibodies ( Egen et al., 2002 ). Although the mechanisms by which CTLA-4 regulates T cell responses are not fully understood, blocking its activity with an antagonist or blocking monoclonal antibody represents a novel approach that is promising for immunotherapy. The fact that CTLA-4 blockade strongly promotes anti-tumor responses and has high therapeutic potential is underlined by a number of US patents, such as No. 5,811,097 , No. 5,855,887 , No. 6,051,227 , No. 6,207,156 and no. 7,229,628 ,

Monoklonale anti-CTLA-4 Antikörper, die durch ihre Bindung die gleichzeitige Bindung von Liganden an CTLA-4 blockieren – hier auch „blockierende" (monoklonale) Antikörper genannt, z. B. Klon BNI3 ( Steiner et al., 1999 ) (kommerziell erhältlich von BD Pharmingen) und Klon AS33 (Antibody Solutions, Mountain View, CA) werden oft für die Detektion von sCTLA-4 in biologischen Flüssigkeiten verwendet ( Oaks und Hallet, 2000 ) sowie zur Reinigung von T_reg-Zellen aus aktivierten peripheren Blut (Birebent et al., 2004 ). Dies ist jedoch nicht notwendigerweise die beste verfügbare Strategie. Strukturanalysen haben gezeigt, dass das humane CTLA-4-Protein aus Homodimeren von variablen extrazellulären(IgV)-Immunglobulindomänen besteht, die durch Disulfidbrücken verbunden sind. Jede Domäne besteht aus zwei geschichteten β-Faltblättern mit zehn Strängen (A, A', B, C, C', C'', D, E, F und G). Diese bilden drei Bereiche, die den hypervariablen Bereichen ähneln, den sog. CDR-Regionen (engl. complementarity determining region), die die Bindungseigenschaften eines Immunglobulins determinieren ( Schwartz et al., 2001 ; Stamper et al., 2001 ). Zusammen mit einer Mutagenesestudie ( Peach et al., 1994 ) haben diese beiden strukturellen Untersuchungen unabhängig voneinander gezeigt, dass CDR1-ähnliche (die B-C-Schleife) und CD3-ähnliche (die F-G-Schleife)-Regionen in CTLA-4 direkt an endogene B7-Liganden binden (CD80 und CD86). Dem gegenüber ist die Rolle von CDR2 sehr trivial, falls eine solche überhaupt existiert. Somit gab es zwar den in den ersten Veröffentlichungen keine genauen Angaben über das CTLA-4-Epitop, an das die blockierenden monoklonalen Antikörper binden. Jedoch können antagonistische Effekte und die sich anschließende Verstärkung der T-Zell- Aktivierung durch eine Kompetition der monoklonalen Antikörper vermittelt werden, die aus einer spezifischen Bindung an Aminosäurereste auf oder nahe eines räumlichen Bereichs resultieren, der CDR1 und CDR2 umfasst. Die Verwendung von blockierenden monoklonalen Antikörper als Paar oder in Kombination mit endogenen 37-Liganden ist somit mit einer möglichen Einschränkung verbunden, die durch sterische Hinderung bewirkt wird.Monoclonal anti-CTLA-4 antibodies that block the simultaneous binding of ligands to CTLA-4 by their binding - also called "blocking" (monoclonal) antibodies, eg clone BNI3 ( Steiner et al., 1999 ) (commercially available from BD Pharmingen) and clone AS33 (Antibody Solutions, Mountain View, CA) are often used for the detection of sCTLA-4 in biological fluids ( Oaks and Hallet, 2000 ) and for the purification of T _reg cells from activated peripheral blood (Birebent et al., 2004 ). However, this is not necessarily the best strategy available. Structural analyzes have shown that the human CTLA-4 protein consists of homodimers of variable extracellular (IgV) immunoglobulin domains linked by disulfide bonds. Each domain consists of two stratified ten-stranded β-sheets (A, A ', B, C, C', C '', D, E, F and G). These form three areas that resemble the hypervariable areas, the so-called CDR regions (English: complementarity determining region), which determine the binding properties of an immunoglobulin ( Schwartz et al., 2001 ; Stamper et al., 2001 ). Together with a mutagenesis study ( Peach et al., 1994 ), these two structural studies independently demonstrated that CDR1-like (the BC loop) and CD3-like (FG loop) regions in CTLA-4 bind directly to endogenous B7 ligands (CD80 and CD86). In contrast, the role of CDR2 is very trivial, if any. Thus, although there was no precise information in the first publications via the CTLA-4 epitope to which the blocking monoclonal antibodies bind. However, antagonistic effects and subsequent enhancement of T cell activation may be mediated by competition of the monoclonal antibodies resulting from specific binding to amino acid residues at or near a spatial region comprising CDR1 and CDR2. The use of blocking monoclonal antibody in pair or in combination with endogenous 37 ligands is thus associated with a potential limitation caused by steric hindrance.

Die Erfindung basiert auf dem Befund, dass andere Bereiche als die CDR1-ähnliche und die CDR3-ähnliche Region von humanen CTLA-4, wie etwa die CDR2-ähnliche Sequenz um Methionin 55, keine Rolle bei der Bindung von Liganden wie dem B7-Liganden spielen. Monoklonale Antikörper, die eine zuvor bestimmte Region um Methionin 55 erkennen, können somit beim Nachweisen von sCTLA-4 und/oder beim Reinigen von T_reg-Zellen verwendet werden, wo sie besonders nützlich sind. Um die Wirkung dieser CDR2-ähnlichen Sequenzen um Methionin 55 zu untersuchen, haben die Erfinder einen vollständig humanen monoklonalen IgG4λ entwickelt und besitzen denselben, der gegen diesen speziellen Bereich gerichtet ist ( Chin et al., 2007 ). Unter der Voraussetzung, dass die Bindung eines natürlichen Agonisten nicht gestört wurde, ist der monoklonale Antikörper in der Lage, eine hochaffine (nanomolare) Bindung an einen extrazellulären Bereich zu vermitteln, der die CDR2-ähnliche Region von CTLA-4 aufweist. Dabei kann er die Aktivierung humaner CD3⁺-Zellen bewirken. Die Erfindung stellt daher auch ein Verfahren und eine Verwendung bereit, mit dem sCTLA-4 nachgewiesen werden kann und/oder T_reg-Zellen isoliert werden können.The invention is based on the finding that regions other than the CDR1-like and the CDR3-like region of human CTLA-4, such as the CDR2-like sequence around methionine 55, have no role in the binding of ligands such as the B7 ligand play. Monoclonal antibodies recognizing a previously determined region of methionine 55 can thus be used in detecting sCTLA-4 and / or in purifying T _reg cells, where they are particularly useful. To investigate the effect of these CDR2-like sequences on methionine 55, the inventors have developed and possess a fully human monoclonal IgG4λ directed against this particular region ( Chin et al., 2007 ). Provided that the binding of a natural agonist was not disturbed, the monoclonal antibody is capable of mediating high affinity (nanomolar) binding to an extracellular region comprising the CDR2-like region of CTLA-4. It can cause the activation of human CD3 ⁺ cells. The invention therefore also provides a method and use, can be detected and with the sCTLA-4 / or T _reg cells can be isolated.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt ein Reagenz, das die extrazelluläre Domäne von CTLA-4 erkennt, indem es an eine Region von CTLA-4 bindet, die vorzugsweise von der CDR3-ähnlichen und der CDR1-ähnlichen Region von CTLA-4 verschieden ist. Das Reagenz blockiert dabei nicht die Ligandenbindung von CTLA-4. Das Reagenz weist einen Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment eines solchen auf. Die Erfindung betrifft auch ein funktionelles Derivat eines solchen Reagenzes. Das Reagenz bindet in einigen Ausführungsformen an eine Sequenz, die SEQ ID NO: 1 enthält. Das Reagenz kann ein monoklonaler Antikörper oder ein polyklonaler Antikörper sein, z. B. ein humaner Antikörper. In einigen Ausführungsformen erkennt er humanes CTLA-4 mit einer K_D von etwa 4 nM oder weniger. Ein solches Reagenz kann ein humaner IgG4λ-Antikörper sein. In einigen Ausführungsformen ist das Reagenz in einem Menschen nicht immunogen.The present invention in a first aspect relates to a reagent which recognizes the extracellular domain of CTLA-4 by binding to a region of CTLA-4, preferably different from the CDR3-like and CDR1-like region of CTLA-4 is. The reagent does not block the ligand binding of CTLA-4. The reagent comprises an antibody or antigen-binding fragment of one. The invention also relates to a functional derivative of such a reagent. The reagent, in some embodiments, binds to a sequence containing SEQ ID NO: 1. The reagent may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, e.g. B. a human antibody. In some embodiments, it recognizes human CTLA-4 with a K _D of about 4 nM or less. Such a reagent may be a human IgG4λ antibody. In some embodiments, the reagent is non-immunogenic in a human.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung zum Nachweisen von humanem CTLA-4. Die Zusammensetzung weist a) einen CTLA-4-Antagonisten oder einen CTLA-4-Agonisten und b) ein wie oben definiertes Reagenz auf, das CTLA-4 nicht blockiert. Ein entsprechender Antagonist weist einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment eines solchen auf. Ein entsprechender Antagonist weist CD80 oder ein CTLA-4-bindendes Fragment desselben auf.In In another aspect, the invention relates to a composition for detecting human CTLA-4. The composition has a) a CTLA-4 antagonist or a CTLA-4 agonist and b) a as defined above, does not block CTLA-4. One corresponding antagonist has an antibody or a An antigen-binding fragment of such on. An appropriate one Antagonist has CD80 or a CTLA-4 binding fragment thereof on.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines wie oben definierten Reagenzes, das CTLA-4 nicht blockiert, zur Diagnose oder Behandlung einer menschlichen Krankheit, die eine Erhöhung der Aktivität von T-Zellen erfordert.In In another aspect, the invention relates to the use of a as defined above, which does not block CTLA-4 Diagnosis or treatment of a human disease that has a Increasing the activity of T cells requires.

Ebenfalls beschrieben ist eine isolierte Population regulatorischer T-Zellen (T_reg). Diese Population regulatorischer T-Zellen ist unter Verwendung eines vorangehend beschriebenen Reagenzes isolierbar. Dieser Aspekt beruht auf dem Umstand, dass das oben beschriebene Reagenz bei der Isolierung von regulatorischen T-Zellen aus einer oder mehreren humanen Proben verwendet werden kann. Typischerweise wird eine solche Population regulatorischer T-Zellen unter Verwendung eines entsprechenden Reagenzes isoliert. Dabei wird eine Population von suspendierten Zellen in einer Probe mit einem wie oben definierten Reagenz, das CTLA-4 nicht blockiert, in Kontakt gebracht. Das Reagenz ist in diesem Fall in einem Menschen nicht immunogen. Es werden Zellen ausgewählt, die an das Reagenz binden, das CTLA-4 nicht blockiert. Diese Zellen sind an regulatorischen T-Zellen angereichert. Es ist möglich die Zellen aus einer humanen Probe zu gewinnen. Die Zellen dieser isolierten Population exprimieren regulatorischer T-Zellen FOXP3.Also described is an isolated population of regulatory T cells (T _reg ). This population of regulatory T cells can be isolated using a previously described reagent. This aspect is due to the fact that the reagent described above can be used in the isolation of regulatory T cells from one or more human samples. Typically, such a population of regulatory T cells is isolated using an appropriate reagent. In doing so, a population of suspended cells in a sample is contacted with a reagent as defined above that does not block CTLA-4. The reagent in this case is not immunogenic in a human. Cells are selected that bind to the reagent that does not block CTLA-4. These cells are enriched in regulatory T cells. It is possible to recover the cells from a human sample. The cells of this isolated population express FOXP3 regulatory T cells.

Die angereicherte Population an regulatorischen T-Zellen kann einem Individuum per Transfusion verabreicht werden, um die Autoimmunantwort zu unterdrücken. Dabei kann die isolierte und angereicherte Zellpopulation in Zellkultur expandiert werden, bevor sie einem Subjekt verabreicht wird.The Enriched population of regulatory T cells can be one Individual be administered by transfusion to the autoimmune response to suppress. It can isolated and enriched Cell population will be expanded in cell culture before taking a Subject is administered.

Ebenfalls beschrieben ist die Verwendung einer wie oben beschriebenen isolierten Population regulatorischer T-Zellen zur Diagnose oder Behandlung eines physiologischen Zustandes, der eine Unterdrückung der Autoimmunantwort erfordert.Also described is the use of an isolated as described above Population of regulatory T cells for diagnosis or treatment a physiological condition that suppresses the Autoimmune response required.

Ebenfalls beschrieben ist eine isolierte Population an Zellen, die um regulatorische T-Zellen abgereichert ist. Eine solche Population an Zellen, die um regulatorische T-Zellen abgereichert ist, ist unter Verwendung eines im vorangehenden beschriebenen Reagenzes isolierbar. Diese um regulatorische T-Zellen abgereicherte Zellpopulation ist auf Grund der Tatsache isolierbar, dass sie an das Reagenz, das CTLA-4 nicht blockiert, nicht bindet. Diese isolierte Population an Zellen ist zumindest weitgehend frei von regulatorischen T-Zellen. Die Population an Zellen, die um regulatorische T-Zellen abgereichert ist, entspricht in diesem Fall typischerweise der negativen oder ausgeschlossenen Population an Zellen, die bei der Isolierung einer Population regulatorischer T-Zellen (s. o.) nicht ausgewählt wird, da die Zellen an das Reagenz, das CTLA-4 nicht blockiert, nicht binden. Die Zellen sind aus einer humanen Probe gewonnen worden. Die Zellen sind darüber hinaus mit einem Antigen in Kontakt gebracht worden.Also described is an isolated population of cells that are regulatory T cells is depleted. Such a population of cells that is depleted of regulatory T cells is using of a reagent described above can be isolated. These is up to regulatory T cells depleted cell population Reason for the fact that they isolate the reagent, the CTLA-4 not blocked, not binding. This isolated population of cells is at least largely free of regulatory T cells. The population to cells depleted of regulatory T cells in this case typically the negative or excluded Population of cells involved in the isolation of a population of regulatory T cells (see above) are not selected because the cells are on Do not bind the reagent that does not block CTLA-4. The cells have been obtained from a human sample. The cells are beyond been contacted with an antigen.

Ebenfalls beschrieben ist die Verwendung einer isolierten Zellpopulation, die um regulatorische T-Zellen abgereichert ist (s. o.), zur Diagnose oder Behandlung einer menschlichen Krankheit, die eine Erhöhung der Aktivität von T-Zellen erfordert.Also describes the use of an isolated cell population, which is depleted of regulatory T cells (see above), for diagnosis or treatment of a human disease that causes an increase in Requires activity of T cells.

Die hier vorgeschlagenen Verwendungen und Verfahren können zu einer erhöhten Nachweisempfindlichkeit in der sCTLA-4-Detektion führen. Es kann somit bei der Diagnose solcher Zustände eingesetzt werden, die mit einer sCTLA-4-Produktion korrelieren. Geeignete Untersuchungsverfahren sind zum Beispiel ELISA (Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest, engl. Enzyme Linked Immunosorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay), FIA (Fluoreszenz-Immuno-Assay) und Durchflusscytometrie. In einer Ausführungsform wird das Reagenz aus der Gruppe ausgewählt, die aus einem Antikörper gegen die CDR2-Region von CTLA-4, einem blockierenden Antikörper gegen CTLA-4 oder einer bevorzugten Kombination aus einem Antikörper gegen die CDR2-Region von CTLA-4 und markiertem humanen CD80 besteht. Die Quantifizierung der Bindung kann durch eine Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt werden. Nach einer Inkubationsperiode, die ausreicht, um ein Bindungsgleichgewicht sich einstellen zu lassen, wird der unlösliche Träger gewaschen und die verbliebene Markierung quantifiziert. Die bevorzugten Reagenzien in Kombination verstärken in Gegenwart von sCTLA-4 die Markierung und den Nachweis und setzen somit die Nachweisgrenze herab.The here proposed uses and methods can to increased detection sensitivity in sCTLA-4 detection to lead. It can thus be used in the diagnosis of such conditions which correlate with sCTLA-4 production. Suitable examination methods are, for example, ELISA (enzyme-linked Immunoadsorption test, engl. Enzyme Linked Immunosorbent Assay), RIA (radioimmunoassay), FIA (fluorescence immunoassay) and flow cytometry. In one embodiment, the reagent is selected from the group selected from an antibody against the CDR2 region of CTLA-4, a blocking antibody against CTLA-4 or a preferred combination of an antibody against the CDR2 region of CTLA-4 and labeled human CD80. Quantification of binding can be achieved by a variety of methods, which are known in the art, are performed. To an incubation period sufficient to establish a binding equilibrium to settle, the insoluble carrier is washed and the remaining mark quantified. The preferred reagents in combination amplify in the presence of sCTLA-4 the Marking and detection and thus set the detection limit down.

Die vorliegende Erfindung kann andererseits zu einer erhöhten Leistungsfähigkeit bei der Isolierung von T_reg-Zellen führen und sie umfasst sowohl in vitro- als auch in vivo-Verfahren und -Verwendungen. Für Verwendungen in vitro kann eine Zelle, die den CTLA-4-Rezeptor ohne vorangehende Aktivierung intrinsisch besitzt, d. h. eine T_reg-Zelle, aus mononuklearen Zellen des peripheren Bluts gereinigt werden. Wirkungsvolle Reinigungsstrategien sind dem Fachmann bekannt, inklusive Techniken der Abreicherung und der Anreicherung. Beispielhafte Verfahren sind eine magnetische Zelltrennung, Schwenken, auf Partikeln basierende Chromatographie und cytometrische Sortierung von Zellen. Als ein illustratives Beispiel kann ein monoklonaler Antikörper an einen unlöslichen Träger gebunden werden, zum Beispiel eine Mikrotiterplatte, magnetische Partikel oder ähnliches. Die Zelle oder Zellen von Interesse werden dem Träger zugegeben und nicht gebundene Bestandteile werden durch Waschen entfernt. Die T-Zelle(n) werden abschließend gereinigt oder durch Elution isoliert. Im Hinblick auf in vivo-Verwendungen und -Verfahren können die T_reg-Zellen in einem Säugetier vorhanden sein, insbesondere in einem Menschen, zum Beispiel einem Patienten, der unter einem Mangel oder einem Überschuss an T_reg-Zellen leidet und der von einer Zunahme oder Abnahme an T_reg-Zellen profitieren würde. Zu möglichen Patienten zählen solche, die einen niedrigen oder gar keinen Gehalt an T_reg-Zellen haben und eine Autoimmunkrankheit entwickeln, die eine Transfusion von T_reg-Zellen erforderlich macht ( Rao et al., 2007 ; Wildin und Freitas, 2005 ). Zu potentiellen Patienten zählen auch solche, die eine adoptive Immuntherapie durchlaufen, die eine Verminderung an T_reg-Zellen erfordert ( Dannull et al., 2005 ). Die Erfindung stellt somit Verwendungen und Verfahren zur Wiederherstellung einer Population an T_reg-Zellen in einem Menschen bereit, zu der eine Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines monoklonalen Antikörpers zählt.On the other hand, the present invention may result in increased efficiency in the isolation of T _reg cells and includes both in vitro and in vivo methods and uses. For uses in vitro, a cell that intrinsically possesses the CTLA-4 receptor without prior activation, ie, a T _reg cell, can be purified from peripheral blood mononuclear cells. Effective purification strategies are known to those skilled in the art, including techniques of depletion and enrichment. Exemplary methods are magnetic cell separation, panning, particle-based chromatography and cytometric sorting of cells. As an illustrative example, a monoclonal antibody can be bound to an insoluble support, for example a microtiter plate, magnetic particles or the like. The cell or cells of interest are added to the carrier and unbound ingredients are removed by washing. The T cell (s) are finally purified or isolated by elution. With respect to in vivo uses and methods, the T _reg cells may be present in a mammal, particularly in a human, for example a patient suffering from a deficiency or excess of T _reg cells, and an increase or decrease in T _reg cells would benefit. Potential patients include those who have low or zero levels of T _reg cells and develop an autoimmune disease that requires transfusion of T _reg cells ( Rao et al., 2007 ; Wildin and Freitas, 2005 ). Potential patients also include those undergoing adoptive immunotherapy requiring reduction of T _reg cells ( Dannull et al., 2005 ). The invention thus provides uses and methods for restoring a population of T "_reg" cells in a human, which includes administration of a therapeutically effective amount of a monoclonal antibody.

In einer Ausführungsform stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, der spezifisch an die CDR2-ähnliche Region um das Methionin 55 des humanen CTLA-4 bindet. Ein solcher Antikörper kann zum Beispiel monoklonaler Antikörper (mAb) sein. Antikörper, die in der Erfindung eingesetzt werden, sind in einigen Ausführungsformen in einem Menschen nicht immunogen. Sie binden typischerweise an ein Epitop in der extrazellulären Domäne von CTLA-4. In einer Ausführungsform ist der Antikörper ein humaner monoklonaler IgG4λ oder ein Fragment davon. Ein geeigneter Antikörper kann zum Beispiel eine Gleichgewichtskonstante (K_D) von wenigstens etwa 10^–6 M in Bezug auf humanes CLTA-4 haben, zum Beispiel wenigstens etwa 10^–8 M. Der Antikörper kann ein IgG-Antikörper sein, wie zum Beispiel IgG4.In one embodiment, the invention provides an antibody that specifically binds to the CDR2-like region around methionine 55 of human CTLA-4. Such an antibody may be, for example, monoclonal antibody (mAb). Antibodies used in the invention are, in some embodiments, non-immunogenic in a human. They typically bind to an epitope in the extracellular domain of CTLA-4. In one embodiment, the antibody is a human monoclonal IgG4λ or a fragment thereof. For example, a suitable antibody may have an equilibrium constant (K _D ) of at least about 10 ^-6 M with respect to human CLTA-4, for example at least about 10 ^-8 M. The antibody may be an IgG antibody, such as IgG4 ,

In noch einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung CTLA-4 und eine lösliche Form dieses bestimmten Rezeptors, der die CTLA-4-Extrazellulardomäne ist. Ein monoklonaler Antikörper gegen die CDR2-ähnliche Region um das Methionin 55 kann in einigen Ausführungsformen mit Molekülen konjugiert oder an diese fusioniert sein. Diese Molekülen können z. B. die Serumhalbwertszeit desselben erhöhen. Sie können als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert sein, die den monoklonalen Antikörper und einen physiologisch zulässigen Träger aufweist. Antikörper, die an die CDR2-ähnliche Region um das Methionin 55 binden, können in einigen Ausführungsformen an ein heterologes Polypeptid oder an magnetische Partikel fusioniert sein. Der Antikörper oder das entsprechende Fusionsprodukt davon können verwendet werden, um CTLA-4 zu isolieren und/oder zu reinigen.In yet another aspect, the invention relates to CTLA-4 and a soluble form of this particular receptor, which is the CTLA-4 extracellular domain. A monoclonal antibody to the CDR2-like Region around the methionine 55 may in some embodiments be conjugated to or fused to molecules. These molecules can, for. B. increase the serum half life of the same. They may be formulated as a pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody and a physiologically acceptable carrier. Antibodies that bind to the CDR2-like region around the methionine 55 may, in some embodiments, be fused to a heterologous polypeptide or to magnetic particles. The antibody or its corresponding fusion product can be used to isolate and / or purify CTLA-4.

In den Abbildungen zeigt 1 die vollständige Proteinsequenz der humanen CTLA-4 Isoformen A und B, in denen kritische Aminosäuren markiert sind, die CDR1, 2 und 3 entsprechen. Sterne zeigen Aminosäureidentität an.In the pictures shows 1 the complete protein sequence of the human CTLA-4 isoforms A and B, in which critical amino acids corresponding to CDR1, 2 and 3 are labeled. Stars indicate amino acid identity.

2 illustriert das Durchmustern von Peptiden mittels Immunoblot. Dargestellt ist die Spezifität monoklonaler Antikörper gegen die CDR2-ähnliche Region um Methionin 55 von humanen CDLA-4. Es wurde 1 μg/ml gereinigten monoklonalen Antikörpers eingesetzt, um das bindende Epitop zu bestimmen. Sequenzen von EYASPGKATEVRVTV, KVELMYPPPYYLGIG und QYIKANSKFIGITEL zeigen die CDR-1 umfassende Region, die CDR3 umfassende Region, bzw. das T-Zell-Epitop (kursiv), das für die ortsgerichtete Immunisierung eingesetzt wurde. 2 illustrates the screening of peptides by immunoblot. Shown is the specificity of monoclonal antibodies against the CDR2-like region around methionine 55 of human CDLA-4. 1 μg / ml of purified monoclonal antibody was used to determine the binding epitope. Sequences of EYASPGKATEVRVTV, KVELMYPPPYYGIG and QYIKANSKFIGITEL show the CDR-1 comprising region, the CDR3 comprising region, and the T cell epitope (italic) used for site-directed immunization.

3 zeigt die immunologischen und biochemischen Eigenschaften der gegen CTLA-4 gerichteten monoklonalen Antikörper. 3A zeigt die Zuordnung zu Isotypen und Subtypen durch Immobilisieren anti-humaner Igs wie angegeben. Das Bindungsprofil des monoklonalen Antikörpers wurde anschließend durch einen biotinylierten CTLA-4 Ig aus Maus und Avidin-Peroxidase-Konjugate nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, dass der entsprechende monoklonale Antikörper zu einer Form des IgG4λ gehört. 3B zeigt die Bestimmung des isoelektrischen Punktes des monoklonalen anti-CTLA-4 IgG4λ (Spur 4 und Spur 8) durch isoelektrische Fokussierung. Zum Vergleich wurden ein monoklonaler humaner Myeloma-IgG1λ (Spuren 2 und 6) und IgG4λ (Spuren 3 und 7) parallel analysiert. Die elektrophoretischen Muster wurden entweder durch Färbung mit dem Triphenylmethan-Farbstoff Coomassie Brilliant-Blau (Spuren 1–5) oder durch Immunoblot (Spuren 6–8) mittels anti-humanem IgG sichtbar gemacht, der mit Peroxidase und FAST DAB (Sigma) konjugiert war. Basierend auf der Kalibrierung durch lineare Regression von Standard-Proteinmarkern liegen die berechneten isoelektrischen Punkte von humanen IgG1λ, IgG4λ und monoklonalem Anti-CTLA-4 Antikörper etwa im Bereich von 7,92–8,79, 5,76–6,52 bzw. 7,87–8,41. 3C zeigt die Bestimmung der Affinität durch IAsys. Oberflächenplasmonresonanz wurde bei 25°C mit steigenden Konzentrationen von monoklonalem Anti-CTLA-4-Antikörper an gereinigtem, unmarkiertem CTLA-4 Ig aus Maus untersucht. Die gerade Linie in der kleinen Einfügung wurde durch Auftragen von k_obs gegen die Konzentration des ligierten Antikörpers erhalten und ergab eine k_diss (der Achsenabschnitt) von 16,81 und einen k_ass-Wert (die Steigung) von 4,2 × 10⁹. Es wurde eine K_D (k_diss/k_ass) von 4 × 10^–9 M erhalten. 3 shows the immunological and biochemical properties of the monoclonal antibodies directed against CTLA-4. 3A shows the assignment to isotypes and subtypes by immobilizing anti-human Igs as indicated. The binding profile of the monoclonal antibody was then detected by a biotinylated murine CTLA-4 Ig and avidin-peroxidase conjugates. The results show that the corresponding monoclonal antibody belongs to a form of IgG4λ. 3B Figure 1 shows the determination of the isoelectric point of the monoclonal anti-CTLA-4 IgG4λ (lane 4 and lane 8) by isoelectric focusing. For comparison, a monoclonal human myeloma IgG1λ (lanes 2 and 6) and IgG4λ (lanes 3 and 7) were analyzed in parallel. The electrophoretic patterns were visualized either by staining with the triphenylmethane dye Coomassie Brilliant Blue (lanes 1-5) or by immunoblotting (lanes 6-8) using anti-human IgG conjugated to peroxidase and FAST DAB (Sigma) , Based on calibration by linear regression of standard protein markers, the calculated isoelectric points of human IgG1λ, IgG4λ and anti-CTLA-4 monoclonal antibody are approximately in the range of 7.92-8.79, 5.76-6.52 and from 7.87 to 8.41. 3C shows the determination of affinity by IAsys. Surface plasmon resonance was examined at 25 ° C with increasing concentrations of monoclonal anti-CTLA-4 antibody on purified, unlabelled mouse CTLA-4 Ig. The straight line in the small insert was obtained by _plotting k _obs against the concentration of the ligated antibody, giving a k _diss (the intercept) of 16.81 and a k _ass (slope) of 4.2 x 10 ⁹ , A K _D (k _diss / k _ass ) of 4 × 10 ^-9 M was obtained.

4 zeigt, dass die Bindung eines hier beschriebenen Anti-CTLA-4 und die eines CD80/CD86-Agonisten an humanes CTLA-4 sich nicht gegenseitig ausschließen. Werte wurden durch einen Ligandenkompetitions-Assay erhalten, der die Fähigkeit des vollständig humanen monoklonalen Anti-CTLA-4 (durchgezogene Linie) und BNI3(gepunktete Linie)-Anti-CTLA-4 zeigt, mit den CD80/CD86 und CTLA-4 Wechselwirkungen zu kompetitieren. Biotinyliertes CD80-Ig aus Maus oder CD86-Ig aus Maus in angegebenen steigenden Konzentrationen der monoklonalen Antikörper (10^–3–10 μg/ml) wurden in Vertiefungen von Mikrotiterplatte inkubiert, die mit gereinigtem CTLA-4 Ig aus Maus beschichtet waren. Gebundenes CD80/CD86 wurde mit Avidin-Peroxidase-Konjugat und einem Peroxidasesubstrat detektiert. Die gezeigten Daten sind für drei Experimente repräsentativ. 4 shows that binding of an anti-CTLA-4 described herein and that of a CD80 / CD86 agonist to human CTLA-4 are not mutually exclusive. Values were obtained by a ligand competition assay demonstrating the ability of the fully human monoclonal anti-CTLA-4 (solid line) and BNI3 (dotted line) anti-CTLA-4 to interact with the CD80 / CD86 and CTLA-4 interactions compete. Mouse mouse biotinylated CD80-Ig or murine CD86-Ig in indicated increasing concentrations of monoclonal antibodies (10 ^-3 - 10 μg / ml) were incubated in wells of microtiter plate coated with purified murine CTLA-4 Ig. Bound CD80 / CD86 was detected with avidin-peroxidase conjugate and a peroxidase substrate. The data shown are representative of three experiments.

5 zeigt repräsentative kombinierte Daten aus dem ELISA humaner CTLA-4-Detektion, bei der verfügbare monoklonale Antikörper und rekombinante humane CD80 und CTLA-4 verwendet wurden. Die Messungen erfolgten mit kommerziell erhältlichen CTLA-4 Ig aus Maus als Standard. Die ELISA-Untersuchung zeigt eine Nachweisgrenze von 0,39, 1,56 bzw. 6,25 ng/ml bei einer Untersuchung mit einem Paar aus humanem monoklonalen IgG4λ und CD80 (⧫), den humanen IgG4λ und BNI3 (

6A und 6B zeigen die Wirkung isolierter T_reg-Zellen, basierend auf der intrinsischen Oberflächenexpression von CTLA-4. 6A zeigt den Nachweis von FOXP3-Genexpression relativ zu GAPDH-Expression durch Echtzeit-PCR-Analyse in gereinigtem CD4⁺CD25^–-(

Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe verwendet, deren beabsichtigte Definitionen wie folgt sind.at The description of the present invention will be made as follows Used terms whose intended definitions are as follows.

Ein „vollständig humaner Antikörper" ist ein Antikörper, der ausschließlich humane Sequenzen enthält. Eine analoge Bedeutung haben Begriffe wie „vollständig humaner Ursprung". Ein entsprechender Antikörper kann zum Beispiel ein monoklonaler Antikörper sein.A "complete human antibody "is an antibody that is used exclusively contains human sequences. Have an analogous meaning Terms like "completely human origin" corresponding antibody may for example be a monoclonal Be antibody.

„Lösliches CTLA-4" oder „sCTLA-4" ist ein CTLA-4-Molekül, das weder eine Transmembrandomäne noch einen cytoplasmatischen Schwanz enthält. Es stellt die native humane Sequenz der CTLA-4 Isoform B dar (1). Die „extrazelluläre CTLA-4-Domäne" oder „CTLA-4-Extrazellulardomäne" ist eine Form des CTLA-4, die zumindest im Wesentlichen frei von der Transmembran- und der cytoplasmatischen Domäne des CTLA-4 ist. In der Regel wird die „extrazelluläre CTLA-4-Domäne" eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens etwa 95% mit der Aminosäuresequenz von CTLA-4 Isoform B, wie in 1 angegeben, haben. Sie weist zum Beispiel CDR1-, CDR2- und CDR3-ähnliche Regionen auf."Soluble CTLA-4" or "sCTLA-4" is a CTLA-4 molecule that contains neither a transmembrane domain nor a cytoplasmic tail. It represents the native human sequence of the CTLA-4 isoform B ( 1 ). The "extracellular CTLA-4 domain" or "CTLA-4 extracellular domain" is a form of CTLA-4 that is at least substantially free of the transmembrane and cytoplasmic domain of CTLA-4. Typically, the "extracellular CTLA-4 domain" will have an amino acid sequence having an amino acid sequence identity of at least about 95% with the amino acid sequence of CTLA-4 isoform B as described in U.S. Pat 1 indicated have. It has, for example, CDR1, CDR2 and CDR3-like regions.

Ein „Agonist" ist ein Molekül, das an Zellrezeptoren binden kann wie zum Beispiel CTLA-4. Durch die Bindung kann es verschiedene biologische Wirkungen auslösen und Änderungen der Zellfunktion einleiten. Endogene Agonisten sind üblicherweise natürlich vorkommende Liganden wie zum Beispiel Neurotransmitter und, im Falle von CTLA-4, CDR80 und CDR86. Beispiele für exogene Agonisten sind Arzneimittel.An "agonist" is a molecule that can bind to cell receptors like for example, CTLA-4. By binding it can be different biological Trigger effects and changes in cell function initiate. Endogenous agonists are usually natural occurring ligands such as neurotransmitters and, in the case of CTLA-4, CDR80 and CDR86. Examples of exogenous agonists are medicines.

Ein „Antagonist" ist ein Molekül, das an Rezeptoren wie zum Beispiel CTLA-4 binden kann, aber Signaltransduktionsmechanismen nicht aktiviert. Die biologische Wirkung eines gegebenen Antagonisten beruht auf einer Verhinderung der Bindung von einem oder mehreren Agonisten und einer Verhinderung der Rezeptoraktivierung, zum Beispiel blockierende monoklonale Antikörper.An "antagonist" is a molecule that binds to receptors such as CTLA-4 can bind, but does not activate signal transduction mechanisms. The biological effect of a given antagonist is based on preventing the binding of one or more agonists and preventing receptor activation, for example, blocking monoclonal antibodies.

„Nicht immunogen in einem Menschen" bezieht sich auf den Kontakt des betreffenden Polypetids auf einem physiologisch zulässigen Träger und in einer therapeutisch wirksamen Menge mit dem entsprechenden Gewebe eines Menschen. Bei diesem Kontakt wird kein Sensitivierungszustand oder Widerstand gegen das entsprechende Polypeptid beobachtet, wenn das betreffende Polypeptid nach einer angemessenen Latenzperiode, zum Beispiel 8 oder 14 Tage, ein zweites Mal verabreicht wird. Es wird vom Fachmann verstanden, dass ein Polypeptid von vollständig humanem Ursprung typischerweise ein Polypeptid repräsentiert, das typischerweise „nicht-immunogen in einem Menschen" ist."Not immunogenic in a human "refers to the contact of the subject Polypetids on a physiologically acceptable carrier and in a therapeutically effective amount with the appropriate tissue of a human. This contact does not become a sensitized state or resistance to the corresponding polypeptide observed when the polypeptide in question after an appropriate latency period, for example, 8 or 14 days, administered a second time. It The skilled person will understand that a polypeptide of complete human origin typically represents a polypeptide, typically "non-immunogenic in a human" is.

„Behandeln", „Verbessern" oder „Lindern" einer Krankheit oder eines medizinischen Zustands bedeutet ein Reduzieren oder Vermindern der Symptome der Krankheit oder des medizinischen Zustands, oder eine Verlangsamung des Voranschreitens der Krankheit/des medizinischen Zustands. Die Verminderung ist zum Beispiel wenigstens etwa 10%, zum Beispiel etwa 20%, etwa 30%, etwa 40%, etwa 50%, etwa 60%, etwa 70%, etwa 80% oder etwa 90%."Treat", "Improve" or "alleviating" a disease or a medical condition Condition means reducing or lessening the symptoms of the condition Illness or medical condition, or a slowdown the progress of the disease / medical condition. The Reduction, for example, is at least about 10%, for example about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80% or about 90%.

Eine „wirksame Menge" ist eine Menge eines Reagenzes, die ausreicht, eine beabsichtigte Wirkung zu erzielen. Beispielsweise ist für einen Antikörper, der zur Behandlung oder Linderung einer Krankheit eingesetzt wird, eine wirksame Menge eine solche Menge des Antikörpers, die ausreicht, die Symptome der Krankheit zu vermindern oder zu eliminieren oder den Fortschritt der Krankheit zu verlangsamen.An "effective Amount "is an amount of a reagent that is sufficient, an intended Effect. For example, for an antibody, used to treat or alleviate a disease, an effective amount of such an amount of the antibody, sufficient to alleviate or reduce the symptoms of the disease eliminate or slow the progress of the disease.

Eine „Probe" ist ein Aliquot oder ein repräsentativer Teil einer Substanz, eines Materials oder einer Population. Eine Probe kann zum Beispiel eine Probe Wasser, Abwasser, Öl, Sand, Blut, biologisches Gewebe, Urin oder Kot sein. Eine „biologische Probe" ist eine Probe, die einem biologischen Subjekt entnommen worden ist oder darin vorhanden ist, zum Beispiel aus bzw. in einem Menschen.A sample" is an aliquot or a representative part of a substance, of a material or a population. For example, a sample can a sample of water, sewage, oil, sand, blood, biological Be tissue, urine or feces. A "biological sample" is a sample taken from a biological subject or in it, for example from or in a human.

Die Begriffe „niedrigere Nachweisgrenze" oder „gesenkte" oder „verringerte Nachweisgrenze" beziehen sich, wenn im Zusammenhang mit einem Verfahren oder einer Verwendung benutzt, auf die Möglichkeit, noch Mengen oder Konzentrationen, z. B. einer Verbindung, eines Antikörpers oder einer Zellpopulation, nachweisen zu können, die mit einem Vergleichsverfahren nicht mehr detektierbar sind. Der Begriff Nachweisgrenze ist somit im Sinne des gängigen Gebrauchs zu verstehen als die niedrigste Menge oder Konzentration, die ein entsprechendes Verfahren, in der Lage ist zu detektieren.The Terms "lower detection limit" or "lowered" or "reduced detection limit" refer, if in the Related to a method or use, on the possibility of still quantities or concentrations, z. A compound, an antibody or a cell population to be able to do that with a comparison process anymore are detectable. The term detection limit is thus in the sense to understand the common use as the lowest Quantity or concentration, which is a corresponding method in the Location is to detect.

Der Begriff „Antikörper" wird, wenn hier verwendet, im weitesten Sinne verstanden. Unter den Begriff „Antikörper" fallen Immunglobuline, Fragmente davon, solange sie eine gewünschte biologische Wirkung zeigen und proteinöse Bindungsmoleküle mit Antikörperfunktion. Beispiele sind ein monoklonaler oder ein polyklonale Antikörper, eine Antikörperzusammensetzung mit polyepitoper Spezifität, ein bispezifischer Antikörper, oder ein einkettiges Molekül. Zu Antikörperfragmenten zählen z. B. Fab, F(ab')₂ oder Fv. Zu proteinösen Bindungsmolekülen mit Antikörperfunktion zählen z. B. ein sogenannter Glubody, ein Diabody, ein Triabody ( Iliades et al., 1997 ), ein Decabody ( Stone et al., 2007 ) und andere Domänenantikörper ( Holt et al., 2003 ). Weitere Beispiele eines proteinösen Bindungsmoleküls mit Antikörperfunktion sind ein Protein, das auf dem Ankyrin- ( Mosavi et al., 2004 ) oder Krystallingerüst ( WO 2001/04144 ) basiert, die von Skerra (2000) beschriebenen Proteine, ein AdNectin, ein Tetranectin, ein Avimer oder ein Peptoid. Ein Avimer enthält sog. A-Domänen, die als Abfolge mehrfacher Domänen in verschiedenen Zelloberflächenrezeptoren vorhanden sind ( Silverman et al., 2005 ). Adnectine entstammen einer Domäne des humanen Fibronectins und enthalten drei Schleifen, die so konstruiert werden können, dass sie ähnlich einem Immunglobulinmolekül an ein Zielmolekül binden ( Gill & Damle, 2006 ). Auch Tetranectine, die dem entsprechenden humanen homotrimeren Protein entstammen, enthalten Schleifenregionen in einer Lectindomäne vom C-Typ, die für eine gewünschte Bindung konstruiert werden können (ibid.). Peptoide, die als Proteinliganden fungieren können, sind oligo(N-alkyl)Glycine, die sich von Peptiden dadurch unterscheiden, dass ihre Seitenkette mit dem Amid-Stickstoffatom verbunden ist und nicht mit dem α-Kohlenstoffatom. Peptoide sind typischerweise gegen Proteasen und andere modifizierende Enzyme beständig und können eine deutlich höhere Zellgängigkeit zeigen als Peptide (siehe z. B. Kwon & Kodadek, 2007 ).As used herein, the term "antibody" is to be understood in the broadest sense The term "antibody" includes immunoglobulins, fragments thereof, as long as they exhibit a desired biological activity and proteinaceous binding molecules having antibody function. Examples are a monoclonal or a polyclonal antibody, an antibody composition with polyepitopic specificity, a bispecific antibody, or a single-chain molecule. To antibody fragments include z. B. Fab, F (ab ') ₂ or Fv. To proteinaceous binding molecules with antibody function include, for. B. a so-called Glubody, a Diabody, a Triabody ( Iliades et al., 1997 ), a decabody ( Stone et al., 2007 ) and other domain antibodies ( Holt et al., 2003 ). Further examples of a proteinaceous binding molecule having antibody function are a protein that is expressed on the anuranin ( Mosavi et al., 2004 ) or crystalline scaffold ( WO 2001/04144 ), the proteins described by Skerra (2000), an adnectin, a tetranectin, an avimer or a peptoid. An Avimer contains so-called A domains, which are present as a sequence of multiple domains in different cell surface receptors ( Silverman et al., 2005 ). Adnectins are derived from a domain of human fibronectin and contain three loops that can be engineered to bind to a target molecule similar to an immunoglobulin molecule ( Gill & Damle, 2006 ). Also, tetranectins derived from the corresponding human homotrimeric protein contain loop regions in a C-type lectin domain which can be constructed for a desired binding (ibid.). Peptoids that can function as protein ligands are oligo (N-alkyl) glycols, which differ from peptides in that their side chain is linked to the amide nitrogen atom and not to the alpha carbon atom. Peptoids are typically resistant to proteases and other modifying enzymes and can exhibit significantly higher cell permeability than peptides (see, e.g. Kwon & Kodadek, 2007 ).

Der Begriff „monoklonaler Antikörper (mAb)" bezieht sich, wenn hier verwendet, auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wird, d. h. die individuellen Antikörper der Population sind bis auf mögliche natürlich vorkommende Mutationen, die in kleinen Mengen vorhanden sein können, identisch. Monoklonale Antikörper sind typischerweise Immunglobuline. Sie sind hochspezifisch, indem sie gegen eine einzige antigene Stelle (Epitop) gerichtet sind. Der Zusatz „monoklonal" gibt die Karte des Antikörpers an als erhalten aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern. Er ist nicht in der Weise auszulegen, dass ein bestimmtes Herstellungsverfahren des Antikörpers durch bestimmte Techniken erforderlich wäre. In diesem Zusammenhang können monoklonale Antikörper durch Verfahren gewonnen werden, mit denen der Fachmann vertraut ist (siehe z. B. Köhler et al., 1975 , und U.S. Patent Nr. 4,376,110 ).As used herein, the term "monoclonal antibody (mAb)" refers to an antibody derived from a population of substantially homogeneous antibodies, ie, the individual antibodies of the population are, except for possible naturally occurring mutations, in small amounts Monoclonal antibodies are typically immunoglobulins and are highly specific in that they are directed against a single antigenic site (epitope) The term "monoclonal" indicates the map of the antibody as obtained from a substantially homogeneous population of antibodies , It is not to be construed as requiring a particular method of preparation of the antibody by certain techniques. In this regard, monoclonal antibodies can be obtained by methods familiar to those skilled in the art (see, eg, US Pat. Köhler et al., 1975 , and U.S. Patent No. 4,376,110 ).

Ein „funktionelles Derivat" eines monoklonalen Antikörpers ist eine Verbindung, die mit dem nativen monoklonalen Antikörperprotein eine qualitative biologische Eigenschaft gemein hat. Zu "funktionellen Derivaten" zählen zum Beispiel Fragmente von monoklonalen Antikörpern mit nativen Sequenzen, vorausgesetzt, dass sie eine biologische Aktivität mit dem entsprechenden monoklonalen Antikörper nativer Sequenz gemein haben. Der Begriff "Fragment" ist, wenn in Verbindung mit monoklonalen Antikörperfragmentderivaten verwendet, wie zum Beispiel Immuntoxinen, ebenso auszulegen, solange sie eine biologische Aktivität mit dem entsprechenden monoklonalen Antikörpern aktiver Sequenz gemein haben.A "functional Derivative of a monoclonal antibody is a compound, the one with the native monoclonal antibody protein qualitative biological property in common. To "functional Derivatives "include, for example, fragments of monoclonal Antibodies with native sequences, provided that they have a biological activity with the corresponding monoclonal Antibodies native sequence have in common. The term "fragment" when used in conjunction with monoclonal antibody fragment derivatives used, such as immunotoxins, interpreted as long as they have a biological activity with the corresponding monoclonal Antibodies of active sequence have in common.

Eine „magnetische Zellsortierung", „magnetische Zelltrennung" oder „magnetische Durchflusssortierung" ist eine Technik des Auswählens von Zellen, die darauf basiert, einen Gleichgewichtszustand bei der Isolation zwischen magnetischen und nichtmagnetischen Zellströmen in einer fließenden Suspension zu erreichen. Die Selektivität hängt vom Markieren der Zelle oder Zellen mit Antikörpern, die gegen Zelloberflächen-Markierungsmoleküle gerichtet sind und die mit einem magnetischen Kolloid markiert sind. Das charakteristische Merkmal des Verfahrens ist die Fähigkeit Zellen basierend auf der Expression von Oberflächenantigenen zu fraktionieren. Um diese Technik für den Zweck einer positiven Selektion, insbesondere Anreicherung, oder für den Zweck einer Anreicherung von Zellen einzusetzen, die mit humanen monoklonalem IgG4λ Antikörper (wie in Beispiel 3 beschrieben) markiert sind, können 1 × 10⁸ PBMC in Einzelzellsuspension zunächst mit dem monoklonalen Antikörper bei 20 μg/ml Reaktionspuffer für 15 Minuten bei 4°C markiert werden. Nach dem Entfernen ungebundenen monoklonalen Antikörpers durch Waschen werden 0,2 ml von antihumanen IgG aus Maus auf Mikropartikeln (Miltenyi Biotec) zugegeben und für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach Waschungen zum Entfernen ungebundener Mikropartikel werden die resuspendierten Zellen in einem magnetischen Feld, das vom Hersteller bereitgestellt wird (VarioMACS Separator), magnetisch getrennt. Die isolierte Zellpopulation stellt Zellen dar, die intrinsisch CTLA-4 auf ihrer Oberfläche exprimieren und repräsentiert somit T_reg-Zellen."Magnetic cell sorting", "magnetic cell separation" or "magnetic flow sorting" is a technique of selecting cells based on achieving equilibrium in the isolation between magnetic and non-magnetic cell currents in a flowing suspension A cell or cells having antibodies directed against cell surface marker molecules and labeled with a magnetic colloid The characteristic feature of the method is the ability to fractionate cells based on the expression of surface antigens In order to use this technique for the purpose of positive selection, in particular enrichment, or for the purpose of enrichment of cells labeled with human IgG4λ monoclonal antibody (as described in Example 3), 1 x 10 ⁸ PBMC in single cell suspension may first be coupled with the monoclonal antibody 20 μg / ml reaction buffer for 15 minutes at 4 ° C are marked. After removing unbound monoclonal antibody by washing, 0.2 ml of mouse anti-human IgG on microparticles (Miltenyi Biotec) is added and incubated for 15 minutes at 4 ° C. After washes to remove unbound microparticles, the resuspended cells are magnetically separated in a magnetic field provided by the manufacturer (VarioMACS Separator). The isolated cell population represents cells that intrinsically express CTLA-4 on their surface and thus represents T _reg cells.

Ein „Thymidinaufnahmeuntersuchungsverfahren" oder „Verfahren zur Untersuchung der Thymidinaufnahme" bestimmt die Fähigkeit von Zellen, zu expandieren. Es kann eingesetzt werden, um die Suppression der T-Zell-Proliferation als Reaktion auf ein Gedächtnisantigen, auch Recall-Antigen genannt, durch isolierte T_reg-Zellen zu messen, d. h. auf ein Antigen, durch das das betreffende Immunsystem mit hoher Wahrscheinlichkeit bereits mehrmals stimuliert wurde und für das somit eine T-zelluläre Sensibilisierung sehr wahrscheinlich ist. Um dieses Untersuchungsverfahren durchzuführen, werden 5 × 10⁵ PBMC pro Vertiefung von geimpften Spendern eingesetzt. Sie werden wie in Beispiel 3 beschrieben beispielsweise mit 5 μg/ml an Tetanustoxoid (TT) aktiviert. Während der durch TT angetriebenen Proliferation werden die Zellen in Kulturschalen mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Diese enthalten eine Testprobe mit oder ohne isolierte T_reg-Zellen (solche Testproben können optional verdünnt werden). Die Zellen werden für 3 bis 7 Tage in einem Zellkulturinkubator bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ und Luft kultiviert. Die Proliferation kann durch die Aufnahme von ³H-Thymidin gemessen werden. während der letzten 16 Stunden des Untersuchungsverfahrens werden jeder Vertiefung 1 μCi von ³H-Thymidin für die letzten 16 Stunden zugesetzt. Die Proliferation kann mit einem Szintillationszähler gemessen werden, zum Beispiel mittels eines Packard TopCount^® Microplate Scintillation Counters (PerkinElmer, Shelton, CT). Es kann erwartet werden, dass T_reg-Zellen relativ zu einer Kontrolle eine statistisch signifikante Abnahme (bis zu einem P-Wert von 0,05) der ³H-Thymidinaufnahme induzieren.A "thymidine uptake assay" or "thymidine uptake assay" technique determines the ability of cells to expand. It can be used to isolate the suppression of T cell proliferation in response to a memory antigen, also called a recall antigen To measure T _reg cells, ie an antigen by which the immune system in question has been stimulated with high probability several times and for which thus T cell sensitization is very likely. To perform this assay, 5 x 10 ⁵ PBMC are used per well of vaccinated donors. They are activated as described in Example 3, for example with 5 ug / ml of tetanus toxoid (TT). During TT-driven proliferation, the cells are plated in 96-well culture dishes. These contain a test sample with or without isolated T _reg cells (such test samples can be optionally diluted). The cells are cultured for 3 to 7 days in a cell culture incubator at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO ₂ and air. Proliferation can be measured by uptake of ³ H-thymidine. during the last 16 hours of the assay, 1 μCi of ³ H-thymidine is added to each well for the last 16 hours. Proliferation can be measured using a scintillation counter, for example by means of a Packard TopCount ^® Microplate Scintillation Counter (PerkinElmer, Shelton, CT). It can be expected that T _reg cells induce a statistically significant decrease (up to a P value of 0.05) in ³ H-thymidine uptake relative to a control.

Die vorliegende Erfindung fundiert auf der Entdeckung von humanen monoklonale IgG4λ mAbs gegen die CDR2-ähnliche Region um das Methionin 55 des CTLA-4. Das so definierte Epitop findet sich bei sowohl CTLA-4 als auch sCTLA-4. Die hier beschriebenen Experimente zeigen, dass dieser monoklonale Antikörper ein vollständig humaner monoklonaler Antikörper ist, der keine Rolle bei der Bindung von CTLA-4 an seine endogenen B7-Liganden zu spielen scheint. Es wurde insbesondere gefunden, dass dieser Antikörper unter bestimmten Bedingungen die CTLA-4-CD80-Wechselwirkung verstärkt, was darauf hindeutet, dass er in Kombination mit humanem CD80 zur Detektion von sCTLA-4 eingesetzt werden kann. Die Gegenwart von natürlichen Liganden von CTLA-4 ist in Präparationen von mononuklearen Zellen aus peripherem Blut (PBMC) verbreitet. Daher werden von der nachfolgenden Diskussion andere Verwendungen dieses monoklonalen Antikörpers, zum Beispiel einstufige Verfahren der Anreicherung humaner T_reg-Zellen offensichtlich und einleuchtend werden. Es folgt eine Beschreibung, wie ein solcher monoklonaler Antikörper hergestellt werden kann.The present invention is based on the discovery of human monoclonal IgG4λ mAbs against the CDR2-like region around the methionine 55 of CTLA-4. The epitope thus defined is found in both CTLA-4 and sCTLA-4. The experiments described here demonstrate that this monoclonal antibody is a fully human monoclonal antibody that appears to play no role in the binding of CTLA-4 to its endogenous B7 ligands. In particular, it has been found that under certain conditions this antibody enhances the CTLA-4 CD80 interaction, suggesting that it can be used in combination with human CD80 for the detection of sCTLA-4. The presence of natural ligands of CTLA-4 is widespread in preparations of peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Therefore, from the discussion below, other uses of this monoclonal antibody, for example, one-step methods of enriching human T _reg cells, will be apparent and obvious. The following is a description of how such a monoclonal antibody can be made.

Kulturmaterialien und Reagenzien sind dem Fachmann bekannt und kommerziell erhältlich. Das verwendete Kulturmedium ist beispielsweise RPMI-1640 (HyClone, Logan, UT), dem 1 × nichtessentielle Aminosäuren (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 10% fötales Kälberserum (FBS; Life Technologies) und 50 μg/ml Gentamycin und Kanamycin (Sinton Chemical & Pharmaceutical, Hsinchu, Taiwan) zugesetzt werden. In einem Antigenspezifischen und Kompetitions-enzymgekoppelten Immunadsorptionstest (ELISA) werden gereinigte und biotinylierte Fusionsproteine aus humanen CTLA-4 und Ig aus Maus (rhCTLA-4-Ig aus Maus oder CD152-IG aus Maus), CD80-Ig aus Maus und CD86-Ig aus Maus (Ancell, Bayport, MN) verwendet. Sie werden zusammen mit Peroxidase markiertem Ziegenantikörpern gegen humanes IgG und IgM (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) oder Avidin-Meerettichperoxidase (eBioscience, San Diego, CA) als Nachweissystem eingesetzt. Der Fluorochrom-konjugierte monoklonale Antikörper aus Maus gegen humane IgGs und humanes CD3 (UCHT1; IgG1 aus Maus) und der monoklonale Antikörper aus Ratte gegen Maus-IgG2a ist von Becton Dickinson Immunocytometry Systems (San Jose, CA) bzw. Abcam (Cambridge, UK) kommerziell erhältlich. Der zur T-Zell-Aktivierung verwendete Anti-CD3 (OKT3; Maus-IgG2a) und der antagonistische Anti-CD152 (BNI3; Maus-IgG2a) können von eBioscience bzw. von Abcam bezogen werden.Culture materials and reagents are known in the art and commercially available. The culture medium used is, for example, RPMI-1640 (HyClone, Logan, UT), the 1 × nonessential amino acids (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 10% fetal calf serum (FBS, Life Technologies) and 50 μg / ml gentamycin and kanamycin (Sinton Chemical & Pharmaceutical, Hsinchu, Taiwan). In an antigen specific and competition enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) are purified and biotinylated fusion proteins from human CTLA-4 and Ig Mouse (rhCTLA-4-Ig from mouse or mouse CD152-IG), CD80-Ig Mouse and mouse CD86-Ig (Ancell, Bayport, MN). you will be together with peroxidase-labeled goat antibodies human IgG and IgM (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) or avidin-horseradish peroxidase (eBioscience, San Diego, CA) as Detection system used. The fluorochrome-conjugated monoclonal Mouse antibody against human IgGs and human CD3 (UCHT1; Mouse IgG1) and rat monoclonal antibody against mouse IgG2a is from Becton Dickinson Immunocytometry Systems (San Jose, CA) and Abcam (Cambridge, UK) are commercially available. The anti-CD3 used for T-cell activation (OKT3, mouse IgG2a) and the antagonist anti-CD152 (BNI3; mouse IgG2a) from eBioscience or Abcam.

Um das spezifische Epitop von humanem CTLA-4 zu definieren, das durch den monoklonalen Antikörper erkannt wird, können Reihen (sog. „Arrays") von Peptiden verwendet werden (Genesis Biotech, Taipei, Taiwan und Fine Research Biochem, Taoyuan, Taiwan), die in-situ synthetisierte Peptide enthalten, die beispielsweise auf einer speziellen Membran immobilisiert sind. In Kürze werden 1 μg/ml eines durch Protein A (Proteus MIDI kit, ProChem, Littleton, MA) gereinigten monoklonalen Antikörpers für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach Waschen kann der membrangebundene monoklonale Antikörper sichtbar gemacht werden, indem verdünnter anti-humaner IgG zugegeben wird, welcher mit Peroxidase (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) konjugiert ist, sowie FAST^TM DAB (Sigma). Die Menge des gebundenen monoklonalen Antikörpers kann auf den eingescannten Bildern berechnet werden, beispielsweise mittels der Image-Pro Plus 4.5 Software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).To define the specific epitope of human CTLA-4 recognized by the monoclonal antibody, arrays of peptides may be used (Genesis Biotech, Taipei, Taiwan and Fine Research Biochem, Taoyuan, Taiwan), Briefly, 1 μg / ml of a monoclonal antibody purified by Protein A (Proteus MIDI kit, ProChem, Littleton, MA) is incubated for two hours at room temperature with shaking After washing, the membrane-bound monoclonal antibody can be visualized by adding diluted anti-human IgG conjugated to peroxidase (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) and FAST ^™ DAB (Sigma) Antibody can be calculated on the scanned images, for example using the Image-Pro Plus 4.5 software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

Untersuchungsverfahren zur Bestimmung der Affinität und Bindungsspezifität, inklusive Kompetitions- und Nichtkompetitions-Untersuchungsverfahren, sind dem Fachmann bekannt. Es wird beispielhaft ein nichtkompetitives Verfahren beschrieben. Die Affinität des monoklonalen Antikörpers gegenüber rhCTLA-4-Maus-Ig-Fusionsprotein kann mit einem optischen Biosensor wie IAsys^® (Affinity Sensors, Cambridge, UK) gemäß den Angaben des Herstellers bestimmt werden. Kurz gesagt, werden 200 μg/ml von dialysiertem und verdünnten rhCTLA-4-Maus-Ig auf der aktivierten Oberfläche von Carboxymethyldextran-Küvetten in 10 mM Natriumacetatpuffer bei pH 3,8 immobilisiert. Nach Aufbereitung mit 10 mM HCl kann die Immobilisierung von 2 mg/ml CD152-Maus-Ig in einem Ansprechen von 1100 Bogensekunden resultieren. Dies stellt die höchste Immobilisierungsreaktion für CD152 dar und ergibt eine Ligandenbindungskapazität (R_max) von 300 Bogensekunden. Reihenverdünnungen des monoklonalen Antikörpers in PBS, also z. B. 1,34 × 10^–9 M, 6,70 × 10^–9 M, 1,34 × 10^–8 M, 2,68 × 10^–8 M und 5,36 × 10^–8 M, werden in die mit CD152 beschichteten Küvetten gegeben (Endvolumen 50 μl). Die Affinitätskonstanten (K_D) können aus diesen Messungen als k_diss/k_ass berechnet werden, zum Beispiels mittels des FASTFIT^®-Programms, das der genannte Hersteller bereitstellt.Assays for determining affinity and binding specificity, including competition and non-competition assay procedures, are known to those skilled in the art. By way of example, a noncompetitive method will be described. The affinity of the monoclonal antibody to rhCTLA-4-mouse-Ig fusion protein may be with an optical biosensor as IAsys ^® (Affinity Sensors, Cambridge, UK) according to the manufacturer determined. Briefly, 200 μg / ml of dialyzed and diluted rhCTLA-4 mouse Ig are immobilized on the activated surface of carboxymethyldextran cuvettes in 10 mM sodium acetate buffer at pH 3.8. After treatment with 10 mM HCl, immobilization of 2 mg / ml CD152 mouse Ig may result in a response of 1100 arcseconds. This represents the highest immobilization reaction for CD152 and gives a ligand binding capacity (R _max ) of 300 arcseconds. Serial dilutions of the monoclonal antibody in PBS, so z. B. 1.34 × 10 ^-9 M, 6.70 × 10 ^-9 M, 1.34 × 10 ^-8 M, 2.68 × 10 ^-8 M and 5.36 × 10 ^-8 M are in the given with CD152 coated cuvettes (final volume 50 μl). The affinity constants (K _D) can be calculated as k _diss / k _ass from these measurements, for example by means of the FASTFIT ^® program that provides the aforementioned manufacturer.

Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zur Messung von humanem sCTLA-4 in biologischen Proben bereit. In soweit wurde ein Immunverfahren zur Quantifikation von sCTLA-4 entwickelt. Wie Beispiel 2 zeigt, kann eine lösliche Form von CTLA-4 wenigstens mit 10-fach höherer Empfindlichkeit nachgewiesen werden als herkömmliche Verfahren, die im Fachgebiet verwendet werden. Zur Veranschaulichung wurden sog. Sandwich-ELISA-Verfahren zum Nachweis von sCTLA-4 im humanen Serum eingesetzt, also Verfahren, bei denen zwei Antikörper verwendet werden, die beide spezifisch an das nachzuweisende Antigen binden, aber an unterschiedlichen Stellen daran binden. Für diesen Zweck wurden die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen als unlöslichem Träger mit einem blockierenden monoklonalen Anti-CTLA-Antikörper beschichtet (Klon BNI3; BD Pharmingen) oder mit einem nicht-blockierenden CTLA-4 mAb. Nach Absättigen mit Rinderserumalbumin werden in die Vertiefungen 100 μl einer 1:3-Verdünnung von Testproben gegeben. Die Platten werden für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. Als nächstes wird ein Nachweissystem zugegeben, das entweder biotinylierte monoklonale Anti-CTLA-4 Antikörper (Klon AS-33, Antikörperlösungen) oder biotinyliertes CD80-Maus-Ig (Ancell) enthält. Die Reaktionen werden für eine Stunde inkubiert. Die Reaktionen werden mittels eines Streptavidin-Peroxidase-Komplexes (Zymed) und eines 3,39,5,59-Tetramethyl-Benzidin-Substrats entwickelt. Die optische Dichte (OD) wird bei 450 nm bestimmt. Mit Hilfe einer Verdünnungsreihe eines kommerziell erhältlichen CTLA-4-Ig-Fusionsproteins (Ancell) kann eine Standardkurve erhalten werden. Die Bindung kann mittels einer Vielzahl an Verfahren bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Nach einer Inkubationszeit, die ausreicht, um ein Bindungsgleichgewicht eintreten zu lassen, wird der unlösliche Träger gewaschen und die verbliebene Markierung bestimmt. Zu geeigneten Bestimmungsverfahren zählen ELISA, RIA, FIA und Durchflusscytometrie.The The present invention provides a novel method of measuring human sCTLA-4 in biological samples. In so far became one Immune method developed for the quantification of sCTLA-4. Like example 2, a soluble form of CTLA-4 may be at least be detected with 10-fold higher sensitivity as conventional methods used in the art become. For illustration, so-called sandwich ELISA methods were used used for the detection of sCTLA-4 in human serum, ie method, where two antibodies are used, both specific bind to the antigen to be detected, but at different Bind to it. For this purpose, the wells were a 96-well microtiter plate as insoluble Carrier with a blocking monoclonal anti-CTLA antibody coated (clone BNI3; BD Pharmingen) or with a non-blocking CTLA-4 mAb. After saturation with bovine serum albumin into the wells 100 μl of a 1: 3 dilution given by test samples. The plates are left for 60 minutes incubated at room temperature and washed to give unbound material to remove. Next, a detection system is added either biotinylated monoclonal anti-CTLA-4 antibody (Clone AS-33, antibody solutions) or biotinylated CD80 mouse Ig (Ancell). The reactions are for incubated for one hour. The reactions are by means of a streptavidin-peroxidase complex (Zymed) and a 3,39,5,59-tetramethylbenzidine substrate. The optical density (OD) is determined at 450 nm. With the help of a Serial dilution of a commercially available CTLA-4-Ig fusion protein (Ancell), a standard curve can be obtained. The bond can determined by a variety of methods known to those skilled in the art are known. After an incubation period that is sufficient to one Bonding equilibrium is the insoluble Carrier washed and determined the remaining mark. Suitable methods of determination include ELISA, RIA, FIA and flow cytometry.

Es wird auch ein Verfahren zur Isolierung von T_reg-Zellen aus einer Probe bereitgestellt. Dieses Verfahren weist auf: in Kontaktbringen des Antikörpers oder eines funktionellen Derivates davon mit einer geeigneten Probe, so dass ein Antigen-Antikörperkomplex aus dem Antikörper und einem eventuellen CTLA-4, das auf der Oberfläche einer oder mehrerer Zellen in der Probe vorhanden ist, sowie Detektion des Vorhandenseins eines so gebildeten Komplexes. Dadurch wird das Vorhandensein von extrazellulären CTLA-4 in der Probe festgestellt. Das Isolieren von T_reg-Zellen kann beispielsweise auch so durchgeführt werden, dass nur ein positiver Selektionsschritt durchgeführt wird bzw. werden muss. Dadurch werden die Zellen geschont bzw. bewahrt, die spezifisch extrazellulares CTLA-4 exprimieren. Unter minimaler in vitro-Beeinflussung und mit maximaler Lebensfähigkeit können somit Populationen von sowohl T_reg-Zellen als auch Nicht-T_reg-Zellen wieder gewonnen werden. Dazu veranschaulicht Beispiel 3, wie eine Einzelzell-Suspension von 1 × 10⁸ PBMC zunächst mit dem monoklonalen Antikörper bei 20 μg/ml in Reaktionspuffer für 15 Minuten bei 4°C markiert werden kann. Nach dem Entfernen von ungebundenem monoklonalen Antikörper durch Waschen werden 0,2 ml Mikropartikel mit anti-humanem IgG aus Maus (Miltenyi Biotec) zugegeben und für 15 Minuten bei 4°C entwickelt. Nach Waschschritten zur Entfernung ungebundener Mikropartikel werden die resuspendierten Zellen in einem magnetischen Feld magnetisch aufgetrennt. Die isolierte Zellpopulation stellt somit T_reg-Zellen dar, die intrinsisch auf ihrer Oberfläche CTLA-4 exprimieren. Eine negativ oder exklusiv ausgewählte Nicht-T_reg-Population kann dementsprechend anschließend stimuliert werden, zum Beispiel durch ein Gedächtnisantigen (s. o.), ohne längere Selektionsschritte und somit ohne Gefährdung ihres Überlebens.There is also provided a method of isolating T _reg cells from a sample. This method comprises: contacting the antibody or a functional derivative thereof with a suitable sample such that an antigen-antibody complex of the antibody and any CTLA-4 present on the surface of one or more cells in the sample, as well as Detecting the presence of a complex so formed. This detects the presence of extracellular CTLA-4 in the sample. The isolation of T _reg cells can, for example, also be carried out in such a way that only a positive selection step is or must be carried out. This protects or preserves the cells that specifically express extracellular CTLA-4. Thus, with minimal in vitro interference and with maximum viability, populations of both T "_reg" cells and non-T "_reg" cells can be recovered. Example 3 illustrates how a single cell suspension of 1 x 10 ⁸ PBMC can be labeled first with the monoclonal antibody at 20 μg / ml in reaction buffer for 15 minutes at 4 ° C. After removing unbound monoclonal antibody by washing, 0.2 ml mouse anti-human IgG microparticles (Miltenyi Biotec) are added and developed for 15 minutes at 4 ° C. After washing to remove unbound microparticles, the resuspended cells are magnetically separated in a magnetic field. The isolated cell population thus represents T _reg cells that express intrinsically on their surface CTLA-4. Accordingly, a negatively or exclusively selected non-T _reg population can subsequently be stimulated, for example by a memory antigen (see above), without prolonged selection steps and thus without jeopardizing its survival.

In Beispiel 3 wird ebenfalls ein funktionelles Derivat, d. h. ein Immuntoxin, durch Konjugation von Diphtherietoxin mit gereinigtem IgG4λ hergestellt. Gereinigter IgG4λ mAb wird mit einem sechsfachen Überschuss an N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat (GE Healthcare Bio-Sciences) in PBS gemischt. Anschließend lässt man das Gemisch für 30 Minuten bei Raumtemperatur reagieren und dialysiert anschließend gegen PBS. Der modifizierte IgG4λ wird dann mit einem dreifachen Überschuss an reduziertem Diphtherietoxin (Merck Taiwan Ltd., Taipei, Taiwan) gemischt sowie mit 10-fach konzentrierter PBS (10% des Gesamtvolumens) und für 36 h bei 40°C aufbewahrt. Das Produkt wird dialysiert und mit Macrosep^®-Zentrifugationsvorrichtungen (Pall Corporation, East Hills, NY) äquilibriert und mit PBS gewaschen.In Example 3, also a functional derivative, ie an immunotoxin, is prepared by conjugation of diphtheria toxin with purified IgG4λ. Purified IgG4λ mAb is mixed with a six-fold excess of N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (GE Healthcare Bio-Sciences) in PBS. Subsequently, the mixture is allowed to react for 30 minutes at room temperature and then dialyzed against PBS. The modified IgG4λ is then mixed with a three-fold excess of reduced diphtheria toxin (Merck Taiwan Ltd., Taipei, Taiwan) and 10X concentrated PBS (10% of the total volume) and stored at 40 ° C for 36 hours. The product is dialyzed and equilibrated with Macrosep ^® -Zentrifugationsvorrichtungen (Pall Corporation, East Hills, NY) and washed with PBS.

Zu geeigneten Proben, die für die Verfahren der CTLA-4-Detektion und Isolation von T_reg-Zellen nützlich sind, zählen, ohne auf diese Beispiel beschränkt zu sein, biologische Flüssigkeiten aus einem humanen Subjekt wie zum Beispiel Blut, Nasenschleimhautsekret, Mundschleimhautsekret, Vaginalschleimhautsekret, Sperma, Eiterexudat, Analschleimhautsekret und Gelenkflüssigkeit. Zu Proben können auch Lymphoidgewebe zählen wie Milz, Lymphknoten, Thymus, Knochenmark, Rachenmandeln (Tonsillen) und die als Peyer-Plaques bezeichneten Ansammlungen von Lymphfollikeln in der Schleimhaut des Dünndarms (auch Peyer Patches genannt). In einer Ausführungsform ist der humane Antikörper mit einer immunologisch abrufbaren Markierung gekennzeichnet, d. h. typischerweise mit einem anti-humanen Ig-Antikörper, der mit magnetischen Partikeln konjugiert ist. Eine solche spezifische Bindung kann durch eine Vielzahl an bekannten Verfahren abgerufen werden, wie zum Beispiel direktes Markieren des präsentierten monoklonalen Antikörpers, Zellschwenken und Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren.Suitable samples useful for the methods of CTLA-4 detection and isolation of T _reg cells include, but are not limited to, biological fluids from a human subject such as blood, nasal mucous membrane secretions, oral mucosal secretions, vaginal mucosal secretions , Sperm, egg exudate, anal mucous secretions and synovial fluid. Lymphoid tissue can also be used for samples such as spleen, lymph nodes, thymus, bone marrow, tonsils and the accumulations of lymphoid follicles in the mucous membrane of the small intestine called Peyer's patches (also called Peyer's patches). In one embodiment, the human antibody is labeled with an immunologically-available label, ie, typically with an anti-human Ig antibody conjugated to magnetic particles. Such specific binding can be retrieved by a variety of known methods, such as direct labeling of the displayed monoclonal antibody, cell pivoting, and fluorescence-activated cell sorting.

Es ist allgemein anerkannt, dass humane CD4⁺CD25⁺-T_reg-Zellen FOXP3 exprimieren, während dies nicht für CD25^–-T-Zellen gilt. Die Expression von FOXP3 in CD4⁺-T-Zellen korreliert mit ihrer Fähigkeit, als T_reg-Zellen zu fungieren ( Sakaguchi, 2005 ). In einer Ausführungsform wird die Expression von FOXP3 durch quantitative Echtzeit-PCR(QPCR)-Analyse quantifiziert, wobei RNA zunächst mittels eines RNeasy Mini Kits (Qiagen, Valencia, CA) gemäß den Angaben des Herstellers extrahiert wird und dann mit 2,5 μM Zufallshexameren (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) cDNA hergestellt wird. Eine Quantifikation kann mittels eines Echtzeit-PCR-Systems erfolgen. Die Amplifikation kann in einem Gesamtvolumen von 25 μl für 40 oder 50 Zyklen von 15 Sekunden bei 95°C und 1 Minute bei 60°C durchgeführt werden. Das Produkt kann mittels SYBR-Green-1-Farbstoff (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) nachgewiesen werden. Es werden Dreifachproben eingesetzt und ihre relative Expression wird durch Normalisierung der Expression jedes Ziels auf GAPDH bestimmt. Dieser normalisierte Wert wird dann mit einer normalisierten Expression in einer Referenzprobe verglichen, um den Wert der Änderung als x-fach-Wert zu berechnen. Primer werden so entworfen, dass die PCR-Produkte die Intron/Exon-Grenzen umfassen, um die Amplifikation genomischer DNA zu minimieren. Die Primer-Sequenzen waren wie folgt:

Der Antikörper oder dessen funktionelles Derivat, beispielsweise ein Immunotoxin, kann gemäß jeden geeigneten Verfahrens, dass dem Fachmann bekannt ist, verabreicht werden, zum Beispiel intravaskulär, intrathekal, intravenös, intramuskulär, parenteral, subkutan, intramedullär, intraperitoneal, topisch, oral, rektal, vaginal, nasal, pulmonal und intratumoral.Of the Antibody or its functional derivative, for example an immunotoxin, may, according to any suitable method, that is known to those skilled in the art, for example intravascular, intrathecal, intravenous, intramuscular, parenteral, subcutaneous, intramedullary, intraperitoneal, topical, oral, rectal, vaginal, nasal, pulmonary and intratumoral.

Zusammensetzungencompositions

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung. Die Zusammensetzung weist einen vollständig humanen Antikörper auf, der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt worden ist. In einigen Ausführungsformen bindet der Antikörper an sein Antigen mit hoher Affinität. Die K_D kann zum Beispiel etwa 100 nM oder weniger betragen, zum Beispiel etwa 40 nM oder weniger wie etwa 10 nM oder weniger, 4 nM oder weniger oder etwa 1 nM oder weniger. Insbesondere ist der Antikörper in der Lage, mindestens zwei verwandte Antigene zu erkennen, wie zum Beispiel mikrobielle Antigene, die sich nur auf Grund einer antigenen Variation unterscheiden oder Proteine, die von Allelen des gleichen Gens kodiert werden.Another aspect of the present invention relates to a composition. The composition comprises a fully human antibody prepared according to the present invention. In some embodiments, the antibody binds to its antigen with high affinity. The K _D may be, for example, about 100 nM or less, for example, about 40 nM or less, such as about 10 nM or less, 4 nM or less, or about 1 nM or less. In particular, the antibody is capable of recognizing at least two related antigens, such as microbial antigens that differ only by antigenic variation, or proteins that are encoded by alleles of the same gene.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung und sind keinesfalls in einer Weise aufzufassen, die den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränkt.The The following examples serve to illustrate the invention and are by no means to be understood in a way that is the scope limited to the present invention.

Beispiel 1example 1

Charakterisierung eines anti-humanen CTLA-4 mAbCharacterization of an anti-human CTLA-4 mAb

a) Epitopkartierunga) epitope mapping

Um die Art der Bindung des vollständig humanen monoklonalen Antikörpers zu charakterisieren, wurde mittels des Western-Blot-Verfahrens eine Epitopkartierung durchgeführt. Verwendete Reihen („Arrays") enthielten überlappende Pendecapeptide, die CDR1-ähnliche (die B-C-Schleife), CDR3-ähnlich (die F-G-Schleife) und die Kernsequenz um Methionin 55 aufwiesen, die zwischen den C'- und D-Strängen der CD152 Extrazellulärregion lokalisiert sind. 2 zeigt, dass nur das Peptid, das dem C-Terminus der Kernsequenz um Methionin 55 entspricht (⁵⁴YMMGNELTFLDDSIC⁶⁸; SEQ ID-NO: 1) am besten durch den monoklonalen Antikörper erkannt wurde. Es handelt sich somit um das Epitop. Dem gegenüber trugen weder das von zahlreichen Bindungspartnern erkannte T-Zell-Epitop, das zum Ankurbeln der in vitro-Stimulation verwendet wurde, noch die CDR1-ähnliche oder die CDR3-ähnliche Region zur Bindung bei. Aus diesem Ergebnis kann geschlossen werden, dass die Aminosäuren Ala 51, Ala 52, Thr 53 und Thr 69 nicht für die Erkennung durch den monoklonalen Antikörper essentiell sind.To characterize the mode of binding of the fully human monoclonal antibody, epitope mapping was performed by Western blotting. Arrays used had overlapping pendecapeptides that had CDR1-like (the BC loop), CDR3-like (the FG loop), and the core sequence around methionine 55, which was located between the C 'and D strands of the CD152 extracellular region are localized. 2 shows that only the peptide corresponding to the C-terminus of the core sequence around methionine 55 ( ⁵⁴ YMMGNELTFLDDSIC ⁶⁸ ; SEQ ID NO: 1) was best recognized by the monoclonal antibody. It is therefore the epitope. Neither of the numerous Bin contributed to that The T cell epitope used to stimulate in vitro stimulation still recognized the CDR1-like or CDR3-like region as binding. From this result, it can be concluded that the amino acids Ala 51, Ala 52, Thr 53 and Thr 69 are not essential for recognition by the monoclonal antibody.

b) Immonologische und biochemische Eigenschaften des mAbb) Immonological and biochemical properties of the mAb

Der Isotyp des weitgehend gereinigten monoklonalen Antikörpers und sein Subtyp wurden durch Festphasen-ELISA bestimmt. Dabei wurde sein Reaktivität auf humanes CTLA-4 ausgenutzt. Geeignete immobilisierte Antikörper wurden zur Bestimmung des Typs verwendet. Die Bindung zeigt die gleichzeitige Gegenwart von γ4- und λ-Ketten im monoklonalen Antikörpern, während andere Ig-Ketten fehlen (3A). Der monoklonale Antikörper ist somit vom humanen γ4λ-Ig-Phänotyp. Um die klonalen Eigenschaften mit bestehenden humanen monoklonalen IgG1λ und IgG4λ zu vergleichen, die mit gereinigtem Myeloma-Proteinen gewonnen wurden, wurden anschließend zusätzlich die Muster der isoelektrischen Fokussierung (IEF) sichtbar gemacht. Die aufgelösten Banden sind in 3B gezeigt. Es zeigte sich, dass der präsentierte monoklonale Antikörper einen etwas niedrigeren, jedoch noch basischen pI hat, der dem des IgG1λ ähnelt. Er steht im Gegensatz zum sauren IgG4λ-Myelomaprotein oder zu den anionischen (pI 4,5–5,0) Formen an Proteinen, die üblicherweise für polyklonale IgG4 beschrieben werden. Western Blot-Analyse bestätigte die Reinheit der Antikörperproben, wie durch die Anti-λ-Färbungskonfigurationen illustriert. Wie in 3B gezeigt, waren die entsprechenden pI-Werte der Myeloid-IgG1λ, IgG4λ und des präsentierten monoklonalen Antikörpers, die durch lineare Regression des pH-Gradienten erhalten wurden, 7,92–8,79, 5,76–6,52 bzw 7,87–8,41. Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K_D) des gereinigten intakten monoklonalen Antikörpers wurde die IAsys-Analyse bestimmt. Die Geschwindigkeitskonstante wurde direkt aus dem Sensogramm mit fünf Zyklen der Bindung des löslichen monoklonalen Antikörpers an immobilisiertes rhCTLA-4-Maus-Ig bestimmt. Wie 3D zeigt, wurde durch Analyse des Ausmaßes und der Assoziation in einer einzigen Phase, der K_D zu 4 × 10^–9 M bestimmt.The isotype of the largely purified monoclonal antibody and its subtype were determined by solid phase ELISA. Its reactivity to human CTLA-4 was exploited. Suitable immobilized antibodies were used to determine the type. The binding shows the simultaneous presence of γ4 and λ chains in the monoclonal antibodies, while other Ig chains are absent ( 3A ). The monoclonal antibody is thus of the human γ4λ-Ig phenotype. In order to compare the clonal properties with existing human monoclonal IgG1λ and IgG4λ, which were obtained with purified myeloma proteins, the patterns of isoelectric focusing (IEF) were additionally visualized. The dissolved bands are in 3B shown. It was found that the monoclonal antibody presented has a slightly lower but still basic pI similar to that of the IgG1λ. It is in contrast to the acidic IgG4λ myeloma protein or to the anionic (pI 4.5-5.0) forms of proteins commonly described for polyclonal IgG4. Western blot analysis confirmed the purity of the antibody samples as illustrated by the anti-λ staining configurations. As in 3B the corresponding pI values of the myeloid IgG1λ, IgG4λ and the presented monoclonal antibody obtained by linear regression of the pH gradient were 7.92-8.79, 5.76-6.52 and 7.87, respectively -8.41. The equilibrium dissociation constant (K _D ) of the purified intact monoclonal antibody was determined by IAsys analysis. The rate constant was determined directly from the five-cycle sensitogram of soluble monoclonal antibody binding to immobilized rhCTLA-4 mouse Ig. As 3D by analysis of the extent and association in a single phase, K _{D was determined} to be 4 x 10 ^-9 M.

c) Geringe oder keine Kompetition mit der B7-CD152-Bindung durch den mAbc) Low or no competition with B7-CD152 binding by the mAb

Obwohl das Epitop, das CDR2 enthält, nicht an der Bindung verwandter endogener Liganden (CD80 und CD86) beteiligt zu sein scheint, könnte das Epitop eine allosterische Stelle für nichtkompetitive Hemmung sein. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden Vertiefungen einer Platte mit rhCTLA-4-Maus-Ig beschichtet. Es wurde entweder biotinylierter CD80-Maus-Ig oder CD86-Mäuse-Ig als Bindungsligand in Gegenwart des monoklonalen Antikörpers oder vom BNI3 verwendet, d. h. ein CTLA-4 blockierender monoklonaler IgG2a Antikörper aus Maus ( Steiner et al., 1999 ). 4 zeigt, dass der monoklonale Antikörper im Gegensatz zur erwarteten Dosis-abhängigen Hemmung einer spezifischen Rezeptorbindung durch den Antagonisten BNI3 nicht signifikant mit weder CD80-Maus-Ig noch CD86-Maus-Ig kompetitieren. Überraschenderweise zeigen hohe Dosen des monoklonalen Antikörpers ein Synergismus mit den natürlichen Liganden CD80, nicht jedoch mit CD86, mit der Folge einer bis zu 50%igen Anreicherung der CD80-Bindung an rhCTLA-4-Maus-Ig.Although the epitope containing CDR2 does not appear to be involved in the binding of related endogenous ligands (CD80 and CD86), the epitope could be an allosteric site for non-competitive inhibition. To investigate this possibility, wells of a plate were coated with rhCTLA-4 mouse Ig. Either biotinylated CD80 mouse Ig or CD86 mouse Ig was used as the binding ligand in the presence of the monoclonal antibody or BNI3, ie, mouse CTLA-4 blocking monoclonal IgG2a antibody ( Steiner et al., 1999 ). 4 shows that the monoclonal antibody, unlike the expected dose-dependent inhibition of specific receptor binding by the antagonist BNI3, did not compete significantly with neither CD80 mouse Ig nor CD86 mouse Ig. Surprisingly, high doses of the monoclonal antibody synergize with the natural ligands CD80, but not with CD86, resulting in up to 50% enrichment of CD80 binding to rhCTLA-4 mouse Ig.

Beispiel 2Example 2

Einsatz eines CDR2-spezifischen Reagenzes senkt die Nachweisgrenze des humanen CTLA-4Use of a CDR2-specific reagent lowers the detection limit of human CTLA-4

Immunologische Untersuchungen, die auf der Verwendung von Paaren von blockierenden Antikörpern beruhen, die auf Epitope innerhalb der B7-bindenden Region des Moleküls reaktiv sind, werden in der Praxis in ihrer Eignung durch sterische Hinderung begrenzt. Blockierende Antikörper können miteinander und mit endogenem CD80 und CD86 um die begrenzten CDR1- und CDR3-Regionen kompetitieren, was es erschwert, sie in einem Untersuchungssystem von nativem sCTLA-4 zu unterscheiden. Um zu bestimmen, ob der oben beschriebenen CTLA-4-Bindungssynergismus mit den natürlichen Liganden CD80, den der monoklonale Antikörper zeigte, zu einer erhöhten Nachweisempfindlichkeit führt, wurde der monoklonale Antikörper mit CD80 für die Detektion von sCTLA-4 gekoppelt. Kurz gesagt, wurde ein ELISA-System unter Verwendung von mit IgG4λ beschichteten Platten für die Bindung (das Fangen) und biotinylierter CD80-Maus-Ig als rekombinantes Protein (Ancell) zum Nachweis eingesetzt. Für die Farbreaktion wurde dann Streptavidin-Peroxidase verwendet. 5 zeigt ein repräsentatives Experiment. Die Kombination löst einen Bereich von CTLA-4 von 0,39 bis 50 ng/ml auf, während das Paar blockierender monoklonaler Antikörper 6,25 bis 50 ng/ml unter gleichen experimentellen Bedingungen nachweist. Es wurde auch eine höhere Auflösung von 1,56 bis 50 ng/ml beobachtet, wenn der hier beschriebene monoklonale Antikörper zusammen mit einem blockierenden monoklonalen Antikörper eingesetzt wurde. Dies stimmt nicht nur mit der, basierend auf vorangegangenen Untersuchungen ( Linsley et al., 1992 ; Schwartz et al., 2000 ; Stamper et al., 2001 ), vorhergesagten entsprechenden dreidimensionalen Bindungsstelle überein, sondern zeigt auch, dass der monoklonale CTLA-4-Antikörper mit einer Spezifität für die CDR2-ähnliche Region in Kombination mit Reagenzien mit Spezifitäten für die CDR1- und CDR3-ähnlichen Regionen, die Nachweisgrenzen für CTLA-4 verbessert, d. h. senkt.Immunological studies relying on the use of pairs of blocking antibodies that are reactive to epitopes within the B7 binding region of the molecule are limited in practice by steric hinderance. Blocking antibodies can compete with each other and with endogenous CD80 and CD86 for the limited CDR1 and CDR3 regions, making it difficult to distinguish them in a native sCTLA-4 assay system. To determine whether the above-described CTLA-4 binding synergy with the natural ligand CD80, which the monoclonal antibody exhibited, leads to increased detection sensitivity, the monoclonal antibody was coupled with CD80 for the detection of sCTLA-4. Briefly, an ELISA system using IgG4λ coated plates for binding (capture) and biotinylated CD80 mouse Ig as a recombinant protein (Ancell) was used for detection. For the color reaction then streptavidin peroxidase was used. 5 shows a representative experiment. The combination resolves a range of CTLA-4 from 0.39 to 50 ng / ml while the pair of blocking monoclonal antibodies detect 6.25 to 50 ng / ml under the same experimental conditions. Also, a higher resolution of 1.56 to 50 ng / ml was observed when the monoclonal antibody described herein was used together with a blocking monoclonal antibody. This is not only true with the, based on previous investigations ( Linsley et al., 1992 ; Schwartz et al., 2000 ; Stamper et al., 2001 ), but also shows that the monoclonal CTLA-4 antibody with a Spe The CDR2-like region combined with reagents with specificities for the CDR1 and CDR3-like regions improves, ie decreases, detection limits for CTLA-4.

Beispiel 3Example 3

Isolieren von intrinsischen CTLA-4⁺-Populationen führte zu einer erhöhten FOXP3-Expression und -SuppressionIsolation of intrinsic CTLA-4 ⁺ populations resulted in increased FOXP3 expression and suppression

Ein wesentliches ungelöstes Problem auf dem Gebiet der Verwendung von T_reg-Zellen als vielversprechende Alternative zum herkömmlichen Immunsuppressions-Behandlungsverfahren ist die Entwicklung eines verlässlichen Verfahrens ihrer Isolierung. Die meisten Berichte im Stand der Technik verwenden eine negative Selektion von Nicht-CD4⁺-Zellen und eine positive Selektion von CD25⁺-Zellen, was eine zeitaufwändige und Erfahrung erfordernde Vorgehensweise beim Umgang mit humanen PBMC darstellt. Nach Erkennen der Bedeutung von CTLA-4 bei der Funktion von T_reg-Zellen ( Read et al., 2006 ; Ward und Barker, 2007 ) wendet sich die vorliegende Erfindung der Verwendung der intrinsischen CTLA-4-Oberflächenexpression für die Isolierung von T_reg-Zellen zu. Insbesondere stellten sich die Erfinder die Frage, ob ein nicht-blockierender anti-CTLA-4 mAb eine einzige positive Selektion für T_reg-Zellen darstellt. Um diese Frage zu beantworten, wurde ein Verfahren zur Untersuchung der Thymidinaufnahme eingesetzt, um die Suppression von „eingebauten" T_reg-Zellen sowie ein verstärktes Entfernen von T_reg-Zellen nachzuweisen.An important unsolved problem in the use of T "_reg" cells as a promising alternative to the conventional immunosuppressive treatment method is the development of a reliable method of their isolation. Most prior art reports use negative selection of non-CD4 ⁺ cells and positive selection of CD25 ⁺ cells, which is a time consuming and experience-requiring approach to human PBMC. Having recognized the importance of CTLA-4 in the function of T _reg cells ( Read et al., 2006 ; Ward and Barker, 2007 ), the present invention is directed to the use of intrinsic CTLA-4 surface expression for the isolation of T _reg cells. In particular, the inventors wondered whether a non-blocking anti-CTLA-4 mAb represents a single positive selection for T _reg cells. To answer this question, a method to study thymidine uptake was used to detect the suppression of "built-in" T _reg cells as well as increased removal of T _reg cells.

Durch Untersuchung der Teilmenge, die durch in vitro-Tetanus-Toxoid-Stimulation auf die Proliferation erhalten wurde, ist die Entfernung der CTLA-4⁺-Population von großem Vorteil für die Gedächtnisantwort (6B), was weiter zeigt, dass es sich hier um eine Population von T_reg-Zellen handelt. Bei einigen Spendern konnte die Mehrzahl der CD4^–CD25^–-Zellen von den gebundenen magnetischen Partikeln zurück gewonnen werden, bei anderen Spendern jedoch nicht. Die Ursache für diese Unterschiede zwischen verschiedenen Spendern ist bislang unbekannt. Auch die Identität der Population, die die CTLA-4-Oberflächenexpression hochreguliert, wurde bestimmt. Die Zellen, die die CTLA-4-Expression hoch regulieren, waren mit T_reg-Zellen angereichert. Diese Zellen behielten ferner ähnlich zur gereinigten CD4⁺CD25⁺-Population ihr Unvermögen, auf das Antigen zu reagieren. Da CD4⁺CD25⁺ überwiegend T_reg-Zellen repräsentieren und die CTLA-4-Oberflächenexpression mit einer sogar noch höheren FOXP3-Expression einhergeht, wurde somit bestätigt, dass CTLA-4⁺-Zellen regulatorische T-Zellen symbolisieren.By studying the subset obtained by in vitro tetanus toxoid stimulation on proliferation, removal of the CTLA-4 ⁺ population is of great benefit for memory response ( 6B ), which further shows that this is a population of T _reg cells. In some donors, the majority of CD4 ^- CD25 ^- cells could be recovered from the bound magnetic particles, but not in other donors. The cause of these differences between different donors is unknown. The identity of the population upregulating CTLA-4 surface expression was also determined. The cells that upregulate CTLA-4 expression were enriched with T _reg cells. These cells also retained their inability to respond to the antigen, similar to the purified CD4 ⁺ CD25 ⁺ population. Since CD4 ⁺ CD25 ^{+ represent} predominantly T _reg cells and CTLA-4 surface expression is associated with even higher FOXP3 expression, it was thus confirmed that CTLA-4 ⁺ cells symbolize regulatory T cells.

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