DE202010004547U1

DE202010004547U1 - Electro-optical arrangement for ultra-fast scanning of an object

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Publication number: DE202010004547U1
Application number: DE202010004547U
Authority: DE
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2010-04-01
Filing date: 2010-04-01
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2020-04-02

Abstract

Optische Anordnung mit einem Steuerungsmittel und mindestens einem Beleuchtungsmittel dessen Lichtstrahl durch optische Abbildungsmittel mittels mindestens eines elektrooptischen Deflektors eine Probe abtastet und in einer Probe durch den Lichtstrahl erzeugtes Licht detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die hochfrequenten Spannungen für den Deflektor mehrfach resonant erzeugt werden.Optical arrangement with a control means and at least one illumination means whose light beam is scanned by optical imaging means by means of at least one electro-optical deflector and a sample is detected in a sample by the light beam generated light, characterized in that the high-frequency voltages for the deflector are generated multiple resonant.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Anordnung, die es erlaubt ein vorzugsweise mikroskopisches Objekt mit sehr hoher Geschwindigkeit abzutasten.The present invention relates to an arrangement which allows a preferably microscopic object to be scanned at a very high speed.

Aufgabenstellung:Task:

Bei Fluoreszenzmessungen insbesondere auch in der Fluoreszenzmikroskopie wird ein Fluoreszenzmolekül mit einem Anregungslicht angeregt. Die Anregungsenergie wird wenige Nanosekunden (ns) später vom Molekül mit etwas längerer Wellenlänge wieder abgegeben. Bei konfokalen Rastermikroskopen beispielsweise wird als Anregungslicht ein beugungsbegrenzter Laserstrahl verwendet. Um schließlich ein Abbild des Objektes zu erzeugen muss dazu der Strahl relativ zum Objekt bewegt und synchron dazu das Messsignal registriert werden.In fluorescence measurements, especially in fluorescence microscopy, a fluorescence molecule is excited with an excitation light. The excitation energy is given off again a few nanoseconds (ns) later by the molecule with a somewhat longer wavelength. In confocal scanning microscopes, for example, a diffraction-limited laser beam is used as excitation light. Finally, in order to produce an image of the object, the beam must be moved relative to the object and the measurement signal must be registered synchronously.

Da Fluoreszenzmoleküle nach der Anregung nicht immer unmittelbar mit Fluoreszenzabstrahlung in den Grundzustand zurückkehren, sondern stattdessen für Mikro- bis Millisekunden in einem nicht fluoreszierenden Zustand verharren, ist es vorteilhafter das Objekt mehrfach mit kurzen Belichtungszeiten abzurastern als einfach mit langer Belichtungszeit. Die Moleküle haben so, bis zu ihrer wiederholten Belichtung, Zeit aus den Dunkelzuständen zurückzukehren. Dies ermöglicht sowohl Messzeit insgesamt zu verkürzen, als auch das Bleichen zu reduzieren, da die Moleküle weniger häufig im nutzlosen Dunkelzustand schädigender Weise belichtet werden.Since fluorescence molecules do not always return directly to the ground state with fluorescence emission after the excitation but instead remain in a non-fluorescent state for a few milliseconds, it is more advantageous to scan the object several times with short exposure times than simply with a long exposure time. The molecules thus have time to return from the dark states until their repeated exposure. This will both reduce measurement time as a whole and reduce bleaching since less frequently the molecules will be exposed in a detrimental dark state.

Stand der Technik/Lösung alt:State of the art / solution old:

Am häufigsten kommen als Rastermechanismus Galvanometer zum Einsatz. Diese Strahlscanner sind schneller als Objektscanner, da die bewegten Massen geringer sind. Besonders schnelle Rasterbewegungen von 10000–20000 Zeilen pro Sekunde werden von resonanten Systemen erreicht. Solche Systeme sind ausführlich im „Handbook of Biological Confocal Microscopy”, Third Edition, edited by James B. Pawley, 2006 , beschrieben.Galvanometers are most commonly used as the raster mechanism. These beam scanners are faster than object scanners because the moving masses are smaller. Particularly fast raster movements of 10000-20000 lines per second are achieved by resonant systems. Such systems are detailed in the "Handbook of Biological Confocal Microscopy", Third Edition, edited by James B. Pawley, 2006 , described.

Um eine noch schnellere Strahlpositionierung zu erreichen wurden in der Vergangenheit auch elektro-optische Deflektoren (EOD) und akusto-optische Deflektoren (AOD) verwendet. Solche praktisch trägheitslose Deflektoren nutzen transparente Materialien, typischer Weise Kristalle, deren Brechzahl durch elektrische Felder, beziehungsweise Ultraschallfelder beeinflussbar sind und so optische Strahlen abzulenken vermögen. AODs sind in ihrer Geschwindigkeit praktisch nur noch durch die Schallgeschwindigkeit im Kristall begrenzt und erreichen so Positionierzeiten im Bereich von einer Mikrosekunde. Nachteilig ist hier für die Fluoreszenzanwendung jedoch, dass die die Ablenkung Wellenlängenabhängig ist, sodass diese Technik sich in der konfokalen Rastermikroskopie nicht durchsetzen konnte. Elektro-optische Strahlablenker sind noch schneller und erreichen Ablenkungen im Nanosekundenbereich. Deren Anwendung ist jedoch durch die kleinen Ablenkwinkel sehr begrenzt. In einem beugungsbegrenzten Laserrastermikroskop werden damit selbst bei hohen Anlenkspannungen von einigen 1000 V nur einige 10 Punkte aufgelöst, sodass auch diese Strahlablenker bislang nicht effektiv einsetzbar waren. Steuerspannungen im 1000 V Bereich wiederum sind auch nicht mehr beliebig schnell veränderbar, sodass hier häufig auch die Ablenkgeschwindigkeiten durch die Treibersysteme eingeschränkt sind.To achieve even faster beam positioning, electro-optic deflectors (EOD) and acousto-optic deflectors (AOD) have also been used in the past. Such practically inertia-free deflectors use transparent materials, typically crystals whose refractive index can be influenced by electric fields or ultrasound fields and thus can deflect optical beams. AODs are limited in their speed practically only by the speed of sound in the crystal and thus achieve positioning times in the range of one microsecond. However, a disadvantage here for the fluorescence application is that the deflection is wavelength-dependent, so that this technique could not prevail in confocal scanning microscopy. Electro-optical beam deflectors are even faster and achieve deflections in the nanosecond range. However, their application is very limited by the small deflection angle. In a diffraction-limited laser scanning microscope, only a few 10 points are resolved, even at high coupling voltages of a few 1000 V, so that these beam deflectors have not yet been used effectively. In turn, control voltages in the 1000 V range can no longer be changed as quickly as desired, so that often the deflection speeds are limited by the driver systems.

Bekanntermaßen werden elektro-optische Deflektoren (EODs) eingesetzt um schnelle kleine Korrekturen in einem Strahlscanner zu bewirken. In der US 5,103,334 etwa wird mit einem EOD der trägheitsbedingt kontinuierliche lineare Strahlverlauf eines Polygonscanners in einen diskontinuierlichen Verlauf gewandelt. Während der Polygonscanner die großen Ablenkwinkel liefert, muss der EOD nur sehr kleine Korrekturschritte bewirken.As is known, electro-optic deflectors (EODs) are used to effect rapid small corrections in a beam scanner. In the US 5,103,334 For example, the inertia-related continuous linear beam path of a polygon scanner is converted into a discontinuous course with an EOD. While the polygon scanner delivers the large deflection angles, the EOD only has to make very small correction steps.

Die Kombination eines Großwinkelscanners mit einem trägheitslosen EOD oder AOD wird auch in der US 7,050,208 B2 vorgeschlagen um schnell und korrigierend bestimmte Positionen mit einem Strahl anzufahren. Auch die US 5,065,008 nutzt einen EOD zur Feinkorrektur der Strahllage. Die US 5,936,764 nutzt einen EOD um wie bei einem Zickzack Stich einer Nähmaschine rasch hintereinander kleine Streifen eines Objektes abzurastern.The combination of a large angle scanner with a sluggish EOD or AOD is also in the US 7,050,208 B2 proposed to quickly and correctly start certain positions with a beam. Also the US 5,065,008 uses an EOD to fine-tune the beam position. The US 5,936,764 uses an EOD to rasterize small strips of an object in quick succession like a zigzag stitch of a sewing machine.

Aus der US 5,189,547 ist außerdem bekannt, hohe Spannungen mittels eines Resonanzschwingkreises für einen Elektrooptischen Modulator zu verwenden.From the US 5,189,547 It is also known to use high voltages by means of a resonant circuit for an electro-optical modulator.

Die Kombination von hintereinander geschalteten resonanten Galvanometern verschiedener Frequenzen zur Linearisierung des sinusförmigen Scanverlaufes ist aus der DE 4322694 A1 bekannt. Hier sind jedoch nach wie vor die maximalen Zeilenfrequenzen trägheitslimitiert und die Anordnung ist in einem Mikroskop optisch aufwändig, da jeder Ablenker im Wesentlichen in ein Pupillenbild des Mikroskops verlagert werden muss. Zudem müssen die mechanischen Resonanzen der Scanner präzise auf einander abgestimmt sein.The combination of successively connected resonant galvanometers of different frequencies for the linearization of the sinusoidal scan progression is known from US Pat DE 4322694 A1 known. Here, however, the maximum line frequencies are still limited in inertia and the arrangement is visually complex in a microscope, since each deflector must be shifted substantially into a pupil image of the microscope. In addition, the mechanical resonances of the scanners must be precisely tuned to each other.

Erfindung/Lösung neu:Invention / Solution new:

Es wurde erkannt, dass elektro-optische Strahlablenker trotz deren kleiner Ablenkwinkel bei nicht beugungsbegrenzten Abbildungsverfahren, wie etwa dem STED-Verfahren, vorteilhaft eingesetzt werden können. Die Auflösung ist hier bis über 10-mal so hoch wie bei beugungsbegrenzten Abbildungen, sodass auch mit elektro-optischen Ablenkern viele hundert Bildpunkte auflösbar werden. Die abzurasternden Bildfelder sind hier auch zumeist nur wenige Mikrometer groß, sodass elektro-optische Ablenker trotz deren kleinen maximalen Ablenkwinkel effektiv einsetzbar werden und die Zahl der Auflösungspunkte nicht wie in beugungslimitierten Mikroskopen limitiert sind.It has been recognized that electro-optical beam deflectors, despite their small deflection angle, can be advantageously used in non-diffraction limited imaging methods such as the STED method. The resolution is up to about 10 sometimes as high as with diffraction-limited images, so that even with electro-optical deflectors many hundreds of pixels can be resolved. The image fields to be scanned are also usually only a few microns in size, so that electro-optical deflectors can be used effectively despite their small maximum deflection angle and the number of resolution points are not limited as in diffraction-limited microscopes.

Eine einfache sinusförmige Spannung wie sie in der US 5,189,547 für einen Modulator verwendet wird, würde bei einem Deflektor zu einem gekrümmten Scan führen, bei dem nur etwa die Hälfte des Weges und der Zeit für die bildgebende Abtastung nutzbar wäre.A simple sinusoidal voltage like that in the US 5,189,547 for a modulator, a deflector would result in a curved scan in which only about half of the path and time would be usable for the imaging scan.

Um eine schnelle quasi lineare Strahlablenkung zu erreichen, wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, die dazu notwendigen Spannungen mittels mehrfach resonanter Schaltkreise zu erzeugen. Die dazu notwendigen Signale und deren Phasenbeziehungen lassen sich sehr einfach in einem Funktionsgenerator erzeugen und mit einem Niederspannungsverstärker verstärken. Die hohen Spannungen von 1000 V und mehr entstehen schließlich erst durch die Resonanzüberhöhungen in den Schwingkreisen, die in kompakter vorteilhafter Weise nahe am EOD platziert werden können.In order to achieve a fast quasi-linear beam deflection, the invention proposes to generate the necessary voltages by means of multi-resonant circuits. The necessary signals and their phase relationships can be generated very easily in a function generator and amplified with a low-voltage amplifier. Finally, the high voltages of 1000 V and more arise due to the resonance peaks in the resonant circuits, which can be placed in a compact advantageous manner close to the EOD.

Mit der erfindungsgemäßen Anordnung können zum Beispiel mikroskopische STED Abbildungen mit 8 × 8 μm in einer Auflösung von 512 × 512 Punkten mit 1000 Bildern pro Sekunde erzeugt werden.With the arrangement according to the invention, for example, microscopic STED images of 8 × 8 μm can be generated in a resolution of 512 × 512 dots at 1000 images per second.

Bei den großen Ablenkfrequenzen sind die Laufzeiten des Lichts im Mikroskopsystem und auch die Fluoreszenzlebensdauer nicht mehr unbedingt vernachlässigbar klein. Die Integrationszeiten der Pixel von 2 ns im obigen Beispiel entsprechen für Hin- und Rücklauf des Lichts zum Objekt und zurück zu Deflektor 30 cm. Das bedeutet, dass das Detektionslicht im EOD nicht mehr komplett descanned wird. Gegebenenfalls muss der Detektor entsprechend relativ zur EOD-Scanachse verschoben. Mittels mehrerer Detektoren nebeneinander könnte dabei auch gleichzeitig auf die Fluoreszenzlebensdauer geschlossen werden und so verschiedene Farbstoffe von einander unterschieden werden. Auch die frühen oder späten Fluoreszenzphotonen werden unter Umständen nicht mehr and der korrekten Position registriert. Auch dafür müssen gegebenenfalls Korrekturmaßnahmen vorgesehen werden. In einem einfachen und vorteilhaften Fall könnte man das Detektionslicht nicht mehr im EOD descannen und stattdessen eine spaltkonfokale Detektion wählen. Die Ortszuordnung in der schnellen Achse geschieht dabei ausschließlich durch das Timing. Vorteilhafter Weise kommt dabei ein großflächiger Detektor im Photon Counting Modus zum Einsatz. Besonders geeignet erscheinen dabei Hybriddetektoren wie der HPD R10467U-40 von Hamamatsu. Im Gegensatz zu den ebenfalls einsetzbaren GaAs Photomultipliern weisen die Hybriddetektoren wesentlich höhere maximale Zählraten auf. Grundsätzlich sind natürlich auch alle anderen Photodetektoren wie Dioden, APDs, PMTs oder MPPCs, EMCCDs etc. ohne Einschränkung der Allgemeinheit einsetzbar. Auch der Einzelphotonzählmodus ist nicht obligatorisch, wenn auch zumeist vorteilhaft. Eine weitere Variante könnte auch ein lineares Array kleiner Detektoren darstellen, die im Detektionsfokus angeordnet sind.With the large deflection frequencies, the transit times of the light in the microscope system and also the fluorescence lifetime are no longer necessarily negligible. The integration times of the pixels of 2 ns in the above example correspond to 30 cm for the back and forth of the light to the object and back to the deflector. This means that the detection light in the EOD is no longer completely descanned. If necessary, the detector has to be displaced relative to the EOD scan axis. By means of several detectors next to each other, it would also be possible at the same time to deduce the fluorescence lifetime and thus distinguish different dyes from one another. Also, the early or late fluorescent photons may no longer be registered at the correct position. Corrective measures may also be required for this. In a simple and advantageous case, one could no longer scan the detection light in the EOD and instead select a gap-confocal detection. The location assignment in the fast axis is done exclusively by the timing. Advantageously, a large-area detector in photon counting mode is used. Hybrid detectors such as the HPD R10467U-40 from Hamamatsu appear particularly suitable. In contrast to the GaAs photomultipliers, which can also be used, the hybrid detectors have much higher maximum count rates. In principle, of course, all other photodetectors such as diodes, APDs, PMTs or MPPCs, EMCCDs, etc. can be used without restriction of generality. Also the single photon counting mode is not obligatory, although mostly advantageous. Another variant could also be a linear array of small detectors located in the detection focus.

Beim STED Verfahren werden zumeist gepulste Laser mit Pulswiederholraten mehrerer 10 MHz verwendet. Um Aliasing Effekte, die potenziell zu Moirémustern in den Abbildungen führen zu vermeiden, ist es vorteilhaft eine Synchronisierung zwischen der Pulsfrequenz des Lasers und der Pixelclock des Scanners vorzusehen. Durch geeignete zeitliche Taktmuster können dabei auch gezielt weiter voneinander entfernte Bildpunkte zeitlich nacheinander beleuchtet werden, um so zum Beispiel eine Relaxation der Anregungs- und Dunkelzustände zu erlauben bevor ein bestimmter Bereich wieder beleuchtet wird.The STED method mostly uses pulsed lasers with pulse repetition rates of several 10 MHz. In order to avoid aliasing effects, which potentially lead to moiré patterns in the images, it is advantageous to provide a synchronization between the pulse frequency of the laser and the pixel clock of the scanner. By means of suitable temporal clock patterns, it is also possible to illuminate pixels, which are further away from each other in a temporally successive manner, in order, for example, to allow a relaxation of the excitation and dark states before a certain area is illuminated again.

Auch eine Multispotanordnung, wie zum Beispiel nach dem Patent WO 2006/108526 ist mit dem schnellen Scanner nutzbar, um eine weitere Abbildungsgeschwindigkeitssteigerung durch Parallelisierung des Prozesses zu bewirken.Also a multi-spot arrangement, such as according to the patent WO 2006/108526 can be used with the fast scanner to increase image speed by parallelizing the process.

Wegen der kurzen Bildpunktintegrationsdauern ist im Allgemeinen die Anzahl detektierter Photonen pro Bildpunkt sehr gering. Für die Signalverarbeitung und die Bewältigung des hohen Datenstromes von einigen hundert Millionen Bildpunkten pro Sekunde ist es vorteilhaft die Information zum Transport in ein Speichermedium zu komprimieren. Im Falle der Einzelphotonendetektion könnte dies besonders vorteilhaft mittels FPGAs und einer Lauflängenkodierung erfolgen, die verlustfrei sein kann.Because of the short pixel integration periods, the number of detected photons per pixel is generally very low. For signal processing and coping with the high data stream of a few hundred million pixels per second, it is advantageous to compress the information for transport to a storage medium. In the case of single-photon detection, this could be done particularly advantageously by means of FPGAs and run-length coding, which can be lossless.

Ein Bild wird so in einem STED Mikroskop durch die Überlagerung einiger Bilder des Objektes aufgebaut, da ein einzelnes Bild in der Regel zu verrauscht sein wird. Der Aufnahmevorgang aus vielen sukzessiven Bilder des Objektes könnte dabei gestartet und nach erreichen eines gewünschten Signal- zu Rauschverhältnisses gestoppt werden.An image is built up in a STED microscope by superimposing some images of the object, since a single image is usually too noisy. The recording process of many successive images of the object could be started and stopped after reaching a desired signal to noise ratio.

Nutzen:Use:

Die erfinderische Anordnung erlaubt eine effektive und kompakte Bauweise, ohne aufwändige Hochspannungselektronik mit großen Verlustleistungen und den damit verbundenen Abwärmeproblemen. Die Synchronisation mit dem Laser vermeidet Moirémusterbildungen.The inventive arrangement allows an effective and compact design, without complex high-voltage electronics with high power losses and the associated waste heat problems. Synchronization with the laser avoids moire patterning.

Beschreibung der Zeichnungen: Description of the drawings:

In den Zeichnungen 1 bis 5 sind beispielhaft mögliche Grundanordnungen dargestellt ohne dabei die Allgemeinheit einzuschränken.In the drawings 1 to 5 exemplary possible basic arrangements are shown without limiting the generality.

In der nachfolgenden Beschreibung wird ohne Einschränkung der Allgemeinheit auf eine Fluoreszenzapparatur Bezug genommen. Besonders vorteilhaft könnte dies beispielsweise ein nicht beugungsbegrenztes STED-Fluoreszenzmikroskop oder auch ein anderes das RESOLFT Verfahren nutzendes Mikroskop sein.In the following description, reference will be made to a fluorescence apparatus without limitation of generality. This could be particularly advantageous, for example, a non-diffraction-limited STED fluorescence microscope or another microscope using the RESOLFT method.

In Zeichnung 1 ist eine mögliche, den Erfindungsgedanken enthaltende Grundanordnung dargestellt. In einem Signalgenerator (11) werden die notwendigen Signale, die verschiedene Frequenzen f1, f2 ... fn aufweisen erzeugt. Die Summe der Signale wird in einem Verstärker (12) verstärkt und einem oder mehreren Schaltkreisen (13) zugeführt, der mindestens 2 Resonanzen aufweist und dadurch hohe Spannungen bei hohen Frequenzen erzeugt. Diese Ablenkspannungen werden schließlich dem elektrooptischen Ablenkmittel (15) zugeführt. Vorteilhaft kann dabei auch eine galvanische Entkopplung (14) sein. Diese kann zusätzlich einen Transformationsfaktor enthalten. Im Allgemeinen werden die Komponenten 13, 14, 15 aufeinander abstimmbar ausgeführt, sodass schließlich dieses Gesamtsystem die gewünschten Resonanzen aufweist, die zu einer linearisierten Ablenkung der Lichtstrahlen führen. In einem einfachen Fall wird eine Grundfrequenz mit ihrer 3. harmonischen kombiniert um angenähert linearisierte eine dreiecksförmige Ablenkung zu bewirken.In drawing 1 a possible, the inventive concept-containing basic arrangement is shown. In a signal generator ( 11 ) generate the necessary signals having different frequencies f1, f2 ... fn. The sum of the signals is stored in an amplifier ( 12 ) and one or more circuits ( 13 ), which has at least 2 resonances and thereby generates high voltages at high frequencies. These deflection voltages are finally the electro-optical deflection ( 15 ). Advantageously, a galvanic decoupling ( 14 ) be. This may additionally contain a transformation factor. In general, the components 13 . 14 . 15 executed tunable to each other, so that finally this overall system has the desired resonances, which lead to a linearized deflection of the light beams. In a simple case, a fundamental frequency is combined with its third harmonic to produce approximately triangular shaped triangular deflection.

In Zeichnung 2 ist der Rasterverlauf einer solchen beispielhaften Anordnung dargestellt. Ein EOD wird zur Ablenkung in der schnellen x-Achse mit einer dreiecksförmigen Spannung beaufschlagt, während ein Galvanometer zum Beispiel die langsamere y-Achse linear abrastert. Selbstverständlich können dabei verschiedenste Kombinationen aller möglichen bekannten Strahlablenker zum Einsatz kommen.In drawing 2, the raster pattern of such an exemplary arrangement is shown. An EOD is subjected to a deflection in the fast x-axis with a triangular voltage, while a galvanometer linearly scans, for example, the slower y-axis. Of course, a variety of combinations of all possible known Strahlablenker can be used.

In Zeichnung 3 und 4 sind mögliche Ausführungen von STED-Mikroskopen schematisiert dargestellt, in denen die Erfindung nutzvoll zur Anwendung gebracht werden könnte.In drawings 3 and 4 possible embodiments of STED microscopes are shown schematically in which the invention could be usefully applied.

In Zeichnung 3 werden die Laserstrahlen zweier Laser (32, 33) durch einen EOD (34) in einer ersten Richtung abgelenkt. Durch einen zweiten Ablenker (311), der auch ein Galvanometer sein kann wir der Strahl in einer 2. Richtung abgelenkt. Die rasternden Lichtstrahlen werden schließlich durch eine Mikroskopoptik (310) auf ein Objekt (37) fokussiert. In solchen Anordnungen spielen die Pupille (39) des Objektives (38) und deren Abbildungen (311, 35) eine wichtige Rolle. Typischer Weise wird die Phasenplatte (38) der STED-Anordnung in oder nahe einer Pupille platziert. Desgleichen werden die effektiven Strahldrehpunkte der Ablenker (311) und (34) in oder nahe von Pupillenabbildungen platziert um Vignettierungen zu vermeiden. Die Anordnung in Zeichnung 3 zeigt beispielhaft eine Anordnung, bei der das Detektionslicht vor dem EOD durch einen Strahlenteiler (36) in Richtung eines Detektors (313) ausgekoppelt wird. Vorteilhafter Weise wird dabei mit einem Spalt in Richtung der schnellen Ablenkachse konfokalisiert. Diese Anordnung reduziert die Lichtbeiträge von Objektteilen außerhalb des Fokus und ist tolerant gegen Lichtlaufzeiteffekten und Effekten die durch die endliche Fluoreszenzlebensdauer bedingt sind. Besonders vorteilhaft ist es dabei den Detektor (313) wiederum in oder nahe einer Pupillenabbildung zu platzieren. Die Laser (32) und (33), die Ablenkmittel (34) und (311) sowie der Detektor (313) stehen dabei optional mit einem Steuerungsmittel (31) in Verbindung, das aus elektronischen Schaltungen, Kontrollern, Prozessoren und Computern bestehen kann. Besonders Vorteilhaft sind dabei auch programmierbare Logiksysteme wie FPGAs, um den hohen Datenfluss zu verarbeiten und/oder eine Synchronisation zwischen den verschiedensten Komponenten herbeizuführen.In drawing 3, the laser beams of two lasers ( 32 . 33 ) by an EOD ( 34 ) deflected in a first direction. Through a second deflector ( 311 ), which can also be a galvanometer, we deflected the beam in a 2nd direction. The rastering light rays are finally replaced by a microscope optics ( 310 ) on an object ( 37 ) focused. In such arrangements the pupil ( 39 ) of the objective ( 38 ) and their illustrations ( 311 . 35 ) an important role. Typically, the phase plate ( 38 ) of the STED array placed in or near a pupil. Likewise, the effective beam pivot points of the deflectors ( 311 ) and ( 34 ) placed in or near pupil images to avoid vignetting. The arrangement in drawing 3 shows by way of example an arrangement in which the detection light before the EOD by a beam splitter ( 36 ) in the direction of a detector ( 313 ) is decoupled. Advantageously, it is confocalized with a gap in the direction of the fast deflection axis. This arrangement reduces the light contributions of object parts out of focus and is tolerant to light-time effects and effects due to finite fluorescence lifetime. It is particularly advantageous in this case the detector ( 313 ) again in or near a pupil image. The lasers ( 32 ) and ( 33 ), the deflection means ( 34 ) and ( 311 ) as well as the detector ( 313 ) are optionally available with a control means ( 31 ), which may consist of electronic circuits, controllers, processors and computers. Programmable logic systems, such as FPGAs, are particularly advantageous for processing the high data flow and / or bringing about synchronization between the most diverse components.

Die Zeichnung 4 dagegen zeigt eine beispielhafte Anordnung, bei der zwei EODs zum Einsatz kommen und dabei das Detektionslicht durch die Deflektoren (45, 46) descannt wird bevor es dem Detektor der konfokal ausgeführt sein kann zugeführt wird. Die Lichtquellen (42, 43), die Laser sein können, die gepulst sein können, die Deflektoren (44, 45), sowie der Detektor können optional mit Steuerungsmitteln (41) funktional in Verbindung stehen. Die Lichtstrahlen werden durch eine Optik (48) wie in Zeichnung 3 dem Objekt zugeführt. Die Deflektoren stehen dabei vorzugsweise zumindest nahe von Pupillenabbildungen der Optik (48).On the other hand, the drawing 4 shows an exemplary arrangement in which two EODs are used, and the detection light through the deflectors (FIG. 45 . 46 ) is descanned before it is fed to the detector which may be confocal. The light sources ( 42 . 43 ), which may be lasers that may be pulsed, the deflectors ( 44 . 45 ), as well as the detector can optionally be equipped with control means ( 41 ) functionally related. The light rays are transmitted through an optic ( 48 ) as shown in drawing 3 supplied to the object. The deflectors are preferably at least close to pupil images of the optics ( 48 ).

Die Zeichnung 5 schließlich erläutert beispielhaft, wie der hohe Datenfluss beherrscht werden kann, wenn ein Einzelphotonendetektor zu Einsatz kommt. Die Pulse (51) von Einzelphotonen können den zeitlich hintereinander aufgenommenen Bildpunkten (55) zugeordnet werden (54). Der binäre Strom kann in Schieberegistern (52), die alternierend betrieben werden können parallelisiert werden und durch logische Operationen in einem FPGA (53) beispielsweise komprimiert werden.Finally, drawing 5 illustrates by way of example how the high data flow can be mastered when a single-photon detector is used. The pulses ( 51 ) of single photons, the temporally successive recorded pixels ( 55 ) be assigned ( 54 ). The binary stream can be stored in shift registers ( 52 ), which can be operated in parallel, are parallelized by logical operations in an FPGA ( 53 ) are compressed, for example.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

1111: SignalerzeugungsmittelSignal generation means
1212: Verstärkungsmittelreinforcing agents
1313: Resonanzmittelresonance means
1414: Galvanische Trennmittel, Symmetrisiermittel, TransformationsmittelGalvanic release agents, symmetrizing agents, transformation agents
1515: Elektrooptisches DeflektionsmittelElectro-optical deflecting agent
31 31: Steuerungsmittelcontrol means
3232: Laserlaser
3333: Laserlaser
3434: Elektrooptisches DeflektionsmittelElectro-optical deflecting agent
3535: Pupillenbildpupil image
3636: StrahlenteilungsmittelBeam splitting means
3737: Objektobject
3838: Objektivlens
3939: Phasenplatte, PupillePhase plate, pupil
310310: Abbildungsmittelimaging means
311311: Galvanometer, PupillenbildGalvanometer, pupil picture
312312: Spaltblendeslit
313313: Detektionsmitteldetection means
4141: Steuerungsmittelcontrol means
4242: Laserlaser
4343: Laserlaser
4444: Elektrooptisches DeflektionsmittelElectro-optical deflecting agent
4545: Pupillenbild, effektiver StrahldrehpunktPupil image, effective beam fulcrum
4646: Elektrooptisches DeflektionsmittelElectro-optical deflecting agent
4747: Pupillenbild, effektiver StrahldrehpunktPupil image, effective beam fulcrum
4848: Abbildungsmittelimaging means
5151: EinzelphotonenpulseSingle photon beams
5252: Schieberegistershift register
5353: DatenkompressionsmittelData compression means
5454: Registrierte Photonen im DatenstromRegistered photons in the data stream
5555: BildpunktdauerPixel Duration

Legenden der Zeichnungen:Legends of the drawings:

Zeichnung 1: Grundanordnung der erfindungsgemäßen Ausführungsform, eine mehrfach Resonanz aufweisende Schaltung zur Erzeugung hochfrequenter Hochspannung zur Ansteuerung elektrooptischer Deflektoren.Drawing 1: Basic arrangement of the embodiment according to the invention, a multi-resonance circuit for generating high-frequency high voltage for controlling electro-optical deflectors.

Zeichnung 2: Rasterform einer erfindungsgemäßen Ausführungsform.Drawing 2: Grid shape of an embodiment of the invention.

Zeichnung 3: STED-Mikroskop in der die erfindungsgemäße elektrooptische Anordnung in Kombination mit einem Galvanometer eingesetzt werden kann.Drawing 3: STED microscope in which the electro-optical arrangement according to the invention can be used in combination with a galvanometer.

Zeichnung 4: STED-Mikroskop mit 2 elektrooptischen Deflektoren, in der die erfindungsgemäße Anordnung beispielsweise zum Einsatz kommen könnte.Drawing 4: STED microscope with 2 electro-optical deflectors, in which the arrangement according to the invention could be used, for example.

Zeichnung 5: Einzelphotonensignalvorverarbeitung, wie sie in einer die Erfindung nutzenden Anordnung dazu dienen kann, den großen Primärdatenstrom zu bewältigen.Figure 5: Single-photon signal preprocessing, as may be used in an arrangement utilizing the invention to handle the large primary data stream.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

US 5103334 [0006]
US 7050208 B2 [0007]
US 5065008 [0007]
US 5936764 [0007]
US 5189547 [0008, 0011]
DE 4322694 A1 [0009]
WO 2006/108526 [0016]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

"Handbook of Biological Confocal Microscopy", Third Edition, edited by James B. Pawley, 2006 [0004]

Claims

Optical arrangement with a control means and at least one illumination means whose light beam is scanned by optical imaging means by means of at least one electro-optical deflector and a sample is detected in a sample by the light beam generated light, characterized in that the high-frequency voltages for the deflector are generated multiple resonant.

Arrangement according to claim 1, characterized in that the raster shape is linearized by the superimposition of a plurality of frequencies with suitable amplitudes and phases.

Arrangement according to claim 1, characterized in that synchronization can be established between the control means and at least one of the lasers.

Arrangement according to claim 1, characterized in that with the control means the pulse distribution over the object to be scanned is adjustable.

Arrangement according to claim 1, characterized in that it controls the laser beams in a STED microscope.

Arrangement according to claim 1, characterized in that by means of the control means, the light transit times are taken into account in the system.

Arrangement according to claim 1, characterized in that by means of the control means the fluorescence lifetimes are detectable.

Arrangement according to claim 1, characterized in that the light transit times in the system can be taken into account by the geometry of the optical arrangement.

Arrangement according to claim 1, characterized in that the fluorescence lifetimes are detectable by the geometry of the optical arrangement.

Arrangement according to claim 1, characterized in that the detection light is coupled out in front of the electro-optical deflector in the direction of the detector and does not pass the deflector.

Arrangement according to claim 1, characterized in that a confocal gap detection is arranged in the direction of the raster direction.

Arrangement according to claim 1, characterized in that a detector array is used for the detection.

Arrangement according to claim 1, characterized in that the detection signal detects individual photons.

Arrangement according to claim 1, characterized in that the number of simultaneously detected photons can be taken into account from the pulse heights.

Arrangement according to claim 1, characterized in that the detection signal is detectable analog.

Arrangement according to claim 1, characterized in that the detection data for data transfer into the image memory are compressible.

Arrangement according to claim 1, characterized in that more than one pixel is rasterized simultaneously.

Arrangement according to claim 17, characterized in that a plurality of detectors for signal detection are arranged in the detection focus.

Arrangement according to claim 1, characterized in that the result image is composed of a plurality of images.