DE2120442B2 - Verfahren zur in vitro bestimmung der schilddruesenfunktion - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur In-vitro-Bestimmung der Schilddrüsenfunktion durch Zugabe von radioaktiv markierter Schilddrüsensubstanz zu dem zu untersuchenden Serum in Gegenwart eines Puffers.

Es wurden in letzter Zeit zahlreiche Untersuchungsmethoden entwickelt, um die Schilddrüsenfunktion in vitro zu bestimmen, ohne den Patienten ionisierender Strahlung auszusetzen. Zum Beispiel sind spezifische Plasmaproteine, die als thyroxinbindende Proteine oder TBP bekannt sind, die hauptsächlichen bindenden Stellen für in der Schilddrüse gebildete Hormone. Da die TBP eine starke Affinität zu den Schilddrüsenhormonen besitzen, binden sie das gesamte freie Schilddrüsenhormon, bis sie gesättigt sind. Bei dieser Untersuchungsmethode werden derartige Hormone in einer Probe des Patientenserums für die TBP verfügbar gemacht, und es wird eine sekundär bindende Substanz in Form eines vernetzten Dextrans angewandt, um das nicht an das TBP gebundene zugesetzte radioaktive Trijodthyronin oder Thyroxin (im folgenden als T₃ bzw. T₄ bezeichnet) zu binden. So ermöglicht die Untersuchung eine Bestimmung des Sättigungsgrades des TBP in einer bestimmten Serumprobe, der ein indirektes, aber zuverlässiges Zeichen für die Schilddrüsenfunktion darstellt. Eine hohe Aufnahme von T, bzw. T₄ in dem Harz zeigt Hyperthyreose und eine geringe so Aufnahme Hypothyreose an.

Derartige Untersuchungsmethoden zur Bestimmung der Schilddrüsenfunktion sind in den USA.-Patentschriften 3 206 602, 3 451777 und 3 507 618 beschrieben. Da bei diesen Untersuchungen keine Farbänderung auftritt, kann der Ausführende verwirrt werden, wenn die Verfahrensstufen unterbrochen werden. Außerdem führt die Zersetzung des mit radioaktivem Jod markierten T₃ zu freiem Jodid, in Verbindung mit einer beachtlichen Adsorption der wäßrigen, gepufferten radioaktiven T₃-Lösung an Glas oder Plastikgefäßen zu einem beachtlichen Fehler bei der Bestimmung des Thyroidhormongehaltes der Serumprobe.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung der Schilddrüsenfunktion zu entwickeln, bei dem bei Verwendung einer Lösung, die einen pH-Indikator enthält,

1. eine Farbänderung auftritt, wenn die Serumprobe zugegeben wird,

2. die Bildung von freiem Jodid aus radioaktiv markiertem T₃ gehemmt und

3. die Adsorption von radioaktiv markiertem T_s an den Wänden des die Probe enthaltenden Gefäßes herabgesetzt wird.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß bei dem eingangs genannten Verfahren ein »Proteinfehler«-pH-Indikator zugesetzt wird.

Obwohl die Untersuchungen der Schilddrüsenfunktion auf viele verschiedene Arten durchgeführt werden können, besteht ein übliches Verfahren darin, daß man eine geeignete Menge einer gepufferten, wäßrigen Lösung von radioaktivem Trijodthyroniii oder Thyroxin und Serum auf eine Säule aus einen Ionenaustauscherharz oder einem vernetzten Dextran aufbringt. Man läßt die Flüssigkeit dann au;; der Säule ablaufen und mißt die Radioaktivität 1 Minute mit einem Gerät zur Messung der y-Strahlung. Die Säule wird anschließend mit destillierten! Wasser eluiert und die in der Säule verbleibende Radioaktivität erneut 1 Minute lang gemessen. Die prozentuale Retention wird dann berechnet, indem man die beiden Werte vergleicht. Retentionen von 41 bis 61 °/o mit vernetzten Detranen und von 25 bis 35% mit Harz werden als normal angesehen.

Es hat sich nun gezeigt, daß man durch Zugabe des »Proteinfehler«-pH-Indikators zu einer wäßrigen radioaktiver T₃-Lösung, bevor diese mit der Seruniprobe zusammengegeben wird, oder durch Zugabe dieses Indikators zu der vereinigten T₃-Lösung und Serumprobe ein wesentlich verbessertes Testsystem erhalten kann.

Der bei der vorliegenden Erfindung verwendete pH-Indikator ist ein Proteinfehlerindikator, der die Farbe in Gegenwart von Albumin ohne eine deutliche Änderung des pH-Wertes ändert. Wenn ein derartiger Indikator in einer Konzentration von ungefähr 50 bis 70 μg/ml einer wäßrigen ¹²⁵J-T₃-Reagens-Lösung, die auf einen pH-Wert von 5 gepuffert ist, zugegeben wird, ändert das Reagens seine ursprüngliche Farbe in eine zweite Farbe, wenn das Serum zugegeben wird. Diese zweite Farbe ist eine Markierung, die in verschiedenen Höhen der Harz- oder Dextransäule auftritt, in Abhängigkeit von der letzten, vollständigen Verfahrensstufe bei der Untersuchung, da sich die Farbe mit der Lösungsmittelfront vorwärts bewegt.

Ein bevorzugter Indikator ist Brcnikresolpurpur, das seine Farbe von Gelb nach Purpur im pH-Bereich von 5,2 bis 6,8 ändert. Wenn er mit einer wäßrigen radioaktiven T₃-Lösung vermischt wird, geht die gelb-orange Farbe in eine grau-grüne Farbe über, wenn eine Menge von 0,05 ml Serum auf 0,45 ml des Reagensgemisches zugegeben wird. Daher zeigt die grüne Farbe das Vorhandensein des Serums an. Andere geeignete Indikatoren, die je nach dem pH-Wert des Puffersystems verwendet werden können, sind

1. Chlorphenolrot, das seine Farbe bei einem pH-Wert von 6,5 von Rot nach Violett ändert,

2. Tetrabromphenolblau, das die Farbe bei einem pH-Wert von 3,0 von Gelb nach Blau ändert,

3. Bromphenolblau, das die Farbe bei einem pH-Wert von 3,0 von Gelb nach Purpur ändert.

3 4

4. Bromkresolgrün, bei dem bei einem pH-Wert gleichsprobe, die keinen Indikator enthielt. Nach von 3,0 eine Farbänderung von Gelb nach Blau 60 Tagen bei 40° C enthielt die T₃-Tesüösung mit auftritt und pH-Indikator 4,25% freies Jodid, während die Ver-

5. Bromthymolblau, dessen Farbe sich bei einem gleichsprobe einen Gehalt an freiem Jodid von 9,0% pH-Wert von 6,5 von Grün nach Gelb ändert. S aufwies.

Ein weiterer Vorteil der Verwendung eines pH-

In der Praxis sind die bei der Farbänderung auf- Indikators in einer T_s-Testlösung besteht darin, daß

tretenden Farben nicht wichtig, solange ein Unter- die Adsorption von radioaktivem T₃ an den Wänden

schied leicht erkennbar ist. aus einem Plastik- oder Glasbehälter gehemmt wird.

Vorzugsweise erhält das erfindungsgemäße, ver- io Propylenglykol und Albumin wurden bisher verwen-

besserte T₃-Testreagens mit dem pH-Indikator die det, um eine derartige Adsorption herabzusetzen,

folgenden Bestandteile: Diese Zusätze stören jedoch bei der Untersuchung

der Schilddrüsenfunktion. Bei den Versuchen wur-

Bestandteil Menge den wäßrige radioaktive T₃-Lösungen, enthaltend

Wasserfreie Zitronensäure 43,2 g ij einen oder mehrere Indikatoren, in einer Konzen-

Zweibasiscb.es Natriurnphosphat ... 125,0 g tration von 60 μg/ml Lösung 14 Tage in einem PoIy-

Formaldehyd (38%ige wäßrige äthylen-Behälter auf einem Rad in Rotation gehalten

Lösung) 8,1 ml und die verbleibende Aktivität mit einer Vergleichs-

¹²⁵J Trijodthyronin 4,0 μg probe verglichen, die keinen Indikator enthielt. Die

Nicht markiertes Trijodthyronin ... 26,0 μ§ ao erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß über 90% der

Bromkresolpurpur 0,18 g Radioaktivität (nach Korrektur des physikalischen

Destilliertes Wasser auf 3,01 Abklingens) in den Lösungen erhalten geblieben

waren, die Bromthymolblau, Chlorphenolrot, Brom-

Neben der bei Verwendung eines pH-Indikators kresolpurpur und Tetrabromphenolblau enthielten, der angegebenen Art auftretenden Farbänderung er- as während in Lösungen, die Phenolrot oder Bromgibt sich ein anderer Vorteil aus der unvorhergesehe- kresolgrün enthielten, 80% der Radioaktivität erhalnen Eigenschaft des Indikators, die Bildung von ten geblieben waren und bei denen, die Bromphenolfreiem Jodid aus dem verwendeten ¹²⁵J-T₃ in dem blau enthielten, 70%. Unter den gleichen Versuchs-T₃-Reagens zu hemmen. Das ist wichtig, da die Zähl- bedingungen waren bei der Vergleichsprobe, die keivorrichtung für die ^-Strahlung nicht zwischen 30 nen der erwähnten Indikatoren enthielt, 32% der 125J _ X_{3 un(}j freiem ¹²⁵J unterscheiden kann und Radioaktivität in der Lösung erhalten geblieben, zunächst während der Untersuchung das gesamte Ähnliche Ergebnisse wurden mit Glasgefäßen er-¹²⁵J gemessen wird. Beim Auswaschen mit Wasser halten.

wird alles etwaige freie ¹²⁵J aus der Säule entfernt, Eine ähnlich starke Abnahme der Adsorption

da nur die Hormonsubstanzen in der Säule festgehal- 35 wurde beobachtet, wenn die Plastik- oder Glasbehäl-

ten werden. So unterliegt, wenn der Prozentsatz an ter vor dem Füllen mit radioaktivem T₃-Reagens,

freiem Jodid über 5% der Gesamtdosis liegt, das das keinen Indikator enthält, vorgewaschen wurden.

T₃-Verhältnis einem deutlichen Fehler von 5 Der Ausdruck »Vorgewaschen« bedeutet, daß die

bis 10%. Innenseiten dieser Behälter mit einer wäßrigen, ge-

Bei einer Reihe von Versuchen wurde eine ge- 40 pufferten Lösung eines der obenangegebenen pH-

pufferte, wäßrige Lösung von ¹²⁵J — T₃, enthaltend Indikatoren in Berührung gebracht wurden, z. B.

60 μg Bromkresolpurpur pro ml, die, wie in dem durch Ausspülen oder Benetzen. Bromkresolpurpur

vorigen Beispiel gezeigt, hergestellt worden war un- oder Bromthymolblau sind die bevorzugten IndiJca-

ter verschiedenen Bedingungen, in einem Polyäthy- toren. Diese Indikatoren werden in einer Konzen-

lenbehälter gelagert, und der Prozentsatz an gebilde- 45 tration von 50 bis 70 μg pro ml auf einen pH-Wert

tem Jodid wurde mit einer ähnlichen Lösung ver- von ungefähr 5 gepuffertes Wasser verwendet,

glichen, die keinen pH-Indikator enthielt. Die ver- Selbstverständlich kann das bei den erfindungsge-

wendeten Anfangslösungen enthielten ungefähr 2% mäßen Prüfmitteln verwendete T₃ entweder mit ¹²⁵J

freies Jodid. Nach 90 Tagen bei Raumtemperatur oder ¹³¹J radioaktiv gemacht werden, obwohl ¹²⁵J

zeigte die radioaktive T₃-Lösung, die den Indikator 50 bevorzugt ist, da es eine Halbwertzeit von 56 Tagen

enthielt, einen Prozentgehalt von 2,25% freiem Jo- besitzt, verglichen mit ¹³¹J, das eine Halbwertzeit

did, verglichen mit 5,2% freiem Jodid in der Ver- von 8 Tagen hat.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur In-vitro-Bestimmung der Schilddrüsenfunktion durch Zugabe von radioaktiv markierter Schilddrüsensubstanz zu dem zu untersuchenden Serum in Gegenwart eines Puffers, dadurch gekennzeichnet, daß ein »Proteinfehler«-pH-Indikator zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- ίο kennzeichnet, daß als Indikator Bromkresolpurpur, Chlorphenolrot, Tetrabromphenolblau, Bromphenolblau, Bromkresolgrün oder Bromthymolblau verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator in einer Menge von ungefähr 60 μg/ml verwendet wird.