DE2211423A1 - Verfahren und vorrichtung zur beobachtung biologischer proben mit einem abtastelektronenmikroskop - Google Patents
Verfahren und vorrichtung zur beobachtung biologischer proben mit einem abtastelektronenmikroskopInfo
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- H01J37/18—Vacuum locks ; Means for obtaining or maintaining the desired pressure within the vessel
Description
2211423 Patentanwalt Dipl.-Phys. Gerhard Liedl 3 München 22 Steinsdorfstr. 21-22 Te!. 29 84 62
B 5527
NIHON DENSHI KABUSHIKI KAISHA 1418 Nakagami-cho, Akishima-shi, Tokyo, Japan
Verfahren und Vorrichtung zur Beobachtung biologischer Proben unter
Verwendung eines Abtastelektronenmikroskopes.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Beobachtung
biologischer Proben unter Verwendung eines Abtastelektronenmikroskopes.
Im Vergleich zu einem bekannten Übertragungselektronenmikroskop weist ein Abtastelektronenmikroskop den Vorteil auf, daß es ein räumliches
Bild der Probengestalt erzeugen kann. Wenn hierbei jedoch große Proben verwendet werden, wirkt sich die Anwesenheit von Wasser,
das mittels Sublimation entfernt wurde, in der Mikroskopsäule
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schädlich auf die Probe aus und beeinflußt die natürliche dreidimensionale
Ausbildung nachteilig. Dies gilt insbesondere für biologische und chemische Untersuchungsproben, bei denen der Wassergehalt hoch ist.
Um dienen Nachteil /λι beseitigen, ist seit einiger Zeit die Absehreckgefrierung
tier Untersuehtmgsprobe eingeführt worden.
Die Abschreekgefrierung ist in doppelter Hinsicht insofern vorteilhaft,
als zusätzlich zu dem Umstand, daß kein Schaden mehr durch die Sublimation
entstehen kann, es auch nicht mehr erforderlich ist, die Probenoberfläche mit einem Überzug zu versehen, um die Beobachtung durchführen
zu können. Es ist jedoch erforderlich, die Frostbildung an der Oberfläche der gefrorenen Probe zu verhindern oder statt dessen den
Frost von dieser Oberfläche wirksam zu entfernen.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und
eine Vorrichtung zur Beobachtung biologischer Proben unter Verwendung eines Abtastelektroneimukroskopes zu schaffen, durch das
die Frostbildung auf der Probenoberfläche verhindert bzw. die Entfernung der Frostbildimg auf der Probenoberfläche erleichtert ist.
Weiterhin soll hierdurch verhindert werden, daß sich an der Querschnittsfläche der Probe, an der die Beobachtung durchgeführt werden
soll, Frost bildet. Schließlich soll auch noch verhindert werden, daß sich während des Probenwechsels am Zwischenobjektträger, der in
der Vorevakuierungskammer angeordnet ist, oder an der Innenwand der Vorevakuierungskammer Frost bildet.
Zur Lösung dieser Aufgabe ist das Verfahren zur Beobachtung biologischer
Proben eifindungsgemäß derart ausgebildet, daß die Probe
durch Abschreckgefrierung gefroren und die gefrorene Probe in die
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evakuierte Vorevakuierungskammer des Mikroskopes eingebracht wird,
daß die Probe mittels emetin der Kammer angeordneten Einrichtung behandelt
und zum Objektträger der Probenkammer überführt wird, der in kaltem Zustand gehalten wird, imd daß die Probenoberfläche zum
Erzielen eines abgetasteten Bildes mit einem Elektronenstrahlbündel abgetastet wird.
In besonderer Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, daß die ungefrorene
Probe auf einem Probenhalter befestigt und dieser zusammen mit der Probe in ein Gefriermittel getaucht wird, daß die Probe noch
in eingetauchtem Zustand mittels eines Deckels dicht verschlossen,
darauf in die Vorevakuierungskammer überführt und dort der Deckel
abgenommen wird.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Behandlung der gefrorenen
Probe ist vorgesehen, daß in der Vorevakuierungskammer des Abtastelektronenmikroskopes
ein Zv/ischenobjekttrtiger angeordnet ist, mittels
dem die Probe und der Halter in kaltem Zustand haltbar sind, und daß zum Schneiden der gefrorenen Probe ein Messer oder anderes Schneidwerkzeug
vorgesehen ist, das an einem Ende einer an der Vor evakuier ungskammer
befestigten Betätigungsstange angeordnet ist.
Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie aus der folgenden Beschreibung
bevorzugter Ausführungsformen anhand der Zeichnung.
Diese zeigt in:
Fig. 1 schematisch das Evakuierungssystem eines typischen Abtastelektronenmikroskopes;
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Fig. 2 querschnittlich das Eintauchen einer an einem Halter befestigten Probe in ein Gefriermittel;
Fig. 3 querschnittlich eine Vorevakuierungskammer, in der der auf die Probe aufgebrachte Deckel
entfernt wird;
Fig. 4 querschnittlich eine Ausführungsform zur Beobachtung eines frostfreien Querschnittes der gefrorenen
Probe;
Fig. 5 querschnittlich eine Ausführungsform der Vorevakuierungskammer
mit einer Heizspule zur Entfernung des Frostes von der Oberfläche der
gefrorenen Probe;
Fig. 6 querschnittlich eine abgewandelte Ausführungsform
hierzu und
Fig. 7 schematisch eine Ausführungsform, mittels der
die Frostbildung während des Probenwechsels verhinderbar ist.
Wie aus Figur 1 ersichtlich, weist das schematisch dargestellte Abtastelektronenmikroskop
eine elektronenoptische Säule auf, die eine Elektronenstrahlerzeugungskammer
und eine Probenkammer umfaßt. Die Säule 1 wird durch eine Kreiselpumpe 2 über ein Ventil 3 in starkem
Maße evakuiert und durch eine Diffusionspumpe 4 sowie eine Kreiselpumpe 5 über ein Ventil 6 vollständig evakuiert. Es ist weiterhin eine
Vorevakuierungskammer 7 vorgesehen, die von der in der Mikroskop-
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säule 1 angeordneten Probenkammer mittels einer Tür 8 und von der
Atmosphäre mittels eines Deckels 9 abgetrennt ist. Die Vor evakuier ungs kammer
7 ist über ein Ventil 10 mittels der Kreiselpumpe 2 evakuiert; sie weist außerdem ein Nebenschlußventil 11 auf.
Die im folgenden beschriebene Ausführungsform der Erfindung bezieht
sich auf die Vorevakuierungskammer 7.
Wie aus Figur 2 ersichtlich, ist auf einem Probenhalter 13," in den
eine Halteraustauschstange 14 eingesciiraubt ist, eine biologische Untersuchungsprobe
2 befestigt. Ier Halter 13 wird zusammen mit der Probe in flüssigen Stickstoff 15 oder in flüssiges Freon, d. h. Frigen, das sich
im Behälter 16 befindet, eingetaucht. Die Probe 2 wird sodann mittels eines Deckels 17 verschlossen, wobei sie noch in das Gefriermittel 15
eingetaucht ist; darauf wird die abgedichtete Probe 2 in die Vorevakuierungskammer
7 überführt. Daraufhin wird der Deckel 17, wie aus Figur 3 ersichtlich, unter Vakuum mittels der Austauschstange 14 entfernt,
die mittels eines Kugelgelenkes 18 und einer Kugelpfanne 19 an der Vorevakuierungskammer 7 angeordnet ist; das Entfernen des Deckels
vom Halter 13 erfolgt dadurch, daß er gegen einen vorspringenden Arm 20 gedruckt wird, der ein Teil der Vorevakuierungskammer 7 ist.
Das Entfernen des Deckels 17 wird dadurch erleichtert, daß eine gläserne Sichtscheibe 21 vorgesehen ist, die ein Teil des die V or evakuier ungs kammer
7 abschließenden Deckels 9 ist. Danach wird die Probe 2 zum Objektträger überführt, der sich in der Probenkammer in der Mikroskopsäule
1 befindet, wobei der Objektträger in kaltem Zustand gehalten wird; danach wird die Probe 2 vom Abtastelektronenstrahlbündel
beaufschlagt und das Probenbild beobachtet.
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BAD *
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Wie aus Figur 4 ersichtlich, ist in der Vorevakuierungskammer 7 ein Zwischenobjektträger 22 vorgesehen, der mittels eines mit flüssigem
Stickstoff gefüllten Behälters 23 und einer würmeleitenden Stange in kaltem Zustand gehalten wird. Weiterhin ist ein optisches Lichtmikroskop 25 vorgesehen, mittels dem die auf den Zwischenobjektträger
22 angeordnete Probe 2 beobachtet werden kann. In der Wand der Vorevakuierungskammer 7 ist mittels einer Gelenkkugel 27 und einer
Kugelpfanne 28 eine Betätigungsstango 26 gelagert, die aufgrund ihrer
Lagerung leicht bedienbar ist, An der Spitze der Stange 26 ist ein Messer 29 oder eine Nadel befestigt, um die gefrorene Probe 2 schneiden
bzw. hiervon Scheiben abtrennen zu können.
Da das Messer, 29 oder die Nadel während der Bearbeitung der Probe 2
in kaltem Zustand gehalten werden müssen, ist es erforderlich, ent-· weder das Messer 29 bzw. die Nadel vor der Durchführung des Schnittes
in direkte Berührung mit dem Zwischenobjektträger 22 zu bringen oder aber mittels eines wärmeleitenden Drahtgurtes 30 mit der wärmeleitenden
Stange 24 zu verbinden. In jedem Fall ist aufgrund dieser Ausbildung gewährleistet, daß die gefrorene Probe 2 je nach Wunsch
geschnitten oder in Scheiben aufgeteilt werden kann, ohne daß an der neu gebildeten Oberfläche Frostbildung entsteht; hierdurch ist es möglich,
die Innenstruktur der Probe in fast natürlichem Zustand zu beobachten.
Bei der Ausführungsform gemäß Figur 5 ist in der Nähe des Zwischenobjektträgers
22, auf dem der Probenhalter 13 zusammen mit der Probe 2 angeordnet ist, eine Heizspule 31 vorgesehen. Der Heizstrom wird
an dieser Heizspule 31 von einer Stromquelle 32 über Isolatoren 33 geliefert. Bei Verwendung dieser Ausführungsform ist es möglich, einen
beliebigen gesamten Bereich der Probenoberfläche aufzutauen.
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.Υ.
Bei der Ausführungsform gemäß Figur 6 wird an Stelle der Betätigungsstange
26 gemäß Figur 4 eine Bifrarotbestrahlungseinrichtung 34 verwendet.
Um diese wiederum leicht verstellen zu können, ist sie auf einer Rolle 35 angeordnet. Die von einer Lampe 36. ausgesandten Infrarotstrahlen
werden durch zwei in die Einrichtung 34 eingebaute Linsen 37, 38 gebündelt und können wahlweise auf jede gewünschte Stelle
der gefrorenen Probenoberfläche gerichtet werden. Hierdurch ist es möglich, den zu beobachtenden speziellen Probenbereich aufzutauen,
ohne daß die Gesamttemperatur der Probe wesentlich beeinflußt wird.
Die aus Figur 7 ersichtliche Ausführungsform ist so ausgebildet, daß
während des Probenwechsels in der Probenkammer keine Frostbildung entsteht. Bei bekannten Vorrichtungen ist. es erforderlich, die Vorevakuierungskammer
der Atmosphäre auszusetzen, um die untersuchte Probe herausnehmen und eine neue einsetzen zu können.
Aus diesem Grund wird der Zwischenobjektträger mit Frost überzogen;
darüberhinaus bewirkt die Sublimation, d.h. die Verdunstung dieses Frostes aufgrund der darauffolgenden Evakuierung, daß sich auf der
neuen Probe Frost bildet. Um dies zu verhindern, wird bei der Ausführungsform gemäß Figur 7 wahrend "der Zeit, in der die Probe 2
ausgetauscht wird, von einer Gasquelle 39 über das Nebenschlußventil Trockengas in die V or evakuier ungskamm er 7 geleitet.
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BAD ORIGINAL
Claims (8)
1. J Verfahren zur Beobachtung biologischer Proben unter Verwendung
eines Abtastelektronenmikroskopes, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe (2) durch Abschreckgefrierung gefroren und danach in
die evakuierte Vorevalaiierungskammer (7) des Mikroskopes eingebracht wird, daß die Probe mittels in der Kammer angeordneter Einrichtungen
(29, 31, 34) behandelt und zum Objektträger der Probenkammer überführt wird, der in kaltem Zustand gehalten wird, und daß die
Probenoberfläche zum Erzielen eines abgetasteten Bildes mit einem ElektronenstrahlbUndel abgetastet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die ungefrorene Probe (2) auf einem Probenhalter (13) befestigt und dieser zusammen mit der Probe in ein Gefrier mittel (15) getaucht
wird, daß die Probe noch in eingetauchtem Zustand mittels eines Deckels (17) dicht verschlossen , darauf in die Vorevakuierungskammer
(7) überführt und dort der Deckel abgenommen wird.
3. Vorrichtung zur Behandlung der gefrorenen Probe unter Verwendung eines Abtastelektronenmikroskopes nach Anspruch 1 oder
2, dadurch gekennzeichnet, daß in der Vorevakiüerungskammer (7) des
Mikroskopes ein Zwischenobjektträger (22) angeordnet ist, mittels dem die Probe (2) und der Halter (13) in kaltem Zustand haltbar sind, und
daß zum Schneiden der gefrorenen Probe ein Messer (29) oder ein anderes Schneidwerkzeug vorgesehen ist, das an einem Ende einer an der
Vorevakuierungskammer befestigten Betätigungsstange (26) angeordnet
ist.
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BAD ORfQfNAL
4„ Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß
zum Beobachten der Probe (2) ein Lichtmikroskop (25) vorgesehen ist,
das in der Wand der Vorevakuierungskanmier (7) gehaltert ist.
5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, gekennzeichnet durch eine Einrichtung (23, 30), mittels der das Schneidmesser (29) in kaltem
Zustand haltbar ist.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet,
daß in der Vorevakuierungskammer (7) eine mit einer
Fokussier einrichtung (37, 38) versehene Infrarot-Bestrahlungseinrichtung (34) vorgesehen ist, mittels der wahlweise bestimmte Bereiche
der Probenoberfläche auftaubar sind.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die Vorevakuierungskamraer (7) eine Heizspule (31) aufweist, die um die Probe (2) herum angeordnet ist.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet,
daß die Vorevakuierungskammer (7) des Mikroskopes
während des Probenwechsels mit Trockengas belieferbar ist.
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