DE2211423C3 - Verfahren und vorrichtung zur beobachtung biologischer proben mit einem abtastelektronenmikroskop - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur beobachtung biologischer proben mit einem abtastelektronenmikroskop

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    • H01J37/18Vacuum locks ; Means for obtaining or maintaining the desired pressure within the vessel

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beobachtung biologischer Proben in einem Abtastelektronenmikroskop, bei dem die Probe auf einem Probenhalter befestigt und dieser zusammen mit der Probe in ein Gefriermittel getaucht und danach in das Mikroskop eingebracht wird und bei dem die Probenoberfläche zum Erzielen eines abgetasteten Bildes mit einem Elektronenstrahlbündel abgetastet wird, sowie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Ein derartiges Verfahren ist aus »Journal of Scientific Instruments« (J. of Physics E), Bd. 1, 1968, Nr. 11. S. 1123-1124 bekannt.
Im Vergleich zu einem Durchstrahlungselektronenmikroskop weist ein Abtastelektronenmikroskop den Vorteil auf, daß es ein räumliches Bild der Probengestalt erzeugen kann. Bei großen Proben jedoch wirkt sich die Anwesenheit von Wasser, das mittels Sublimation in der Mikroskopsäule entfernt wird, schädlich auf die Probe aus und beeinflußt die natürliche dreidimensionale Gestalt der Probe nachteilig. Dies gilt insbesondere für biologische und chemische Untersuchungsproben, bei denen der Wassergehalt hoch ist.
Bei dem o. g. aus »Journal of Scientific Instruments« (J. of Physics E), Bd. 1, 1968, Nr. 11, S. 1123-1124 bekannten Verfahren zur Beobachtung biologischer Proben in einem Abtastelektronenmikroskop kann zwar kein Schaden mehr durch die Sublimation des Wassers in der Mikroskopsäule entstehen und es ist auch nicht mehr erforderlich, die Probenoberfläche mit einem Überzug zu versehen, um die Beobachtung durchführen zu können; es ist jedoch erforderlich, die Frostbildung an der Oberfläche der gefrorenen Probe zu verhindern oder statt dessen den Frost von dieser Oberfläche wirksam zu entfernen.
Aus der deutschen Patentschrift 7 23 583 ist eine Vorrichtung zur Beobachtung infiziöser Proben in einem Elektronenmikroskop bekannt, bei der der Probenträger mit der Probe mit einem Deckel verschlossen wird, in die Vorevakuierungskammer des Mikroskops eingebracht wird, der Deckel in der Vorevakuierungskammer abgehoben wird und dann die Probe in das Mikroskop übergeführt wird. Bei dieser Vorrichtung ergibt sich jedoch nicht das Problem der Frostbildung auf der Probenoberfläche. Entsprechende Vorkehrungen sind an der bekannten Vorrichtung demgemäß nicht vorhanden.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Beobachtung biologischer Proben in einem Abtastelektronenmikroskop zu schaffen, durch das die Frostbildung auf der Probenoberfläche verhindert wird.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird beim Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß die noch im Gefriermittel eingetauchte Probe mittels eines Deckels dicht verschlossen, darauf in die Vorevakuierungskammer des Mikroskops überführt und dort unter Vakuum der Deckel abgenommen wird, und daß die Probe mittels in der Vorevakuierungskammer angeordneter Einrichtungen behandelt und zum im kalten Zustand gehaltenen Objektträger der Probenkammer des Mikroskops überführt wird.
Eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens unter Verwendung eines Abtastelektronenmikroskops ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß in der Vorevakuierungskammer des Mikroskopes ein Zwischenobjektträger angeordnet ist, mittels dem die Probe und der Probenhalter in kaltem Zustand haltbar sind, und daß zum Schneiden der gefrorenen Probe ein Schneidwerkzeug vorgesehen ist, das an einem Ende einer an der Vorevakuierungskammer befestigten Betätigungsstange angeordnet ist.
In vorteilhafter Weise wird durch die Erfindung verhindert, daß sich an der Schnittfläche der Probe, an der die Beobachtung durchgeführt werden soll, Frost bildet. Außerdem wird noch verhindert, daß sich
Λ' während des Probenwechsels am Zwischenobjektträger, der in der Vorevakuierungskammer angeordnet ist, oder an der Innenwand der Vorevakuierungskammer Frost bildet.
Die folgende Beschreibung erläutert Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung. Diese zeigt in
F i g. 1 schematisch das Evakuierungs>ystem eines Abtastelektronenmikroskopes;
F i g. 2 querschnittlich das Eintauchen einer an einem Halter befestigten Probe in ein Gefriermittel;
F i g. 3 querschnittlich eine Vorevakuieningskammer, in der der auf die Probe aufgebrachte Deckel entfernt wird;
F i g. 4 querschnittlich eine Ausführungsform der Vorevakuierungskammer zur Beobachtung eines frostfreien Querschnittes der gefrorenen Probe;
Fig.5 querschnittlich eine Ausführungsform der Vorevakuierungskammer mit einer Heizspule;
F i g. 6 querschnittlich eine abgewandelte Ausführungsform der Vorevakuierungskammer und
F i g. 7 schematisch ein Abtastelektronenmikroskop, bei dem die Frostbildung während des Prolyenwechsels verhinderbar ist.
Wie aus Fig.! ersichtlich, weist das schematisch dargestellte Abtastelektroneiimikroskop eine elektronenoptische Säule auf, in der eine Probenkammer angeordnet ist Die Säule 1 wird durch eine Kreiselpumpe 2 über ein Ventil 3 vorevakuiert und durch eine Diffusionspumpe 4 sowie eine Kreiselpumpe 5 über ein Ventil 6 vollständig evakuiert. Es ist weiterhin eine Vorevakuierungskammer 7 vorgesehen, die von der in der Mikroskopsäule I angeordneten Probenkammer mittels einer Tür 8 und von der Atmosphäre mittels eines Deckels 9 abgetrennt ist. Die Vorevakuierungskammer 7 ist über ein Ventil 10 mittels der Kreiselpumpe 2 evakuiert; sie weist außerdem ein Nebenschlußventil 11 auf.
Wie aus F i g. 2 ersichtlich, ist auf einem Probenhalter 13, in den eine Halteraustauschstange 14 eingeschraubt ist, eine biologische Untersuchungsprobe 2 befestigt. Der Halter 13 wird zusammen mit der Probe 2 in flüssigen Stickstoff 15 oder in flüssiges Freon, d. h. Frigen, das sich im Behälter 16 befindet, eingetaucht. Die Probe 2 wird sodann mittels eines Deckels 17 verschlossen, wobei sie noch in das Gefriermittel 15 eingetaucht ist; darauf wird die abgedichtete Probe 2 in die Vorevakuierungskammer 7 überführt. Daraufhin wird der Deckel 17, wie aus Fig.3 ersichtlich, unter Vakuum mittels der Austauschstange !4 entfernt, die mittels eines Kugelgelenkes 18 und einer Kugelpfanne 19 an der Vorevakuierungskammer 7 angeordnet ist; das Entfernen des Deckels 17 vom Halter 13 erfolgt dadurch, daß er gegen einen vorspringenden Arm 20 gedrückt wird, der ein Teil der Vorevakuierungskammer 7 ist. Das Entfernen des Deckels 17 wird dadurch erleichtert, daß eine gläserne Sichtscheibe 21 vorgesehen ist, die ein Teil des die Vorevakuierungskammer 7 abschließenden Deckels 9 ist. Danach wird die Probe 2 zum Objektträger überführt, der sich in der Probenkammer in der Mikroskopsäule 1 befindet, wobei der Objektträger in kaltem Zustand gehalten wird; danach wird die Probe 2 vom Abtastelektronenstrahlbündel beaufschlagt und das Probenbild beobachtet.
Wie aus F i g. 4 ersichtlich, ist in der Vorevakuierungskammer 7 ein Zwischenobjektträger 22 vorgesehen, der mittels eines mit flüssigem Stickstoff gefüllten Behalters 23 und einer wärmeleitenden Stange 24 in kaltem Zustand gehalten wird. Weiterhin ist ein optisches Lichtmikroskop 25 vorgesehen, mittels dem die auf den Zwischenobjektträger 22 angeordnete Probe 2 beobachtet werden kann. In der Wand der Vorevakuierungskammer 7 ist mittels einer Gelenkkugel 27 und einer Kugelpfanne 28 eine Betätigungsstange 26 gelagert, die aufgrund ihrer Lagerung leicht bedienbar ist. An der Spitze der Stange 26 ist ein Messer 29 oder eine Nadel befestigt, um die gefrorene Probe 2 schneiden bzw. hiervon Scheiben abtrennen zu können.
Da das Messer 29 oder die Nadel während der Bearbeitung der Probe 2 in kaltem Zustand gehalten werden müssen, ist es erforderlich, entweder das Messer 29 bzw. die Nadel vor der Durchführung des Schnittes in direkte Berührung mit dem Zwischenobjektträger 22 zu bringen oder aber mittels eines wärmeleitenden Drahtgurtes 30 mit der wärmeleitenden Stange 24 zu verbinden. In jedem Fall ist aufgrund dieser Ausbildung gewährleistet, daß die gefrorene Probe 2 je nach Wunsch geschnitten oder in Scheiben aufgeteilt werden kann, ohne daß an der neu gebildeten Oberfläche Frostbildung entsteht; hierdurch ist es möglich, die Innenstruktur der Probe in fast natürlichem Zustand zu beobachten.
Bei der Ausführungsform gemäß F i g. 5 ist in der Nähe des Zwischenobjektträgers 22, auf dem der Hrobenhalter 113 zusammen mit der Probe 2 angeordnet ist, eine Heizspule 31 vorgesehen. Der Heizstrom wird an dieser Heizspule 31 von einer Stromquelle 32 über Isolatoren 33 geliefert Bei Verwendung dieser Ausführungsform ist es möglich, einen beliebigen gesamten Bereich der Probenoberfläche aufzutauen.
Bei der Ausführungsform gemäß F i g. 6 wird anstelle der Betätigungsstange 26 gemäß F i g. 4 eine Infrarotbestrahlungseinrichtung 34 verwendet. Um diese wiederum leicht verstellen zu können, ist sie auf einer Rolle 35 angeordnet. Die von einer Lampe 36 ausgesandten Infrarotstrahlen werden durch zwei in die Einrichtung 34 eingebaute Linsen 37, 38 gebündelt und können wahlweise auf jede gewünschte Stelle der gefrorenen Probenoberfläche gerichtet werden. Hierdurch ist es möglich, den zu beobachtenden speziellen Probenbereich aufzutauen, ohne daß die Gesamttemperatur der Probe wesentlich beeinflußt wird.
Das aus F i g. 7 ersichtliche Abtastelektronenmikroskop ist so ausgebildet, daß während des Probenwechsels in der Probenkammer keine Frostbildung entsteht. Bei bekannten Mikroskopen ist es erforderlich, die Vorevakuierungskammer der Atmosphäre auszusetzen, um die untersuchte Probe herausnehmen und eine neue einsetzen zu können.
Aus diesem Grund wird der Zwischenobjektträger mit Frost überzogen; darüber hinaus bewirkt die Sublimation, d. h. die Verdunstung dieses gefrorenen Wassers aufgrund der darauffolgenden Evakuierung, daß sich auf der neuen Probe Frost bildet. Um dies zu verhindern, wird bei dem Mikroskop gemäß Fig. 7 während der Zeit, in der die Probe 2 ausgetauscht wird, von einer Gasquelle 39 über das Nebenschlußventil 11 Trockengas in die Vorevakuierungskammer 7 geleitet.
Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

Claims (7)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Beobachtung biologischer Proben in einem Abtastelektronenmikroskop, bei dem die Probe auf einem Probenhalter befestigt und dieser zusammen mit der Probe in ein Gefriermittel getaucht und danach in das Mikroskop eingebracht wird und bei dem die Probenoberfläche zum Erzielen eines abgetasteten Bildes mit einem Elektronenstrahlbündel abgetastet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die noch im Gefriermittel (15) eingetauchte Probe (2) mittels eines Deckels (!7) dicht verschlossen, darauf in die Vorevakuierungskammer (7) des Mikroskops überführt und dort unter Vakuum der Deckel (17) abgenommen wird, und daß die Probe (2) mittels in der Vorevakuierungskammer (7) angeordneter Einrichtungen (29, 31, 34) behandelt und zum im kalten Zustand gehaltenen Objektträger der Probenkammer des Mikroskops überführt wird.
2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 unter Verwendung eines Abtastelektronenmikroskopes, dadurch gekennzeichnet, daß in der Vorevakuierungskammer (7) des Mikroskopes ein Zwischenobjektträger (22) angeordnet ist, mittels dem die Probe (2) und der Probenhalter (13) in kaltem Zustand haltbar sind, und daß zum Schneiden der gefrorenen Probe ein Schneidwerkzeug (29) vorgesehen ist, das an einem Ende einer an der Vorevakuierungskammer befestigten Betätigungsstange(26) angeordnet ist (F i g. 4).
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zum Beobachten der Probe (2) ein Lichtmikroskop (25) vorgesehen ist, das in der Wand der Vorevakuierungskammer (7) gehaltert ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, gekennzeichnet durch eine Kühleinrichtung (23,30), mitteis der das Schneidmesser (29) in kaltem Zustand haltbar ist.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in der Vorevakuierungskammer (7) eine mit einer Fokussiereinrichtung (37, 38) versehene Infrarot-Bestrahlungseinrichtung (34) vorgesehen ist, mittels der wahlweise bestimmte Bereiche der Probenoberfläche auftaubar sind (F ig. 6).
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorevakuierungskamtner (7) eine Heizspule (31) aufweist, die um die Probe (2) herum angeordnet ist (F i g. 5).
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorevakuierungskammer (7) des Mikroskopes während des Probenwechsels mit Trockengas belieferbar ist (F i g. 7).
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