DE2243962A1 - Enzymelektrode - Google Patents

Description

DH. UiG. F. WTJKSTHOFF ' DR. E. τ. FECHMANN DB. ING. D. BEHRENS DIPL. ING. R. GOETZ

PATENTANWÄLTE

MÜNCHEN OO SCHIVEIGEHSTH. a

1A-41 737

Mil 4701/47

F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz

Enzymelektrode

' Die Erfindung betrifft eine Enzymelektrode zur Bestimmung der Konzentration von Substanzen, die im intermediären Metabolismus auftreten, insbesondere der Glukosekonzentration.

Es sind Enzymelektroden bekannt, die in der Regel nach folgendem Prinzip aufgebaut sind: Sie bestehen aus einem elektrochemischen Sensor (z.B. Pt-Elektrode, Glaselektrode, etc.), einer semipermeablen Membran und einer dazwischenliegenden, ein Enzym enthaltenden Schicht. Die Messung geht in der Weise vor sich, dass das Substrat durch die Membran diffundiert und im Bereich der Enzymschicht eine enzymatische Reaktion eingeht. Mit dem elektrochemischen Sensor wird gleichzeitig die Konzentration eines elektrochemisch aktiven Reaktionsteilnehmers oder -Produktes gemessen. Die gemessene Konzentration steht in einer durch Eichung der Anordnung zu ermittelnden Relation mit der Substrat-Konzentration in der zu untersuchenden Lösung.

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Die bekannten Messverfahren mit Enzymelektroden können in zwei Kategorien eingeteilt werden, je nachdem ob an der Enzyinreaktion neben Substrat und Enzym ein dritter spezifischer Reaktionspartner, z.B. ein Ko-enzym, beteiligt ist oder nicht.

So wird z.B. bei der durch das Enzym Urease katalysierten Spaltung von Harnstoff zu Ammonium und C0_p kein derartiger dritter Reaktionspartner benötigt. In einer Enzymelektrode für Harnstoff werden die bei der Spaltung freiwerdenden Ammonium-Ionen direkt durch eine auf diese ansprechende Membranelektrode bestimmt.

Im Gegensatz dazu handelt es sich bei den erfind.ungsgemässen Enzymelektroden um Systeme der ersten Kategorie, insbesondere um solche, in denen durch das Enzym die Oxydation einer organischen Verbindung katalysiert wird, z.B. die Oxydation von Glucose zu Gluconsäure oder die Oxydation von Lactat zu Pyruvat. Im allgemeinen ist eine solche Oxydation mit der Reduktion eines weiteren Stoffes gekoppelt, der üblicherweise als Akzeptor bezeichnet wird. Ein derartiger gekoppelter Prozess lässt sich durch folgende Bruttoreaktionsgleichung beschreiben:

^E PA (1)

Hierbei bedeuten S und P das Substrat und das Produkt der Enzymreaktion, A und A . die oxydierte und die reduzierte Form des Akzeptors und E das Enzym.

Das Prinzip der erfindungsgemassen Enzymelektroden besteht darin, die Konzentration der reduzierten oder oxydierten Form des Akzeptors, A oder A ., elektrochemisch zu bestimmen und dadurch auf indirektem Wege ein Mass für die Konzentration des Substrats in der zu untersuchenden Lösung zu gewinnen.

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Im Fall der Glucosebestimmung mit Hilfe des Enzyms Grlueose-Qxldase sind mehrere Methoden bekannt, die auf der Verwendung von Sauerstoff- des natürlichen Akzeptors für dieses Enzym, beruhen* So wurde z.B. vorgeschlagen, mit Hilfe einer Clark-Elektrode, die in engen Kontakt mit einer Enzymschicht gebracht wurde, den Sauerstoffverbrauch während der Enzymreaktion zu ermitteln. Eine derartige Messung ist jedoch in starkem Masse abhängig von dem Sauerstoffpartialdruck in der Umgebung der Elektrode und dadurch nur bedingt geeignet in physiologischen Lösungen, in denen.der Sauerstoffpartialdruck variiert. Es wurde zwar aus diesem Grund vorgeschlagen, den durch Schwankungen des Sauerstoffpartialdruckes verursachten Fehler durch Verwendung einer zweiten Clark-Elektrode, die mit einer Schicht aus desaktiviertem Enzym in möglichst ähnlicher Weise überschichtet wurde, zu korrigieren. Jedoch ist eine solche Messmethode experimentell sehr aufwendig und deshalb zur Vervrendung für Rout inemessungen in einer Klinik ungeeignet.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, das bei der enzymatischen Oxydation der Glucose in Gegenwart von Sauerstoff entstehende HpOp an einer Platinelektrode anodisch zu oxydieren. Wegen der Zersetzung des H₂Op durch in Spuren vorhandene Katalase ist es jedoch schwierig, diese Oxydation quantitativ durchzuführen, wodurch die Messung mit einem schwer zu erfassenden Fehler behaftet wird. Ausserdem ist die Messung, sofern keine speziellen Vorkehrungen getroffen werden, in ähnlicher Weise abhängig von dem Säuerstoffpartialdruok in der. Umgebung der Elektrode wie in dem oben erwähnten Fall. Zur Konstanthaltung des Sauerstoffpartialdruckes wurde deshalb bereits vorgeschlagen, einen Teil der Enzymschicht in Kontakt mit einer hydrophoben, für Sauerstoff permeablen Membran zu bringen. An der Rückseite dieser hydrophoben Membran wird Sauerstoffgas vorbeigeleitet, daß durch die Membran in die Enzymsehicht diffundiert lind den Sauerstoff partialdruck dort auf konstant em Niveau hält. Eine solche Elektrodenkonstruktion ist jedoch ebenfalls sehr auf-

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wendig und deshalb für Routinemessungen in der Klinik ungeeignet. Aueserdem schlieast die Komplizierthait dieses System die Möglichkeit einer Miniaturisierung aus, wie sie für eine Verwendung zur in-vivo Messung (z.B. intravasal) notwendig wäre.

Um alle diese Schwierigkeiten, die mit der Verwendung von Sauerstoff als Akzeptor in Enzymelektroden zur Messung von Glukose verbunden sind, auszuschalten, wurde auch schon vorgeschlagen, andere in die Testlösung eingebrachte Akzeptoren, z.B. p-Benzochinon oder Hexacyanoferrat (III) zu verwenden. Dies bringt jedoch den Nachteil mit sich, dass die Testlösung, z.B. die entnommene Blutprobe, vor der Messung mit einer bestimmten Menge dieses Reagens vermischt werden muss, was einen zusätzlichen Arbeitsaufwand mit sich bringt. Ausserdem ist diese Methode für die in-vivo Messung prinzipiell nicht geeignet.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Enzymelektrode bereitzustellen, die von den Nachtellen der bekannten Enzymelektroden frei ist und sich besonders für die Messung von Glukose eignet.

Erfindungsgemäss wurde diese Aufgabe gelöst durch eine Enzymelektrode der eingangs erwähnten Art, die sich im wesentlichen zusammensetzt aus einem elektrochemischen Sensor, einer mit diesem in Kontakt befindlichen, ein Enzym und einen Akzeptor enthaltenden Schicht und einer diese Schicht abdeckenden semipermeablen Membran. Zweckmässigerweise ist der Akzeptor zum überwiegenden Teil in fester, ungelöster Form zwischen der Membran und dem elektrochemischen Sensor enthalten. Dadurch bleibt die Konzentration des gelösten Akzeptors in der Enzymschicht über längere Zeit auf einem für die Enzyrareaktlon ausreichend hohen Wert. Wäre kein solcher Ueberschuss des Akzeptors in ungelöster Form vorhanden, würde eine anfänglich der Enx.ymschicht zugegebene Menge von gelöster Substanz innerhalb kurzer Zeit durch Diffusion durch die Membran in die Testlönung ver-

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loren gehen und damit verursachen, dass die Enzymelektrode funktionsunfähig wird. Durch die Anwesenheit der ungelösten Form wird jedoch erreicht, dass die durch Diffusion aus der Membran verlorengehende Menge durch neu aufgelöste Substanz kompensiert wird. Unter stationären Bedingungen stellt sich innerhalb der Enzymschicht eine Akzeptorkonzentration ein, die im wesentlichen durch die Löslichkeit des Akzeptors, seine Auflösungsgeschwindigkeit, sowie die Permeabilität der Membran für den Akzeptor gegeben ist.

Als besonders vorteilhaft hat sich herausgestellt, dass die Möglichkeit besteht, diese 3 Parameter weitgehend unabhängig voneinander so zu wählen, dass optimale Bedingungen für eine/ bestimmte Enzymelektrode gewährleistet sind.

Eine andere Möglichkeit, die erforderliche Akzeptorkonzentration in der Enzymschieht über längere Zeit aufrechtzuerhalten, besteht darin, ein mit der Enzymschieht in Verbindung stehendes Reservoir vorzusehen, in dem der Akzeptor in gelöster Form enthalten ist. Vorteilhafterweise kann das Reservoir ein poröses Material, beispielsweise ein Polymer, zur Aufnahme des gelösten Akzeptors enthalten. Es ist auch möglich, den gelösten Akzeptor in eingedickter Form im Reservoir zu speichern. Optimale Bedingungen werden beispielsweise wie folgt erreicht:

Die Akzeptorlconzentration in der Enzymschicht wird in einen Bereich gelegt, der für die jeweilige Enzymreaktion am günstigsten ist. Eine zu hohe Konzentration kann eine Verhinderung der Enzymreaktion zur Folge haben, während eine zu geringe Akzeptorkonzentration eine Sättigung der Elektrodenempfindlichkeit schon bei niedrigen Substratkonzentrationen bewirkt.

Es wird, wie vorstehend beschrieben, dafür gesorgt, dass die Akzeptorkonzentration in der Enzymschieht über einen möglichst langen Zeitraum aufrechterhalten bleibt.

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Es wird ausserdem sichergestellt, dass die Diffusion des Akzeptors aus der Elektrode nur sehr langsam erfolgt. Insbesondere muss für die in-vivo Messungen die austretende Menge un-. terhalb der Toxizitätsgrenze liegen.

Als Akzeptoren kommen verschiedene an sich bekannte organische und anorganische Redoxsysteme in Frage, für die die Kopplung mit der Enzymreaktion gemäss Gleichung (l) kinetisch möglich ist. Insbesondere ist es im Falle der Olucoseelektrode •wichtig, dass die Reduktion des Akzeptors genügend schnell abläuft gegenüber der Reduktion von Sauerstoff, die als Konkurrenzreaktion stattfinden kann. Nur dann kann die Interferenz von Sauerstoff ausgeschaltet werden.

Ferner muss die reduzierte Form des Akzeptors stabil und quantitativ elektrolytisch reoxydierbar sein.

Ausserdem muss der Akzeptor die gewünschte Löslichkeit besitzen. Im Falle einer zu hohen Löslichkeit kann jedoch durch Verwendung von Bindemitteln (z.B. Polyvinylalkohol oder Polystyrol) oder durch Mikroverkapselung eine Verringerung der Auflösungsgeschwindigkeit und damit eine Erniedrigung der Akzeptorkonzentration in der Enzymschicht erreicht werden.

Solche als Akzeptoren geeignete Substanzen Bind beispielsweise bestimmte Redoxfarbstoffe, schwer lösliches Hexacyanoferrat-(III) oder Chinone, insbesondere monosubstituierte p-Benzochinone.

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Als Akzeptoren für das Substrat Glukose haben sich beispielsweise 2_f 6-Dichlorphenolindophenol-Natrium, Methylenblau und-Pyocyaninperchlorat als besonders " . geeignet herausgestellt. Für das Substrat L~Lactat ist beispielsweise Chrom-(III)-hexaantipyrin-hexacyanoferrat-(III), Phenolblau oder Thionin als Akzeptor besonders geeignet.

Die Reoxydation des reduzierten Akzeptors wird amperometriseh bestimmt. Der gemessene Strom steht in Relation zur Substratkonzentration. Diese Beziehung ist im Idealfall linear. Als elektrochemischer* Sensor eignet sich dabei eine Festkörperelektrode, beispielsweise Platin.

Die semipermeable Membran muss folgende Anforderungen erfüllen: Sie muss für das Enzym undurchlässig sein und ihre Permeabilität für das Substrat muss auf einem niedrigen Wert gehalten werden, um eine lineare Beziehung zwischen dem gemessenen Strom und der Substratkonzentration in der Testlösung zu erhalten. Durch die Verwendung einer Membran mit einer niedrigen

Permeabilität lässt sich weiterhin erreichen, dass die Eichkurve innerhalb des Bereiches geringer Substratkonzentrationen unabhängig von der Enzymkonzentration in der Enzymschicht wird. Dadurch wird eine Drift der Eichkurve als Folge einer zeitli- · chen Abnahme der Enzymaktivität innerhalb bestimmter Grenzen vermieden.

Um trotz einer vorgegebenen niedrigen Membranpermeabilität für das Substrat eine kurze Ansprechzeit der Enzymelektrode auf Aenderungen der Substratkonzentration zu erhalten, ist es notwendig, dass die Membrandicke sowie der Verteilungskoeffizient der Membran für das Substrat klein, der Diffusionskocjffizient der Membran für dao Substrat dagegen möglichst gross t, i-iie aus der Theorie der Membran folgt.

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Als Material für die semipermeable Membran eignen sich deshalb u.a. regenerierte Cellulose, Celluloseacetat (verschiedener Hydrolysegrade) oder Polyvinylalkohol. Die Membranen können je nach den speziellen Anforderungen auf verschiedene Weise vernetzt sein, Ladungen tragen oder mit anderen Verbindungen kopolymerisiert, insbesondere auch durch Beschichten eines geeigneten Trägers hergestellt sein.

Im folgenden wird anhand der beiliegenden Zeichnung eine Enzymelektrode zur GlueosebeStimmung und die mit dieser durchführbare Messung als Ausführungsbeispiel der Erfindung beschrieben.

Ein als Halter dienender zylindrischer Kunststoffblock 1 weist an einer Stirnfläche eine zylindrische Vertiefung auf, die von einem ringförmigen Vorsprung umgeben ist. In der Vertiefung ist ein Platinzylinder 2 als elektrochemischer Sensor angebracht. Vom Platinzylinder führt eine Anschlussleitung 3 durch den Kunststoffblock 1 nach aussen und dient zum Anschluss an ein übliches Strom-Messgerät. Die Oberfläche des Platinzylinders liegt ca. 0,2 mm unterhalb des Randes des Vorsprungs und weist Vertiefungen zur Aufnahme des Akzeptors, im vorliegenden Fall 2,6-Dichloroindophenol-Natrium, auf. In dem Raum zwischen der Oberfläche des Platinzylinders und. der Membran befindet sich das Enzym Glucoseoxidase in Puffer gelöst oder an einem Trägermaterial fixiert. Eine Membran 4 aus regenerierter Cellulose wird durch einen Haltering 5 gegen den Rand des Vorsprungs und einen ausserhalb des Vorsprungs angeordneten Gummi-0-Ring 7 gedruckt und das Ganze durch Metallstifte 6 und eine aufßchraubbare Kappe 8 festgehalten.

Zur Messung wird diese Elektrode in die thermostatierte ■ Lösung (z.B. Vollblut, Serum, Plasma, Urin usw.) getaucht. Der Platinzylinder in der Enzymelektrode ist über eine Spannungs-

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_ Q —

quelle (Polarisationsspannung 300 bis 400 mV) und ein Strommessgerät mit einer Referenzelektrode {z.B. eine Silberchlorid-Elektrode) verbunden·. Nach einer Ansprechzeit von 5 bis I5 Mi-. nuten je nach Membran, erhält man 95 f° des Endausschlages eines der Glucosekonzentration proportionalen Stromes, wobei bis zu Glueosekonzentrationen von ca. 6OO mg/100 ml Proportionalität herrscht (normaler Blutzuckergehalt 90 mg/100 ml).

Die zeitliche Stabilität dieser Elektrode beträgt für eine Glucosekonzentration von 500 mg/100 ml mehr als 60 Stunden. Eine Miniaturisierung dieser Elektrode für in-vivo Messungen 1st technisch leicht durchführbar. In diesem Fall ist zusätzlich ein Thermistor zur Temperaturmessung eingebaut, um den Einfluss von Temperaturechwankungen auf den Messwert kompensieren zu können. Selbstverständlich können mit einer entsprechenden Enzymelektrode auch andere Substrate, wie z.B. L-Laetat, bestimmt werden. Für eine L-Lactat-Bestimmung wurde z.B. als Enzym L-Lactatdehydrogenase (Cytochrora b₂) und als Akzeptor Chrom-(III)-hexaantipyrin-hexacyanoferrat-(III) verwendet. Man erhält nach einer Ansprechzeit von 1 bis 3 Minuten (je nach Membran) 95 $ des Endausschlages eines der L-Lactatkonzentration

proportionalen Stromes, wobei bis zu L-Lactatkonzentrationen von 180 mg/100 ml Proportionalität herrscht (normaler L-Lactatgehalt im Blut: 7 mg/100 ml). Die zeitliche Stabilität dieser Elektrode beträgt für eine L-Lactatkonzentration von 130 mg/ 100 ml mindestens 8 Stunden.

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Claims (12)

1. Pat entans prüche

   'Enzymelektrode zur Bestimmung der Konzentration von · Substanzen, die im intermediären Metabolismus auftreten, gekennzeichnet durch einen elektrochemischen Sensor,,eine mit diesem in Kontakt befindliche, ein Enzym und einen Akzeptor enthaltende Schicht und eine diese Schicht abdeckende semipermeable Membran,
2. 2. Enzymelektrode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Schicht mit einem den Akzeptor enthaltenden Reservoir in Verbindung steht,
3. 3. Enzymelektrode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Akzeptor teilweise in ungelöster Form vorliegt.
4. 4. Enzymelektrode nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Akzeptor in gelöster Form im Reservoir enthalten ist.
5. 5. Enzymelektrode nach einem der Ansprüche 1, 2 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Akzeptor in einem porösen Material enthalten ist,
6. 6. Enzymelektrode nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Akzeptor ein Redo.:farbstoff, ein schwer lösliches Hoxacyanoferrat-(III) oder ein monosubstituiertes p-Benzochinon ist.
7. 7. Enzymelektrode nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Akzeptor für das Substrat Glukose, 2,6-Dichlorphenolindophenol-Natrium, Methylenblau, Pyooyaninparohlorat oder p-Toluchinon iet.

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8. 8. Enzymelektrode nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Akzeptor für das Substrat L-lactat Chrom-CEII)~hexaantipyrin~hexacyanoferrat~(III)_f Phenolblau oder Thionin ist,
9. 9« EnzymeIektrOde nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des elektrochemischen Sensors Vertiefungen aufweist, in denen derungelöste Akzeptor enthalten ist.
10. 10. Enzymelektrode nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran aus regenerierter Cellulose, Cellulosetriacetat oder Polyvinylalkohol besteht .
11. 11. Enzymelektrode nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran aus einem Träger und einer semipermeablen Beschichtung besteht,
12. 12. Enzymelektrode nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran mit anderen Verbindungen vernetzt ist oder Ladungen trägt.

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