DE2243962B2 - Enzymelektrode - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Enzymelektrode zur Bestimmung der Konzentration von Substanzen, die im intermediären Metabolismus auftreten, mit einem elektrochemischen Sensor, der zusammen mit einer semipermeablen Membran einen Bereich begrenzt, in dem Enzym und ein Akzeptor enthalten sind.

Die Messung von im intermediären Metabolismus enthaltenen Substanzen geht im allgemeinen so vor sich, daß eine Enzymelektrode in eine Lösung getaucht wird, aus der zu messendes Substrat durch die Membran diffundiert, die die Enzymelektrode zur Lösung hin abschließt und im Bereich einer Enzymschicht zwischen der Membran und einem elektrochemischen Sensor eine enzymatische Reaktion eingeht Mit dem elektrochemischen Sensor wird die Konzentration eines elektrochemisch aktiven Reaktior.steilnehmers oder -produkts gemessen. Die gemessene Konzentration steht in einer durch Eichung der Anordnung zu ermittelnden Beziehung mit der Substanz-Konzentration in der zu untersuchenden Lösung.

Die Erfindung beschäftigt sich mit Enzymreaktionen, bei denen rieben der Substanz und dem Enzym ein dritter, spezifischer Reaktionspartner beteiligt ist, insbesondere mit solchen Reaktionen, in denen durch das Enzym die Oxydation einer organischen Verbindung katalisiert wird, z. B. die Oxydation von Glukose zu fts Glukonsäure oder die Oxydation von Lactat zu Pyruvat. Im allgemeinen ist eine solche Oxydation mit der Reduktion eines weiteren Stoffes gekoppelt, der P +A_n

■ed

Hierbei bedeutet

S die Substanz,

P das Produkt der Enzymreaktion,

Ami die oxydierte und die reduzierte Form des

Akzeptors und
E das Enzym.

Mit der Enzymelektrode wird nun die Konzentration der reduzierten und oxydierten Form des Akzeptors, Ao, oder A_nA elektrochemisch bestimmt und dadurch auf indirektem Weg ein Maß für die Konzentration der Substanz in der zu untersuchenden Lösung gewonnen.

Bei der Glukosebestimmung mit Hilfe des Enzyms Glukose-Oxidase ist beispielsweise aus der US-PS 35 91 480 die Verwendung von Sauerstoff als Akzeptor bekannt Dabei wird gemäß dieser PS zur Vermeidung der durch Schwankungen der Sauerstoffkonzentration bedingten Störungen nicht die Sauerstoffkonzentration selbst sondern die Konzentration des Reaktionsproduktes Wasserstoffperoxyd gemessen, und zwar indirekt über die parallel ablaufende Reduktion der bei der Reduktion des Wasserstoffperoxyds oxydierten jodionen. Der Akzeptor, Sauerstoff, ist in der Lösung außerhalb der Enzymelektrode enthalten. Da die semipermeable Membran für Glukosemoleküle durchlässig sein soll, ist sie auch für das an der Messung beteiligte Jod durchlässig, so daß dieses in relativ kurzer Zeit aus der Enzymschicht herausdiffundieren wird und sich an das Blut anlagen. Dies ist bei ln-vivo-Messungen aus physiologischen Gründen unerwünscht und kann zu einer Verfälschung der Meßwerte führen. Allgemein sind mit Sauerstoff als Akzeptor arbeitende Enzymelektroden experimentell aufwendig zu handhaben und weisen eine relativ kurze Einsatzdauer auf.

Aus der Zeitschrift »Analytical Chemistry«, Vo. 42, Nr. 1, Jan. 1970, ist eine Enzymelektrode der eingangs beschriebenen Gattung bekanntgeworden. Bei dieser Elektrode werden andere, in die zu messende Lösung eingebrachte Akzeptoren verwendet, z. B. Benzochinon oder Hexacyanoferrat Als Membran wird eine CeIIophan-Membran verwendet, als elektrochemischer Sensor eine Platinelektrode. Die bekannte Enzymelektrode erfordert daß die Testlösung, z. B. eine entnommene Blutprobe, vor der Messung mit einer bestimmten Menge Akzeptor vermischt wird. Dies erfordert einen zusätzlichen Arbeitsaufwand und bedingt, daß sich diese Elektrode für ln-vivo-Messungen prinzipiell nicht eignet.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Enzymelektrode zu schaffen, die auch für In-vivo-Messungen geeignet ist.

Diese Aufgabe wird mit einer Enzymelektrode der eingangs beschriebene Gattung erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der Akzeptor in dem Bereich zwischen semipermeabler Membran und elektrochemischem Sensor teilweise in ungelöster Form vorliegt.

Damit wird erreicht, daß die Konzentration deü gelösten Akzeptors in dem Bereich, in dem auch Enzym vorhanden ist, über längere Zeit auf einem für die Enzymreaktion ausreichend hohen Wert bleibt. Wan:

kiin solcher Überschuß des Akzeptors in ungelöster Form vorhanden, würde eine anfänglich in der Enzymelektrode vorhandene Menge gelösten Akzeptors innerhalb kurzer Zeit durch Diffusion durch die Membran in die Testlösung verlorengehen, so daß die Enzymelektrode funktionsunfähig würde. Bei der erfindungsgemäßen Enzymelektrode aber geht Akzeptor aus der ungelösten Form ständig in Lösung, so Gaß die durch DiRasion aus der Membran verlorengehende Menge durch neu aufgelösten Akzeptor kompensiert wird. Stationär stellt sich in der Enzymelektrode eine Akzeptorkonzentration ein, die im wesentlichen durch die Löslichkeit des Akzeptors, seine Auflösungsgeschwindigkeit sowie die Permeabilität der Membran für den Akzeptor gegeben ist ,

Als besonders vorteilhaft hat sich herausgestellt, die drei letztgenannten Parameter derart zu -zählen, daß optimale Bedingungen für eine bestimmte Enzymelektrode gewährleistet sind.

Die Akzeptorkonzentration im Bereich des Enzyms wird entsprechend der jeweiligen Enzymreaktion gewählt. Eine zu hohe Konzentration kann eine Hemmung der Enzymreaktion zur Folge haben, eine zu geringe Akzeptorkonzentration kann eine Sättigung der Elektrodenempfindlichkeit schon bei niederen Substratkonzentrationen bewirken. Durch geeignete Wahl der Bedingungen wird dafür gesorgt, daß die Akzeptorkonzentration im Bereich des Enzyms über einen möglichst langen Zeitraum konstant bleibt und nur wenig Akzeptor aus der Elektrode in die Testlösung diffundiert. Dies ist insbesondere für Invivo-Messungen wichtig, bei dener. die austretende Akzeptormenge unterhalb der Toxizitätsgrenze liegen muß.

Als Akzeptoren kommen vor allem ein Redoxfarbstoff, ein schwerlösliches Hexacyanoferrat(lll) oder ein monosubstituiertes p-Benzochinon in Frage.

Insbesondere ist es im Falle der Glukose-Elektrode wichtig, daß die Reduktion des Akzeptors genügend schnell abläuft gegenüber der Reduktion von Sauerstoff, die als Konkurrenzreaktion stattfinden kann. Nur dann kann eine durch Sauerstoff bedingte Störung ausgeschaltet werden. Die reduzierte Form des Akzeptors muß weiter stabil und quantitativ elektrolytisch reoxydierbar sein. Der Akzeptor muß weiter die gewünschte Löslichkeit besitzen. Im Falle einer zu hohen Löslichkeit kann jedoch durch Verwendung von Bindemitteln (z. B. Polyvinylalkohol oder Polystyrol) oder durch Mikroverkapselung eine Verringerung der Auflösungsgeschwindigkeit und damit eine Erniedrigung der Akzeptorkonzentration in der Enzymschicht erreicht werden.

Solche als Akzeptoren geeignete Substanzen sind beispielsweise für die Messung von Glukose, 2,6-Dichlorphenolindophenol-Natrium, Methylenblau, Pyocyaninperchlorat oder p-Toluchinon.

Bei der Messung von L-Lactat haben sich Chrom(lII)-hexaantipyrin-hexacyanoferrat(IH), Phenolblau oder Thionin bewährt.

Die Reoxydation des reduzierten Akzeptors wird amperometrisch bestimmt. Im Idealfall besteht eine lineare Beziehung zwischen Strom und Konzentration.

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Enzymelektrode weist die Oberflache des elektrochemischen Sensors Vertiefungen auf, in denen der ungelöste Akzeptor enthalten ist. Als elektrochemischer Sensor fts wird beispielsweise eine Festkörperelektrode aus Platin verwendet.

nip <pittinermeable Membran muß folgende Anforde rungen erfüllen: Sie muß für das Enzym undurchlässig sein und für die zu messende Substanz nur in geringem Maß durchlässig sein, damit eine lineare Beziehung zwischen dem gemessenen Strom und der Substanzkonzentration in der Testlösung erhalten wird. Durch die Verwendung einer Membran mit niedriger Permeabilität läßt sich weiterhin erreichen, daß die Eichkurve bei geringer Substanzkonzentration unabhängig von der Enzymkonzentration innerhalb der Elektrode ist. Dadurch wird eine Drift der Eichkurve als Folge einer zeitlichen Abnahme der Enzymaktivität innerhalb bestimmter Grenzen vermieden.

Um trotz einer vorgegebenen niedrigen Membranpenneabilität für die Substanz eine kurze Ansprechzeit der Enzymelektrode auf Änderungen der Substanzkon zentration zu erhalten, ist erforderlich, daß die Membrandicke und der Verteilungskoeffizient der Membran für die Substanz klein sind, der Diffusionskoeffizient der Membran für die Substanz dagegen möglichst groß ist, wie sich aus theoretischen Überlegungen ergibt.

Gute Erfahrungen wurden mit Membranen aus regenerierter Cellulose, Cellulosetriacetat (verschiedener Hydrolysegrade) oder Polyvinylalkohol gemacht.

Weiter können die Membranen je nach den speziellen Anforderungen aus einem Träger und einer semipermeablen Beschichtung bestehen.

Im folgenden wird anhand der Zeichnung eine Enzymelektrodc zur Glucosebestimmung und die mit dieser durchführbare Messung als Ausführungsbeispiel der Erfindung beschrieben.

Ein als Halter dienender 2y!indrischer Kunststoff-Dlock 1 weist an einer Stirnfläche eine zylindrische Vertiefung auf, die von einem ringförmigen Vorsprung umgeben ist. In der Vertiefung ist ein Platinzylinder 2 als elektrochemischer Sensor angebracht. Vom Platinzylinder führt eine Anschlußleitung 3 durch den Kunststoffblock 1 nach außen und dient zum Anschluß an ein übliches Strom-Meßgerät. Die Oberfläche des Platinzylinders liegt ca. 0,2 mm unterhalb des Randes des Vorsprungs und weist Vertiefungen zur Aufnahme des Akzeptors, im vorliegenden Fall 2,6-Dichloroindophenol-Natrium, auf. In dem Raum zwischen der Oberfläche des Platinzylinders und der Membran befindet sich das Enzym Glucoseoxidase in Puffer gelöst oder an einem Trägermaterial fixiert. Eine Membran 4 aus regenerierter Cellulose wird durch einen Haltering 5 gegen den Rand des Vorsprungs und einen außerhalb des Vorsprungs angeordneten Gummi-O-Ritig 7 gedrückt und das ganze durch Metallstifte 6 und eine aufschraubbare Kappe 8 festgehalten.

Zur Messung wird diese Elektrode in die thermostatierte Lösung (z. B. Vollblut, Serum, Plasma, Urin usw.) getauscht. Der Platinzylinder in der Enzymelektrode ist über eine Spannungsquelle (Polarisationsspannung 300 bis 400 mV) und ein S'rommeßgerät mit einer Referenzelektrode (z. B. eine Silberchlorid-Elektrode) verbunden. Nach einer Ansprechzeit von 5 bis 15 Minuten je nach Membran, erhält man 95% des L.idausschlages eines der Glucosekonzentration proportionalen Stromes, wobei bis zu Glucosekonzentrationen von ca. 600 mg/100 ml Proportionalität herrscht (normaler Blutzuckergehalt 90 mg/100 ml).

Die zeitliche Stabilität dieser Elektrode beträgt für eine Glucosekonzentration von 500 mg/100 ml mehr als 60 Stunden. Eine Miniaturisierung dieser Elektroden für In-vivo-Messungen ist technisch leicht durchführbar. In diesem Fall ist zusätzlich ein Thermistor zur Tempera-

turmessung eingebaut, um den Einfluß von Temperaturschwankungen auf den Meßwert kompensieren zu können. Selbstverständlich können mit einer entsprechenden Enzymelektrode auch andere Substrate, wie z. B. L-Lactat, bestimmt werden. Für eine L-Lactat-Bestimmung wurde z. B. als Enzym L-Lactatdehydrogenase (Cytochrom b2) und ais Akzeptor Chrom(III)-hexaantipyrin-hexacyanoferrat(III) verwendet. Man erhält nach einer Ansprechzeit von 1 bis 3 Minuten (je nacl Membran) 95% des Endausschlages eines der L-Lactat konzentration proportionalen Stromes, wobei bis zi L-Lactatkonzentrationen von 180 mg/100 ml Propor tionalität herrscht (normalei L-Lactatgehalt im Blut 7 mg/100 ml). Die zeitliche Stabilität dieser Elektrodi beträgt für eine L-Lactatkonzentration von 130 mg 100 ml mindestens 8 Stunden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

'f Patentansprüche:

1. Enzyraelektrode zur Bestimmung der Konzentration von Substanzen, die im intermediären s Metabolismus auftreten, mit einem elektrochemischen Sensor, der zusammen mit einer semipermeablen Membran einen Bereich begrenzt, in dem Enzym und ein Akzeptor enthalten sind, dadurch gekennzeichnet, daß' der Akzeptor in dem Bereich zwischen der semipermeabler! Membran (4) und dem elektrochemischen Sensor (2) teilweise in ungelöster Form vorliegt

2. Enzymelektrode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Akzeptor ein Red^xfarbstoff, ein schwer lösliches Hexacyanofeirat(lU) oder ein monosubstituiertes p-Benzochinon ist

3. Enzymelektrode nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß der Akzeptor für die Substanz Glukose, 2,6-Dichlor-phenolindophenol-Natrium, Methylenblau, Pyocyaninperchlorat oder p-Toluchinon ist

4. Enzymelektrode nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß der Akzeptor für die Substanz L-Lactat Chrom(lll)-hexaantipyrin-hexacyanoferrat(lll), Phenolblau oderThionin ist

5. Enzymelektrode nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet daß die Oberfläche des elektrochemischen Sensors (2) Vertiefungen aufweist, in denen der ungelöste Akzeptor enthalten ist

6. Enzymelektrode nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran (4) aus einem Träger und einer semipermeablen Beschichtung besteht.

üblicherweise als Akzeptor bezeichnet wird Ein derartiger gekoppelter Prozeß läßt sich durch folgende Bruttoreaktionsgleichung beschreiben: