DE2248475A1

DE2248475A1 - Verfahren zur gewinnung von hepatitissicheren, lagerungsstabilen und infundierbaren haemoglobinloesungen

Info

Publication number: DE2248475A1
Application number: DE19722248475
Authority: DE
Original assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Current assignee: Biotest AG
Priority date: 1972-10-03
Filing date: 1972-10-03
Publication date: 1974-04-25
Also published as: JPS5012223A; DE2248475C3; FR2201102A1; DE2248475B2; JPS6025411B2; US3864478A; FR2201102B1; GB1430217A

Description

Biotest-Serum-Institut GmbH, 6 Frankfurt/M,-Niederrad,
Fluqhafenstr. 4

l/erfahren zur Gewinnung von hepatitissicheren, lagerungsstabilen und infundierbaren Hämoglobinlösungen,,

Die Erfindung betrifft ein l/erfahren zur Gewinnung von hepatitssicheren, lagerungsstabilen und infundierbaren Hämoglobinlösungen mit einem stabilisierten 2,3-Di-phosphoglyceratspiegel durch Hämolyse von menschlichen Erythrozyten, quantitative Abtrennung des Stromalipids, Senkung des Kaliumgehaltes und Sterilfiltration der Lösung.

Die im Handel befindlichen, sogenannten "Blutersatzstoffe"
weisen gegenüber Blutkonserven folgende Vorteile auf:
1.) Ihre Anwendung erfordert keine Blutgruppen-Diagnostik,
2.) sie sind länger haltbar,
3.) sie sind hepatitissicher.

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Ihr Hauptnachteil ist, daß sie viele Spezialfunktionen des Blutes nicht ersetzen können, so zum Beispiel nicht den Sauerstofftransport der roten Blutkörperchen. Speziell dafür befinden sich als Alternative zum Blut isotonische Lösungen von menschlichem Hämoglobin seit einigen Dahren in der vorklinischen Prüfung. Da offenbar der entscheidende Faktor für die Entstehung eines Schocks die mangelnde Sauerstoffversorgung ist, erscheint ein^ solches Präparat vor allem für die Schock-Therapie erstrebenswert.

Man hat bereits versucht, als Sauerstoffträger wässrige Emulsionen von Fluorkohlenstoffverbindungen, insbesondere zur Perfusion von isolierten Organen einzusetzen. Oa es jedoch für diese Substfilzgruppen keinen natürlichen Eliminierungsueg gibt, steht eine intravenöse Infusion in den Körper jetzt noch vor einem entscheidenden Hindernis, zumal" solche physiologisch nicht abbaufähigen Fremdstoffe zwangsläufig im Geuebe gespeichert uerden.

Freies Hämoglobin ist demgegenüber harnfähig, beziehungsweise uird zum Teil resorbiert und dem natürlichen Stoffwechsel unterworfen. Bei den bekannten Hämoglobinpräparaten ist die Frage nach der Hepatitissicherheit noch nicht angesprochen worden. Für die klinische Anwendung kommt ihr jedoch eine erhebliche Bedeutung zu, da bei Spenderblut als Ausgangsmaterial eine Infektiosität nicht ausgeschlossen werden kann.

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Es sind bereits l/erfahren beschrieben, wie man aus menschlichen Erythrozyten unter Verminderung des Kaliumgehaltes und Entfernung des bei der Hämolyse ebenfalls anfallenden Strotnalipids der Blutplasma-Physiologie angepasste Mämoglobinlösungen herstellen kann. Bei Erprobung dieser bekannten Hämoglobirilösungen haben sich jedoch Nachteile herausgestellt, die bisher eine klinische Anwendung verhinderten, ueil insbesondere Nierenstörungen beobachtet wurden. Andere bekannte Hämoglobinlösungen sind zwar nierenverträglich, zu ihrer Herstellung wird jedoch unter anderem ein Dialysewerfahren angewendet, wodurch der für die physiologisch wichtige Sauerstoffaffinität verantwortliche Phosphatester, das 2,3-Diphospho-glycerat, quantitativ entfernt wird.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von hepatitissicheren, lagerungsstabilen und infundierbaren HämoglDbinlösungen mit einem stabilisierten 2,3*-Oiphospho*- glyceratspiegel durch Hämdlyse von menschlichen Erythrozyten, quantitative Abtrennung des Stromalipids, Senkung des Kaliumgehaltes und Sterilfiltration der Lösung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Erythrozyten enthaltende Ausgangsmaterial bei Temperaturen zwischen 5 und 15 C wenige Minuten mit verdünnten Lösungen von Ö-Propiolacton behandelt, wobei der Anteil an ß«-Propiöläcton 4 bis 12 g je Liter Erythrozytensediment beträgt, anschließend mit einer schwach alkalischen Lösung überschüssiges Ö-Propiö*·

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lacton und dessen Reaktionsprodukte herausuäscht, das erhaltene Hämolysat dann mit einem Kationenaustauscherharz in H -Form behandelt, bis der pH-Uert auf 5,0 bis 5,5 abgesunken ist, vom Harz und der ausgefällten Stromamasse durch Zentrifugieren befreit, die gewünschte Hämoglobinkonzentration durch Verdünnen mit Uasser einstellt, übliche Mittel zur Regelung der Isotonie und zur Stabilisierung von pH-Uert und Ferrohäm zugibt und schließlich sterilfiltriert.

Durch diese Kombination von kritischen Verfahrensschritten wird ein Produkt erhalten, bei dessen Anwendung die Gefahr einer Hepatitis ausgeschaltet ist. Die Behandlung mit der Lösung des ß-Propiolactons uird vorzugsweise nicht länger als 25 Minuten durchgeführt. Durch 4maliges Waschen auf der Zentrifuge wird dann der Gehalt an noch nicht abreagiertem ß"*ßropiolacton im Erythrozytenüberstand auf 20 bis 10 mq% herabgesetzt, uobei vorzugsweise Uaschlösungen verwendet werden, die Kochsalz oder Natriumbicarbonat enthalten» Andere geeignete Waschmittel sind Lösungen von tert. Natriumcitrat, tert. Natriumphosphat und Natriumcarbonat. Bei der anschließenden Hämolyse uird auf 1/50 ueiterverdünnt. Erst in einer solchen Konzentration kommt das ß*ßropiolacton in direkte Berührung mit dem Hämoglobin und den anderen Komponenten des Zellinneren. Es kann vollständig dann abreagieren.

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Als bevorzugtes Verdünnungsmittel uird destilliertes Wasser i/eruendet, Man kann aber auch physiologisch geeignete Elektro— lytlösungen zusetzen, z.B. Kochsalz-, Glukose-oder Bicarbonatlösungen.

Es uurde überraschenderweise gefunden, daß bei einem derart durchgeführten Verfahren vor allem das für die Hydrolyse des 2,3-Diphospho-glycerats verantwortliche Enzymsystem deutlich gehemmt wird. Arbeitet man bei dem Verfahren gemäß der Erfindung ohne die Stufe der ß-Propiolactonbehandlung, dann weist das Verfahrensprodukt nach l/4jähriger Lagerung etwa das Doppelte an freiem Phosphat auf wie das erfindungsgamäße Produkt. Uie direkte Messungen ergaben, uird durch die erfindungsgemäße Behandlung mit ß-Propiolacton der 2,3-Diphospho-glyceratgehalt in Hämoglobinlösungen auf einem Wert von etwa 0,4 mmol je 0,8 mmol Hämoglobin über einen Zeitraum von mehr-als einem Vierteljahr stabilisiert. Ohne diese Stabilisierung schwankt der entsprechende 2,3-Diphospho-glyceratwert von Charge zu Charge zwischen 0 und 0,25 mmol.

Für die erfindungsgemäße Uaschbehandlung besonders geeignete Lösuggen sind 3,8$ige Natriumbicarbonatlosungen oder l,6j£ige Kochsalzlösungen. Uie bereits erwähnt, wird als Verdünnungsmittel vorzugsweise destilliertes Wasser verwendet, wobei insbesondere das Erythrozytenvolumen auf das 4,5fache verdünnt uird· Besonders geeignete Kationenaustauscherharze sind saure PoIystyrol-Sulfonat-Kationenaustauscher, insbesondere die im Handel von der Firma Dow Chemical Comp., Midland, Michigan, unter der

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der Bezeichnung Douex 50 UX vertriebenen Harze, die eine Austauscherkapazität von 4-5 mval je g trockenes Harz haben. Andere geeignete Austauscher sind z.B. Amberlite IR-120 der Firma Rohm und Haas Comp., Philadelphia, Zeo-Karb 225 der Permutit Comp. Ltd., London und Levatit S 100 der Farbenfabriken Bayer, Leverkusen.

Die Verringerung des Kaliumgehaltes erfolgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise durch den Kationenaustausch K gegen H und die anschließende Zentrifugenbehandlung bei Zusatz von destilliertem Wasser. Vorteilhaft sollen dann etua 6,3 g Hämoglobin je 100 ml vorliegen. 0er stabilisierte pH-Uert beträgt bei Verfahrensende vorteilhaft 7,4. Ein bevorzugtes Flittel zur Regelung der Isotonie ist Glukose, alle für diesen Zueck sonst bekannten Mittel sind aber ebenfalls geeignet.

Beim Einfrieren der erfindungsgemäß erhaltenen Hämoglobinlösung und teilueisem Uiederauftauen läßt sich ein an Hämoglobin konzentrierteres Produkt abziehen, das durch Wiederholung dieses Verfahrens auf 15% Hämoglobin gebracht werden kann ( das entspricht dem Gesamthämoglobingehalt von Blut). Die relative Viskosität einer solchen Lösung von etua 1,8 bei 37°C liegt noch im Normalbereich von Plasma. Bei Veruendung von sterilen Flaschen und Blutübertragungsgeräten kann man auf diese schonende Ueise in einem geschlossenen System eine Variante mit verstärkter Uirkstoffkonzentration

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gewinnen. Die Endeinstellung dar Isotonie uird vorteilhaft erst nach der Ankonzentrierung durchgeführt, damit das erhaltene hyperqkotische Konzentrat nicht auch hypertonisch ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren uird durch die nachstehenden Beispiele erläutert. Die nach diesen Beispielen erhaltenen Produkte wurden an Mäusen, Ratten, Kaninchen, Hunden, Schweinen und Menschen bereits erprobt und v/erträglich sowie transportwirksam befunden.

Beispiel 1

Erythrozytensedimente von 6 Blutspendern zu je 500 ml Blut wurden vom Plasma getrennt, vereint, mit l,6j£iger Kochsalzlösung auf ein Volumen von 2 Litern verdünnt und bei 10⁰C mit 6 g frisch destilliertem ß-Prapiolacton 15 Minuten bei 10 bis 12⁰C verrührt. Es wurde 20 Minuten einer Kühlzentrifugation unterworfen, der Überstand abgesaugt und die Erythrozytendedimente 4 mal hintereinander mit frischer, l,6%iger Kochsalzlösung in Anteilen von jeweils etwa 1,1 Liter auf der Zentrifuge geuasbben und anschließend in 5,2 Liter steriles, entmineralisiertes und destilliertes Uasssr eingetragen. Nach 5 Minuten Rühren wurden 500 ml hochreiner (pA-Qualität) Kationenaustauscher Dowex 50 in H -Form zugegeben und der pH-Uert durch Zugabe von normaler Natronlauge bei 5,0 gestoppt, bis Stromalipid sichtbar sedimentierte. Danach wurde auf einen

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pH-Uert von 5,5 abgestumpft und nach 10 Minuten bei 2000 g zentrifugiert·

Von etua 1 Liter abgesetztem Sediment ( Stroma und Austauscherharz ) wurde etua 5 Liter 6-7$£iger Hämoglobinlösung abdekantiert. Nach Zugabe von 40 g Glukose uurde mit Natronlauge ein pH-Uert von 7,4 eingestellt, die Losung nochmals in der vorstehend beschriebenen Ueise zentrifugiert und durch ein Cellulose-Asbest-Filter (EKS I der Firma Seitz-Uerke, Bad Kreuznach) sterilfiltriert, nan kann auch mit gutem Erfolg Filter folgender Typen veruendent Filtroxsteril-Filter der Filtrox-Uerke AG, St. Gallen, Filterkerzen der Firma Pail, Typ "Ultipore" - beides sind Cellulose-Asbestfilter - oder Cellulose-Acetat-flembranfilter ule Flillipore Typ G.SUP der Will.Corp.Bedford,Hass., Sartorius Typ SH1107 der Sartorius-Uerke Göttingen u.Ä.Di e Sauerstoff-Bindungskurve eines nach diesem Beispiel hergestellten Produktes zeigte nach 2-monatiger Lagerung bei 10°C einen P 50-Uert von 19 Torr bei einem pH-Uert von 7,4. Umgerechnet auf einen intraerythrozytirtn pH-Uert von 7,2 entspräche der P 50-Uert des Hämoglobins des genannten Präparates 23 Torr. 0er ρ 50-Uert von frischen Erythrozyten liegt um 27 Torr.

Beispiel 2 Es uurde uie in Beispiel 1 gearbeitet, jedoch wurden

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zu 2 Litern Erythrozytensuspension 16 g 8-Propiolacton gegeben. Nach dem Abzentrifugieren und Absaugen des Uberstandes uurde das Erythrozyten-Sediment mit etua 1,1 Liter jeder der folgenden Lösungen geuaschens 1.) Natriumbicarbonatlösung mit einem Gehalt won 38g je Liter, 2.) uie 1. und 3.) mit einer Lösung, die 38 g Natriumbicarbonat und 16 g NaCl je Liter enthielt und im Verhältnis 1:1 gemischt war, 4·) mit einer Kochsalzlösung mit einem Gehalt von 16 g NaCl je Liter« Es uurde dann uie im Beispiel 1 ueitergearbsitet bis nach der Stromaabtrennung. Vor der Sterilfiltration uurde noch der pH-Uert mit n-NaOH auf 7,0 eingestellt, 33 g je Liter Glukose zugegeben, dann 2,5 g js Liter Natriumbicarbonat zugesetzt und mit n-NaQH der pN~ Erriuert auf 7,4 eingestellt.

Beispiel 3

Es uurde uie in den Beispielen 1 oder 2 bis nach der Stromaabtrennung gearbeitet· Danach uurderf auf einen blutanalogen Hämoglobingehalt von 15 g/lOÖ ml durch das nachstehend beschriebene Verfahren ankonzentrierts Die Hämoglobinlösung uurde in Anteilen von je 500 '11 in liegenden 1000 ml-Flaschen eingefroren und anschließend bei Raumtemperatur in den auf den Kopf gestellten Flaschen so aufgetaut, daß durch Perforation des Stopfenverschlusses mit einem sterilen

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Blutentnahmegerät laufend die tiefrote Schmelze von der verbliebenen weißen Eisstange abgelassen werden konnte· Eine Wiederholung des Verfahrens ergab eine etwa 150g/ Liter Hämoglobin enthaltende Lösung, die dann gemäß Beispiel 1 zu einem infundierbaren Produkt aufgearbeitet wurde.

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Claims

P atentansprüche ι

1«) Verfahren zur Gewinnung von hepatitisslcheren_f lagerungs-" stabilen und infundierbaren Hämoglobinlösungen mit einen stabilisierten 2,3-Diphospo-glyceratspiegel durch Hämolyse von menschlichen Erythrozyten, quantitative Abtrennung des Stromalipids, Senkung des Kaliumgehaltes und Sterilfiltratioo der Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß man das Erythrozyten enthaltende Ausgangsmaterial bei Temperaturen zuiaohen 5 und 15 C uenige Minuten mit verdünnten Lösungen von behandelt, uobei der Anteil an ß-Propiolacton 4 bis 12 g je Liter Erythrozytensediment beträgt, anschließend mit einer schuach alkalischen Lösung überschüssiges ß-Propiolacton und dessen Reaktionsprodukte herausuäscht, das erhaltene Hänolysat dann mit einem Kationenaustauscherharz in H -»Fora behandelt, bis der pH-Uert auf 5,0 bis 5,5 abgesunken, ist, vom Harz und der ausgefällten Stromaraasse durch .Zentrifugieren befreit, die gewünschte Hämoglobinkonzentration durch Verdünnen mit Uasser einstellt, übliche Mittel zur Regelung der Isotonie und zur Stabilisierung von pH-Uert und Ferrohän zugibt und dann sterilfiltriert.
2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß man 6 bis 16 g ß-Propiolacton in Lösirgsn von 1,2

bis 3,2 g/100 ml auf 1,5 Liter Erythrozyten-Sediment anwendet·

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3.) Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bis zu 25 Minuten mit dem ß-Propiolacton behandelt.
4.) V/erfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die ß-Propiolactonbehandlung bei 10 bis 12⁰C durchführt.
5.) !/erfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Entfernung von überschüssigem ß-Propiolacton 4mal wäscht.
6.) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Waschen nach der Behandlung mit ß-Propiolacton Lösungen von Natriumbicarbonat und Kochsalz verwendet, insbesondere 3,8j6ige Natriumbicarbonatlösungen und/oder 1,6/fcige Kochsalzlösungen.
7.) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kationenaustauscherharze Polystryol Sulfonat-Harze in H-Forra veruendet.
8.) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Isotonie mit Glukose, Natriumacetat oder Natriumbiearbonat einstellt.

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9.) \/erfahren nach Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Uert des Endproduktes mit Natronlauge einstellt.
10.) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Einstellung einer höheren Hämoglobinkonzentration die nach der Stromaabtrennung vorliegende Lösung stangenförmig einfriert und in aufrechter Stellung dann auftaut, die aus dem Eisblock ablaufende hämoglobinreiche Schmelze abtrennt und gegebenenfalls dieses Uerfahren wiederholt.
11.) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung durch Cellulose-Asbest-Filter oder durch Scheiben aus Celluloseacetat sterilfiltriert.

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