DE2252364A1

DE2252364A1 - Verfahren zur herstellung von zeaxanthin

Info

Publication number: DE2252364A1
Application number: DE2252364A
Authority: DE
Inventors: Jaroslav Dasek; David Shepherd; Knut Rude Traelnes
Original assignee: Nestle SA
Current assignee: Nestle SA
Priority date: 1971-10-27
Filing date: 1972-10-25
Publication date: 1973-05-10
Also published as: IT969896B; CA980276A; FR2158296A1; PL78558B1; FR2158296B1; JPS4849989A; US3841967A; GB1385274A; BE790289A; DK133828B; DK133828C

Description

22523S4

r«u«|al»«l! ,.I₁U 4074'

München

49

Te*. £93183

Societe dea Frodui'te Hsstle S.A.

in Vevey, Schweiz

Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin

Die Erfißdu»g bezieht aich auf die Herstellung von gefärbten Substanzen durch Biosynthese, und sie "bezieht sich insbesondere auf die Horstellu»g des gelben Pigments, das mit Zeaxanthin oder ^S'-Dib^rosEy-ß-carotia bezeichnet wird, durch Kultivierung eiaes Mikroorganismus, der disse Substanz erzeugen kann.

Dieses Pigment kann beispielsweise als Zusatz sum Futter von Hühnern verwendet werde?}, ura die gelbe Parbs der Haut dieser Tiere zn verstärken oder vm die Farbe des Eigelbs besser herausssubriagen. Es ist auch möglich, dif?se Substanz als FärDemittal eu verwendet», beispielsweise in dsr kosmetischen Industrie*

BAD ORIGINAL

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Die Synthese von Pigmenten durch gewisse Mikroorganiseen, insbesondere von carotinoide Pigmenten durch Bakterien der Art Flavobacter, ist bekannt. Die industrielle Herstellung dieser Pigmente durch Biosynthese erweist sich im allgemeinen aber als schwierig, und außerdem erfordert die Herstellung von größeren Mengen Pigment die Verwendung von beträchtlichen Mengen an Kulturmedium« da die Ausbeuten im allgemeinen schwach sind.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich in erster Linie auf die Herstellung von Zeaxanthin durch Biosynthese durch ein einfaches Verfahren, welches es gestattet, die Ausbeute bei der Herstellung dieses Pipaents beträchtlich zu erhöhen. Gegenstand der Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin durch Kultivierung eines dieses Pigment erzeugenden Mikroorganismus der Art Flavobacter, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man diesen Mikroorganismus in einem Nährmedium kultiviert, bis Zeaxanthin erzeugende Zelle» im wachsenden Zustand erhalten worden sind, daß man hierauf diese Zellen bei einer Temperatur von 22 bis 25°C unter ausreichenden Oxidierungsbedingungen in einem wässrigen Pennentatioösnährmedium kultiviert, welches mindestens ein Kohlehydrat in einer Konzentration von 15 bis 35 ag/nl als assimilierbare Kohlenstoffquelle und mindestens eine freie Aminosäuren aufweisende Quelle für assimilierbaren Aminatickstoff enthält, daß man die entsprechenden Mengen dieser Substanzen auf eirve im weser?tliehen, konstante Konzentration hält, indem mac diese Substanzen!während der Kultivierung dem Fermentationsmedium zugibt, und daß man die Kultivierung solange fortsetzt, bis sich eins beträchtliche Menge an Zeaxanthin im Iiedium angesammelt hat.

BAD ORIGINAL

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3 -

Hit dem Ausdruck "Hüc^corganismuß der Art Flsvobacfcer" soll in der folgenden Beschreibung eis? Mikroorganismus versta&dexi werden, der aus Bakterien dieser Art oder einem Mutanten eines solchen Mikroorganismus ausgewählt ist» Weiterhin "bedeutet der Ausdruck "unter ausreichende« Qxidierungsbedingungert" , daß der Gehalt an Sauerstoff im Kulturmedium niemals unter einem Wert liegt, unter des* das Wachstum des rSLkrcorga^i smus unter den Kultivierungsbedingungea gehemmt wird. Diese Oxidieruxsgshedingusgen kön».es beispielsweise dadurch hervorgerufös. werden., daß man das KulturmediuQ belüftet usd energisch rührt« Schließlich bezeichjaet der Ausdruck "liährmsdiuis" ein Kulturmedium, welches die für des Leben des Iiikroorgass.Ismus nötigen und assimii-ies?- baren Substa'Cuer? enthält, lon diesesi Substaaf.en sollen iasbesoadere die Quellen, für Kohlenstoff und für Stickstoff sowie die Minerals-u 1 ze ge^asunt werdea·» Das Hahraedium kann natürlich auch andere Substsüse» enthalten, wi© s.B. Vitamis.e, Wachstumafaktoren ucd Spur-3iieieaie/j.te.

Bei einer besonderen Ausführungsforni-des erfindungsgeaäßea Verfahrens stellt man zunächst eine Kultur ©ines Mikro- . Organismus der Art Plavobacter her, mit der ean anschließend ein Nährmedium impft, das sich in eir-em Fermsntator befindet und ale Hauptquellen für durch den Mikroorganismus assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff mindösteas ein Kohlehydrat und mindestens eine freie Aminosäuren aufweisende Substanz enthält. Das Wachstum des lükroOrganismus la Permentator wird dadurch aufrechterhalten, daß man eine ausreichende Oxyd ie rupissvTi rkung im Kulturmedium sicherstellt uttd" eine geeignete Temperatur in. der (rroiienoixlnviig von ?.& bis 3C⁰C und eioeo geeignet?!} pH

BAD ORIGINAL

Venn die Bakterieczellen ein ausreichendes WachßtumoetadiuD erreicht haben, wobei vorzugsweise die Kultur eich in einem exponentiell» WachstumsStadium befindet, und wenn die Zellen das Stadium der Erseugung von Zeaxanthin erreicht haben, welches leicht an der Gelbfärbussg dieses Pigmente erkannt werde» kavai, dann fährt man mit der Kultivierung dieser Zellen bei eirer Temperatur zwischen 22 bis 25⁰C unter ausreichendes Oxtdierurgsbedingungen und in einem wässrigen Nährmediuit fort, welches 15 mg *>±b 35 mg/ml mindestens eines Kohlehydrats und mindestens eine freie Aminosäure aufweisende assimilierbare Stickstoffquelle enthält, wobei men durch allmähliche Zugabe dieser beiden Substanzen zum Fermentationsmedium eine im wesentlichen konstante Konzentration dieser Stoffe aufrechterhält.

Das Kohlehydrat, welches die hauptsächliche assimilierbare Kohlenetoffquelle für den Mikroorganismus daretellt, kann aus Substanzen wie Glucose., Lactose cder Sucrose ausgewählt werden. Diese assimilierbare Hauptkohlenstoffquelle kann auch aus einem Gemisch dieser Substanzen bestehen.

Beispiele für Substanzen, welche eis Hauptaminstickatoffquelle für die Zusammensetzung vsrv/cadet werden können, sind Maisauszugprodukte, Hefeerbrakte, Proteinhydrolysate, insbesondere diejenigen Produkte, die durch eaure oder enzymatische Hydrolyse von pflanzlichen Proteinen erhalten werde», wie* z.B. von Proteinen von Sojabohnen oder Erdnußkernen, und/oder das Casoivihydrolyaat, welches als "Tryptone" bezeichnet wird. Diese Aminsticketoffquelle kann auch eine Substanz en i; ha lter., die durch saure oder enzymatische Hydrolyse einer Biomasse hergestellt worden

BAD ORIGINAL

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ist, welche als Nebenprodukt der Biosynthese einss c&retinoiden Pigmente durch Kultivierung ©Inas Bakteriuma der Art Flavob&cter erhalten v/erden ist_? und swar insbesondere durch Hydrolyse einer Biosaasse von Flavobactar, die sur Herstellung von Zeaxanthin kultiviert und von der das Pigment extrahiert worden ist.

Hierauf fährt man alt der Kultivierung unter diesen Bedingungen während einer Seit fort, die ausreicht, daß im Kulturmedium eine beträchtliche !isege Zeaxanthin entstanden ist, wobei dieses Pigment in den Zellen vorliegt;. Man kaim. auch am Ende dieses Zeitraums die fortlaufende Zugabe der Kohlenstoffquelle und der Stickstoffquelle unterbrechen und die Zusammensetzung des Kulturmediums uiater Verbrauch der Bahr-Stoffe durch die Mikroorganismen selbst weiter entwickeln lassen.

Versuchsergebnisse haben gezeigt, daß, wenn nan die Kultivierung des Mikroorganismus gemäß diesem Verfahren durchführt, die Bildung von Zeaxanthin wesentlich höber ist, als wenn die Kultivierung des gleichen Mikroorganismus unter den üblichen Bedingungen durchgeführt wird.

Man kann hierauf, gegebenenfalls nach Konzentrierung d@2? Nänrbrüha', das Zeaxanthin aus den Zellen mit Hilfe eines polaren organischen Lösungsmittels, wie z.B.. Aceton, Äthylalkohol oder chlorhaltig® Lösungsmittel wie Chloroform^ extrahieren.

Gemäß eis ei' Variante kann mass die Biomasse vom Kulturmedium abtrennen,-beispielsweise sur Zsöfcrifugatio»., Dekantation oder Filtration. Die Biomasse kanu so wie sie ist verwendet

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BAD ORIGINAL

werden* beispielsweise als Zusatz zum Futter von Hühnern, oder man kann sie alt Hilfe eines polaren organischen Lösungsmittels extrahieren.

Gemäß einer besondere vorteilhaften AuefiiliirungaforBi des erfindungsgen&ßen Verfahrene stellt man eine Kultur eines Mikroorganismus der Art Flavobacfcer her, mit der man ein wässriges Nährmedium impft, welches eich in einem Permentator befindet und als Hauptkohlenstoffquelle ein Kohle™ bydrat oder eine Mischung von Kohlehydraten, vorzugsweise in einer Konzentration von 6 bis 8 Gew.--%, sowie ein© assimilierbare Hauptaminstickstoffquelle enthält· Hierauf unterhält man das Wsehstuia des '. ti kroorga/il suras dndurch, daß man eine ausreichende Oxidierungswirkung im Medium sicherstellt und daß mat», eine ausreichende Temperatur in der Größenordnung von 28 bis 30⁰G und einen geeigneten pH zwischen 6,5 und 8,0» vorzugsweise zwischen ?,0 und 7,5» aufrechterhält.

Wenn die Konzentration dea Kohlehydrats im Medium abnimmt und einen Wert zwischen 15 und 35 fflg/ml erreicht, dann stellt man die Temperatur des Mediums zwischen 22 und 25°C ein und gibt dem Teraientator allmählich, d.h. entweder fortlaufend oder in aufeinanderfolgender Portionen, mizideeteoa ein Kohlehydrat und misdeste/is eine Quelle für assimilierbaren Aminstickstoff Ru. Ma* kann, diese Substanzen ia den Fermentator entweder gesondert oder als Hährstoffmischung sugebeo.. Biese Zugabe erfolgt in einer Menge, daß der Gehalt des Kohlehydrats irr. Kulturmedium zwischen 15 und 35 Dg/ml bleibt und daß die Menge» an Kohlehydrat und an Quelle für Aminsttckatoff konsteut bleiben. Hierzu führt man vorzugsweise in den Fermentator ein diese Subst&azsn enthaltendes Substrat in einor .Menge eis, daß der Gehalt an Kohlehydrat im ifediuu iiwiachea 15 und 35 Eg/ml bleibt,

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wobei die chemische Zusammensetzung des Substrats dsrarfc ist, daß das Verhältnis der Gewientemengen des Kohlehydrats und der assimilierbaren Imiasubs^ansa konstant sind und vorzugsweise zwischen1,6 txr>d 3,4 lieges.«

Während dieser Fermentation wird der pH des Kediums auf 6,5 bis 8,0, vorzugsweise 7,0 bis 7,5» eiegestellt. Di© Einstellung des pH kann mit alkalisches Losungen, wie 25»B. einer wässrigen Lösung von Natrium-, Kalium- oder Arainomhydroxid, oder mit Hilf© eines Ammoniakstroms bewirkt werden. Yorsugsweise worden die letzteren "beiden Substanzen verwendet, da sie Aminstickatoffquellen sind, welche durch den Mikroorganismus assimiliert werden können«

Diese Kultivierung wird dami wo.ure.Dd einer Seit förtgesetst, die ausreicht, im Ke&iura eix-e beträchtliche Menge Zeaxanthin z-u erzeugen» Man kann die Kultivierung auch nach' Unterbrechung der allmählichen Zugabe der Mhrsubstansen fortsetzen und das Medium unter Verbrauch der Nähx'substanzen durch den Mikroorganismus von selbst wsitorent'wickeln lassen.

Besonders interessante Resultate vatrden erhalten, wenn eine Kultivierung, wie sie ober, beschriabsn wuraö, von Mutanten durchgeführt wurde, welche durch die Einw:ii\!n.iö.g von i-Methyl-J-iiitro-'i-ii.itroso-suaDi.dxz·, in der Folge mit STGr abgekürzt, a"uf gewisse Bakterien der Art Flavobacter gemäß einem Hatatic&ßvörfahren hergsstel.lt \ioi*de». sind, das sich dadurch auszeichnet_t daß mac das WG auf das Bakteriuia, welches sich auf einem featea Γ-fedium befindet* einwirken läßt.

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BAD ORIGINAL

Gemäß einer besonderen Ausführungeform dieses Mutatione- verfahrens stellt man ©ine Kultur βineο Bakteriums der Art Flavobacter, welches Zeaxanthin erzeugen kanu, her.

Diese Kultur wird mit einer sterilen physiologischen Lösung verdünnt, u»d die erhaltene Lösung wird dann in einer Petrischale mit einer wässrigen Lösung, von OTG in geeigneten Verhältnissen geniacht, beispielsweise mit einem Volumen, das einer wässrigen Lösung von NTG äquivalent ist, die 1 bis 10 mg dieser Substans/ml enthält. Hierauf gießt man auf öle erhaltone Lösung geschmolzenen Agar, den man sorgfältig mit der Lösung mischt. Vena der Agar fest ist,dann hält man das erhaltene feste Medium auf eine geeignete Inkubationstemperatur, beispielsweise zwischen 25 und 28⁰C, bis Kolonien auf dem verfestigter Medium in Erscheinung treten. Die Kolonien werden damx ebgehobon und dann mehrere Kaie auf festen Nährträgern aufgepflanzt.

Der erhaltene mutierte Mikroorganismus kann dann den Gegenstand mehrerer anderer fiutationebehandlungen auf einem festen liediuin bilden.

Die Versuchsergebnisse haben gezeigt, daß eir>e solche Mutationsbehandlung, die auf einem festen Medium mit einem mutagesen Mittel wie NTG ausgeführt wird, es gestattet, ausgehend von Bakterien der Art Flavobacter Mutanten 2u erhalten, die unter den angegebenen Kulturbedinguagon Mengen an Zeaxanthin erzeugen, die höher sind, als man sie von Mutanten erhält, die nach bekannten Mutationsverfahren ausgehend von den gleichen Bakterien und unter Zuhilfenahme des gleichen mutagenen Mittels erbalter· worden sind.

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Sie Erfindung wird nun durch die folgeflden B©ifSpi©i@- erläutert. In diesen Beispielen aii3d di© der Nähraedien in Gewichtsprozent ausgedrückt

Beispiel 1

Man stellt eine Kultur eines Stammes der Art flavobacter (ATOO Nr, 21 588) her, mit der man in einer Xonzenttfation von 5 Vol.-% ein wässriges Nährmedium, das sich in einem Permentator befindet, impft. Dieses Nährinedium, das vorher während 40 min bei 120°0 sterilisiert und dann auf 28⁰C abgekühlt worden ist und dessen pH mit Hilf© von Ammoniak auf zwischen 6,9 und 7,1 eingestellt worden ist, besitzt die folgende Zusammensetzung:

Glucose (gesondert in konzentrierter Lösung sterilisiert) ?»0% Maisauszugsflüssigkeit

Caseinhydrolysat (Tryptoae) O₉I

Hefeextrakt 1,(

Magnesiumsulfat

Maisöl . 0,08%

destilliertes Wasser ad

Der Mikroorganismus wird dann im Fermentator bei 28⁰O kulti viert, und zwar unter Belüftung und energischer Mihrusg* wobei der pH des Mediums fortlaufend durch automatische Zugabe einer verdünnten wässrigen Aitußoniaklösung wiscii&a 7,2 und 7,3 gehalten .wird.

Die unter diesen Bedingungen gezüchtete Kultur ergibt aaöli 6 bis 7 st eine gebundene Phase. Die Bildung τοπ beginnt nach 14 st dauernder K-ultisrierung.

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»J« «ο

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Venn der Gebalt on Glucose im Permentationßnsdium auf 25 abgenommen hat, d.h. 24 st nach Beginn der Kultivierung, stallt man die Temperatur des Mediums auf 24°C ein und gibt allmählich zvja Fermeatator in einer Weise _v daS der Gehalt an Glucose im Medium weitgehend konstant, bleibt, ein ÜT&hreubatrat zu, daa vorher in einora gesonderten Behälter eterili iert worden ist, dessen pH auf 7,2 eingestellt ist und daasan Zusammensetzung wie folgt istS

Glucose 32%

Ka ί s au a zupji' 1 Ii sei gke it 4,7%

Caseishyd.ro!,yea b (Tryptone) ** ~5%

Hefeextratet 5,%

destilliertes Wasser ad 100%

Die allmähliche Zugabe wird 20 st lang fortgesetzt, wobei die Temperatur des Mediums auf 24°C gehalten wird.

Nach einer gesamter, Kultiviorungs&awjr \ron 50 at mi St man den Gehalt deo Fermeütatiocsmodiuan s*i Zeaxanthin. Hierzu isoliert man die Biomasse vom Nährend3trat durch Zeutrifugienmg und extrahiert daa Seaxantfeia aus den Zellen init Hilfe von Aceton. Die Zea2tanthinlÖ3UEi5 in Aceton wird dann kolorimetrisch analysiert, und zwar durch Vergleich, mit titrierten Lösungen von cjnthetiachom Zeaxanthin im gleichen Lösungsmittel.

Der auf diese Wolae geiaösasno Gehalt an !'.saxantbin la Farmentationsmedium beträgt 20/<g

Zum Vergleich wird der gleiche 3taom durch ein herkömmliches Varfahren kultiviert. Hierzu wird eiüo gleiche Kecge eines vorher sterilisierte >.:rd auf 28⁰C- abgekjb-l.ten Mhnaediune mit einer Kotisentratiow von 5 V'ol.-~i· geimpft, -lio'jei daa

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Nährsediim einen auf 6,9 Ms 7,1 eingestellten pH ms& Äie folgende Zusammensetzung aufweist:

Glucose ^: 10,0 %

Jfei3aue»ugflüssigkeit 1_T85%

Caseinhydrolysat (Trjptono) 1_?25%

Hefeextrakt * 2,1 %

Magnesiumsulfat 0,3 %

Maisöl 0,08% ''

destilliertes Wasser ad 100 %

Die Kultivierung wird *»&ter energischem'Hü&rexi mal BeIiIftea ausgeführt, wobei der pH fortlaufeiaä swisclxen 7»2 uad 7»3 eingestellt wird. Ei tie gebusde&e Phase wir-d nach 8 st beobachtet, und die Bildung von Zeaxant^ia beginnt m&fa ©insr 15 S^" dauernden KultivieruJig* nach 24-stündiger lultiiritnmg stellt man die Temperatur des Mediums auf 2M-⁰G ®1eu üach 55-stündiger Kultivierung beträgt der Gehalt dee F©rm©B.tationi3w©äiuiis an Zeaxanthin, der wie oben beschrieben "bastisrnt worden ist_s 12

Beispiel 2

Man stellt eine Kultur eines Stamms der Art Flavobacter (ATCC Nr. 21 081) in einem wässrigen MhrmsdiuEi her, pH auf 6,5 eingestellt ist und dessen wie folgt ist:

Glucose	3,0 %
Hefeeitrakt	1,0 %
Caseinhydrolysat (Tryptono)	1,0%
Magnesiumsulfat	0,5%
destilliertes V/asser	ad 100 %

Diese Kultur, welche 5 g Mikroorganismus ze Ilen je 1 NiÜirmediura enthält, wird dann in einer Reihe von aufeinanderfolgenden Vorgängen mit einer eterilen phyeiologieohen LSeung, die 0,9 Gew.-% Natriumchlorid enthält, auf ein Voluaenverhältmis vor 1:10⁸ verdünnt.

Dann mischt man sorgfältig in eine* Petri-Schale 1 ml dieser Lösung mit 1 bI einer wässrigen Losung von NTG, welche 5 «g/ml dieser Substanz enthält. Dann fügt man IO ml geschmolüenen Agar zu dieser Lösung zu und mischt den Agar mit der Lösung vollständig. Nachdem der Agar fest geworden ist, wird die Petri-Schale bei einer Temperatur i» der Größenordnung von 25 bis 28°C inkubiert, bis auf dem verfestigten Medium Kolonien in Erscheinung treten, was in 2 bis 4 Tagen eintritt. Eierauf entfernt man die Kolonien aus der Petrischale und bringt sie In Abwesenheit von KTG in mehreren aufeinanderfolgenden Operationen auf Nähragartrager.

Mt dem erhaltenen mutierten Stamm werden dann 100 ml eines sterilen Hähraediums in einer Konzentration von 5 Vol.-% geimpft, wobei der pH des Nährmediums auf 6,5 eingestellt ist und die folgende Zusammensetzung aufweist:

Glucose 2,

Hefeextrakt 1,0%

Gaseinhydrolysat (Tryptone) 1*0%

Magnesiumsulfat 0,5%

destilliertes Wasser ad 100%

Der Mikroorganismus wird dann 24 st lang bei 2S⁰C in diesen Medium und unter aeroben Bedingungen kultiviert, worauf dass, mit dieser Kultur von neuem 2 1 eines Nährmediums der gleichen Zusammensetsung geimpft werden. Nach einer Fermentationsaeit

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von 24 st unter den gleiches Bedingungen wird alt dieser letzteren Kultur in einer Eonsentration ^©a- 5 Vol.«-# ei& wässriges Mhrmedium geimpft, das sich in einem Fermentatoi? befindet. Dieses Kßbirmedium, welches vorher 40 min lang bei 120⁰C sterilisiert und auf 28⁰C abgekühlt worden ist, 1st mit Hilfe von Ammoniak auf einen pH zwischen 6,9 und 7,1 eingestallt und besitzt die folgende Zusammensetzung;

Glucose (gesondert in konsen- 7,0 % trierter Lösung sterilisiert)

Maisausaugflüsaigkeit 1_S6 %

Caseinhydrolysat (Tryptoye) 0,8 %

Hefeextrakt 1,8 %

Kagnesiumsulfat 0,5 %

Maiaöl 0,08?a

destilliertes Wasser ad 100 %

Die Kultivisrung wird im EeraiQBtafcoj? bei 28⁰C unter Belüftung und energischer Mhrung durchgeführt, wobei der pH des Mediums automatisch swischen 7»2 und 7»3 eingestellt wird. Eine gebundene Phaae kann ma'Q nach 5 bis 6 st feststellen. Die Bildung von Zeaxanthin, begisnt nach 12 st dauernder Kultivierung»

Wenn der Gehalt an Glucose des Kulturmediums auf 25 mg/al abgenommen hat, was 22 st »ach Beginn der Kultivierung eingetreten ist, stellt man die Temperatur des Hedlums auf 24-⁰C ein und führt is einer Weiss, daß der Gehalt an Glucose des Kadiums im wesentliches konstant blsibt, ein Nährsubstrat ein, das vorher sterilisiert worden ist, dessen pH auf 7i2- eingestellt ist und dessen Zusammensetzung wie folgt ist:

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• it *

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Glucose 32,0%

Maioauo2uflus9igke.it 4,7%

Caseinhydrolysat (Tryptone) 4,3%

Hefeextrakt : 5,5%

destilliertes Waasor ad 100%

Die allmähliche Zugabe wird 20 st,fortgesetzt, wobei die Temperatur des Mediums auf 2'+⁰C gehalten wird.

Nach eiser gesamten Kultivierungsdauer von 48 at hat die Konzentration des Mediums an Glucose ¹J mg/ml erreicht, und der Gehalt an Zeaxanthin, ^ameasen- wie in Baispisl 1, beträgt danjö 335

Beispiel 3

Man stellt einen Mutanten dee Stammea Flavobacter (ATCC Nr. 21 081) her, wie·es in Beispiel 2 beecfcrieben ist.

Mit dem mutierten Sfeanan wird dann in einer Menge von 4 Vol.-% ein wäasrigQQ Kähroiedium geimpft, das vorher während 40 min bei 120⁰C sterilisiert und auf 28⁰C abgekühlt worden ist und sich in einem Ferroontatoz· befindet. Dieses Näiirmedium, dessen pH mit Ammoniak auf 6,9 bis 7»1 eingestellt worden ist* besitzt die folgende Zuaaaraiensetzuue:

Glucose 7,0 %

Maieauszugflüßßigkeit

Hydroljsafc ei.c»ea Erdpußker.otrosfcera

Hefeexfcrakt;
Magne ai umen Ife t

destilliertes Wasnor

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1.6	%	%
0 7	%	BAD ORIGINAL
2,0	%
.0,5	%
0,08%
a>'i 100

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Der Mikroorganismus wird iq eijuea Permentator bei 28⁰G wie in Beispiel 2 kultiviert.

Venn der Gehalt des Hediums an Glucose auf 25 mg/ml abgenommen hat, stellt man die Temperatur des Mediums auf 24°C ein und fügt ellmählich, um den Gehalt aa Glucose im wesentlichen konstant zu halten»ein Nährsubstrat au, das vorher sterilisiert worden ist_s dessen pH auf 7»2 eingestellt ist und das die folgende Susaaimennetzung aufweist:

Glucose . 32,0%

Maisauszugflüssigkeit 4,7 %

Hydrolysat eises Erdnußkera- 3,5 % tresters

Hefeextrakt 6₅0 %

destilliertes Wasser ad 100 %

DIo Zugabe wird während 20 st bei einer Temperatur von 24°C fortgesetzt.

Nach einer gesamten Kultivierungsdauer von 51 st erreicht der Gehalt des Mediums an Glucose 7*5 mg/ml. Der Gehalt an Zeaxanthin, der wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt wird, ist dann 312 /tg/ml,

Man stellt ein Kulturmedium des Bakteriums Flavobaeterium aquatil« (A.TCG Nr. 11 9^7) her, mit dem »an ein wässriges Nährmedium impft» das sich in einem Fermentator befindet* Dieses Hährmedium, welche3 vorher 4O min bei 12O^PC sterilisiert und dann auf 2B⁰C abgekühlt worden ist und dessen pH mit Ammoniak auf 6,9 bis 7*1 eingestellt worden ist, ist mit dem In Beispiel 1 beschriebenen Ilährsiediura identisch·

Der MikroorganiBmue, de* im Fermentatcr unter den gleichen Bedingungen der Temperatur, des pH und der Belüftung wie in Beispiel 1 kultiviert worden ist, ergibt nach 6 bie 7 et eine gebundene Phase und beginnt nach 14 et Kultivierungezelt mit der Bildung des Zeaxanthins«

Wenn der Gehalt an Glucose des Fennentationsmediuma auf 25 mg/ml, abgenommen hat, v&a 24 st nach Beginn der Kultivierung der Fall ist, stellt man die Temperatur des Mediums auf 2#°C ein und führt allmählich in den Fermentator ein Nährsub'etrat ein, das vorher in einem gesonderten Behälter sterilisiert worden ist, dessen pH auf 7-,2 eingestellt ist .und dessen Zusammensetzung mit derjenigen des in Beispiel 1 beschriebenen Substrate identisch ist. Die allmähliche Einführung &ea Substrats in den Fermentator, welche in einor Weise erfolgt, daß dsr Gehalt an Glucose im Medium Im wesentlicher», koiistant bleibt (d«h. in der Größenordnung von 25 mg/ml) wird während 24 st fortgesetzt, wobei die Temperatur des Mediums auf 24°C gehalten wird.

Nach einer gesamten Kultivierungsdaucr von 50 st wird der Gehalt des Fermentetion&medlums an Zeaxanthin durch Diimischichtchroiaatographie und durch UV-Spektroskopie gemessen.

Der auf diese Weise gemessene Gehalt des Fermontationsmödiuma an Zeaxanthin beträgt 16yicg/ml.

Zum Zweck© de3 Vergleichs wird das Baktorlvji nach einem herkömmlichen Verfahren kultiviert, welches ebo'ofalls f'ir Vergleichszwecke ia Beiaplel 1 tosschriebe» ist. 55 st nach Beginn der Kultivierung beträgt der Gehalt an Zeaxanthin im Fcnaentationamodium, gemessen vde obe» beschrieben, nur 4^ g/ml.

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Beispiel 5

Man stellt einem Mutanten des Stamms von Flavobacterium aquatile (ATOC Nr. 11 94-7) durch das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren und unter den gleichen Bedingungen her.

ti

Der mutierte Stamm wird hierauf sukzessive in den gleichen Nnhmaedien unter allmählicher Zugabe des gleichen Sährsubstrats wie in Beispiel 2 und unter den gleichen Bedingungen kultiviert.

!fach einer gesamten Kultivierungsdauer vor 4-8 st hat die Konzentration des Mediums an Glucose 5 mg/ml erreicht, wobei der Gehalt dieses Mediums an Zeaxanthin, gemessen wie in Beispiel 4, 40 /ig/ml beträgt.

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BAD

Claims

Fat ent aiisprüc he
Vorfahre!*, zvx Herstellung von Zeaxanthin durch.
Kultivierung sines dieses Pigment "bildenden Mikroorganis- . mus der Art Flsvobectar, dadurch gekennzeichnet, daß man diesen Mikroorganismus in einem Iföhrmedium kultiviert, bis wachsende und Zeaxanthin erzeugende Zellen entstanden sind« daß man hierauf diese Zellen hei einer Temperatur von 22°C bis 25⁰C unter· &erober< Bedingungen in einem wässrigen Nährferaier)tat.ionsfflfec^!iuiu kultiviert, welches als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff n?.ia&03tens ein Kohlehydrat in einer Konzentration von 15 bis 35 rng/ial und mlndeätens eine freie Ami0osäursn aufweisende assimilierbare Aainstiokatofiquelle enthält, daß man die einzelnen Mengen dieser Subetanzen auf eine im itfesentlichen konstante Konzentration hält, iudom man alimählich diese Substanzen während der Kultivieruög dem Fermettatioosmedium zugibt, und daß man mit dieser Kultivierujog fortfährt_% bie im Medium eine beträchtliche Menge an intrazellularem Zeaxanthin gebildet worden ist.
2» Vorfahren nach Aß3x>ruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß man de« pll flea Ferraeutatlonaaediums zwischen 6,5 ur.d 8,0 hält.
5. Verfahron nach Aneyruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlehydrat Glucose, Lactose oder Sucrose verwendet.

BAD ORIGINAL

US

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4·." Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminstickstoffquells r&isauszugflüssigkeit enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aainstickstoffquelle Hefeextrakt enthält.
6. Verfahren nach Anspruch Ί_ν dadurch gekennzeichnet, daß die Amiastiekstoffquelle mindestens ein Proteinhydrolysat enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 1» dadurch gekennzeichnet, daß die Aminstiekstoffquelle ein Hydrolysat einer Biomasse von Flavobacter enthält.
S. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nan daa Zeaxanthin durcii Behandlung des Kulturmediums mit einea polaren organischen Lösungsmittel aus den Seilen extrahiert„
9» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennsoichnet, daß man die Zellen vom FermentationssiecLiuni abtrennt.
10. Verfahren nach ä.en Ansprüchen 1 und 9-, dadurch gekennzeichnet, daß man das Zeaxanthin τοη den Zellen mit Hilfe eines pol&ren orgaKischea Lösungsmittels abtrennt.
11. Verfahren nacJi Anspruch 1 _? dadiirch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus vom St&iaae AICO 21 588 'ist^
12. Verfahren, nach A»Spruch 1, dadurch gekewraseichnet, daß der MikroorearAsmvs vom Stamme ATCO 21 081 ist.
13. Vejrfahrsn nach. Aösjn-uch I₁ cLsxvüroU gekeur»2-.elehnet, daß der fuhroorgaaaamus voa Seam-je J'Ia'/otooteriMä! ^s

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ATCC 11 ?Α7
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Mutant tat, der von einen Zeaxanthin erzeugenden Bakterium der Art Flavobacter stammt.
15·' Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Mutant durch Einwirkung von 1 -Methyl-3-nitro-1 -nitro8o-guanidin auf ein Bakterium des Stamms Flavobacter auf einem festen Hödium erhalten worden ist.
16. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 14 und 15* dadurch gekennzeichnet, daß der Mutant vom Stamme ATCC 21 081 stammt,
17. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 14 und I5i dadurch gekennzeichnet _% daß der Mutant vom Stamme ATCC 21 588 stammt.
18. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 14 und 15» dadurch gekennzeichnet, daß der Mutant vom Stamme Flavobacterium aQuatil« ATCC 11 947 stammt.
19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus uxrfcer aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 28 uad 30⁰C in einem NShrmedium kultiviert, W9lche8 mindestens ein Kohlehydrat und mindestens eine freie Aminosäuren aufweisende assimilierbare Aminstickstoffquelle enthält, daß man den Gehalt des Mediums an Kohlehydrat bis zu einem Wert zwischen 15 und 35 ag/ml fallen läßt, daß man die Temperatur des Permentationsmctdiuos zwischen 22 und 25⁰C einstellt, daß man allmählich zum FermeDtationtHiedium mindestens ein assimilierbares Kohlehydrat in einer Kenga, daß äeir Gehalt des Fermentationsmediums a» Kohlehydrat swissJien 1·? u»ü 35 mg/ial bleibt, und mindestens eine freie Aminosäuren entnalttude aaaicilierbare Aminstickatoffquelle zugitt, wcbei man die Temperatar

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des Mediums zwischen 22 usd 2$°C hält, und daß ?aan die Kultivierung des Mikroorganismus fortsetzt, bis sich eine beträchtliche Menge a^i iatrazellularem Zeaxanthin angesammelt hat.
20. Verfahren nach eiaem der Ansprüche 1 und 19» dadurch gekennzeichnet, daß man allmählich zum Kulturmedium Kohlehydrat und Quelle fur Aminstick3toff in einem Gew."-Verhältnis zwischen 1,6 und 3,4 zugibt»

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