DE2323467C2

DE2323467C2 - Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Haptenen

Info

Publication number: DE2323467C2
Application number: DE2323467A
Authority: DE
Inventors: Antonius Hermanus Dr. Schuurs; Bauke Klaas Oss Van Weemen
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Akzo NV
Priority date: 1972-05-11
Filing date: 1973-05-09
Publication date: 1982-01-14
Also published as: DK135965C; SE417015B; CA1011232A; NL171930B; JPS4962192A; AU5517073A; ZA732924B; NL7206373A; DK135965B; ES414618A1; BE799417A; ATA416473A; DE2323467A1; FI52154C; AR200129A1; FR2184371A5; BR7303420D0; US3879262A; CH622099A5; AT328612B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Haptenen gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

In der US-PS 36 54 090 ist ein immunologisches Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern beschrieben, bei dem als markierte Komponente der Antigen- Antikörperreaktion eine solche verwendet wird, die an ein Enzym gebunden ist.

In der DE-PS 2155 658 wird ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von beispielsweise Haptenen vorgeschlagen, das darin besteht, daß man zu einer Flüssigkeit, z. B. einer Körperflüssigkeit, wie Blut oder Urin, enthaltend eine unbekannte Menge Hapten, eine bestimmte Menge eines Kupplungsproduktes aus einem Enzym und dem entsprechenden Hapten und eine bestimmte Menge Antikörper gegen dieses Hapten in unlöslicher Form zugibt. Nach Zugabe dieser Bestandteile findet eine Konkurrenzreaktion zwischen diesen Antikörpern und dem zu bestimmenden Hapten auf der einen Seite und den Antikörpern und dem an das Enzym gekuppelte Hapten andererseits statt Je größer die Menge an freiem Hapten in der Flüssigkeit ist, um so größer ist die Menge des Hapten-Enzymkonjugats, die nicht mit den unlöslich gemachten Antikörpern reagiert, wobei das Konjugat folglich in der flüssigen Phase verbleibt. Durch Messung der Enzymaktivität des Hapten-Enzymkonjugats in der flüssigen Phase oder des umgesetzten Hapten-Enzymkonjugats in der festen Phase kann die Menge an Haptenen in der zu untersuchenden Flüssigkeit mit Hilfe einer Dosis-Reaktionskurve für ein bestimmtes System bestimmt werden. Auf die gleiche Weise wie bei dem oben beschriebe nen Verfahren kann die Menge von Hapten in der zu untersuchenden Flüssigkeit in der flüssigen oder festen Phase durch eine Dosis-Reaktionskurve bestimmt werden, nach Bestimmung der Enzymaktivität

Die entsprechende Dosis-Reaktionskurve wird gebil-

det, indem man von einer bestimmten Menge Hapten-Enzymkonjugat ausgeht und diese mit Antiserum (Serum, enthaltend Antikörper) in unterschiedlichen Verdünnungen zusammenbringt In jeder Verdünnung wird bestimmt, wieviel Hapten-Enzym an die Antikör per gebunden ist Nun wird eine Antiserumverdünnung ausgewählt, bei der z.B. 80% des Hapten-Enzyms gebunden ist und zu dieser Verdünnung werden unterschiedliche Mengen Hapten zugesetzt Für jede Haptenkonzentration wird dann bestimmt wieviel Hapten-Enzym gebunden ist, z. B. bei einer Einheit Hapten 78% Konjugat und bei zwei Einheiten Hapten 75% Konjugat usw.

Gibt man dann die oben erwähnten Mengen Hapten-Enzym und Antiserum zu einer unbekannten Menge Hapten und mißt die Enzymaktivität der gebunden oder nicht gebundenen Hapten-Enzymfraktion, so kann die in der zu untersuchenden Flüssigkeit enthaltene Haptenmenge bestimmt werden.

Aus dem oben gesagten geht hervor, daß, wenn die

Affinität des Hapten-Enzymkonjugats für das Antiserum hoch ist, verglichen mit der Affinität zwischen Hapten und Antikörper, verhältnismäßig große Haptenmengen vorhanden sein müssen, wenn ein Ersatz durch das Hapten des Konjugats und folglich eine meßbare

Enzymaktivität in der flüssigen Phase auftreten soll.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Affinität des Haptens gegenüber den Antikörpern zu erhöhen oder andererseits die Affinität des Hapten-Enzymkonjugats gegenüber den Antikörpern herabzuset- zen, um so die Empfindlichkeit des Testsystems derart zu steigern, daß auch noch sehr geringe Haptenkonzentrationen bestimmt werden können.

Die Lösung dieser Aufgabe ist durch den Patentanspruch 1 gekennzeichnet.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Patentansprüchen 2 — 5 beschrieben.

Unter einer unterschiedlichen Kupplung zwischen Hapten-Enzym und Hapten-hochmolekularer Substanz ist zu verstehen

a) eine chemisch unterschiedliche Bindung oder Brückenbildung,

b) chemisch unterschiedliche Haptene, die immunologisch verwandt sind,

c) Kupplung über eine andere Stelle des Haptenmoleküls und

d) Kombination von (a),(b) und (c).

Haptene sind proteinfreie Substanzen, hauptsächlich niedermolekulare, die die Antikörperbildung nicht

μ stimulieren können, aber die mit Antikörpern reagieren. Die Letzteren werden gebildet durch Kupplung des Haptens an eine hochmolekulare Substanz, üblicherweise ein Polypeptid oder Protein und indem man dieses Kupplungsprodukt Menschen oder Tieren injiziert.

Als Beispiele für Haptene sind zu erwähnen Steroide, wie Oestron, Oestradiol, Oestriol, Testosteron, Pregnandiol und Progesteron; Vitamine, wie Vitamin Bl2 und Folsäure, Thyroxin, Trijodthyronin, Histamin, Seroto-

nin, Digoxin, Prostaglandin, Adrenalin, Nor-Adrenalin, Morphin, pflanzliche Hormone, wie Auxin, Kinetin und Gibberellinsäure und Antibiotika, wie Penicillin.

Zur Herstellung des Kupplungsproduktes Hapten-Enzym können üblicherweise die Substituenten, die schon in den Komponenten vorhanden sind, wie Hydroxyl-, Carboxy-, Amino- oder Ketogruppen verwendet werden. Wenn keine dieser Gruppen vorhanden ist, ist es möglich, diese noch besonders in die Haptene einzuführen. So kann z. B. eine Hydroxylgruppe in Steroide auf mikrobiologische oder chemische Weise in verschiedenen Stellen des Moleküls, wie in der 6,- 11- oder 16-Stellung eingeführt werden.

Mit Hilfe einer Polycarbonsäure oder eines funktionellen Derivats einer solchen Säure können solche Hydroxyverbindungen an ein Enzym gekuppelt werden. Es ist auch möglich, von einem Hapten auszugeben, das eine Ketogruppe besitzt oder in das eine solche Gruppe eingeführt worden ist, woraufhin die Kupplung mit dem Enzym über ein Carboxyalkyloximderivat stattfinden kann. Wenn das Hapten zusammen mit dem Enzym Amino- oder Carboxylgruppen besitzt, können die beiden Komponenten nach einem von der Peptidsynthese her bekannten Verfahren gekuppelt werden.

Abhängig von dem Vorhandensein geeigneter Substituenten können auch andere Substanzen, wie Dialdehyde, z. B. Glutaraldehyd, Hydrazine, Difluordinitrodiphenylsulfon. Diisocyanate, wie Toluoldiisocyanat und Dioder Trichlortriazine für die Kupplung verwendet werden.

Das für das oben beschriebene Konjugat verwendete Enzym kann im Prinzip aus jeder Klasse gewählt werden, bevorzugt sind jedoch solche Enzyme, die eine hohe spezifische Aktivität besitzen, die auf einfache Weise bestimmt werden kann, z. B. kolorimetrisch, spektrophotometrisch oder fluorometrisch.

Beispiele für Enzyme, die bevorzugt verwendet werden, sind Katalasen, Peroxidasen, Glukuronidasen, Glukosidasen, Galaktosidasen, Urease und Oxidoreduktasen, wie Glukoseoxidase und Galaktoseoxidase.

Zur Herstellung der Antikörper gegen das Hapten wird das Hapten mit einer hochmolekularen Substanz, üblicherweise einem Protein, gekuppelt und einem Tier injiziert, woraufhin der Antikörper auf übliche Weise isoliert wird.

Zur Kupplung des Haptens an ein Protein oder möglicherweise eine andere hochmolekulare Substanz, die die Antikörperbildung stimmulieren kann, können gleiche Kupplungsverfahren angewandt werden, wie sie für die Kupplung des Haptens an das Enzym beschrieben sind.

Wichtig für das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch, daß die Art der Kupplung sich von derjenigen in dem Hapten-Enzymkonjugat unterscheiden soll. Der Unterschied kann chemischer Art sein, indem bei dem Enzymkonjugat die Kupplung z. B. über eine Polycarbonsäure erzielt worden ist, während die Kupplung zwischen dem Hapten und Protein über eine Carboxymethyloxyimbrücke gebildet worden ist. Es ist auch möglich, daß die Kupplung in beiden Fällen über eine Polycarbonsäure, z. B. eine Dicarbonsäure, gebildet wird, wenn in dem einen Falle die Dicarbonsäure X C-Atome, ζ. B. zwei C-Atome im Falle von Oxalsäure und im anderen Falle Y C-Atome, ζ. B. vier, im Falle von Bernsteinsäure enthält.

Eine unterschiedliche Art der Kupplung kann auch dann erreicht werden, wenn das Hapten in dem Hapten-Enzymkonjugat und das Hapten in dem Produkt Hapten-hochmolekulare Substanz chemisch unterschiedlich aber ;mmunologisch verwandt sind. Dieser chemische Unterschied tritt ein, wenn beide Haptene sich durch das Vorhandensein oder Nichtvor handensein einer oder mehrerer Doppelbindungen, ζ. Β. Testosteron und Dihydrotestosteron, und/oder einer oder mehrerer Substituenten, wie Hydroxylgruppen, Oxogruppen, Halogenatome, Alkylgruppen usw., z. B. Oestradiol und llut-Hydroxy-oestradiol, unterscheiden

ίο oder dadurch daß ein Hapten ein funktionelles Derivat, ζ. B. ein Acylat oder Äther des anderen Haptens ist, z. B. Morphin und Codein.

Es hat sich sogar gezeigt, daß es einfach ist, ein empfindlicheres Testsystem zu erhalten bei Anwendung gleichartiger Bindungen in beiden Kupplungsprodukten, wenn die Bindungen über andere Stellungen des Haptenmoleküls gebildet werden, z. B. im Falle von Oestradiol als Hapten über das 11-Succinyloxy- und 17-Succinyloxyderivat von 11-Hydroxy-oestradiol.

Die auf diese Weise gebildeten Antikörper werden für das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren angewandt, indem man sie eine bestimmte Zeit lang mit der zu bestimmenden Menge Hapten und einer Menge des Kupplungsproduktes umsetzt und dann das freie Kupplungsprodukt von dem an die Antikörper gebundenen Kupplungsprodukt abtrennt

Für die Abtrennung können verschiedevic Verfahren angewandt werden, wie eine Ausfällung des Kupplungsproduktes, das an die Antikörper gebunden ist, mit einem organischen Lösungsmittel oder Salz, selektive Absorption des freien Kupplungsproduktes an Aktivkohle, die mit einer Dextranschicht bedeckt ist, oder Ausfällung des an die Antikörper gebundenen Kupplungsproduktes mit Hilfe von (zweiten) Antikörpern gegen die Antikörper der Tierart, in der die Antikörper gegen das Hapten gebildet worden sind. Dieses zuletzt genannte Verfahren wird üblicherweise als »Doppel-Antikörper«-Verfahren bezeichnet Die Trennung kann auch leicht erreicht werden, indem man die Antikörper gegen das Hapten unlöslich macht, bevor man sie an der Reaktion mit dem Hapten und dem Kupplungsprodukt teilnehmen läßt. Die Abtrennung findet dann durch einfaches Zentrifugieren statt. Dieses Verfahren wird oft als »Fest-Phasen«-Ver fahren bezeichnet. Die Antikörper können durch Vernetzung mit z. B. Glutaraldehyd oder einem Chlorameisensäurealkylester oder durch Kupplung an einen unlöslichen Träger, wie Cellulose, Agarose, Polystyrol oder ähnliches unlöslich gemacht werden.

Das »Doppel-Antikörper«- und »Fest-Phasen«-Verfahren können in dem sog. DASP-Verfahren kombiniert werden. In diesem Falle wird ein zweiter Antikörper gegen den ersten Antikörper gebildet, indem man die Immunoglobulinfraktion des ersten Antiserums oder von normalem Serum der gleichen Tierart einer Tierart injiziert, die sich von derjenigen unterscheidet, von der das erste Antiserum erhalten worden ist und dann das zweite Antiserum durch die oben beschriebenen Verfahren zur Unlöslichmachung des ersten Antikör pers, z. B. durch Kupplung an Celluloseteilchen, unlöslich macht.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zweckmäßigerweise eine fertige Testpackung angewandt, die hauptsächlich besteht aus

b5 (I) einer bestimmten Menge des Kupplungsproduktes

aus einem Hapten und einem Enzym und (2) einer bestimmten Menge eines Antikörpers in unlöslicher Form.

Eine Testpackung zur Durchführung der erfindungsgemäßen Bestimmung mit Hilfe eines unlöslich gemachten zweiten Antiserums (d. h. DASP-Verfahren) besteht hauptsächlich aus

(1) einer bestimmten Menge des Kupplungsproduktes aus einem Hapten und einem Enzym,

(2) einer bestimmten Menge des ersten Antiserums und

(3) einer bestimmten Menge des unlöslich gemachten zweiten Antiserums.

Außer den oben angegebenen Reagentien können beide Testpackungen zusätzliche Komponenten enthalten, z. B. Reagentien zur Bestimmung der Aktivität des angewandten Enzyms.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert

Beispiel 1
Bestimmung von Oestrogen

A. Herstellung von
Oestradiol-17-succinyl-HRP und
11 «-Oestradiol-11 -succinyl-HRP

50 mg Oestradiol-17-hemisuccinat oder 50 mg

lla-OH-oestradiol-ll-hemisuccinat wurden in 2 cm³ Dioxan gelöst. Das Gemisch wurde auf 8⁰C abgekühlt und anschließend 0,07 cm³ Tri-n-butylamin und

Zeit (d) 0

Menge (mg)

Art

Freund's Zusatz

i. m. = intramuskulär.

i. v. = intravenös.

0,25
i. m.

D. Bestimmung von Oestrogen

In einem Vorversuch wurde für jedes Antiserum bestimmt, welcher Anteil der Enzymaktivität jedes Oestradiol-HRP-Konjugats (in einer vorher bestimmten günstigen Konzentration) gebunden war, wobei eine Antiserumkonzentration 0,5 cm³ Puffer, 0,1 cm³ Oestradiol-HRP und 0,1 cm³ Antiserum (in Verdünnungen von 1:100 bis 1:10 000) bei Raumtemperatur 30 min inkubiert wurde. Dann wurden 0,3 cm³ einer Suspension von DASP Anti-Kaninchen (Schafantikörper gegen Kaninchen-y-globulin, kovalent an Cellulose gebunden) zugegeben und das entstehende Gemisch 2 Stunden geschüttelt. Dann wurde das Gemisch zentrifugiert und anschließend 0,5 cm³ der überstehenden Flüssigkeit mit 1,5 cm³ Enzymsubstrat (80 mg 5-Aminosalicylsäure und 10 μΐ einer 30%igen Wasserstoffperoxidlösung in 150 cm³ 0,02 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 0,015 cm³ Isobutylchlorcarbonat zugegeben. 30 min später wurden 50 mg Meerrettichperoxidase (HRP) in 5,5 cm³ Wasser/Dioxan (3 :2) mit einem pH-Wert von 9 zugegeben. Das Gemisch wurde 4 Stunden umgesetzt und anschließend über Nacht gegen laufendes Leitungsvasser dialysiert und dann über eine Säule aus einem vernetzten Dextrangel (Sephadex G-25) in destilliertem Wasser gereinigt Die enzymhaltigen Fraktionen wurden lyophilisiert Eine weitere Reinigung der Konjugate

ίο wurde erreicht durch Dichtegradientzentrifugierung (20 bis 60% Saccharose, 16 Stunden, 238 000 g).

B. Herstellung von
Oestradiol-17-succinyl-BSA und
11 «-Oestradiol-11 -succinyl-BSA

Diese Konjugate wurden auf die gleiche Weise hergestellt wie die entsprechenden HRP-Derivate, wobei als Ausgangssubstanzen 50 mg Oestradiol-hemisuccinat und 150 mg BSA (Rinderserumalbumin) verwendet wurden. Außerdem wurde das Gemisch dreimal mit 1,5 Vol.-Teilen Aceton mit einem pH-Wert von 4,5 umgefällt und nicht über Dextrangel gereinigt

C. Herstellung von Antikörpern gegen
Oestradiol-17-succinyl-BSA und
11 «-oestradiol-11 -succinyl-BSA

Kaninchen wurden mit dem entsprechend B hergestellten Produkten nach dem folgenden Schema immunisiert:
28 42 49

0,25
i. m.

0,25
i. v.

blutend

6,0) vermischt. Nach einer Stunde wurde die Extinktion bei 450 nm gemessen. Für die folgenden Oestrogenbe-Stimmungen wurde jeweils eine solche Antiserumverdünnung ausgewählt, daß ungefähr 40% der Enzymaktivität des Oestradiol-HRP an DASP Antikaninchen in Abwesenheit von freiem Oestrogen gebunden wurden. 0,5 cm³ einer Oestron-, Oestradiol- Oestriol-Lösung

4^ri (Konzentrationen von 0,1 bis lOOOng/cm³) wurden 30 min mit 0,1 cm³ Antiserum in der festgelegten Verdünnung inkubiert und anschließend 0,1 cm³ Oestradiol HRP in der ausgewählten Konzentration zugegeben und das Gemisch erneut 30 min inkubiert. Dann

so wurden 0,3 cm³ der DASP Antikaninchensuspension zugegeben und die Bestimmung weiter, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die Empfindlichkeit der Bestimmungsverfahren ist in der folgenden Tabelle angegeben:

Oestrogenmenge in ng/m\ die erforderlich ist, um die Hälfte des Oestradiol-HRP an der Bindung mit Antikörper zu hindern

	Antiscrum B₂-Il-BSA	gegen	E₂-H-BSA	E₂-H-HRI'
	Konjugat E₂-Il-HRI'	1-2-17-11RP	E₂-Il-IlRI'	7
Oestron	1000	7	3	7
Oestradiol	800	1.5	2	380
Oestriol	1000	230	14
E₁ = Oestradiol.

Ähnliche Ergebnisse wurden mit verschiedenen Antisera erhalten. Wenn nicht anders angegeben, wurde 0,1 m Phosphat mit einem pH-Wert von 6,0, enthaltend 0,1% Lactalbumin als Puffer verwendet.

Beispiel 2
Bestitr 'Hing von Oestrogen

A. Herstellung von Oestradiol! 7-succinyl-HRP,

Oestradiol-17-maleinylHRP,

Oestradiol-17-glutaryl-HRP und

Oestron-^-N-carboxymethyloxim-HRP

Diese Produkte wurden wie in Beispiel IA beschrieben hergestellt, wobei die Menge der Oestrogenderiva-

te entsprechend ihrem Molekulargewicht gewählt wurde und die Reaktion mit Oestron-17-0-(carboxymethyl)-oxim in einem Gemisch von Dimethylformamid/Wasser anstelle eines Gemisches von Dioxan/ Wasser durchgeführt wurde.

B. Bestimmung von Oestrogen

Die Bestimmung wurde wie in Beispiel ID durchgeführt unter Verwendung von zwei Antisera gegen Oestradiol-17-succinyl-BSA (s. Beispiele IB und C). Die Empfindlichkeit der Bestimmung ist in der folgenden Tabelle angegeben:

Konzentrationen von Oestron (E₁), Oestradio! (E;) und Ocstrio! (E;) in ng/cm³, die erforderlich sind, um die Hälfte des Oestradiol-HRP an der Bindung mit Antikörper zu hindern

Succinyl
Maleinyl
Glutaryl
Oxim

Beispiel 3
Bestimmung von Progesteron

A. Herstellung von
1 Ια-OH-progesteron-l l-succinylalkalischer

Phosphatase (AP) und
1 2λ-ΟΗ -progesteron-12-succinyl- A P

Diese Substanzen wurden analog den Oestrogenderivaten in Beispiel 1A hergestellt, wobei die Ausgangssubstanzen 55 mg Progesteron-Hemisuccinat und 125 mg AP waren.

Antiserum Kaninchen	A	E₃	Kaninchen	B	E,
Hupten E₁	E;	190	E,	E₂	300
4	6	ioO	12	9	100
3	4	150	3	3	300
4	5	150	8	6	50
2	2	1	0.8

ron-11-BSA oder Progesteron-12-AP mit Antiprogesteron-12-BSA 4- bis lOmal weniger empfindlich gegenüber Progesteron waren, als die Systeme Progesteronll-AP/Antiprogesteron-12-BSA und Progesteron-12-AP/Antiprogesteron-11-BSA.

Die in diesem Beispiel beschriebenen Reaktionen wurden durchgeführt in 0,01 m Veronalpuffer. pH 7,5, enthaltend 0.1% Lactalbumin, soweit nicht anders angegeben.

E Bestimmung von Progesteron

B. Herstellung von

1 lat-OH-progesteron-l 1-succinyl-BSA und
12«-OH-progesteron-12-succinyl-BS A

Diese Substanzen wurden analog den Oestrogen-Derivaten in Beispiel 1B hergestellt.

C. Herstellung von Antikörpern gegen

1 ΐΛ-OH-progesteron-l I-succinyl-BSA und

12«-OH-progesteron-l 2-succinyl-BSA

Diese Antikörper wurden entsprechend dem Schema des Beispiels IC hergestellt.

D. Bestimmung von Progesteron

Das angewandte Verfahren unterschied sich nicht wesentlich von dem für die Bestimmung von Oestradiol in Beispiel ID beschriebenen Verfahren. Die Enzymbestimmung fand folgendermaßen statt: 0,5 cm³ einer enzymhaltigen Probe wurden zugegeben zu 0,5 cm³ einer Substratlösung (0,01 m p-Nitrophenylphosphat in 0,1 m Carbonatpuffer mit einem pH-Wert von 2 und 0,007 m MgOj). Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37° C inkubiert und anschließend die Extinktion bei 400 nm gemessen.

Man sah, daß Bestimmungsssteme, bei denen Progesteron-11-AP kombiniert war mit Antiprogeste-Ähnliche Ergebnisse wie in Beispiel 3D beschrieben wurden mit dem folgenden Testsystem erhalten: 0,5 cm³ einer Progesteronlösung wurden mit 0,1 cm³ Antiserum in einer geeigneten Verdünnung 30 Minuten inkubiert und anschließend 0,1 cm³ Progesteron-AP in einer geeigneten Konzentration zugegeben und das Gemisch

so erneut 30 Minuten inkubiert Dann wurden 03 cm³ einer Norit-Suspension (25 mg/cm³), die vorher mit Dextran inkubiert und dann gewaschen worden war zugegeben und das Gemisch 15 Minuten zentrifugiert und die AP-Aktivität in der fiberstehenden Flüssigkeit wie in Beispiel 3 D beschrieben, bestimmt

Beispiel 4 Bestimmung von Folsäure

A. Herstellung von Folat MBSA

60

25 mg ^^φ) imid und anschließend 20 mg Folsäure wurden zu 50 mg methyliertem Rindersennnalbumin (MBSA) in 5 cm³ 0,05 m Phosphatpuffer, pH 7,0 gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden umgesetzt und anschließend ausgiebig gegen destilliertes Wasser dialysiert and dann tyopfaDisiert

B. Herstellung von Antisera gegen Folat MBSA

Bei diesem Verfahren wurde das Schema des Beispiels IC angewandt.

C. Herstellung von Folat-glukoseoxidase (FGO)

und Pteroylglukoseoxidase (PGO)

I mg Folsäure oder 0,7 mg Pterosäure wurden in 5 cm¹ 0,05 m Phosphatpuffer, pH 7, enthaltend 0,5 mg 1 -Cyclohexyl-3-(2-morpholino-äthyl)-carbodiimid gelöst. Nach 5 Minuten wurden 50 mg Glukoseoxydase in dem Gemisch gelöst und die Reaktion zwei Stunden fortgesetzt. Dann wurde die Lösung gegen 0,05 m Phosphatpuffer, pH 7,0, eine Zeit lang dialysiert.

D. Bestimmung von Folsäure

Das Bestimmungsverfahren war im wesentlichen das Gleiche wie im Beispiel ID beschrieben. Die Enzymbestimmung wurde folgendermaßen durchgeführt: 0,5 cm³ der enzymhaltigen Lösung wurden mit 2,5 cm³ der Substratlösung (50 mg Glukose, IQ^g Peroxidase und 1 mg 5-Aminosalicylsäure in 0,05 m Phosphatpuffer, pH 6,0) vermischt und anschließend 30 Minuten die Extinktion bei 450 nm gemessen. Das Testverfahren, bei dem Antikörper gegen Folat MBSA kombiniert wurden mit FGO erwies sich als 3- bis 20mal weniger empfindlich als dasjenige, bei dem die Antikörper kombiniert waren mit PGO. Der Unterschied in der Empfindlichkeit variiert für jedes einzelne Antiserum.

Beispiel 5 Bestimmung von Oestrogen

A. Herstellung von

1 l«-OH-oestran-l 1-succinyl-HRP,

1 l«-OH-oestron-l 1-glutamyl-HRP,

1 ΐΛ-OH-oestradiol-l 1-succinyl-HRP und

11*-OH-Oestradiol-ll-glutamyl-HRP

Diese Verbindungen wurden wie im Beispiel IA beschrieben hergestellt Die Menge der Oestrogenderivate, die verwendet wurde, wurde entsprechend dem Molekulargewicht gewählt

10

B. Bestimmung von Oestrogen

Die Bestimmung wurde mit den vier oben erwähnten E-HRP-Konjugaten durchgeführt, wobei das Antiserum ι gegen lia-OH-oestradiol-ll-succinyl-BSA, das unter Beispiel IB und IC beschrieben ist, verwendet wurde.

Die Empfindlichkeiten der Bestimmungen sind in der folgenden Tabelle angegeben:

κ, Oestrogenmcnge in ng/cm\ die erforderlich ist, um eine Bindung der Hälfte des Oestrogen-HRP an den Antikörper zu verhindern

K-HRP Konjugat

F.

V-,

Ej-ll-Succinyl-HRP >1000 >1000 E₂-ll-Glutanyl-HRP >1000 8

,„ Ep-11-Succinyl-HRP >1000 5

Ej-ll-Glutanyl-HRP 80 0,8

Beispiel 6 ,. Bestimmung von Oestrogen

A. Herstellung von Oestradiol-17-succinyl-HRP undOestriol-16,17-disuccinyl-HRP

Diese Verbindungen wurden wie in Beispiel IA

ίο beschrieben hergestellt, wobei das Molekulargewicht der jeweiligen Oestrogenderivate berücksichtigt wurde.

B. Herstellung von

Anti(oestradiol-17-succinyl-BSA)und Anti(oestriol-17,17-disuccinyl-BSA)

Diese Antisera wurden wie im Beispiel IA und IB angegeben hergestellt.

C. Oestrogenbestimmungen

Die vier möglichen Kombinationen von Oestrogen-HRP-Konjugat und Antisera wurden für Oestrogenbestimmungen, wie im Beispiel 1D beschrieben, verwendet.

Die Ergebnisse für zwei Antisera sind in der

5 folgenden Tabelle angegeben;

Oestrogenmenge in ng/m\ die erforderlich ist, um die Hälfte des Oestrogen-HRPan der Bindung mit dem Antikörper zu hindern

Antiserum gegen E₂-H-BSA E3-I6, 17-BSA

Konjugat

E₂-P-HRP E3-1.6, 17-HRP E2-I7-HRP

E₃-16,17-HRP

Oestron

Oestradiol

Oestriol

>300 >300 >300

6 16 70

30

100

100 150 300

Beispiel 7 Bestimmung von Morphin

A. Herstellung von Codein-e-succinyi-HRP

Nach dem in Beispiel IA beschriebenen Verfahren wurde Codein-6-hemisuccinat in Codein-6-succinyi-HRP umgewandelt.

B. Herstellung von Morphin-3,6-diglutaryl-BSA

und Herstellung eines Antiserums

gegen dieses Produkt

Nach dem in Beispiel IB beschriebenen Verfahren wurde Morphin-3,6-dihemiglutarat umgewandelt in Morphin-3,6-diglutaryl-BSA und das Antiserum gegen dieses Produkt wie unter IC beschrieben, hergestellt

it

C. Bestimmung von Morphin

Nach dem in Beisiel ID beschriebenen Verfahren wurde die Menge Morphin in einer Probe bestimmt, indem die flüssige und feste Phase unter Verwendung von DASP-Antikaninchenserum getrennt wurden.

10 ng/cm³ Morphin waren für eine 50%ige Hemmung der Bindung von Codein-6-succinyl-HRP an Antiserum gegen Morphin-3,6-diglutaryl-BSA erforderlich.

Beispiel 8
Bestimmung von Testosteron

A. Herstellung von

1 ΐΛ-OH-Testosteron-l 1-succinyl-HRP,
lla-OH-Dihydrotestosteron-11-succinyl-HRP
undl l«-OH-nortestosteron-l1-succinyl-HRP

Diese Verbindungen wurden nach den für die Oestrogene in Beispiel IA beschriebenen Verfahren hergestellt.

B. Herstellung von
Anti(1 !«-OH-testosteron-ll-succinyl-BSA)

Dieses Antiserum wurde wie im Beisiel IB und C für Oestrogenantisera beschrieben hergestellt.

C. Testosteronbestimmung

Testosteron wurde nach dem für Oestrogene in Beispiel 1D beschriebenen Verfahren bestimmt.

Unter Verwendung von Testosteron-HRP waren 30 ng/cm³ Testosteron für eine 50%ige Hemmung der Bindung des Konjugais an Antiserum erforderlich. Unter Verwendung des gleichen Antiserums und Dihydrotestosteron-HRP waren jedoch 5 ng/cm³ Testosteron ausreichend, um die gleiche Reaktion zu erzielen. Nortestosteron-HRP war von mittlerer Empfindlichkeit und es waren 15 ng/cm³ Testosteron für eine 50%ige Hemmung der Bindung an die Antikörper erforderlich.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Haptenen, bei dem man eine flüssige Probe mit vorher bestimmten Mengen eines Hapten-Enzym-Konjugsts und eines spezifisch bindenden Proteins für das Hapten und Hapten-Enzym-Konjugat zusammenbringt, das an das Protein gebundene Enzym-Konjugat von dem nicht gebundenen Konjugat abtrennnt und die Enzymaktivität in einer der beiden Fraktionen mißt, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Hapten-Enzym-Konjugat verwendet, bei dem sich die Kupplung zwischen dem Enzym und Hapten unterscheidet von der Kupplung in dem Produkt Hapten-hochmolekulare Substanz, das zur Entwicklung des spezifisch bindenden Proteins verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trennung zwischen dem an Protein gebundenen und nicht gebundenen Hapten-Enzym-Konjugat durchführt, indem man die zu analysierende Probe mit einem unlöslich gemachten bindenden Protein zusammenbringt, das für das Protein spezifisch ist, das zur Bindung des Haptens und Hapten-Enzym-Konjugats verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hapten ein östrogenderivat verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hepten Progesteron oder Folsäure verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das spezifische bindende Protein für das Hapten und Hapten-Enzym-Konjugat in unlöslich gemachter Form verwendet