DE2402809C2 - Verfahren zur Herstellung eines mit Bromcyan aktivierten, trockenen hydrophilen polymeren Trägers für biologisch wirksame Verbindungen - Google Patents

Description

Die Umsetzung von Bromcyan gehört zu den «> beliebten Aktivierungsmethoden der üblichen Träger für biologisch aktive Verbindungen, die in der Affinitätschromatographie oder als Katalysatoren angewandt werden. Dieses von Axen und Mitarbeitern ausgearbeitete Verfahren (Nature, 214, 1302-1304, r> (1967); 215. 1491-1492 (1967)) hat sich besonders bei Trägern, wie aus Polysacchariden bestehen, sehr gut bewährt. Nach diesem Verfahren läßt man Bromcyan mit Agarose-Gel in alkalischem Milieu reagieren. Nach beendeter Reaktion muß man die Suspension des aktivierten Gels rasch auswaschen und dann sofort mit der Lösung der biologisch aktiven Verbindung (dem Affinant) verrühren. Die Waschoperation und das Verrühren mit dem Affinat dürfen nicht länger als 90Sekunden dauern. Diese Forderung stellt natürlich ·>> hohe Ansprüche an die Erfahrung und die technische Geschicklichkeit der die Reaktion ausführenden Fachkräfte.

Die mit der notwendigen Aktivierung des Gels unmittelbar vor der Bindung der biologisch aktiven '> <> Substanz verbundenen Komplikationen werden durch die Erzeugung eines trockenen aktivierten Agarose-Gel*: beseitigt, mit dem die Arbeit bequemer ist.

Die Nachteile der Polysaccharid-Träger bei der Affinitätschromatographie, d. i. die niedrige mechani- >5 sehe Stabilität und geringe hydrolytische Beständigkeit, die leichte Anfälligkeit durch Mikroorganismen, die für bestimmte Anwendungen unzureichende Porosität, die in bestimmten Fällen auftretende unspezifische Sorption und schließlich der hohe Preis können durch das &o den Gegenstand dieser Erfindung bildende Verfahren zur Herstellung eines mit Bromcyan aktivierten, trockenen makroporösen Trägers überwunden werden.

Der Vergleich der mechanischen Stabilität des homogenen und des makroporösen Gels in Berührung t>5 mit einem Lösungsmittel spricht eindeutig zugunsten des makroporösen Materials mit einer starren inneren Struktur. Diese Eigenschaft gewinnt enorme Bedeutung insbesondere bei der technologischen Anwendung unter Heranziehung einer größeren Materialmenge in einer größeren dimensionierten Apparatur. Die chemische Beständigkeit des aktivierten Materials kann man bekanntlich durch Fixierung reaktiver Gruppen an der festen Oberfläche wesentlich steigern. Es ist also nicht überraschend, daß das mit Bromcyan aktivierte makroporöse Gel auch nach sehr langer Zeit aktiv ist, und dies auch ohne Anwendung stabilisierender Zusätze, die bei der Aktivierung und Lagerung der homogenen Materialien unentbehrlich sind. Es entfällt auch das bei den homogenen Gelen unerläßliche Auswaschen des Stabilisators vor der Bindung der biologisch aktiven Substanz. Wenn eine besonders hohe Lagerbeständigkeit gefordert wird, kann man durch Stabilisierung des makroporösen Gels eine fast vollständige Unterdrückung der desaktivi-renden Reaktionen erreichen.

Bei der Hersteilung des trockenen aktiven Gels für die Affinantbildung spielt auch der Kostenaufwand für seine Trocknung eine erhebliche Roiie. Evident ist die leichte Trocknung des nichtquellenden starren polymeren Gerüstes des makroporösen Gels gegenüber dem stark gequollenem homogenen Material sowohl hinsichtlich der Trocknungszeit als auch der zu entfernenden Wassermenge. Angesichts der geringen thermischen Stabilität der aktiven funktioneilen Gruppen am Gel muß man bei der Trocknung eine sehr delikate Technologie heranziehen unter Anwendung einer niedrigen Temperatur. In Betracht kommen nur erheblich aufwendige Trocknungstechnologien, wie die Lyophilisierung, d. i. Abdünsten des Wassers im Vakuum bei einer Temperatur unterhalb des Schmelzpunktes oder die Dehydratisierung mit Lösungsmitteln.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung eines mit Bromcyan aktivierten, trockenen hydrophilen polymeren Trägers, der sich außerordentlich gut zur Bindung von biologisch wirksamen Verbindungen eignet, deren Molekül eine oder mehrere primäre Aminogruppen enthält.

Gegenstand der Erfindung ist das Verfahren der Ansprüche I und 2.

Das für die Aktivierung angewandte Gel muß neben der makroporösen Struktur in hinreichender Menge freie Hydroxylgruppen enthalten, die mit Bromcyan reagieren können. Deshalb wurden die nach der britischen Patentschrift 13 70 477 durch Suspensionscopolymerisation von Hydroxyalkylacrylaten oder -methacrylaten mit vernetzenden Convnomeren aus der Gruppe Acrylate oder Methacrylate zwei- oder mehrwertiger Alkohole, die zwei oder mehrere Acryl- oder Methacrylgruppen im Molekül enthalten, Bisacrylamide oder Divinylbenzol bereitete Gele gewählt.

Die biologische Aktivität der durch Bindung der biologisch aktiven Verbindungen bereiteten Substanzen wurde in der üblichen Weise bestimmt.

Die Erfindung wird durch nachstehende Beispiele näher erläutert.

Beispiel I

5 Gewichtsteile des durch Fällungs-Suspensionscopolymerisation von 2-Hydroxyäthylmethacrylat mit Äthylenglykoldimethacrylat (3 :2) in Gegenwart eines 9 : 1 Cyclohexanol-Dodecylalkohol-Lösungsmittelgemisches bereiteten hydrophilen makroporösen Gels der Molekular-Gewichts-Ausschlußgrenze 300 000 wurden in destilliertem Wasser gleichgewichtsgequollen. Das gequollene Gel wurde dann mit dem gleichen Volumen Wasser

A) Die erste Hälfte — die Fraktion Α— wurde sofort in 10 ml 0,In-NaHCO₃, pH 9, verrührt und die Suspension mit 1 g Chymotrypsin versetzt. Sodann wurde die Suspension bei 4° C 24 Stunden mit einem Magnetrührer gerührt. Hierauf wurde das Gel aufeinanderfolgend mit den folgenden Puffern gewaschen: O.lm-Natriumborat und 0,Im-NaCl (pH 8,5); 0,1 m-Natriumacetat und 1 m-NaCI (pH 4,1); 0,01 m-Natriumacetat (pH 4,1). Bei der Aktivierung von mehr als 10 ml Gel wurde die Waschoperation an einer Säule einer entsprechenden Dimension vorgenommen, wobei man die Durchflußgeschwindigkeit auf 8 ml/h einsiellte.

Mit dem ersten Puffer wurde die Gelsäule 48 Stunden und mit den beiden weiteren Puffern jeweils 24 Stunden ausgewaschen. Bei der Aktivierung von weniger als 10 ml gequollenem Gel wurde die Waschoperation auf einem Filter mit Glasfritte durchgeführt Das Volumen des ersten Puffers entsprach <ism vierzigfachen Gelvolumen in gequollenem Zustand und die Volumina der beiden weiteren Puffer jeweils dem dreißigfachen Gelvolumen. Das in dieser Weise bereitete Gel wurde für die Affinitälschromatographie verwendet und seine proteolytische und Esterase-Aktivität durch Analyse bestimmt. Die Kapazität betrug 12.2 mg Chymotrypsin/ml gequollenes Gel.

Erfindungsgemäßes Verfahren

verrührt, das Gefäß mit der Suspension mit einem Magnetrührer versahen und in die Suspension eine Glaselektrode getaucht. Nun wurde ^ie Suspension mit Gewichteilen lOproz. wäßriger Bromcyanlösung versetzt. Die Bromcyanlösung 'wurdr: einige Minuten vor Durchführung der Reaktion jeweils frisch bereitet. Sofort nach dem Zusatz des Bromcyans wurde die Suspension mit 4n-NaOH auf pH 11 eingestellt und unter stetigem Rühren durch Zutropfen von 4n-NaOH der pH 12 Minuten bei diesem Wert gehalten. Dann wurde die Suspension am Glasfilter mit dem zwanzigfachen Volumen gekühltem 0,1 m-NaHCOj, pH 9, bezogen auf das Volumen des ursprünglichen gequollenen Gels, ausgewaschen. Die Waschoperation dauerte maximal zwei Minuten. Nach dem Waschen und Absaugen wurde das aktivierte Gel in zwei als Fraktionen Λ und B bezeichnete Hälften geteilt.

Vergleich

B) Die zweite Hälfte des mit Bromcyan aktivierten Gels — die Fraktion B — wurde bei Raumtemperatur mit wäßrigem Äthanol von steigender Konzentration (50%, 60%, 70%, 80% und 90%) verrührt und die wäßrige Äthanollösung jeweils durch Zentrifugieren vom Gel entfernt, im letzten Dehydratisierungsstadium wurde das Gel mit absolutem Äthanol verrührt, abzentrifugiert und im Vakuumexsiccator bei Raumtemperatur getrocknet (die Trocknung dauerte ca. 24 Stundend Die Aktivität des so getrockneten Gels betrug 70% der Aktivität der Fraktion A. Nach 6 Wochen langer Lagerung bei 4°C wurde das Gel in 0,In-NaHCO₁ gequollen und dann mittels des gleichen Verfahrens wie in Abschnitt A die Bindung des Chymotrypsin bewerkstelligt. Die Kapazität des Gels betrug 6,6 mg Chymotrypsin/ml gequollenes Gel. Die proteolytische Aktivität, ausgedrückt in A_2m pro mg gebundenes Chymotrypsin, betrug bei den beiden Fraktionen gleichermaßen 0,038/min.mg.

Beispiel 2

Das hydrophile makroporöse Gel wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 aktiviert. Nach dem Waschen und Absaugen wurde das Gel mit einer Lösung von Gewichtsteilen Dextran vom Molekulargewicht 000 und 5 Gewichtsteilen Lactose in 100 Gewichtsteilen Wasser verrührt, abzenirifugiert und lyophilisicrt. Das trockene lyophilisierte Gel hatte nach der Reaktion mit Chymotrypsin eine Kapazität von ι 1,8 mg Chymotrypsin/ml Gel. wobei der in Beispiel 1 beschriebenen Reaktion des aktivierten Gels mit Chymotrypsin Waschen mit 50 Gewichtsteilen 0,Im-NaHCOj voranging.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines mit Bromcyan aktivierten, trockenen hydrophilen polymeren Trägers für biologisch wirksame Verbindungen, da- > durch gekennzeichnet, daß man ein durch Suspensionscopolymerisation von Hydroxyalkylnsethacrylaten oder -acrylaten mit vernetzenden Comonomeren, die zur Copolymerisation mit diesen Hydroxyalkylestern fähig sind aus der Gruppe m Acrylate oder Methacrylate zwei- oder mehrwertiger Alkohole, deren Molekül zwei oder mehrere Acryl- oder Methacrylgruppen enthält, Bisacrylamide oder Divinylbenzol, bereitete Hydroxylgruppen enthaltendes, hydrophiles makroporöses Gel in an ι > sich bekannter Weise mit Bromcyan aktiviert und das aktivierte Gel durch Dehydratisierung mit organischen Lösungsmitteln und anschließendem Abdünsten dieser Lösungsmittel oder durch Lyophilisierung von Wasser befreit. -<>

2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Stabilisierung des mit Bromcyan aktivierten Gels bei der Lyophilisierung ein Polysaccharid und einen Zucker, wie Dextran und Lactose, zusetzt. ->