DE2405353C3

DE2405353C3 - Verfahren zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose

Info

Publication number: DE2405353C3
Application number: DE2405353A
Authority: DE
Inventors: Ralph Allan Horseheads N.Y. Messing (V.St.A.)
Original assignee: Corning Glass Works
Current assignee: Corning Glass Works
Priority date: 1973-02-16
Filing date: 1974-02-05
Publication date: 1978-09-28
Also published as: HU168190B; BR7401017D0; JPS49110889A; GB1440703A; JPS5649558B2; US3868304A; DE2405353A1; BE810254A; ES422764A1; DE2405353B2; NL180444C; IT1004988B; CH584753A5; NL7402121A; AU477084B2; PH10242A; FR2218385B1; AU6558374A; FR2218385A1; AR197546A1

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose durch Einwirkung immobilisierter Glucose-Isomerase auf eine Glucose enthaltende, schwach alkalisch gehaltene wäßrige Lösung bei erhöhter Temperatur.

Fructose hat bekanntlich die doppelte Süßwirkung von Glucose; so kann daher zum Süßen unter Halbierung der Kalorienzufuhr verwendet werden, Ihrer Herstellung kommt somit große Bedeutung zu. Die Umwandlung kann durch Einwirkung von Enzymen erfolgen, die wegen ihrer spezifischen Wirkung ohne Rücksicht auf ihre Herkunft als Glucose-Isomerase bezeichnet werden. 3>

Die rationelle Herstellung auf enzymatischem Wege erfordert eine wiederholte Verwendung des vergleichsweise teuren Enzyms. Die Glucose-Isomerase muß daher in fixierter oder immobilisierter Form in oder auf einem geeigneten, die Umsetzung nicht störenden oder erschwerenden Träger eingesetzt werden können.

Nach einem bekannten Verfahren soll die unter Einhaltung gewisser Bedingungen als möglich erkannte Fixierung der Glucose-Isomerase in lebenden Zellen das Enzym immobilisieren und die wiederholte Verwendung gestatten, ohne das Enzym aus den Zellen herauszulösen. Durch Wärmebehandlung der Zellen bei mäßig erhöhter Temperatur (etwa 65°C) wurde das Enzym soweit fixiert, daß es mehrmals, t. B. siebenmal oder im Durchlauf mehrere Tage, z.B. 15Tage, verwendet werden konnte, s. D. Perlman (Herausgeber), Fermentation Advances. Academic Press, New York, 1969. S. 561 -589, vgl. insbesondere Seite 568 Mitte bis S. 570. letzter Absatz.

In ähnlicher Weise wird nach der US-PS 36 94 J14 intracelluiar fixierte Glucose-Isomerase eingesetzt. Die Fixierung erfolgt hier in den Zellen bestimmter Mikroorganismen durch Behandlung zur Hemmung der Extraktion des Enzyms durch die für die Umwandlung von Glucose in Fructose einzusetzenden Lösungen. e>o Hierdurch soll eine Enzymstabilität von mindestens 50Std. mit einer 54%igen GIucosc-Fructose-Umwandlung erzielt werden.

Da die Behandlung von /eilen lebender Organismen eine gewisse Aufwendigkeit der Herstellung, Lagerung tr, und Verwendung mit sich bringt, wurde auch bereits so vorgegangen, das Iji/vni an polymere Träger, insbeson ilere basische Aiiioiienaustaiischer-Cellulosen /u binden. US-PS 37 08 397. Der erhaltene Enzymkomplex soll hiernach soweit beständig sein, daß die Aktivitätsverluste nach jeder Umwandlung etwa 10—15% betragen, aaO, Sp. 7, Z. 37-40.

Auch diese Immobilisierung durch Bindung an einen Träger erfordert organische Stoffe, die für den Einsatz der Herstellung in größerem Umfang eine Reihe von Nachteilen mit sich bringen, wie z. B. die Anfälligkeit durch Mikrobenbefall und dadurch bedingte Verluste, Schwierigkeiten in der Aufbewahrung bzw. Lagerung, sowie eine gewisse Wärmeempfindlichkeit. Besonders nachteilig ist ferner die unzureichende Abmessungsbeständigkeit infolge von Quellung. Die Abmessungen der Enzymkomplexe verändern sich hierbei in unkontrollierbarer Weise, so daß der Durchsatz in den für die Massenherstellung erforderlichen Durchlaufkolonnen schwankt. Diese können u. U. sogar verstopft werden.

Auch die Beständigkeit, insbesondere die Wärmebeständigkeit, sollte für eine rationelle Fertigung im Sinne verlängerter Halbwertszeiten noch weiter verbessert werden. Das Gleiche gilt für die Dauer der Lagerungsbeständigkeit.

Die Erfindung hat demgegenüber ein Verfahren zur enzymatischen Umwandlung von Glucose zu Fructose zur Aufgabe, welches die aufgezeigten Nachteile organischer Stoffe vermeidet, eine verbesserte Wärmebeständigkeit, größere Halbwertszeiten der enzymatischen Aktivität und längere Lagerungsfälligkeit aufweist.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren der Erfindung dadurch gelöst, daß man in den Poren eines Aluminiumoxidträgers mit Porendurchmessern von 100— 1000 Ä adsorbierte Glucose-Isomerase einsetzt.

Nach weiterer günstiger, insbesondere für den Einsatz in Durchlaufkolonnen in kontinuierlicher Arbeitsweise geeigneter Ausgestaltung dieses Verfahrens werden Aluminiumoxidpartikel mit Korngrößen von 0,074 —4J6 mm als Träger für das Enzym verwendet. Ganz besonders günstig sind Aluminiumoxidträger mit Porendurchmessern von 140—220 Ä und Korngrößen von 0,25—0,71 mm.

Im Zusammenhang nichtenzymatischer Glucoseumwandlungsverfahren wird bereits der Einsatz von feinverteiltem alkalischem Aluminiumoxid vorgeschlagen, US-PS 34 31 253. Das Aluminiumoxid dient hier nicht als Enzymträger, sondern soll die Nachteile der alkalischen Isomerisierungsverfahren teilweise beheben, wie z. B. die Entstehung schwer trennbarer unerwünschter Nebenprodukte, Einfärbungen, Säuren, usw. Die lange erforderliche Verweilzeit der Glucose schließt aber die kontinuierliche Herstellung im Durchlauf aus, und die Umwandlungsrate bleibt im Vergleich zur Umwandlung durch Enzymeinwirkung unbefriedigend.

Im Vergleich zu den bekannten, oben erörterten Verfahren der enzymatischen Umwandlung, insbesondere z. B. dem Verfahren nach der US-PS 37 08 397 unter Verwendung an Celluloseträger gebundener Glucose-Isomerase mit einer Beständigkeit im Sinne einer Halbwertzeit von etwa 20 Std. werden durch das erlindungsgemäße Verfahren Halbwertzeiten von 17, 20, 40 und mehr Tagen erreicht. Selbst nach beispielsweise 31 Tagen kontinuierlichem Betrieb konnten Akti% itätsausbeuten von 19,4% erzielt werden. Hs entfielen im übrigen die Geiahren des Mikrobenbel'alls und der unerwünschten Quellung organischer Träger und das Produkt war monatelang lagerfähig.

Der poröse Ahiiiiinkumuidträger für die Glucose-

Isomerase muß eine durchschnittliche Porengröße von 100—1000 Ä besitzen, um eine maximale Enzymbeschickung ?u gewährleisten. Die untere Grenze von lOOÄ richtet sich nach der größten Abmessung des annähernd 100 Ä betragenden Glucose-Isomerase-Mo- -, leküls. Das Molekül muß in die Poren eindringen können und vor Adsorption auf den inneren Flächen des porösen Trägers muß eine Massendiffusion des Enzyms tief in die Poren stattfinden. Da Glucose-Isomerase ein längliches Molekül ist, müssen die Poren dieser größten Ausdehnung mindestens gleichkommen.

Die Notwendigkeit der oberen Grenze von lOOOÄ ergibt sich aus mehreren Gesichtspunkten. Bei größerer Porenweite nimmt die verfügbare Adsorptionsflcche ab. Außerdem bietet die Innenstruktur der Poren weniger i-j Schutz gegen Ablösung des Enzyms, besonders unter turbulenten Bedingungen, z. B. bei kontinuierlicher Arbeitsweise im Durchlauf. Die für die Enzymbesetzung verfügbare Oberfläche des Trägers soll in der Regel größer als 5 qm/g sein. Die bevorzugte durchschnittliehe Porengröße liegt etwa zwischen 140 und 220 Ä. Die physikalischen Eigenschaften des bevorzugten Trägers sind weiter unten näher angegeben. Es kann u. U. notwendig sein, das poröse Aluminiumoxid auf eine mit dem Umsetzungsgefäß vereinbare Korngröße zu 2; zerkleinern.

Bei Verwendung einer Durchlaufkolonne ist die bevorzugte Partikelgröße des Trägers etwa 0,074 — 4,76 mm. Größere Partikel brauchen eine sehr lange Zeit zur Enzymdiffusion, eine größere Verweildauer des j< > Substrats, erschweren die Substratdiffusion und machen den Umwandlungsprozeß weitgehend unwirtschaftlich. Kleinere Partikel sind schwierig in der Handhabung, führen zu dichter Packung in der Kolonne und damit einem sehr starken, verstärkte Auslegung der Ausrü- r> stung erfordernden Druckabfall. Ein besonders bevorzugter Bereich liegt zwischen etwa 0,25—0,71 mm.

Das poröse Aluminiumoxid wird auf die gewünschte Korngröße gemahlen und klassiert, sodann mit einem geeigneten Puffer oder Salz hydratisiert. Hydratation -κι bei einem pH von 7 wird für den Aluminiumoxidträger bevorzugt. Der Puffer wird dann entfernt, das Aluminiumoxid aber vor der Adsorption naß gehalten. Nunmehr wird die Glucose-Isomerase in Lösungsform zu dem nassen Träger gegeben, und zwar mit einer die 4 j optimale Adsorption bzw. Beschickung gewährleistenden Konzentration pro Gewichtseinheit Träger. Die Adsorption wird durch Rühren, Umlauf, Umdrehen, Anwendung eines fluiden Betts oder andere bekannte, die Massendiffusion des Enzyms durch die Poren >o fördernde Weise verbessert. Die zur Adsorption erforderliche Zeitdauer hängt von der Partikelgröße des Trägers, der Größe des Enzyms im Verhältnis zur durchschnittlichen Porengröße und weiteren Faktoren wie Temperatur und pH-Wert ab. Die Mindestzeitdauer r> beträgt etwa V₂ Std. Für die Adsorption von Glucose-Isomerase in den Poren von Aluminiumoxid mit einer durchschnittlichen Porengröße von etwa 175 Ä erzielt man in 1 V₂ bis 5 oder 6 Std. die maximale Adsorption. Sie geht im Bereich von pH. 6.9—9 gut vonstatten, t,o bevorzugt wird der Bereich 7,1 —8,5.

Nach der Adsorption wird loses Enzym mit Wasser, Salzlösung (z. B. 0,5 M NaCI) oder anderen geeigneten, den Träger oder das gebundene Enzym nicht beeinträchtigenden Mitteln entfernt. hi

Bei der Verwendung wird das Enzympräparat beispielsweise in eine Kolonne gegeben oder in ein kontinuierlich gerührtes Umsetzungsgefäß, ein Unities Bett oder anderes für die Einleitung der .Substratlösung geeignetes Gefäß gebracht. In den Beispielen weiter unten wurde das Präparat in Kolonnen mit kontinuierlichem Durchlauf von glucosehaltigen Lösungen gegeben. Die Kolonnen können mit einem wassergekühlten Mantel umgeben sein, um die optimale Umsetzungstemperatur oder eine die Enzymlebensdauer möglichst weit verlängernde Temperatur aufrechtzuerhalten. Eine Behandlungstemperatur von 50—70°, vorzugsweise 60°, sichert nicht nur eine rationelle Glucoseumwandlung zu Fructose, sondern gewährleistet auch eine lange enzymatische Halbwertzeit. Vorzugsweise enthält die Substratlösung wenigstens etwa 45 Gew.-% Glucose.

Der Inkubations-pH-Wert und das Puffersystem hängen vom Enzym und den Umsetzungsbedingungen ab. Für die erfindungsgemäßen Präparate geht die Umsetzung bei einem pH-Wert von 7,2—8,2 gut vonstatten. Besonders günstig sind 7,4—7,8 pH. Die Art des im Einzelfall verwendeten Puffers richtet sich weitgehend nach dem Säuregehalt der Substratlösung, und der inneren Beschaffenheit der Poren.

Wird z. B. eine glucosehaltige Lösung (z. B. 50% Glucose) mit dem Glucose-lsomerasepräparat inkubiert, so können, wie aus P e r I m a η, aaO., S. 566 und 568 bekannt, kleine Mengen von Cobalt- und Magnesiumionen dem Substrat vor Zusatz zum Enzympräparat beigegeben werden, wodurch sich aber infolge der Säurewirkung dieser Ionen der Säuregehalt ändert. Geeignete Puffer sind hier z. B. Sulfitsalze, die gleichzeitig auch die Beständigkeit des Präparats verbessern. Die Auswahl der in Frage kommenden Puffer liegt im Einzelfall im Bereich des fachmännischen Könnens.

In den folgenden Beispielen I —X wurden Präparate aus verschiedenen Glucose-isomerasequellen hergestellt und die langfristige Beständigkeit und Halbwertzeit bestimmt. Die Präparate wurden unter den für Glucose-Isomerase in abschnittsweisen Umsetzungen üblichen Bedingungen geprüft. Die angegebenen Werte sind in internationalen Glucose-Isomeraseeinheiten ausgedrückt (IGIE). in denen eine Einheit die zur Umwandlung von I μΜο! Glucose in Fructose pro Min. bei 60° und pH 6,85 nötige Enzymmenge darstellt.

Die folgenden Beispiele zeigen eine im Vergleich zu den aufgezeigten bekannten Verfahren der enzymatischen Glucose-Fructose Umwandlung überraschend große Lagerbeständigkeit und Beständigkeit im Sinne langer Halbwertszeiten und lange Brauchbarkeit bei langwährendem kontinuierlichen Betrieb. So war die Enzymaktivität im Beispiel I noch nach 106 Tagen Lagerung kaum vermindert. Nach 31 Tagen kontinuierlichem Kolonnenbetrieb war eine gute Aktivitälsausbeute und eine Halbwertzeit von 42 Tagen festzustellen. Beispiel II. Weitere Versuche nach den Beispielen Hl-X ergaben zum Teil noch höhere Halbwertzeiten von 47 und 49 Tagen.

Erhebliche Verbesserungen konnten auch gegenüber den mit porösen Glasträgern gokopelten Glucose-Isomerasepräparaten nach der US-PS 37 83 101 (Beispiel Xl) erzielt werden.

Schließlich konnte durch das Beispiel XII auch nachgewiesen werden, daß die erfindungsgemäß erzielten Verbesserungen ein überraschender Effekt der vorgeschlagenen in den 100— 1000 Ä großen Poren des Aluminiumoxid trägers adsorbierten Glucose-Isomerase sind. Wie ein Vergleich der Beispiele I —X mit den Ergebnissen der bekannten enzymatischcn Verfahren /eigt, u 11 ti dies weder durch das Enzym als Solches.

noch, wie das Beispiel XII zeigt, durch Aluminiumoxidpartikel als Solche erreicht. Das vorgeschlagene Verfahren zeitigl also synergistisch eine echt überraschende und überragende Wirkung.

Poröser Aluminiumoxidlräger der 3eispielc

Porengröße, Durchschnitt (Ä) 175 Porengröße, Minimum (A) 140 Porengröße, Maximum (A) 220 Oberfläche in qm/g 100 Porenvolumen in ccm/g 0,6

Porösität 62.5%

Parlikelgröße in mm 0,25—0.71

Die Porengrößenverteilung wurde in bekannter Weise gemessen; sie entsprach weilgehend der durchschnittlichen Porengröße (d.h. 90% innerhalb ±26% 175 Ä).

Beispiel 1

Ein aus 444 JGIE/g bestehendes, aus Streptomyces-Organismen gewonnenes rohes Glucose-lsomerasepräparat wurde in einer Menge von 5 g 28,7 ml 0.1 M Magnesiumazetatlösung in einem 25 ml Becher zugesetzt. Die Aufschlämmung wurde 25 Min. bei Zimmertemperatur gerührt und dann durch Filterpapier filtriert. Der Rückstand wurde mit 14,3 ml 0,1 M Magnesiumazetat, dann mit 14 ml 0,5 M NaHCOj und zulei /t mit 4,3 ml 0.5 M NaHCOs versetzt und die Lösung unmittelbar auf dem ursprünglichen Enzymfilter aufgefangen. Ihr Gesamtvolumen (Filtrat) betrug 50 ml.

500 mg poröse Aluminiumoxidkörper wurden in eine 50 ml Kugelflasche gegeben und 10 ml der Glucose-Isomeraselösung zugesetzt. Die Flasche wurde an einem Rotationsverdampfer befestigt, ein Vakuum angelegt und die Flasche in einem auf 30—45° gehaltenen Bad 25 Min. rotiert. Weitere 10 ml Glucose-lsomcrasclösung wurden in die Flasche gegeben und die Verdampfung unter denselben Bedingungen während der nächsten 35 Min. fortgesetzt. Zusatz und Verdampfung wurden unter gleichen Bedingungen 4 Std. fortgesetzt. Das gleiche Verfahren wurde zweimal mit getrennten 10 ml Glucose-Isomeraselösungen wiederholt. Ein abschließender Teil von 7 ml Glucose-Isomerase wurde dann eingeführt und die Verdampfung bei 45° für weitere 70 Min. fortgesetzt. Die Flasche wurde dann übers Wochenende in einen kalten Raum gebracht. Insgesamt wurden 47 ml Glucose-Isomeraselösung dem Aluminiumoxid zugesetzt.

50 ml Puffer (0,01 M Natriummaleat, pH 6,8-6,9, enthaltend 0,001 M Cobaltchlorid und 0,005 M Magnesiumsulfat) wurden zugesetzt und die gesamte Probe 1 Std. bei Zimmertemperatur extrahiert. Der Extrakt in einer Menge von 50 ml wurde aufbewahrt. Das Präparat wurde mit 200 ml Wasser und anschließend 10 ml 0,5 M Natriumchlorid und zuletzt über einem Giasfrittentrichter mit Wasser gereinigt. Das Präparat wurde dann in einen 50-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und im Puffer bei Zimmertemperatur gelagert. Während eines Zeitraums von 106 Tagen wurden wiederholt Proben zur Prüfung entnommen.

Ergebnisse

En/ymcxtraklprüfung (50 ml) - 39.8 IGIi-VmI. (Enzymaklivitätsausbeule im Extrakt — 90"/»). Durchschnittswert der Präparate — 130 IGIE pro 300 mg Probe (En/ymaktivitälsausbeuie — 6%). Durchschnittliche Beschickung — 260IGIIVg.

Zur Prüfung der Lagerbestiindigkeit während des

Zeitraums von 106 Tagen wurden 21 periodische Proben entnommen, von denen 16 eine Aktivität von 100-150 IG IE pro 500 mg oder 200-300 IGl E/g

"· zeigten.

Beispiel Il

Zur Prüfung der langfristigen Stabilität und Halbwertzeit des Enzympräparat wurde eine weitere Probe in für eine Durchlaufkolonne mit Glucoselösungsdurchsatz entsprechend industriellen Einsatzbedingungen bereitet. Die obigen Aluminiumoxidkörper (175 Ä durchschnittliche Porengröße, 0,25—0.71 mm Partikelgröße) wurden folgendermaßen vorbehandelt: 11g poröses Aluminiumoxid wurden in einen 100 ml Zylinder gegeben, 100 ml 0.05 M Magncsiuniazelat. 0,1 M Cobültazeiai. pH 7.5 zugesetzt, der Zylinder verstöpselt, behutsam durch Umdrehen gemischt und in ein 60^c warmes Bad gelegt. Nach 15 Min. wurde der :o Zylinder umgedreht und die Flüssigkeit abgegossen. 100 ml frisches Magnesium-Cobaltazetat wurden zugesetzt, der Zylinder umgedreht und bei Zimmertemperatur 2 Std. stehen gelassen.

Eine rohe Glucose-Isomeraselösung aus der gleichen Quelle wie zuvor, enthaltend 590 IGlE pro ml in 0,6 M gesättigtem Ammoniumsulfat wurde für die Umsetzung wie folgt gereinigt:

Einer 40 ml Glucose-Isomeraselösung in einem Becherglas wurden zur Enzymausfällung weitere 1,4 g in Ammoniumsulfat zugesetzt und die Ausfällung bei Zimmertemperatur 20 Min. lang gerührt. Die Probe wurde dann bei 2° 30 Min. mit 16 000UpM zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit abgegossen und weggeworfen. 12 ml der oben beschriebenen Magnesii-i um-Cobaltazetatlösung wurden der Ausfällung zugesetzt und gerührt. Sodann wurden 3 ml 0.5 M Nalriumbicarbonat zugesetzt und zur Auflösung des Enzyms gerührt. Die Lösung wurde nun in ein 60° warmes Bad gesetzt und 15 Min. belassen, anschließend 15 Min. bei 2° mit 16 000 UpM zentrifugiert. Die klare, überstehende Enzymlösung wurde abgegossen und die Ausfällung weggeworfen. Die Enzymlösung in einer Menge von 28 ml hatte einen pH-Wert von 7.5. Falls während der Reinigung keine Aktivität verloren ging, enthielt die 5 Lösung 23 600 IGIE.

Die Magnesium-Cobaltazetatlösung wurde nach Umdrehen von den porösen Aluminiumoxidkörpern abgegossen. 28 ml Enzymlösung wurden dem porösen Aluminiumoxid im Zylinder zugegeben, der Zylinder verstöpselt, durch Umdrehen gemischt und in ein 60° warmes Bad gesetzt. Das Enzym wurde während 2 Std. 30 Min. bei 60° umsetzen gelassen und während dieses Zeitraums der Zylinder alle 15 Min. umgedreht. Nach Entnahme aus dem Bad wurde die Umsetzung bei Zimmertemperatur unter Umdrehen über Nach bei Zimmertemperatur fortgesetzt. Die Enzymlösung in einer Menge von 28,5 ml mit pH 7,1 wurde abgegossen und aufbewahrt. Das Präparat wurde zuerst mit 60 ml dest. Wasser, dann mit 40 ml 0,5 M Natriumchlorid und bo schließlich mit 40 ml Magnesium-Cobaltazetatlösung behandelt. Drei Proben vot. insgesamt 1 g wurden zur Prüfung entnommen, die restlichen 10 g in eine thermostatisch auf 60° gehaltene Kolonne überführt. In die Kolonne wurde eine 50% Glucose und 0,005 M h5 Magnesiumsulfat enthaltende, mit Nalriumsulfil auf 7.7 — 8 gepufferte Lösung eingespeist. Während der eisten 26 Std. wurde der .Speiselösung 0,001 M C'obalichlorid /ugexcl/i. nach 26 Sld. aber weggelassen.

mi «.liiIl der einzige Aktivator ;uis M.ignesiumionen bestand. Der Anlangsduichsatz war annähernd 190 ml/ SuI. Durch Verringerung des Durchsatzes in periodischen Abstanden wurde die Ιτιι. 'osoiimwandlung zwischen 80 und 85"-n der theoretischen gelullten. Die gesamte l.aulzeit der Kolonne betrug etwa 31 Tage. Die Kolonne wurde dann durch Abbrechen der Zufuhr ausgetrocknet und I 5 Std. trocken stehen gelassen. Die .i .nähernde Halbwertzeit wurde durch lierechnung der gesammelten l'roduktmenge und der Umsetzung des Produkts mit 42 lagen bestimmt. Die Prüfung des Produkts vor dem Gebrauch zeigte eine Beschickung von 381 ICjIE pro g. was einer Aktivitätsausbeute von 17.8% der gesamten, dem Träger ausgesetzten IGl!! ausmacht. Eine Prüfung der 28.5 ml Enzymlösung zeigte iei iGiE pro mi. aiso eine Aktiviiäisausbeule von uiwa 19.4'Vi₁. Der pH-Wert der Kolonne wurde durch entsprechende Einstellung der Zufuhr auf 7.4 — 7.8 ^ehalten. Die gesamte Kolonnenbeschickung war 3810 ICi ΙΓ.

Beispiele Hl-X

Zur Bestimmung des Einflusses verschiedener Piiffers\ steine auf die Halbwertszeit der Präparate wurden Versuche in acht Kolonnen durchgeführt. In jedem Fall wurde die Flucose-Isomerase auf dem oben beschriebenen porösen Aluminiumoxidträger adsorbiert. Das Enzym stammte aus zwei verschiedenen Quellen. In den Beispielen III und IV stammte es wie in den vorigen beiden Beispielen von Streptomyces-Organismen (als Quelle A bezeichnet). In den Beispielen V bis X stammte es von einem anderen Streplomyces-Organismus (Quelle Ii). Das Adsorptionsverfahren entsprach im wesentlichen dem Beispiel II. 10 g des Präparats wurden in jede Kolonne gegeben. Eine 50"/nigc Glucose-Isomeraselösung mit dem jeweils angegebenen Puffersystem wurde durch jede Kolonne geleitet, wobei der Durchsatz periodisch verändert wurde, um eine Umsetzung von 84% der theoretischen (theoretisch Endprodukt rnii 50 — 50 Glucosc-Fructosclösung) zu erzielen. Alle Substratlösungen und die Kolonnen wurden durch Thermostate auf 60" gehalten und der pH-Wert auf konstant 7.8 eingestellt. Die Enzymbeschickung jeder Kolonne ist in IGI[i/g in Mittelwerten mit oberen und unteren 95%igen Wahrscheinlichkchsgrenzen angegeben. Der Beschickungsgrad bezeichnet das prozentuale Verhältnis auf der gesamten Trägermenge adsorbierter IGIE zur Anfangszahl IGIE beirr Adsorptionsverfahren.

Beispiel Enzymquelle

V B

Vl B

VII B

VIII B

IX B

Beschickung IGIi'g

unlere mittlere obere

Grenze Grenze Grenze

Bcschickungsgrud in %

Substratzusätze (M)

554

573

591

510 563 616 70.8

164 206 248 36.5

176 192 209 32.3

179 204 229 39.9

372 407 441 49.2

268 398 528

372 407 441 49.2

0.004 MgSC>4
0.001 CoCi:
0.004

0.005 MgCI:
0,001 CoCl:
0.004NHoHCOi

0.005 MgCl:
0.001 CoCl:
0.004 Na:SCh

0.005 MgCl:
0.001 CoCI:
0.004 NHoHCCh

0.005 MgCI:
0.004 NH*HCOi
NoCo--

0.005 MgSOi
0.001 CoCI:
0.004 Na:SOj

0.005 MgCl:
0.004 NHtHCOj
NoCo^

0,005 MgSOi
0,001 CoCb
0,004 Na₂HPOj
0,001 NasPO*

Anfangs- 1 laibwert durehsatz in Tagen in ml/Std.

122

112

45

38

48

74

36

49.0

23

47.0

17.0

18.0

38.0

23.0

20.0

Beispiel XI

Die Halbwertzeiten der Präparate nach den Beispielen II —X übertreffen noch chemisch an einen porösen Glasträger gekoppelte Glucose-Isomerasepräparate unter entsprechenden Bedingungen. Die chemisch gekoppelte Glucose-Isomerase wurde nach dem Verfahren des US-PS 37 83 101 hergestellt. Der Träger bestand aus mit Zirkonoxid überzogenem porösen Glai an das das Enzym aus der Quelle A chemisch gekoppel wurde. Das Material wurde in einem abschnittsweise Umsetzungsgefäß unter gewöhnlichen Bedingunge geprüft und besaß eine Aktivität von 1068 IGIE/g. Di Prüflösung bestand aus 2 M Glucose enthaltend 0.02 N MgSO.. und 0.001 M CoCI₂-

Kine 10.2 g Trockengewicht dieses chemisch gekuppelten Iji/\mpr;ip;ir;Hs enthaltende Kolonne wurde IN Tage lang bei 60 gefahren. Line 50%ige Glucoselösiiiij.' wurde mit einem konstanten Durchsatz von 124—I Jl ml/Std. durch die Kolonne geleitel. Die Aktivität in der Kolonne wurde auf Grund einer die in bekannter Weise gemessene Umwandlungsralc (¹Vn Eruciose) und den Durchsat/ der .Speiselösung in Beziehung setzenden empirischen l-'ormel errechnet. Der l-Yuctosepro/entsatz wurde mit einem automat! sehen Bendix Polarimeter in zwölf zeillichen Abständen von j bis 431 Std. gemessen und zeigte eine Aklivilätsabnahme von 934—473 IGIE/g. Die geschätzte Halbwertzeit wurde mit 1 b.b Tagen mit 95% Wahrscheinlichkeit 14,8—18.8 Tagen ermittelt. Während der ersten 24 Std. bestand die Speiselösung aus 50 Gew.-% Glucoselösung, enthaltend 0.005 M MgSO₄, 0,004 M Na₂SO₁ und 0,001 M CoCl· mit einem pH-Wert von 7,8. Während der restlichen Laufzeit wurde die Speiselösung ohne CoCI:. im übrigen aber mit der gleichen Zusammensetzung eingeleitet.

Der Vergleich zeigt höhere Werte für auf porösen Aluminiunioxidkörpern adsorbierte Glucose-Isomerase. Außer einer längeren llalbwerlzeit unter gleichen Bedingungen ist das Präparat infolge geringerer Kosten des Trägermaterials und einer kleineren Anzahl von Verfahrensschritten auch wirtschaftlicher in der Herstellung.

He i s ρ i e I XII

Im Hinblick auf die aus der US-PS 34 31 2'>i bekannten Möglichkeit der Glucose-lTUcloseuniwandliing allein mit basischen Aluminiumoxidgraiiulai wurde der KinHufi des porösen Aliiminiumoxids beim Vorgehen nach den Beispielen M-X untersucht. Ils wurde eine 11 g poröses Aluminiumoxid, mit 0.05 M Magnesium· azelat und 0.01 M Cobaltazct.il enthaltende Kolonne unter Wiederholung der in den Beispielen angegebenen Voradsorptionsbehandlung gefahren.

Das behandelte, poröse Aluminiumoxid wurde in eine thermostatisch auf 60" gehaltene Kolonne gegeben und eine Lösung von 0,005 M MgSO₄, 0,004 M NajSO,. 0.001 M CoCI.. und 50Gew.-% Glucose bei pH 7.8 mit einem konstanten Durchsatz von etwa 45 ml/Std. durch die Kolonne geleitet. (Ein 277 ICiIE/g enthaltendes, adsorbiertes Glueose-Isomerasepräparat ergab 84% der theoretischen Umwandlung von Glucose /u lYiictose unter sonst gleichen Bedingungen). Eine Probe des Ablaufs der nur Aluminiumoxid enthaltenden Kolonne wurde täglich gesammelt und zur Bestimmung der prozentualen Umwandlung mit einem Polarimeter gemessen, wobei das Instrument mit der Speiselösung auf Null eingestellt wurde. Der pH-Wert des Produkts wurde ebenfalls gemessen. Die Ergebnisse waren wie folgt:

/ur Bestimmung der prozentualen Umwandlung infolge der Erhitzung tier Speiselösung wurde eine weitere Kolonne ohne Aluminiumoxid oder Enzympräparat bei b0 mit einem Durchsatz von 45 ml/Std. gefahren. Die Umwandlung wurde mit 0.5% und der Produkt-pll-Wert mit 7.45 gemessen. Somit ist das Aluminiumoxid für die Glucose-! rucloseumwandlimg nicht als konsativ zu v\ erteil.

Durchsalz	Fructose.	Pn
	ihcorcl.
(ml/Std.)	('Vo)	(pi
43.8	4.8	5,4
47.0	0.0	6,4
47.0	0.0	7,5
47,0	0.0	7,5

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose durch Einwirkung immobilisierter GIucose-Isomerase auf eine Glucose enthaltende, schwach alkalisch gehaltene wäßrige Lösung bei erhöhter Temperatur, dadurch gekennzeichnet, daß man in den Poren eines Aluminiumoxidträgers mit Porendurchmessern von 100— !000 Ä adsorbierte Glucose-Isomerase einsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Aluminiumoxidträger Korngrößen von 0,074—4,76 mm aufweist

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Aluminiumoxidträger Porendurchmesser von 140—220 Ä und Korngrößen von 0,25—0,71 mm aufweist.