DE2412833A1 - Verfahren und einrichtung zur radioimmunopruefung mit rueckgewinnung des immunadsorbens - Google Patents
Verfahren und einrichtung zur radioimmunopruefung mit rueckgewinnung des immunadsorbensInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich allgemein auf die unter der Bezeichnung Radio immunopr üf ung (radioinununoassay) bekannte
analytische Technik, nach welcher Antigene an spezielle Antikörper gebunden werden und die Konzentration
des Antigens in einer Probe durch Anwendung von Tracern und vorbestimmten Verhaltensnormen bestimmt
wird. Insbesondere betrifft die Erfindung verbesserte Veriäiren und Vorrichtungen für die Radioinununoprüfung,
bei denen eine Kurzzeitanalyse, also eine schnellere
Analyse vorgenommen wird, die Antikörper-Masse (das
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Immunoadsorbens) zur ständigen Wiederbenutzung zurückgewonnen
und nicht verworfen wird und der Gesamtablauf automatisiert wird.
Die Radioimmunoprüfung ist eine analytische Technik, die auf dem Wettbewerb (Affinität) des Antigens nach Antigen-Bindungs-Qlätzen
an Antikörper-Molekülen beruht. Bei der praktischen Ausübung der Prüfung werden Standardkurven
aus einer Untersuchung an einer Anzahl Proben gewonnen, die jeweils (a) die gleiche bekannte Konzentration an
markiertem Antigen aufweisen und (b) unterschiedliche, aber bekannte Konzentrationen an unmarkiertem Antigen.
Die Antigene sind mit radioaktiven Isotopen als Tracern markiert. Das Gemisch wird in Kontakt mit einem Antikörper
bebrütet, das freie Antigen von dem Antikörper und dem daran gebundenen Antigen getrennt, und dann wird unter Verwendung
eines Gamma- oder Beta-Strahlendetektors oder eines anderen geeigneten Nachweisgeräts der Prozentanteil des
gebundenen oder freien markierten Antigens bestimmt. Dieses Vorgehen wird an einer Reihe von Proben mit unterschiedlichen
bekannten Konzentrationen von unmarkiertem Antigen wiederholt und das jweilige Resultat aufgezeichnet. Der
Prozentanteil gebundenen Tracer-Antigens wird als Funktion der Antigenkonzentration aufgetragen. Normalerweise nimmt
mit wachsender Konzentration des Gesamt-Antigens die relative
Menge des an den Antikörper gebundenen Tracer-Antigens ab. Nach der Herstellung der Standardkurve wird sie anschliessend
zur Bestimmung der Konzentration des Antigens in den zu analysierenden Proben verwendet.
Zur eigentlichen Analyse wird die Probe, in der die Antigen-Konzentration
bestimmt werden soll, mit einer bekannten Menge Tracer-Antigen vermischt. Bei dem Tracer-Antigen
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handelt es sich um das gleiche Antigen, das bekanntermaßen
auch in der Probe vorkommt, jedoch mit einem geeigneten radioaktiven Isotop markiert. Dann wird die Probe
mit Tracer in Kontakt mit' dem Antikörper bebrütet. Danach kann in einem geeigneten Detektor gezählt werden, der das
in der Probe verbliebene freie Antigen zählt. Das an den Antikörper oder das Immunoadsorbens gebundene Antigen kann
also ebenfalls gezählt werden. Dann wird aus der Standardkurve die Konzentration des Antigens in der Originalprobe
ermittelt. Danach wird die Antikörper- oder Immunoadsorbens-Masse weggeschüttet.
Um den Prozentsatz des an den Antikörper gebundenen Antigens (des gebundenen Antigens) und/oder den-Prozentsatz, der
frei oder ungebunden bleibt, zu ermitteln, muß zunächst die Probe in eine Fraktion, die das gebundene Antigen enthält,
und eine Fraktion, die nur freies Antigen enthält, aufgeteilt werden. Man kann zu diesem Zweck dextranbeschichtete
Holzkohle in die Mischung geben. Die Holzkohle adsorbiert dann das freie Entigen. Dann wird die Holzkohle
mit dem adsorbierten freien Antigen durch Zentrifugieren von dem Antikörper (und gebundenen Antigen) getrennt. Nach
einer anderen bekannten Methode wird dem Gemisch ein weiterer Antikörper hinzugefügt, der den ersten Antikörper (mit
gebundenen Antigen) selektiv ausfällt, so daß in der Lösung nur das freie Antigen verbleibt. Die Trennung der jeweiligen
freien von den gebundenen Fraktionen wird dann durch Abtrennen des Niederschlags von dem Überstehenden durch Zentrifugieren
oder auf andere geeignete Weise herbeigeführt. Einige Autoren haben sich mit der Technik der Bindung des
Antikörpers an die Innenwand eines Kunststoffgefäßes beschäftigt,
wobei das Gefäß mit der Antigen enthaltenden Probe gefüllt und dann während einer üblicherweise zwischen 4 und
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72 Stunden betragenden Bebrütungszeit stehen gelassen
wird und anschliessend das freie Antigen von dem gebundenen Antigen durch Abziehen und Spülen des Gefäßes getrennt
wird, so daß in dem Gefäß nur der Antikörper und das gebundene Antigen verbleibt. Nach einer neueren Technik
wird das Immunoadsorbens- durch Binden der Antikörper
an ein unlösliches, vernetztes Dextran hergestellt. Die Immunoadsorbens und Antigen enthaltende Probe wird
bebrütet, und dann wird das Dextran mit dem gebundenen Antigen auf geeignete Weise aus der Lösung entfernt.
Bei allen bisher besprochenen Methoden wird der prozentuale Anteil markierten Antigens entweder in der gebundenen
Fraktion oder der freien Fraktion oder in beiden bestimmt und wird die Standardkurve herangezogen, um die
Antxgenkonzentration zu ermitteln. Danach wird das Immunoadsorbens weggegossen.
Die beschriebenen Techniken der Radioimmunoprüfung haben sich zwar als wertvolle Hilfsmittel erwiesen und haben
weite Verbreitung gefunden, sie haben aber nicht die wünschenswerte Vollkommenheit erreicht, weil der Antikörper
(das Immunoadsorbens) bei jeder Analyse aufgebraucht wird und daher weggegossen werden muß. Darüber hinaus läßt sich
nach den bisherigen Methoden nur chargenweise und diskontinuierlich arbeiten und die verschiedenen Reagentien werden
dem Antikörper in Teströhren zugefügt, in denen die verschiedenen Stufen, wie Bebrütung, Spülen u. dgl. vorgenommen
werden, so daß ein langsamer und kostspieliger Verfahrensablauf resultiert.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein verbessertes Verfahren und eine verbesserte Vorrichtung zur Ausübung der
Radioimmunoprüfung angegeben. Gemäß der Erfindung wird das
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Immunoadsorbens (der Antikörper) mehrfach und schnell
zurückgewonnen, womit die Notwendigkeit und damit Zeit und Kosten für ständigen Ersatz entfallen. Erfindungsgemäß
werden Verfahrensschritte hinzugefügt, aufgrund derer das Verfahren kontinuierlich und in ständig S"ich
wiederholenden Arbeitsspielen ausführbar ist, wodurch das teure, zeitraubende, diskontinuierliche Arbeiten
entfällt. Ferner wird eine neue Geräteanordnung zur Automatisierung
des Verfahrens vorgeschlagen.
Die Erfindung beruht auf den Erfahrungen, daß (1) durch Herstellen der Immunoadsorbens-Masse in Form einer festliegenden
Masse von Antikörpern, durch die die Antigenprobe und sonstige Reagentien fliessen können, das Verfahren
kontinuierlich ausgeübt werden kann, ohne daß weitere Manipulationen erforderlich sind, und daß (2) das
festliegende Immunoadsorbens zu wiederholtem Gebrauch regeneriert werden kann, indem ein Lösungsmittel oder
eine Elutionslösung mit bestimmten Eigenschaften hindurchgeleitet
wird. Das heißt, gebundene Antigene werden freigesetzt, so daß der Antikörper von gebundenem Antigen durch
Waschen befreit und dadurch zur Wiederverwendung regeneriert werden kann, ohne dadurch die wesentlichen Eigenschaften
der Antikörper Masse, nämlich seine Fähigkeit, Antigen-Lösung wiederholt durchtreten lassen zu können und Antigen
binden zu können, während einer großen Zahl von Zyklen zu verlieren.
Der hier benutzte Ausdruck "festliegende Antikörper Masse"
bezieht sich auf eine Masse von Antikörpern, die in der Bahn einer strömenden Flüssigkeit derart an Ort und Stelle
gehalten wird, daß der Strom über oder durch die. Masse fliessen kann, während diese ihre Lage nicht verändert.
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-Q- 24Ί2833
Eine geeignete Antikörper-Masse kann aus Festkörperflächen gebildet werden, beispielsweise aus Glas oder
wasserunlöslicher! Polymeren, an denen die Antikörper durch homöopolare Bindung haften. Eine Masse derartiger Perlen
mit anhaftenden Antikörpern wird auf e'inem Netz in einem
Rohr oder sonstigen Hohlzylindern gehalten, durch die die mit Antigen beladenen Proben und die anderen Reagentien
nacheinander geleitet werden. Das homöopolare Koppeln von Antikörpern oder Antigenen an derartige Träger ist bekann,
beispielsweise aus der USA-Patentschrift-3 652 761. '<-
Gemäß der Erfindung werden die für die zu analysierenden Antigene spezifischen Antikörper durch homöopolare Bindung
an Perlen oder einen ähnlichen festen Träger gekoppelt, eine Masse dieser Perlen festgelegt, eine mit Antigen
beladene Lösung über oder durch die Masse· geleitet, der
prozentische Anteil des in der Lösung verbliebenen freien, markierten Antigens bestimmt, das gebundene Antigen gleichzeitig
unter Regeneration der Antikörpermasse freigesetzt und der prozentische Anteil des freigesetzten Antigens
ebenfalls bestimmt. Die Anteile werden in Beziehung zu dem Gesamt-Antigen in der eingegebenen Probe gesetzt. Bestimmt
wird, wie erwähnt, das markierte oder Tracer-Antigen.
Die Freisetzung des gebundenen Antigens und die gleichzeitige Regeneration oder Reaktivierung der Antikörper-Masse
erfolgt durch Spülen der Masse mit einem Lösungsmittel oder einer Elutionslösung, die die Bindung zwischen dem
Antigen und dem Antikörper löst, aber die homöopolare Bindung zwischen dem Antigen und seinem Träger nicht beeinträchtigt,
Ausserdem darf das Lösungsmittel weder die Durchströmungsverhältnisse
noch die Antigenaffinität der Antikörper-Masse verändern.
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Eine andere Art von festliegender Antikörper-Masse läßt sich durch Einschließen von Antikörpern in eine semipermeable Membran herstellen. Eine Anzahl derartiger
Mikrokapseln wird dann in einer Säule festgehalten, durch die die antigenbeladene Lösung fließt. Die Membranen
sind so ausgewählt, daß sie den Durchtritt von Antikörpern nach aussen blockieren, den freien Durchtritt von
Antigenen und ihren Lösungsmitteln in beiden Richtungen aber nicht behindern.
Für den Fall von Membrankapseln besteht, weil keine homöopolaren Bindungen vorliegen, nicht die Gefahr, daß solche
Bindungen durch ein Regenerationslösungsmittel zerstört
werden. Es muß aber weiterhin darauf geachtet werden, daß das Lösungsmittel nicht die Strömungsverhältnisse oder die
Adsorptionsfähigkeit des Antikörpers beeinträchtigt. Man kann die Wirksamkeit der Membranen erhöhen, indem man die
Antikörper an ein lösliches Polymer koppelt, wodurch das Molekulargewicht des kombinierten Antikörpers erhöht wird
und eine relativ stärker durchlässige Membran verwendet werden kann.
Im Hinblick auf die Strömungsverhältnisse in den beiden Systemen sollte das Lösungsmittel kein Quellen des Antikörper-Trägers
oder der Membranwand in solchem Maße verursachen, daß das Fließen verhältnismässig kleiner Antigene
blockiert wird oder relativ grössere Antikörper durch
die Wand verlorengehen könnten.
Zusammengefaßt umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die Schritte, eine Masse aus festliegenden, für das gewählte
Antigen spezifischen Antikörpern herzustellen, diese Masse in der Bahn eines Flüssigkeitsstroms festzuhalten, eine mit
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Antigen beladene Probe herzustellen, indem eine bekannte Menge markierten Antigens zu einer eine unbekannte Menge
des gleichen Antigens enthaltenden Probe gegeben wird, diese Probe in dem genannten Flüssigkeitsstrom über den genannten
festliegenden Antigenkörper zu leiten und sie mit ihm in Kontakt zu bringen und danach die Menge des in der Probe
verbliebenen freien markierten Antigens und/oder die an den
Antikörper gebundene Menge zu bestimmen.
Die Menge des an den Antikörper gebundenen Antigens wird durch Spülen des Antikörpers mit einem speziellen Lösungsmittel,
das die gebundenen Antigene freisetzt, und anschliessenden Nachweis der Antigene in der Spüllösung bestimmt.
Die den Anforderungen der Erfindung genügenden Lösungsmittel haben hydrophobe Eigenschaften. Als typische Lösungsmittel
gelten Methyl-, Äthyl- und Isopropylalkohol und auch Dimethylformamid
.
Die erfindungsgemäße Einrichtung umfaßt im wesentlichen eine Kontaktkammer mit Einlaß und Auslaß, die einen Flüssigkeitsstrom
durch die Kammer leiten, eine Antikörper-Masse, eine Einrichtung zum Festhalten und Positionieren der genannten
Antikörper in der genannten Kontaktkammer in der Bahn des sie durchfliessenden Antigen-Stroms, eine Nachweiskammer
mit Einlaß und Auslaß, einen dieser Kammer zugeordneten Detektor zum Bestimmen der Menge eines die genannte Kammer
durchfliessenden Tracers, eine Leitung, die Flüssigkeit vom
Auslaß der genannten Kontaktkammer in den Einlaß der genannten Nachweiskammer führt, eine Quelle für markiertes und unmarkiertes
Antigen enthaltende Lösung, eine Quelle für Regenerations-Lösungsmittel, eine Einrichtung, die dem Einlaß
der Kontaktkammer getrennt und nacheinander eine sie durchfliessende Menge der genannten Probe und des genannten Lösungs-
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mittels zuleitet, und eine Einrichtung zum Regeln der Strömung der genannten Probe und des genannten Lösungsmittels
durch die genannte Kontaktkammer und die genannte Nachweiskammer. Ferner ist eine Vorrichtung vorgesehen,
die einen sogenannten Schintillations-Cocktail in die Anlage zwischen der Kontaktkammer und dem Detektor einführt,
der durch die Nachweiskammer fliessen soll und die Impulse des radioaktiven Zerfalls in Lichtimpulse oder
Photonen umwandelt:, die mit einem Photomultiplier nachgewiesen
werden können.
Die für die Strömung in der Kontaktkammer und im Detektor erforderlichen Fließgeschwindigkeiten werden empirisch
ermittelt und durch Dosierpumpen gesteuert. Die Strömungsfolge wird durch Ventile- gesteuert. Durch geeignetes
Programmieren kann eine kontinuierliche Strömung durch das System aufrechterhalten werden, wobei die Strömungsgeschwindigkeiten
so gewählt werden, daß an jeder Station ausreichend Zeit bleibt, daß die dort herbeizuführenden
Ergebnisse, also Bindung, Freisetzen oder Zählen, erzielt werden können.
Um die Erfindung verständlicher zu machen und ihre praktische
Ausbildung darzustellen, wird nachstehend anhand der zugehörigen Zeichnung die Erfindung beschrieben; die
Erfindung soll nicht auf diese Ausführungsform beschränkt sein, sie wird vielmehr durch die Patentansprüche definiert
und umfaßt auch äquivalente Lösungen.
Die Zeichnung (Fig. 1) ist eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Einrichtung.
Die gezeichnete Anlage umfaßt eine Probenquelle 10, eine
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Quelle 11 für ein pufferndes Spülmittel, eine Quelle 12 für Regenerations-Lösungsmittel, eine Quelle 13 für·den
Seinzillations-Cocktail, einen Spülwasserbehälter I1*,
eine mit festliegenden Antikörpern (Immunoadsorbens) gefüllte Kontaktkammer 16, eine Mischkammer 17 und eine
Detektorkammer oder Rohrschlange 18 mit daneben befind-'lichem Detektor 19. Die genannten Bestandteile werden
durch eine Anzahl Rohrleitungen und strömungslenkende Ventile
miteinander verbunden, die in Verbindung mit Dosierpumpen und einem Programmgeber die Strömung durch die Anlage
steuern.
Im einzelnen ist die Probenquelle 10 über eine Leitung 21 mit einem Zweiwegeventil 2 2 verbunden, das in seiner einen
Stellung die Verbindung zu einer Probenschleife 2 3 herstellt.
Die-Probenschleife endet an einem Zweiwegeventil 24, das in seiner einen Stellung zu einer Leitung 26 führt, die mit
einem weiteren Zweiwegeventil 27 verbindet, das in seiner
einen Stellung die Leiting 26 und die Probenschleife 2 3 an
eine Saugpumpe 28 anschließt, die ins Abwasser fördert. Eine Spülwasserzuleitung 29wird durch die andere Stellung des
Ventils 27 mit der Pumpe -28 verbunden, um die Pumpe zum Ansaugen zu bringen und zu spülen, wem sie keine Probe ansaugt.
Die Verdrängungsspülflüssigkeit fließt aus dem Tank 11
einem Zweiwegeventil 31 zu, das in seiner einen Stellung über eine Pumpe 32 mit einem zweiten Zweiwegeventil 33 verbindet,
das die Verbindung zu der zu dem Ventil 22 und der Probenschleife 23 führenden Leitung 34 herstellt oder zu einer
Leitung 36, die zu der Kontaktkammer, zur Mischkammer und zum Detektor führt. Eine Leitung 37 schließt das Ventil 24
an die Hauptleitung 36 an. Eine Zweigleitung 38 stellt die Verbindung mit der Hauptleitung 36 an einer Verbindungsstelle
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zwischen der Kontaktkammer und dem Detektor oberhalb der
Mischkammer 17 her. Eine Pumpe 39 fördert ein Reagens aus dem Tank 13 durch die Leitung 38.
Ein insgesamt mit Hl bezeichneter zentraler Programmgeber steuert die Funktionen der.Ventile und Pumpen. Der Programmgeber
kann aus handelsüblichen Teilen für den speziellen Zweck passend zusammengebaut werden und braucht daher hier
im einzelnen nicht beschrieben zu werden. Es braucht nur, wie in der Zeichnung geschehen, erwähnt zu werden, daß
alle Ventile, die sämtlich elektrisch betätigte Magnetventile darstellen, und die Dosierpumpen, die sämtlich elektrisch
betrieben werden,mit entsprechenden Leitungen 42 an den Programmgeber
angeschlossen sind.
Die Anlage arbeitet folgendermaßen:
Zu Beginn eines Zyklus fließt Spülreagens aus dem Tank 11
durch das Ventil 31, die Pumpe 32, das Ventil 33 in und durch die Leitung 36. Dadurch wird die Anlage gespült. Die Probe
aus dem Tank 10 wird von der Pumpe 28 durch die Ventile in und durch die Probenschleife 23 gesaugt, bis die Schleife
gespült und gefüllt ist, worauf die Ventile 22, 24, 27 und in die andere Stellung umschalten und ein kontinuierlicher
Strom aus dem Tank 11 durch das Ventil 31, die Pumpe 32, das Ventil 33, das Ventil 22, die Schleife 23, das Ventil 2«* und
die Leitung 37 zur Leitung 36 fließt. Die von dem Tank U austretende Flüssigkeit verdrängt auf diese Weise die Probe
aus der Schleife und drückt sie in die Kontaktkammer 16 und durch sie hindurch. Wenn der Strom so lange geflossen ist,
daß die gesamte Probe aus der Schleife verdrängt ist, kehren die Ventile 22, 24 und 33 in die in der Zeichnung dargestellte
Ausgangslage zurück. Dadurch wird die Probenschleife isoliert.
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Nachdem die Probe die Kontaktkammer 16 und die Nachweisrohrschlange
passiert hat, schaltet das Ventil 31 um und nimmt Regenerations-Lösungsmittel aus dem Tank 12 und leitet
es durch die Pumpe 32 und das Ventil 3 3 unmittelbar
in die Leitung 36 zu der Kontaktkammer 16, wo es die gebundenen Antigene freisetzt und sie in die Mischkammer und
zum Detektor fördert. Gleichzeitig wird das Immunoadsorbens
in der Kontaktkammer regeneriert.
Der im Tank 13 befindliche Scinzillations-Cocktail besteht
im allgemeinen aus einem Hauptscintillator, einem Zusatzscintillator und einem LösungsVermittler, die sämtlich in
Toluol aufgenommen sind. Er soll sich mit der in der Mischkammer befindlichen, mit Antigen beladenen Lösung mischen
und dann die radioaktiven Impulse des Tracers in Licht oder Photonen umwandeln, die von einem Photomultiplier nachgewiesen
werden können. Photonen können mit einem Gamma- oder Beta-Scintillationsspektrometer
nachgewiesen werden.
Als Tracer können die am besten zu handhabenden Indikatoren dienen. Bei einem Beta-Scintillationsdetektor mit Koinzidenzschaltung
läßt sich eine H Tritium-Markierung anwenden, für einen Gamma-Detektor, bei dem die Koinzidenzschaltung entfallen
kann, ist eine Markierung mit J geeignet. Bei den hier beschriebenen Tests wurde eine Tritium-Markierung angewendet.
Es ist wichtig, daß die Probenschleife nicht durch Regenerations-Lösungsmittel
verunreinigt wird, denn Spuren dieses Lösungsmittels in Verbindung mit der Probe könnten die
Bindungswirksamkeit der Kontaktkammer herabsetzen.
Obwohl eine sehr elementare Probe beschrieben ist, sindnatürlich sehr vollkommene Probenehmer bekannt, die im Rahmen der
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Erfindung verwendet werden können.
Eine Folge von grundlegenden Versuchen wurde ausgeführt, um sicherzu sein, daß Immunoadsorbentien in Form von
festliegenden Antikörpern mit geeigneten Reagentien in
reproduzierbarer Weise regeneriert werden konnten.
Die folgenden Lösungsmittel wurden verwendet:
Spüllösung mit Pufferwirkung (Lösung A) 0,02 M Natriumphosphat, pH 7,5
0,05 M Natriumchlorid
0,01 % Merthiolat
0,02 % Natriumazid
0,01 % Merthiolat
0,02 % Natriumazid
Regenerations-Lösungsmittel (Lösung B) Lösung A mit Zusatz von
30 % (v/v) Äthylalkohol 95 %
30 % (v/v) Äthylalkohol 95 %
Scintillationslösung (Lösung C)
Fünf Teile einer Lösung aus
0,1 % Cw/ν) 2,5 Diphenyloxazol 0,09 % (w/v) l,4-bis-2(4-Methyl-5-Phenyloxazolyl)
Fünf Teile einer Lösung aus
0,1 % Cw/ν) 2,5 Diphenyloxazol 0,09 % (w/v) l,4-bis-2(4-Methyl-5-Phenyloxazolyl)
benzol
Toluol als Lösungsmittel
ein Teil
Scintisol-GP (Hersteller: Isolab, Inc.)
ein Teil
Scintisol-GP (Hersteller: Isolab, Inc.)
Eine Kontaktkammer wurde au s einer an einem Ende mit Glaswolle zugestopften Glaspipette hergestellt. Eine Aufschlämmung
von 0,04 ml Immunoadsorbens-Suspension wurde
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eingeführt. Die Suspension enthielt 20 mg/ml festen Träger, an den Testosteron-Antikörper homöopolar ge»
bünden war. Die Kanuner wurde mit 5 ml einer Spül lösung
mit Pufferwirkung (Lösung A) gespült, dann mit 1 ml Regenerationslösungsmittel
(Lösung B) und dann noch einmal mit 2 ml Spüllösung mit Pufferwirkung (Lösung A). Der Zyklus
wurde mehrmals wiederholt» Jede von der Kontaktkammer
abgegebene Fraktion wurde getrennt in Scintillations-Gefäßen gesammelt, mit 15 ml des Scintillations-Cocktaife
(Lösung C) vermischt und 5 Min. lang in einem Scintillationsspektrometer
gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben, in der für jeden von vier Zyklen die Prozentzahlen
des gebundenen Antigens und die Prozentzahlen des freienMtigens aufgeführt sind. Das gebundene Antigen
wurde zunächst mit dem Regenerations-Lösungsmittel aus dem festliegenden Antikörper freigesetzt, dann nachgewiesen
und gezählt.
Tabelle I
(Probe - 3H-Testosteron)
(Probe - 3H-Testosteron)
Zyklus Zyklus Zyklus Zyklus 1 2 3 Ή
Prozent freies
markiertes Antigen 61,3 33,4 33,1 33,3
Prozent gebundenes
markiertes Antigen 40,3 65,3 70,5 71,4
Die ersten beiden Zyklen wurden zum Stabilisieren verwendet .
Gemessen nach dem Durchlaufen des festliegenden Antikörpers .
++ Gemessen nach der Freisetzung aus dem festliegenden
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Antikörper durch das Regenerations-Lösungsmittel (Lösung B).
Eine besondere Testserie wurde mit Östriol-Antigen unter
Bedingungen vorgenommen,,die mit denen aus Beispiel I
vergleichbar waren. Die in Tabelle II wiedergegebenen
Werte zeigen, daß der Antikörper viele Male regeneriert werden kann, ohne daß er an Wirksamkeit verliert. In
den Tests enthielt eine Standardprobe immer 0,28 ng/ml markiertes Antigen (62 nC/ml Tritium) plus einer bekannten
Menge unmarkiertem östriol. Die Konzentration in der ersten Kolonne gibt nur die bekannte Konzentration von unmarkiertem
Östriol an.
Tabelle II | Durchschnitt1. Prozentzahl Gebunden ++ |
Standard abweichung |
|
Konzentration unmarkiertes östriol ng/ml |
Anzahl der Zyklen |
84,8 | 0,57 |
0 | 13 | 84,6 | 1,02 |
0 + | 22 | 77,1 | 1,1 |
0,27 | 5 | 70,6 | 2,2 |
0,54 | 14 | 57,3 | 1,1 |
1,08 | 10 | 36,1 | 1,9 |
2,7 | 13 | 24,3 | 0,47 |
5,4 | 8 | ||
Diese beiden Serien waren zeitlich voneinander getrennt,
Die gebundene Fraktion wurde nach Freisetzung durch das Regenerations-Lösungsmittel gemessen.
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Alle Durchläufe wurden mit einer einzigen Antikörper-Masse
durchgeführt. Einundzwanzig anfallende klinische Proben wurden durch die gleiche Masse geleitet, eingestreut
zwischen die in Tabelle II aufgeführten Durchläufe. Zusätzlich wurden mehrere hundert weitere Standardproben
und sontige Proben durch die.gleiche Antikörper-Masse geschickt,
so daß sie tatsächlich ungefähr 500 mal regeneriert wurde, ohne daß ein nachteiliger Rückgang der
Antigenbindungswirkung auftrat. Die in Verbindung mit Tabelle II wiedergegebenen Tests wurden sämtlich nach der
anschliessend in Beispiel III beschriebenen Arbeitsweise durchgeführt.
Eine Vielzahl von Regenerations-Lösungsmitteln ist untersucht worden und als brauchbar für die Freisetzung von gebundenem
Antigen und zur Regeneration des Antikörpers erkannt worden. Einige Lösungsmittel, insbesondere Äthyl-
und Isopropylalkohol, haben sich als fast unbegrenzt regenerationsfähig erwiesen. Wie schon im Zusammenhang mit Lösung
B angegeben, ist eine Antikörper-Masse ungefähr 500 mal regeneriert worden. Die geforderten Kennzeichen des Lösungsmittels
sind, daß es die Antikörper-Antigen-Bindung löst, ohne die Strömungseigenschaften oder die Antigen-Bindungs-Wirksamkeit
des Antikörpers zu beeinträchtigen. Im praktischen Betrieb ist es erforderlich, das richtige Lösungsmittel
für das jeweils vorliegende System empirisch zu ermitteln.
Ein Prototyp der Anlage wurde mit einem Drehtischprobennehmer
aufgebaut, der eine Anzahl Proben aufnahm und eine Hubvorrichtung besaß, um das Probenrohr 21 in die Proben und aus
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ihnen heraus zu heben, nachdem sie von einem Programmgerät nacheinander in Position gebracht waren. Es wurde
ein periodisch arbeitendes Programmgerät 41 verwendet. Ein handelsübliches Drehventil wurde zur Ausübung der
Funktionen der Ventile 22, 24- und 33, gesteuert durch Signale des Programmgebers, eingesetzt. Als Ventile 27 und
31 dienten einfache elektrisch betriebene Zweiwegeventile.
Die Pumpen 28, 29 und 32 waren geeignete Dosierpumpen. Als Rohrleitungen wurden enge Teflonrohre, im allgemeinen
mit 0,03 bis 0,16 mm (0,0012 bis 0,0062 ") Innendurchmesser
benutzt. Die Kontaktkammer bestand aus einem Polypropylen-Rohr von 3,175 mm (0,125 ") Innendurchmesser und 4,762 mm
(0,188 ") Länge. In dieser Form enthielten die Säulen
0,04 ml einer Sephadex G-25-Suspension in einer Konzentration von 20 mg Sephadex/ml einer Lösung von 0,2 M
Natriumphosphat (pH 7,5), 0,05 M NaCl, 0,01 % Merthiolat und 0,02 % Natriumazid. Der Antikörper zu dem Antigen war
homöopolar an das Sephadex gebunden. Die Probenschleife hatte ein Fassungsvermögen von 0,2 ml. Die Fließgeschwindigkeiten
waren:
durch die Probenschleife: 0,45 ml/min während 2 min,
vom Tank 11 oder 12 durch die Pumpe'32: 0,112 ml/min, vom Tank 13 über die Pumpe 39: 1,0 ml/min.
Die die Detektorzelle bildende Rohrschlange hatte ein Fassungsvermögen von 2,2 ml. Die Mischkammer 17 faßte
ungefähr 1 ml. Nachweis und Zählung erfolgten mit einem Beta-Scintillationszähler neben der Rohrschlange, in
Verbindung mit einem nicht gezeichneten Zähler üblicher Bauart.
Das Immunoadsorbens in der Kontaktkämmer bestand aus mit
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Antikörper gekoppelten Sephadex-Perlen, die ihrerseits
in der Kontaktkammer durch Nylongitter (325-400 mesh)
(Maschenweite ca. 0,3 mm) gehalten wurden. Sephades ist ein vernetztes Dextran (Hersteller: Pharmacia A.B.,
Uppsala, Schweden). Derartige Perlen-oder andere Festkörperteilchen mit der Fähigkeit, Antikörper durch homöopolare
Bindung festzuhalten, stellen geeignete Träger dar, an denen die Antikörper festgelegt werden können.
Die übliche Zyklusdauer beim Betrieb der Anlage betrug bei einigen Tests 28 min. Darin enthalten waren 3 min
Spüldauer, während welcher Zeit Spülflüssigkeit aus dem Tank 11 die Anlage von Regenerations-Lösungsmittel freimachte.
Die Probenschleife, die nicht vorher gespült zu
werden braucht, wird gleichzeitig m±t Probenflüssigkeit gespült und gefüllt. Auf die erste Periode von 3 min folgt
eine 10 min-Periode, während welcher Reagens aus dem Tank 11 durch die Probenschleife fließt und die Probe aus der
Schleife heraus und in und durch die Kontaktkammer, die Mischkammer und den Detektor gefördert wird. Darauf folgt
ein Abschnitt von 15 min als Regenerationsperiode, während welcher Lösungsmittel aus dem Tank 12 unter Umgehung
der Probenschleife - wie oben beschrieben - durch die
Kontaktkammer fließt, um die gebundenen Antigene freizusetzen, wodurch das Immunoadsorbens regeneriert wird. Die
freigesetzten Antigene werden nachgewiesen, wenn sie sich durch die Detektorzelle bewegen und gegebenenfalls weggeführt
werden.
Bei anderen Tests ist die Zyklusdauer auf weniger als 15 Min, herabgesetzt worden. Allgemein läßt sich die
Zyklusdauer durch Erhöhen der Konzentration des radioaktiven Tracers herabsetzen.
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Wie erwähnt, ist als Regenerationsreagens für das Immunoadsorbens
ein Mittel geeignet, das die Bindung zwischen dem Antigen und dem Antikörper auflöst, den Antikörper
aber nicht schädigt» Das heißt, es darf den Antikörper nicht von seinem Träger lösen und weder seine Durchlässigkeit
noch seine Affinität für das Antigen herabsetzen. Bisher sind brauchbare Reagentien empirisch nach
ihrem Verhalten beurteilt worden. Wenn aber ein geeignetes Reagens für ein bestimmtes Antikörper-Antigen-System ermittelt
worden ist, wird es als ständiges Reagens für dieses System benutzt.
Die überraschende Feststellung, daß eine Regeneration möglich ist, und die Ermittlung geeigneter Reagentien macht
eine schnelle Analyse bei erheblich verringertem Kostenaufwand möglich. Ausserdem kann das System automatisiert
werden, wodurch der Bedienungsperson unterlaufende Irrtümer unwahrscheinlicher werden und gleichzeitig die Genauigkeit
gesteigert wird.
In der Beschreibung ist von gebundenem Antigen die Rede gewesen. Das bezieht sich auf das an die Antikörper-Masse
gebundene Antigen. Das gebundene Antigen wird erst gemessen, nachdem es von dem Antikörper mit Hilfe des
Regenerations-Lösungsmittels freigesetzt ist. Wenn die Ausbeute (in Prozent) des gebundenen (freigesetzten) Antigens
zu den in einem beliebigen Zyklus gemessenen Prozenten freien Antigens addiert wird, ergibt sich eine für
praktische Bedürfnisse ausreichend reproduzierbare Summe bei 100 %, Das ist wichtig, denn es bestätigt, daß praktisch
das gesamte gebundene Antigen von dem Antikörper freigesetzt ist und daß der Antikörper vollständig regeneriert
ist.
Zwar ist die Erfindung in erster Linie an dem Beispiel
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von Steroiden erläutert worden, sie soll aber nicht auf dieses Anwendungsgebiet beschränkt sein; die Anlage
ist vielmehr auch schon für die Bestimmung von Polypeptiden, Thyroidhormonen und einigen Viren verwendet worden. Natürlich läßt sich die Anlage in großem Umfang für die Verfahren der Radioimmunoprüfung anwenden.
ist vielmehr auch schon für die Bestimmung von Polypeptiden, Thyroidhormonen und einigen Viren verwendet worden. Natürlich läßt sich die Anlage in großem Umfang für die Verfahren der Radioimmunoprüfung anwenden.
409840/077?
Claims (8)
- Paten tansprüc h"e ;ν 1·JVerfahren zum wiederholten Binden bzw. Lösen von Antigenen und Antikörpern aneinander bzw. voneinander, dadurch gekennzeichnet, daß eine Masse von für ein ausgewähltes Antigen spezifischen Antikörpern festgelegt wird, daß dann eine die ausgewählten Antigene enthaltende Lösung mit den genannten festliegenden Antikörpern in Kontakt gebracht und von ihnen wieder abgezogen wird, wodurch zumindest ein Teil der genannten Antigene an die genannten Antikörper gebunden wird, daß dann die genannten gebundenen Antigene von den genannten Antikörpern freigesetzt werden, indem die festliegende Masse der Antikörper in Kontakt mit einem Lösungsmittel gebracht wird, das zu einer Gruppe von Lösungsmitteln gehört, die die Bindung zwischen Antigen und Antikörper lösen, ohne die Fließeigenschaften und das Antigen-Bindungs-Vermögen des genannten Antikörpers merklich zu be e int rä cht i gen.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die festliegende Antikörper-Masse Antikörper enthält, die homöopolar an einzelne Festkörper aus einer Masse kleiner Festkörperteilchen gebunden ist, daß die Masse der Festkörperteilchen von einem porösen Organ gehalten wird, und daß das genannte Lösungsmittel durch diese Mas·409840/0777se geleitet wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Antikörper-Masse sntikörper enthält, die homöopolar an Perlen aus einem vernetzten Dextran-Polymer gebunden sind.
- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper spezifisch für ein Antigen sind, daß zu der Gruppe aus Steroiden, Polypeptiden und Thyroidhormonen gehört.
- 5, Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper spezifisch sind für ein Antigen, das zu der aus Steroiden und Thyroidhormonen bestehenden Gruppe gehört, und daß das Lösungsmittel ein Alkohol ist./
- 6,J Verfahren zur Radioimmunoprüfung, nach welchem eine nachzuweisendes Antigen enthaltende Probenlösung mit einer bekannten Konzentration markiertem Antigen vermischt wird, die Probenlösung mit einem für das genannte Antigen spezifischen Antikörper in Kontakt gebracht wird, wodurch eine Bindung eines Teils des markierten Antigens an den genannten Antikörper erfolgt, und zumindest der prozentische Anteil des nichtgebundenen Antigens ermittelt wird,
dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren wiederholbar409840/0777gemacht wird, indem die genannten Antikörper als Masse festgelegt"werden, die Antigene an die genannte Masse gebunden werden, indem der vermischte Probenstrom in Kontakt mit der genannten festliegenden Masse gebracht und dann weitergeleitet wird, die gebundenen Antigene von der genannten festliegenden Masse freigesetzt werden, indem die genannte festliegende Masse mit einem Lösungsmittel durchspült wird, das die Bindung zwischen Antikörper und Antigen aufhebt, das freigesetzte Antigen und das Lösungsmittel von der festliegenden Masse getrennt werden, die nbhtgebundenen, markierten Antigene in (a) der vermischten Probenlösung nach ihrem Passieren der festliegenden Masse und/oder in (b) dem Lösungsmittel nach seinem Kontakt mit der festliegenden Masse und anschliessender Trennung von dieser nachgewiesen werden, und danach die genannte festliegende Masse mit einer besonderen Probenlösung in Kontakt gebracht wird, die das nachzuweisende Antigen in Mischung mit einer bekannten Konzentration von markiertem Antigen enthält. - 7, Vorrichtung zur Radioimmunoprüfung, gekennzeichnet durch eine in einer flüssigkeitsdruchströmten Leitung angeordnete Kontaktkammer (16), eine für ein nachzuweisendes Antigen spezifische Antikörper-Masse, eine Einrichtung, die diese Antikörper in Form einer festliegenden Masse kleiner Festkörperteilchen in der Kontaktkammer (16) hält, wodurch Flüssigkeit durch die genannte Masse leitbar ist, einen in Strömuijprichtung unterhalb der Kontaktkammer (16) angeord-403840/0777neten Detektor (19), der radioaktive Impulse aus einem radioaktiven Material in der ihn durchströmenden Flüssigkeit nachzuweisen vermag, eine Einrichtung, die dazu dient, nacheinander durch die genannte Leitung und dabei nacheinander durch die Kontaktkammer (16) und den Detektor (19) (a) eine Spüllösung, (b) eine Antigen enthaltende Probe und (c) ein Lösungsmittel zu leiten, das beim Passieren der Kontaktkammer (16) die Freisetzung der an die genannte festliegende Antikörper-Masse gebundenen Antigene zu bewirken.
- 8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Antikörper-Masse eine Mehrzahl kleiner Festkörperperlen enthält, an die Antikörper homöopolar gebunden sind, und daß die die genannten Antikörper als festliegende Masse tragende Einrichtung ein quer in der flüssigkextsdurchströmten Leitung liegendes Netz aufweist, auf dem die genannten Perlen als poröse Masse liegen.409840/0777
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