DE2417619A1

DE2417619A1 - Plasmaproteinersatzmittel und verfahren zu dessen herstellung

Info

Publication number: DE2417619A1
Application number: DE2417619A
Authority: DE
Inventors: Abraham Mazur
Original assignee: COMMUNITY BLOOD COUNCIL
Current assignee: COMMUNITY BLOOD COUNCIL
Priority date: 1973-04-11
Filing date: 1974-04-10
Publication date: 1974-10-31
Also published as: SU629854A3; DE2417619C2; CA1033721A; FR2225171B1; SE429195B; US3925344A; GB1427903A; FR2225171A1; BR7402876D0; NL7404140A

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. VON KRHISLEtI ÜK-iNG. SCHDNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLDPSCH DIPL.-ING. SELTING

5 KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 6. 4. 1974 Fu/Ax

THE COMMUNITY BLOOD COUNCIL OF GBEATER NEW YORK, INC« 310 East 67th Street, New York, N.Y. 10021 / USA

Plasmaproteinersatzraittel und Verfahren zu dessen

Herstellung

Die Erfindung betrifft ein Plasmaeiweißmaterial, das auch, als Plasmaexpander bekannt ist. Die Erfindung ist insbesondere auf ein vernetztes polymeres Hämoglobinmaterial gerichtet, das als Plasmaeiweißersatz oder Plasmaexpander dient und mit dem chemischen System des menschlichen Körpers verträglich ist und schließlich zu Aminosäuren abgebaut wird, die leicht verwertet oder vom Körper abgeführt werden können. Die Erfindung umfaßt insbesondere intramolekular vernetzte Hämoglobinmaterialien mit niedrigem Molekulargewicht, speziell ein intramolekular vernetztes Hämoglobinmaterial mit einem Molekulargewicht zwischen 68.000 und 85.000. Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Erhöhung des Blutdrucks von Warmblütern durch Einführung eines Plasmaeiweißersatzmittels in Form eines vernetzten Hämoglobins mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 250.000.

Vollständiges Blut erwies sich als äußerst wertvolle Substanz für die Behandlung von Patienten nach starken Blutverlusten oder nach einem Schock. Leider kann voll-409844/0986

24T76T3

ständiges Blut ζ.Zt. nur etwa 21 Tage gelagert werden. Es wurde festgestellt, daß vollständiges Blut bezüglich der darin enthaltenen roten Blutzellen zerfällt, so daß es notwendig wird, die roten Zellen zu verwerfen. In nicht zu ferner Vergangenheit wurde vorgeschlagen, das Blut in eine Anzahl seiner Komponenten zu zerlegen, die für die zukünftige Verwendung konserviert werden können. Eine dieser Komponenten ist das Blutplasma. Leider gibt es noch im vollständigen Blut Substanzen wie Hämoglobin von eiweißartiger Uatur, die bisher verworfen wurden. Kürzlich wurde vorgeschlagen, vom Plasma das Serumalbumin zu trennen, das ein Eiweißstoff ist, der sich als wertvoll als Plasmaeiweißersatz oder Plasmaexpander erwies. Bisher wurde das Hämoglobin in den roten Zellen verworfen, da es keinen bekannten Verwendungszweck dafür gab. Hämoglobin ist ein Protein, dessen Hauptaufgabe der Transport von Sauerstoff aus der Lunge durch den Blutstrom zu den Geweben des Körpers ist. Ebenso wie andere Eiweißstoffe im Plasma kann das Hämoglobin auch eine weitere Aufgabe haben, die äußerst wichtig ist und darin besteht, zur Aufrechterhaltung des richtigen Blutdrucks im Körper beizutragen. Ein osmotischer Druck wird gegen die Membranen der Blutgefäße erzeugt, wodurch es dem Wasser und anderen niedrigmolekularen Materialien des Bluts möglich ist, durch die Membranwände der kleinen Blutgefäße (Kapillaren) hindurchzutreten, wodurch der gewünschte Blutdruck aufrechterhalten wird.

Wenn jedoch ein Patient Blut verliert, gehen auch die Plasmaeiweißstoffe, die den Blutdruckausgleich aufrechterhalten, verloren. Wenn eine wesentliche Menge des Plasmaeiweißes aus den Blutgefäßen verlorengeht, erreicht der Blutdruckabfall einen kritischen Wert, und Wasser tritt aus dem Blut in die Gewebe über (Ödem).

Wenn Hämoglobin als Plasmaexpander verwendet werden sollte, hat es leider den Nachteil, daß im Körpersystem die schwachen Bindungen, die die Polypeptidgruppen des Tetrameren verbinden, getrennt werden, so daß das Hämoglobin in Polypeptide von niedrigem Molekulargewicht (17·000) abgebaut und ausgeschieden werden kann.

Es ist erwünscht, über ein Material zu verfügen, das, wenn es in die Blutgefäße eingeführt wird, schnell und leicht den Blutdruck auf gewünschte vorbestimmte Werte erhöht und Jeder Neigung zu Ödemen entgegenwirkt. Ferner ist es überaus erwünscht, ein Plasmaeiweiß-Ersatzmittel auf Basis eines natürlichen Materials verfügbar zu haben, das der Körper leicht aufnehmen und verarbeiten kann. Äußerst erwünscht wäre ferner eine Nutzbarmachung des in den roten Zellen von vollständigem Blut vorhandenen Hämoglobins und hierdurch die Erhaltung dieses wertvollen Eiweißstoffs.

Es besteht außerdem ein Bedürfnis für ein Hämoglobinmaterial, das ungefähr das gleiche Molekulargewicht wie natürliches Hämoglobin hat, jedoch im Blutstrom nicht in einzelne Polypeptideinheiten zerlegt wird.

Die vorstehend genannten, lange vorhandenen Bedürfnisse werden gemäß der Erfindung durch ein Plasmaeiweiß-Ersatzmittel in Form einer vernetzten Hämoglobinsubstanz befriedigt, die wiederkehrende Einheiten der Formel

NH+ j

/Hämoglobin- \- C- (CHp) - C- / Hämoglobin-I dimeres oder I | dimeres oder!

y-tetrameres / \-tetramer.es J

enthält und ein mittleres Molekulargewicht zwischen 68.000 und 600.000 hat. In dieser Formel hat η einen

Wert von 1 bis 10 und m einen Wert von 1 bis 12. A09844/0986

Hämoglobin kann mit Hilfe von Vernetzungsmitteln der Formel ₊

R-O-C =

in der m für 1 bis 12 und R für einen Alkylrest mit 1 bis 4- C-Atomen steht, vernetzt werden. Das Hämoglobin kann in ein vernetztes Material mit einem mittleren

Molekulargewicht von 68.000 bis 600.000, meistens ; 250.000 oder weniger, überführt werden.

Es wurde gefunden, daß bei Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung unter Anwendung bestimmter Parameter und eines bestimmten Typs eines Vernetzungsmittels die Bildung eines intramolekular vernetzten Hämoglobins begünstigt wird. In diesem intramolekular vernetzten : Hämoglobin ist eine Polypeptideinheit des Hämoglobintetrameren mit einer anderen Polypeptideinheit des ■ \ gleichen Hämoglobintetrameren verbunden. Die Erfindung umfaßt somit ferner eine intramolekular vernetzte ; Hämoglobinverbindung der Struktur

NH* NHi
2 Ii 2

0 - A - C - (⁰¹^m -C-A-O II

in der 0 eine Polypeptideinheit von Hämoglobin, insbesondere eine einzelne Polypeptideinheit, A der Rest einer £-Aminogruppe eines Lysylsrestes und m eine Zahl von 6 bis 12 ist. Hinsichtlich dieses intramolekular vernetzten Hämoglobinmaterials umfaßt die Erfindung allgemein Verbindungen, in denen wenigstens eine Polypeptideinheit eines Hämoglobintetrameren mit einer anderen Polypeptideinheit des gleichen Hämoglobintetrameren durch ein Vernetzungsmittel der Formel

409844/0986

f -

vernetzt ist, wobei dieses Vernetzungsmittel mit den ^! Polypeptideinheiten an £-Aminogruppen von Lysylresten
verbunden ist. Das intramolekular vernetzte Hämoglobinmaterial gemäß der Erfindung hat ein entschieden niedrigeres Molekulargewicht als das intermolekular vernetzte Hämoglobinmaterial. Das Molekulargewicht eines

i intramolekular vernetzten Hämoglobinmaterials liegt ι allgemein zwischen 68.000 und 600.000. überraschenderweise haben jedoch in den meisten Fällen wenigstens
80 % des aus einer inter-Vernetzung gewonnenen Materials ein Molekulargewicht zwischen 68.000 und
85.000. Die Hämoglobindimer- oder -tetramereinheiten j sind somit durch das Vernetzungsmittel nicht mit Hämo- ! globindimer- oder -tetramereinheiten einer anderen j Hämoglobinstruktur verbunden, sondern" die Polypeptideinheiten der gleichen Hämoglobinstruktur sind mitein- ' . ander verbunden. Dies bedeutet, daß das Material im ι wesentlichen das Molekulargewicht von natürlich vorkom- ' mendem Hämoglobin hat. Es hat im wesentlichen alle- ■ physikalischen Eigenschaften von natürlichem Hämoglobin
mit der bemerkenswerten Ausnahme, daß die einzelnen
Polypeptideinheiten ©ovalent durch ein Vernetzungs-

mittel verbunden sind. Bei Einspritzung in den Blutstrom eines Warmblüters oder bei Einführung in anderer Weise
hält das Vernetzungsmittel die Polypeptideinheiten \ unversehrt, so daß das Hämoglobin als Bluteiweiß- j Ersatzmittel oder Expander dienen kann und dennoch . ■ keine der vielleicht etwas unnatürlichen Reaktionen'
verursacht, die bei Verwendung von Materialien mit
extrem hohen Molekulargewichten eintreten können.

Das vernetzte Hämoglobinmaterial kann leicht zusammen
mit den geeigneten anorganischen Salzen, in den Blutstrom

409.844/098·©-'-■- — - " ~ — '

injiziert werden, wodurch es den gewünschten Blutdruck innerhalb der Blutgefäße aufrechterhält. Durch Vernetzung des Hämoglobins mit Hilfe des Yernetzungsmiutels der vorstehend genannten Formel wurde ein Vorteil ι erzielt. Das Hämoglobin wurde nicht ohne weiteres durch Bindung einer als Haptoglobin bekannten im Plasma natürlich vorkommenden Substanz nachteilig beeinflußt.

Es wurde festgestellt, daß natürliches Hämoglobin im Gegensatz zu vemetztem Hämoglobin durch die Anwesenheit von Haptoglobin nachteilig dadurch verändert wird, daß es mit Haptoglobin einen Komplex bildet, der durch die retikuloendothelialen Zellen der Leber und Milz schnell entfernt wird. Darüber hinaus ist das intramolekular und intermolekular vernetzte Hämoglobin völlig verträglich mit den vorher geschaffenen chemischen Bedingungen innerhalb des Körpers, so daß es durch diese Chemikalien nicht leicht angegriffen wird und, wenn es schließlich abgebaut wird, Aminosäuren bildet, die der Körper leicht verwerten oder ohne Komplikationen ausscheiden kann. Ferner wird yernetztes Hämoglobin nicht leicht aus dem Körper durch die Nieren entfernt, wie es bei natürlichem Hämoglobin der Fall ist. Der Grund hierfür liegt darin, daß das natürliche Hämoglobin zu Molekülen mit einem mittleren Molekulargewicht von 34-.000 und teilweise von 17*000 dissoziiert. Dies sind verhältnismäßig kleine Proteinmoleküle, die von den Nieren leicht ausgeschieden werden, während das vernetzte Hämoglobin im Gegensatz hierzu nicht ausgeschieden wird. Das intervernetzte Hämoglobin gemäß der Erfindung mit einem mittleren Molekulargewicht zwischen 68.000 und 600.000 wird durch die folgenden allgemeinen Arbeitsschritte hergestellt:

409644/0

a) Zunächst wird Hämoglobin aus den roten Blutzellen in bekannter Weise durch Lyse der roten Zellen und Entfernung aller Membranmaterialien durch Zentrifugieren mit hoher Geschwindigkeit gewonnen.

b) Das gewonnene Hämoglobindimere oder -tetramere wird .dann bei einer Temperatur zwischen -5 und +10 C mit einem "Vernetzungsmittel der Formel

E-O-

- 0

= MH,

-J.

in der m und B die obengenannten Bedeutungen haben, bei einem pH-Wert zwischen 7,4 und 8,5» vorzugsweise durch kontinuierlichen Zusatz von Triäthylamin, umgesetzt. Hierbei wird ein Produkt erhalten, das > etwas nicht umgesetztes Hämoglobin, Hämoglobin mit einem Molekül arg ewich/c von mehr als 600.000 und Hämoglobin mit einem Molekulargewicht zwischen j 68.000 und 600.000 enthält.

c) Anschließend wird das in dieser Weise gewonnene Produkt der Fällung durch Zusatz von Ammoniumsulfat bis zu 0,2- bis O,25facher Sättigung unterworfen, wodurch das Material mit sehr hohem Molekulargewicht, d.h. über 600.000, ausgefällt wird. Nach Zentrifugierung der Fällung erfolgt eine weitere Zugabe von _: Ammoniumsulfat zum teilweise gereinigten Heaktionsprodukt, wodurch die Ammoniumsulfatkonzentration auf 50 %ige Sättigung erhöht wird. Hierbei wird ein vernetztes Hämoglobinmaterial mit einem Molekulargewicht zwischen 68.000 und 600.000 erhalten. .

d)Die in dieser Weise ausgefällte Mischung Ammoniumsulfat/ vernetzte Hämoglobinverbindung wird dialysiert, um das Ammoniumsulfat aus dem vernetzten Hämoglobin zu 409844/09 8 6

entfernen, wobei das gewünschte vernetzte Hämoglobin mit einem Molekulargewicht zwischen 68.000 und 600.000 in der richtigen Salzlösung gewonnen wird.

Das Verfahren umfaßt somit mehrere Schritte. Diese können in vier getrennte Stufen eingeteilt werden, nämlich Herstellung des Hämoglobinreaktanten, Herstellung des vernetzten Hämoglobins, Entfernung des gewünschten vernetzten Hämoglobins von anderen Hämoglobin enthaltenden Materialien und Abtrennung des gewünschten vernetzten Hämoglobins von anderen Materialien, insbesondere Salzen von Ammoniumsulfat, und ihren Ersatz durch Salze in einer Lösung, die mit den roten Blutzellen isotonisch ist. ;

Es ist zu bemerken, daß das Hämoglobin aus roten Blutzellen durch Lyse der roten Blutzellen in bekannter Weise und Entfernung aller Membranmaterialien durch Zentrifugieren mit hoher Geschwindigkeit hergestellt wird. Das Hämoglobin wird dann mit dem Vernetzungsmittel während einer Zeit bis zu 2 Stunden bei einer Temperatur zwischen 0 und +10 C vorzugsweise bei einem pH-7/ert zwischen 7i5 und 8,5 umgesetzt/ Das Hämoglobin ist in der Lösung, in der die Heaktion stattfindet, im allgemeinen in einer Menge zwischen 7 und 12 g/100 ml Lösung vorhanden. Das Hämoglobin kann in gewissem Umfange in der Lösung unter Bildung von Polypeptid-Untereinheiten dissoziieren, wobei eine gewisse Menge von Dimeren vom Molekulargewicht 34.000 gebildet werden, die ihrerseits unter Bildung von Polyhämoglobin mit einem Molekulargewicht von 68.000 oder mehr vernetzt werden können. Tetramere bilden schwereres Polyhämoglobin.

Es wurde gefunden, daß, wenn das Vernetzungsmittel verhältnismäßig langkettig ist, wie es beispielsweise der Fall ist, wenn m einen V/ert von 6 bis 12, insbesondere von 6 bis 8 hat, und der Hämoglobinreaktant

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-Q-

in einer Menge von 1 % vorhanden ist, ein intramolekular vernetztes Hämoglobinmaterial erhalten wird, dessen Polypeptideinheiten durch das Vernetzungsmittel verbunden sind. Die Verbindung des Vernetzungsmittels mit den Polypeptideinheiten befindet sich an den £-Aminogruppen von Lysy!resten an Jeder Polypeptideinheit. Es wird angenommen, daß durch Verwendung eines langkettigen bifunktionellen Vernetzungsmittels die Kettenlänge sich von einer Untereinheit des Hämoglobindimeren oder -tetrameren zu einer anderen Untereinheit erstreckt. Das Ergebnis ist, daß ein Produkt mit einem mittleren Molekulargewicht von etwas mehr als 68.000 erhalten wird, worin die Untereinheiten durch das Vernetzungsmittel verbunden sind. Durch 7/ahl eines langkettigen Vernetzungsmittels werden die Gelegenheiten zur Verbindung der funktioneilen Gruppe der Vernetzungsmittel mit £-Aminogruppen von Polypeptideinheiten der gleichen Hämoglobinstruktur deutlich gesteigert. Ss wird angenommen, daß die Erscheinung nicht in einem größeren Ausmaß stattfindet, wenn m den Wert Λ bis 5 hat, weil die Länge des Vernetzungsmittels nicht genügt, um die -OR-Gruppen mit dem Wasserstoffatom an der £-Aminogruppe in Berührung und die Bindung Zustandekommen zu lassen. Die Bindungen zwischen den Atomen des Vernetzungsmittels sind nicht genügend elastisch, um dem Vernetzungsmittel die Möglichkeit zu geben, den Abstand zwischen den Polypeptideinheiten der gleichen Hämoglobinstruktur zu überbrücken. "Jenn somit ein Vernetzungsmittel von geringer Kettenlänge verwendet wird, verbindet das Vernetzungsmittel Hämoglobindimer— oder -tetramereinheiten einer Hämoglobinstruktur mit Untereinheiten einer benachbarten Hämoglobindimer- oder -tetramerstruktur, wodurch ein intermolekular vernetztes Hämoglobinmaterial gebildet wird.

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Es wurde gefunden, daß die Konzentration des Hämoglobins in der Lösung, in die das Vernetzungsmittel gegeben wird, eine wichtige Bolle in der Lenkung des Prozesses und hinsichtlich der Bestimmung des erhaltenen Produkts spielt. Das Hämoglobinvernetzungsverfahren gemäß der Erfindung kann zwar allgemein unter Verwendung einer Hämoglobinlösung durchgeführt werden, die Hämoglobin in einer Konzentration von O_r5 Gew.—# als untere Grenze bis zu 12 Gew.-ja als obere Grenze enthält, jedoch hängen die Ergebnisse von der Hämoglobinkonzentration ab. 7/enn das Hämoglobin in einer Menge zwis'chen 0,5 bis 1,5 Gew.-ίέ in der Lösung vorhanden ist, ist das vernetzte Hämoglobin .weitgehend intramolekular vernetzt. Im allgemeinen haben wenigstens 80 % des synthetisierten vernet-zten Hämoglobins bei Verwendung einer solchen verdünnten Hämoglobin lösung ein Molekulargewicht ;' zwischen 68.000 und 85.000, d.h. im wesentlichen die : gesamte Vernetzung findet innerhalb der Polypeptid- \ Untereinheiten der gleichen Hämoglobinstruktur statt.

Wenn andererseits die Hämoglobinkonzentration zwischen etwa 1,5 und 8" Gew.-?£ liegt, wird ein Gemisch von intramolekular vernetztem Hämoglobin und intermolekular vernetzten! Hämoglobin erhalten. Ebenso ist bei Verwendung einer stärker konzentrierten Hämoglobinlösung im Prozeß, z.B. einer Lösung mit einer Eämoglobinkonzentration von 8 bis 12 Gew.-^6, das Produkt im wesentlichen vollständig intermolekular vernetzt, d.h. ein Produkt, das Polypeptideinheiten von verschiedenen Hämoglobinstrukturen enthält, wird erhalten. ^:

Das intramolekular vernetzte Hämoglobin wird nacn dem gleichen allgemeinen Verfahren hergestellt, das vorstehend im Zusammenhang mit der Herstellung von intermolekular vernetztem Hämoglobin beschrieben wurde. Allgemein wird wie folgt gearbeitet: Das Material wird

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hergestellt, indem eine Lösung, die 0,5 bis 1»5 Gew.-% Hämoglobin enthält, mit dem vorstehend genannten Vernetzungsmittel, in dem m einen Wert von 6 bis 12, vorzugsweise von 6 bis 8 und R die oben genannte Bedeutung hat, bei einem pH-'tfert von 7»4- bis 8,5 zusammengeführt. Die Zugabe der Reaktionsteilnehmer erfolgt über einen Zeitraum von 1 bis 1,5 Stunden, so daß das langkettige Vernetzungsmittel eine stärkere Neigung zur Bildung intramolekularer Vernetzungsbrücken als zur Bildung von intermolekularen Vernetzungsbrücken hat. Das l Produkt wird auf pH 7,4- eingestellt und anschließen! filtriert. Die Fällung oder ein etwaiger Peststoff wird verworfen. Die überstehende Flüssigkeit wird durch Ultrafiltration auf eine Hämoglobinkonzentration ' zwischen 5 % und 7 %, insbesondere von 6 }Ό konzentriert ; und umfassend gegen eine 0,9%ige Natriumchlcridlösur-g : (isotonische Kochsalzlösung) dialysiert. Das in dieser \ Weise dialysierte Material wird durch ein Millipore-Filter mit einer Porenweite von 0,2 u geleitet. · ;

Als. Vernetzungsmittel eignen sich für die Zwecke der j Erfindung die "Verbindungen der vorstehend genannten Formel, insbesondere beispielsweise Dimethylmalonsäureimidat, DiäthyIbernsteinsäureimidat, Dimethylglutar-.säureimidat, Dimethyl- oder Diäthyladipinsäureimidat, Dimethylpimelinsäureimidat, Dimethylkorksäureimidat, ; Dimethylazelainsäureimidat, Dimethylsebacinsäureimidat, Dimethyldecandicarbonsäureimidat und Dirne thy ldodecandicarbonsäureimidat, sämtlich als Hydrochloride.

Von den vorstehend genannten Vernetzungsmitteln wird das Dimethylsebacinsäureimidat, in dem m den Wert 8 hat, .besonders bevorzugt. Der Grund hierfür liegt, darin, daß die Sebacinsäureimidateinheit die am meisten gewünschte Länge hat und der Länge zwischen Lysengruppen benachbarter Polypeptideinheiten am nächsten

' A09BAA/D986

kommt.

Durch die intramolekulare Vernetzungsreaktion wird eine positiv geladene 6 -ΝΗΪ-G-ruppe entfernt und durch, eine Imidatgruppe EHp ersetzt, wodurch die Oberflächenladungseigenschaften des Hämoglobinmoleküls nicht verändert werden. Dies ist ein entschiedener Vorteil, da man bestrebt ist, viele der Eigenschaften des Hämoglobinmaterials möglichst genau bei denen des natürlichen Materials zu halten und hierdurch nicht irgendwelche Oberflächenladungseigenschaften seines Proteins zu verändern.

Die Menge des Vernetzungsmittels bestimmt in gewissem Umfange das Ausmaß der Vernetzungsreaktion. Es sei daran erinnert, daß Materialien mit einem mittleren Molekulargewicht von mehr als 600.000 unerwünscht sind, da sie zu groß sind, um im Blutkreislaufsystem aufgenommen zu werden. Das Vernetzungsmittel ist vorzugsweise in einer Menge von 4,4 g/100 ml einer 10%igen Hämoglobinlösung, jedoch allgemein in einer Menge zwischen 3 und 5 g/100 ml einer 10#igen Hämoglobinlösung vorhanden. Beim Verfahren gemäß der Erfindung können Gemische von intramolekular und intermolekular vernetzten Materialien gebildet werden, wenn Vernetzungsmittel verwendet werden, in denen m einen Wert von 1 bis 12 hat. Im allgemeinen werden jedoch keine intramolekular vernetzten Materialien gefunden, bei denen m in der Formel kleiner als 6 ist. Umgekehrt werden im allgemeinen keine intermolekular vernetzten Materialien gefunden, in denen nr größer als 6 ist, wenn die Hämoglobinkonzentration niedrig ist.

Das Verfahren wird unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes zwischen 7,5 und 8,5 zweckmäßig durchgeführt, indem geringe Mengen Triäthylamin kontinuierlich in das Reaktionsgemisch eingeführt werden. Triäthylamin

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erwies sich, als außergewöhnlich, wertvolle Base, die zur Aufrechterhaltung des pH-7/ertes innerhalb des ^: vorstehend genannten Bereichs verwendet wird. ITach ^: beendeter Reaktion braucht kein weiteres Triäthylamin mehr zugesetzt zu werden. Die Vollendung der Reaktion läßt sich leicht unter Verwendung eines pH-Messers feststellen. Normalerweise würde die Reaktion kontinuierlich, zum Verbrauch von basischen Materialien neigen, wodurch, der pH-Wert gesenkt wird. Die Srniedrigung des pH-Wertes wird durch, das Triäthylamin j ausgeglichen. Wenn alle Reaktionsteilnehmer umgesetzt ^: sind, findet keine pH-Senkung statt, ein Zeichen, daß die Reaktion vollendet und der Zusatz von driäthylamin nicht mehr notwendig ist. !

I Das Reaktionsprodukt wird zweckmäßig zunächst einer _; Fällung unterworfen, um vernetzte Hämoglobinmaterialien, mit extrem hohem Molekulargewicht zu entfernen. Dies = geschieht durch Zusatz einer mit Ammoniumsulfat _# [-gesättigten Lösung in einer solchen Weise, daß das ' Ammoniumsulfat in einer Menge von wenigstens 20 % bis ; 25 % Sättigung vorhanden ist, wobei die obere Grenze von der gewünschten oberen Grenze des mittleren Mole- . kulargewichts des zu gewinnenden Produkts abhängig ist.

Nachdem die Fällung Atnmoniumsulfat/vernetztes Hämoglobin durch Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzen- : tration auf 50 Yo Sättigung isoliert worden ist, können die Ammonium- und Sulfationen durch Dialyse leicht vom vernetzten Hämoglobin entfernt werden. Die Dialyse kann durchgeführt werden, um die vorhandenen Ammonium- · und Sulfationen zu entfernen und sie durch anorganische Salze zu ersetzen, die für die Einführung in den Blutkreislauf gewünscht werden, wenn das vernetzte Hämoglobin dem Blut zugesetzt wird.

Wenn das vernetzte Hämoglobin in Mischung mit anorga-4 09844/0986 "

nischen Salzen vorliegt, ist somit ein vernetztes Hämoglobinprotein-Ersatzmittel gebildet worden, das die ; folgenden Komponenten enthält: 5 bis &% Polyhämoglobin in einer 310-milliosmolaren Lösung von Natriumphosphat in Wasser mit einem pH-Wert der Lösung von 7,4.("Milliosmolar" bezeichnet die Zahl der Millimole, die zur Einstellung eines bestimmten osmotischen Drucks erforderlich ist. 310-milliosmolar ist die Konzentration anorganischer Salze, die dieser Salzkonzentration im normalen Blutplasma entsprechen würde.) Es können jedoch 4 bis 8 Gew.-% Polyhämoglobin in einer wäßrigen Salzlösung von pH 7*4, die isotonisch zu Blut ist, verwendet werden". ^!

Wie die vorstehenden Ausführungen zeigen, ist das Hämoglobinmolekül ein kompliziertes Molekül, das in Wirklichkeit aus vier Polypeptideinheiten besteht, von denen jede lose an die anderen Einheiten gebunden ist. Im Molekül des Hämoglobintetrameren, das ein Molekulargewicht von etwa 68.000 hat, sind zwei a-Polypeptideinheiten und zwei ß-Polypeptideinheiten vorhanden. Die intermolekulare · Vernetzung findet zwischen diesen Einheiten von verschiedenen Hämoglobintetramermolekülen in der nachstehend dargestellten Weise statt: · .

H NH₂"

NH-@*—@-N-C-(CH₂)_m-C-NH-Q·.. Q-N-C-(CH₂)_m-C-NH-Q"-Q-

.NH-@ @

H NH₂ NH₂ NH_p NH_p

In den vorstehenden Formeln Ist die g-Aminogruppe jeder
Untereinheit, die reagiert, dargestellt. Wenn eine intramolekulare Vernetzung nicht innerhalb des gleichen Hämoglobinmoleküls, sondern zwischen zwei verschiedenen Humoglobinmolekülen stattfindet, verläuft die Reaktion in der nachstehend dargestellten Weise:

HN-ta

HN- ta

-NH

NH²

NH

I i

+RO-C- (CH₀) - C - OR

Die ε-Aminogruppe jeder Polypeptideinheit, die an der Reaktion teilnimmt,· ist vorstehend dargestellt. Die Reaktion kann auch zwischen α*- und ßg- und ß.- und cu-Gruppen stattfinden, wenn das Vernetzungsmittel lang-.kettig genug ist.

Hierdurch wird das Vernetzungsmittel wirksam ausgenutzt. Zusätzlich hat das so gebildete vernetzte Hämoglobin eine nützliche Bindung, so daß das vernetzte Hämoglobin nicht dem Angriff durch das im Blut vorhandene Haptoglobin oder einer Dissoziation in niedrigmolekulare Einheiten unterliegt.

Es ist offensichtlich aus den vorstehenden Formeln, die die polymeren Einheiten des vernetzten Hämoglobins darstellen, daß in Abhängigkeit von der Art der angewandten Vernetzungsbedingungen verschiedene wiederkehrende Einheiten vorhanden sind. In der Formel für intermolekular vernetztes Hämoglobin hat Ji einen Wert zwischen 2 und 5. Dieses vernetzte Hämoglobin kann somit als ein Oligomeres, d.h. ein vernetztes polymeres Hämoglobin, bei dem nur eine begrenzte Anzahl von wiederkehrenden Einheiten vorhanden ist,, angesehen werden. Offensichtlich kann ein Material mit höherem Molekulargewicht nicht vorteilhaft im Blutkreislauf verwendet werden. Ein solches Material kann auch eine zu hohe Beständigkeit gegen Abbau haben und somit für eine unnötig lange Zeit nach der Genesung eines Patienten zurückgehalten werden. Das intramolekular vernetzte Material läßt sich nicht leicht einstufen. Es ist oligomer in dem Maße, in dem Vernetzung zwischen Polypeptideinheiten von verschiedenen Hämoglobindirneroder -tetramereinheiten stattfindet.'

AO984470986

Die Plasmaersatzmittel gemäß der Erfindung sind besonders vorteilhaft in Krisensituationen, bei denen der Blutdruck im Körper schnell wieder auf die gewünschte Höhe gebracht werden soll. Das Material arbeitet wenigstens teilweise in der gleichen Weise wie das Serumalbumin. Die vernetzten Hämoglobine gemäß der Erfindung nutzen jedoch zusätzlich das Hämoglobin der roten Blutzellen, das andernfalls verworfen würde, nutzbringend aus. Sie sind mit dem menschlichen Blutkreislaufsystem vollständig verträglich, so daß sie äußerst vorteilhaft und erwünscht sind, da sie nicht die bei rein synthetischem Blutplasmaersatzmitireln oder Plasmaexpandern auftretenden Probleme hinsichtlich ihrer natürlichen Elimination aus dem Körper aufwerfen. Ferner bilden die neuen Plasmaexpander keine Antikörper. Diese Antikörperbildung ist ein charakteristischer Nachteil anderer bisher hergestellter Plasmaersatzmittel.

Die zur Vernetzung des Hämoglobins verwendeten bifunktionellen Imidate sind Verbindungen der folgenden _: Formel:

CH,. oder C₀H₁-O^C =
3 2 5 ι

^,. oder C_oH_c-0.C = ΝΗΪ . j

3252 I

Hierbei hat m für die intermolekulare Vernetzung einen ' Wert von 1 bis 12 und für die intramolekulare Vernetzung

einen Wert von 6 bis 12, insbesondere von 8. Diese ·

Verbindungen reagieren mit ^.-Aminogruppen von Lysyl- " ! resten an der Oberfläche jeder der vier Untereinheiten

des Hämoglobintetrameren. _;

4 09&44/098 6"

In konzentrierten Lösungen von Hämoglobin (7 bis
und bei einem pH-Wert von beispielsweise 8,5 findet die Vernetzung zwischen Untereinheiten von verschiedenen Tetrameren statt, wobei Hämoglobinpolymere entstehen, deren Dissoziation durch die oovalenten Vernetzungsbrücken verhindert wird. Die Reaktion kann-wie folgt dargestellt werden:

NH₂

NH P2

• i

J_{2 +} C₂H₅-O-C - (CH₂)_m - CO-C₂H₅

^H2^NO-Cr

NH₂

I ., -j

Il d. ti

usw. -ΗΝ-ΓΛ-Q-NH-C -(CH₂)_m-C-NH—Q.-Q -NH-usw.

f ₊ O

c = NH+

C₂)_m usw.

C = NH+

NH

\C\ NH usw.

An Stelle der Reaktion des Tetrameren in der dargestellten Weise kann ein Dimeres, z.B. ein a-ß-Dimeres reagieren, wobei f X eine Untereinheit eines Hämoglobin- . tetrameren ist und die -NHp-Gruppen die £-Aminogruppen der lysylreste darstellen. Bei der intramolekularen Vernetzung hat das Vernetzungsmittel die richtige Größe,' um Dissoziation des Hämoglobintetrameren zu hemmen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Seispiele weiter erläutert.

Beispiel 1 j

In einem auf 5⁰C gekühlten Becherglas, das mit einem ^: Magnetrührer versehen war, wurden 2,4 g Diäthylmalonsäureimidathydrochlorid in 5 ml 0,05-molarem Natriumphosphatpuffer bei p„ 8,5 gelöst. Eine Lösung von 5K NaOH wurde tropfenweise zugesetzt, bis die Reagenslö- _; sung milchig wurde (p_u 7 bis 8), worauf 50 ml einer

Xl ί

"!Öligen Hämoglobinlösung schnell zugesetzt wurde. Die ' Lösung wurde mit Alkali auf p™ 0,5 eingestellt und mit · fortschreitender Reaktion bei diesem p_H-Wert gehalten. ^: Nach 1,5 bis 2 Stunden war die Reaktion im wesentlichen beendet, erkennbar am Aufhören der Säureentwicklung. _;

Das Polyhämoglobin wurde vom niedrigmolekularen Mate- ; rial durch Fällung bei 505ε Sättigung mit Ammoniumsulfat abgetrennt und durch Zentrifugieren isoliert. Die Fäl- '' lung wurde erneut in Wasser gelöst und noch zweimal mit Ammoniumsulfat erneut ausgefällt. Die endgültige Fällung wurde in Wasser zu einer 10bigen Lösung gelöst und gegen .eine Lösung, die 310-milliosmolar in Bezug auf Natriumphosphat war,bei pH 7,4 weitgehend dialysiert, durch ein 0,25/U-Filter filtriert und bei 5⁰C gelagert. Die Ausbeuten bei drei Versuchen betrugen 4o, 44 und 47 % des Ausgangsmaterials je nach der Konzentration der Hämoglobinlösung.

A DTS 4'4TO 9 8'6

Beispiel 2

Die Reaktion und Isolierung wurden auf die in Beispiel 1 ■beschriebene Weise durchgeführt, wobei jedoch der 0,05-molare Natriumphosphatpuffer, p_H 8,5 und 5H UaOH durch Triäthylamin ersetzt wurden, um das Ausmaß der Denaturierung des Hämoglobins "bei Zusatz von überschüssigem starkem Alkali zu verringern. Ausbeuten über 55 bis wurden erhalten.

Beispiel 3

Das nach den beiden vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellte Polyhämoglobin enthielt eine kleine Fraktion (5$) mit einem Molekulargewicht von 800.000, die zur Bildung von unlöslichem Material beim Stehenlassen beitrug. Diese Fraktion wurde durch Vorfällung bei 20 bis 255^ Sättigung mit Ammoniumsulfat entfernt. Diese Fällung wurde verworfen und das verbleibende Polyhämoglobin durch Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration auf 0,50 ausgefällt. Eine Lösung dieses Präparats ist im gefrorenen Zustand stabil.

Bei den in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Versuchen wurde Diäthylmalonsäureimidathydrochlorid als Vernetzungsmittel verwendet. Es wurde jedoch gefunden, daß auch andere Vernetzungsmittel der vorstehend genannten Formel verwendet werden können. Hierzu gehören Dimethyladipinsäureimidat und Diaethylkorksäureimidat. Die letztgenannte Verbindung führt zu intramolekular vernetzten Produkten,wie die folgenden Beispiele 4 bis 7 zeigen.

Das gemäß der Erfindung hergestellte Polyhämoglobin ist dem natürlichen Hämoglobin als Plasmaeiweiß-Ersatzmittel überlegen, da Hämoglobin selbst eine begrenzte Lebensdauer hat, wenn es in das Plasma infundiert wird. Hämoglobin selbst pflegt zu den Dimeren zu dissoziieren, die (a) sich mit dem normalen Plasmahaptoglobin unter Bildung

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eines Komplexes verbinden, der durch die retikuloendothelialen Zellen der Leber und Milz entfernt wird, und die (b) ein Molekulargewicht (34.000) haben, das ihre Ausscheidung durch die Nieren ermöglicht. Die Hämoglobinpolymeren verbinden sich nicht mit Plasmahaptoglobin und dis$oziieren nicht vollständig zu kleinen Einheiten, die durch die Nieren ausgeschieden werden können.

Um dies zu veranschaulichen, wurde die Verweildauer von normalem Hämoglobin und von Polyhämoglobin (intermolekular vernetzt) im Plasma bei Kaninchen bestimmt. Zunächst wurde·die Verweildauer von Kaninchenhämoglobin, und zwar sowohl von normalem Hämoglobin als auch von Polyhämoglobin, bei diesen Versuchstieren bestimmt. Anschließend wurde die Verweildauer von menschlichem Hämoglobin, und zwar sowohl von normalem Hämoglobin als auch von Polyhämoglobin, im Plasma bei den Versuchstieren bestimmt. Das verwendete Hämoglpbinpolymere war ein Gemisch von etwa

Die Molekulargewichte lagen im Bereich von 300.000 bis 450,000. Durchschnittlich 27 von insgesamt 46 Lysylaminogruppen pro Tetrameres waren an der Vernetzungsreaktion beteiligt. Die Ergebnisse der Ermittlung der Verweildauer sind in der folgenden !Tabelle genannt. In dieser Tabelle bedeutet T-l/2 die Zeit bis zur Entfernung der Hälfte des injizierten Materials aus dem Plasma bei den Kaninchen, denen normales Hämoglobin und Polyhämoglobin verabreicht worden war.

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	Normales	Hämoglobin	Polyhämoglo- bin	1-1/2 Min.
	Dosis g/kg	T-1 /2 Min.	Dosis g/kg	245 300 900
1) Kaninchenhämo globin in Kaninchen	0,134 0,137 0,50	55 80 85 ■	0,134 0,137 0,50	900 1605
2) Menschliches Hämoglobin in Kaninchen	0,27 0,42	80 110 _	0,27 0,42
Intramolekular vernetztes	Hämoglobin

Beispiel 4

0,44 g DiäthylmalonsäureimidathydroChlorid wurde in fünf gleichen Teilen unter Rühren zu 100 ml einer Lösung von menschlichem Hämoglobin bei 5 C gegeben, wobei der PjT-Wert durch Zusatz von Triäthylamin bei 8,5 gehalten wurde. Nach 1 bis 2 Stunden benötigte die Lösung kein Triäthylamin mehr für die Aufrechterhaltung des pjT-Wertes. Die Lösung wurde mit verdünnter Salzsäurelösung auf PjJ 7i4 gebracht und zur Entfernung von etwaigem unlöslichem überschüssigem Reagens zentrifugiert. Die modifizierte Hämoglobinlösung wurde durch Ultrafiltration eingeengt, bis die Hämoglobinkonzentration 5 bis 6$> erreichte, und weitgehend gegen mehrmals ausgetauschte 0,9#ige NaCl-Lösung dialysiert,

Beispiel 5 ;

Die Reaktion wurde auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise unter Verwendung von 0,52 g Dimethyladipinsäureimidathydrochlorid pro 100 ml 1^ige Hämoglobinlösung durchgeführt.

Beispiel! 6

Der in Beispiel 4 beschriebene Versuch wurde unter Verwendung von 0,57 g Diraethylkorksäureimidathydrochlorid pro 100 ml 1$ige Hämoglobinlösung wiederholt.

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Beispiel 7

Die in Beispiel 4 beschriebene Reaktion wurde unter Verwendung von 0,63 g Dimethylsebacinsäureimidathydro.-ehlorid pro 100 ml 1$ige Hämoglobinlösung wiederholt.

Um den Grad der intramolekularen Vernetzung zu bestimmen, wurden die ungefähren Molekulargewichte der gemäß den vorstehenden Beispielen hergestellten modifizierten Hämoglobine durch Filtration durch eine Chromatographiesäule bestimmt, die mit dem Produkt "Sepharose 6B" (Pharmacia Co.) gefüllt und mit einer Anzahl von Proteinen von bekanntem Molekulargewicht einschließlich nichtmodifiziertem menschlichem Hämoglobin, das ein Molekulargewicht von 68.000 hat, standardisiert war. Wenn sie mit einer I^igen Hämoglobinlösung zusammengebracht und in mehreren Portionen zugesetzt wurden, ergaben diesen Reagentien ein Produkt, das zu 85 bis 90% ein ungefähres Molekulargewicht von 68.000 hatte, obwohl etwa 50 der insgesamt 44 Lysinreste mit dem Reagens reagiert hatten.

Da es das Ziel, dieser Versuche war, ein intramolekular vernetztes Hämoglobintetrameres herzustellen, das nicht zu Untereinheiten von niedrigerem Molekulargewicht dissoziiert, wurde das A_usmaß einer möglichen Dissoziation gemessen, indem jedes modifizierte Hämoglobin der dissoziierenden Wirkung von Natriumdodecylsulfat während der Elektrophorese an Polyacrylamidgel unterworfen wurde. Nach der Färbung jeder Proteinbande und Entfärbung wurde die relative Verteilung der dissoziierbaren Einheiten mit einem Abtastdensitometer und durch Vergleicbjmit Proteinen von bekanntem Molekulargewicht der Untereinheiten gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt. Sie veranschaulichen die Wirksamkeit der Diimidate mit längerer Kette bei der intramolekularen Vernetzungsreaktion.

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Verteilung von dissoziierbaren Untereinheiten von vernetzten Hämoglobinen durch Natriumdodecylsulfat

Dissoziierbare	Vergleichs-	DEM-*	DMA-*	DMS-*	DMSb-*
Untereinheit	Hämoglobin	Hb	Hb 1°	Hb	Hb
Monomeres	100,0	37,4	31,9	6,8	2,6
Dimeres	0	31,2	35,5	19,1	10,2
Trimeres	0	0,5	11,5	25,3	18,8
Tetrameres	0	0,0	6,6	21,4	33,6
Tetrameres	0	30,0	14,2	27,2	34,6

* DEM = Diäthylmalonsäureimidat DMA = Dirnethyladipinsäureimidat DMS = Dimethylkorksäureimidat DMSb= Dimethylsebacinsäureimidat Hb = Hämoglobin

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Claims

Patentansprüche

Plasmaprotein-Ersatzmittel in Form eines Hämoglobin enthaltenden Materials in polymerer Form, wobei das Polymerisat die wiederkehrende Einheit der Formel

HN-

L \

Hämoglobindimeres oder -tetrameres

NHI

NH,

₂) -C - Hämoglobin- \ -NH Idimeres oder \-tetrameres j

in der m für 1 bis 12 steht, enthält und ein mittleres Molekulargewicht zwischen 68.000 und 600.000 hat und die Komponente der Formel

ml *™⁺

- C-- (CH₂)_m- C-

über S:-Aminogruppen von Lysylresten des Hämoglobin- [ dimeren oder -tetrameren an die Hämoglobindimer- oder -tetramergruppe gebunden ist. . · _;

Plasmaprotein-Ersatzmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet', daß ein größerer Anteil des Polymerisats ein mittleres Molekulargewicht zwischen 68.000 und 600.000 hat. j

Plasmaprotein-Ersatzmittel nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerisat 1 bis

10 wiederkehrende Einheiten aufweist. . \.

Plasmaprotein-Ersatzmittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß m in den vorstehenden Formeln einen Wert zwischen 1 und 4 hat.

Verfahren zur Herstellung von vernetztem Hämoglobin ' nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Hämoglobin mit einem Vernetzungsmittel der allgemeinen Formel ,

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E-O-C- NH₂

R _ 0 - C = NH*

in der R ein Alkylrest mit 1 bis 8 C-Atomen ist und in die oben genannte Bedeutung hat, bei einer Temperatur zwischen 0° und +10⁰C und einem pH-Wert zwischen 7*5 und 8,5 zusammenführt und ein polymeres vernetztes Hämoglobin mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 68000 bis 600 000 isoliert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion für eine Zeit bis zu etwa 2 Stunden bei einer Temperatur zwischen 0° und 5°c durchführt und hierbei kontinuierlich Triäthylamin zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes zwischen 7,5 und 8,5 zusetzt.

7· Verfahren nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Hämoglobin als Lösung, die 7 bis 12 g Hämoglobin pro 100 ml der zu behandelnden Lösung enthält, und etwa 4,4 g Vernetzungsmittel pro 100 ml !Obiger Hämoglobinlösung verwendet.

8". Verfahren nach Anspruch 5 his 7* dadurch gekennzeichnet, daß man des Vernetzungsmittel in Form eines Hydrochloride verwendet.

9, Verfahren nach Anspruch 5 his 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel Diäthylmalonsäureimidathydrochlorid bzw. Dimethyladipinsäureimidat verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Vernetzungsmittel verwendet, in dessen Formel m den Wert 6 bis 12 hat.

11. Verfahren nach Anspruch 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin in einer Konzentration von 0,5 bis 8#, vorzugsweise als 0,5- bis l,5^ige Lösung verwendet wird.

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12»verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel Dimethylkorksäureimidat, Dimethylazelainsäureiraidat, Dimethylsebacinsäureimidat, Dimethyldecandicarbonsäureimidat, bzw. Dimethyldodecandicarbonsäureimidat verwendet.

1?. Intramolekular vernetztes Hämoglobin, in dem wenigstens eine Polypeptideinheit mit einer anderen einzelnen Polypeptideinheit des gleichen Hämoglobintetrameren durch ein Vernetzungsmittel der Formel

in der m für 6 bis 12 steht, vernetzt ist, wobei das Vernetzungsmittel an die Polypeptideinheiten an fc-Aminogruppen von Lysylresten gebunden ist und das Hämoglobin ein durch Gel-Elektrophorese bestimmtes Molekulargewicht zwischen 68.000 und 85.000 hat.

14. Intramolekular vernetztes Hämoglobin nach Anspruch I3,

dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 8o# der Komponenten ein Molekulargewicht zwischen 68.000 und 85.000 haben.

15. Intramolekular vernetztes Hämoglobin nach Anspruch I3 und

14, dadurch gekennzeichnet, daß m den Wert 6 hat.

16. Intramolekular vernetztes Hämoglobin nach Anspruch I3

und 14, dadurch gekennzeichnet, daß m den Wert 7 hat.

17. Intramolekular vernetztes Hämoglobin nach Anspruch Ij5 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß m den Wert 8 hat.

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