DE2417619C2

DE2417619C2 - Intramolekular vernetztes Hämoglobin, Verfahren zu dessen Herstellung und seine Verwendung

Info

Publication number: DE2417619C2
Application number: DE2417619A
Authority: DE
Inventors: Abraham New York N.Y. Mazur
Original assignee: Community Blood Council Of Greater New York Inc New York Ny Us
Current assignee: Community Blood Council Of Greater New York Inc New York Ny Us
Priority date: 1973-04-11
Filing date: 1974-04-10
Publication date: 1986-10-23
Also published as: SU629854A3; CA1033721A; FR2225171B1; DE2417619A1; SE429195B; US3925344A; GB1427903A; FR2225171A1; BR7402876D0; NL7404140A

Description

R-O-C=NH₂ ⁺ I

(CH₂)_

in der R ein Alkylrest mit 1 bis 8 C-Atomen ist und m den Wert 6 bis 12 hat, bei einer Temperatur zwischen 0° und +10⁰C und einem pH-Wert zwischen 7,5 und 8,5 zusammenfuhrt und ein vernetztes Hämoglobin mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 68 000 bis 85 000 isoliert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion für eine Zeit bis zu etwa 2 Stunden bei einer Temperatur zwischen 0° und 5⁰C durchführt und hierbei kontinuierlich Triethylamin zur

Aufrechterhaltung des pH-Wertes zwischen 7,5 und 8,5 zusetzt.

5. Verfahren nach Ansprüchen 3 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Vernetzungsmittel in Form eines Hydrochlorids verwendet.

6. Verfahren nach Ansprüchen 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel Dimethylkorksäureimidat, Dimethylazelainsäureimidat, Dimethylsebacinsäureimidat, Dimethyldecandicarbonsäu- reimidat, bzw. Dimethyldodecandicarbonsäureimidat verwendet.

7. Verwendung des intramolekular vernetzten Hämoglobins nach den Ansprüchen 1 bis 2 in einem Plasmaproteinersatzmittel.

Die Erfindung betrifft ein Plasmaeiweißmaterial, das auch als Plasmaexpander bekannt ist. Die Erfindung ist auf ein vernetztes polymeres Hämoglobinmaterial gerichtet, das als Plasmaeiweißersatz oder Plasmaexpander dient und mit dem chemischen System des menschlichen Körpers verträglich ist und schließlich zu Aminosäuren abgebaut wird, die leicht verwertet oder vom Körper abgeführt werden können. Die Erfindung umfaßt insbe- sondere intramolekular vernetztes Hämoglobin mit niedrigem Molekulargewicht, speziell ein intramolekular vernetztes Hämoglobinmaterial mit einem Molekulargewicht zwischen 68 000 und 85 000. Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen intramolekular vernetzten Hämoglobins sowie seine Verwendung in einem Plasmaproteinersatzmittel.

Vollständiges Blut erwies sich als äußerst wertvolle Substanz fur die Behandlung von Patienten nach starken

Blutverlusten oder nach einem Schock. Leider kann vollständiges Blut z. Zt. nur etwa 21 Tage gelagert werden. Es wurde festgestellt, daß vollständiges Blut bezüglich der darin enthaltenen roten Blutzellen zerfallt, so daß es notwendig wird, die roten Zellen zu verwerfen. In nicht zu ferner Vergangenheit wurde vorgeschlagen, das Blut in eine Anzahl seiner Komponenten zu zerlegen, die fur die zukünftige Verwendung konserviert werden können. Eine dieser Komponenten ist das Blutplasma. Leider gibt es noch im vollständigen Blut Substanzen wie Hämo globin von eiweißartiger Natur, die bisher verworfen wurden. Kürzlich wurde vorgeschlagen, vom Plasma das Serumalbumin zu trennen, das ein Eiweißstoff ist, der sich als wertvoll als Plasmaeiweißersatz oder Plasmaexpander erwies. Bisher wurde das Hämoglobin in den roten Zellen verworfen, da es keinen bekannten Verwendungszweck dafür gab. Hämoglobin ist ein Protein, dessen Hauptaufgabe der Transport von Sauerstoff aus der Lunge durch den Blutstrom zu den Geweben des Körpers ist. Ebenso wie andere Eiweißstoffe im Plasma kann das Hämoglobin auch eine weitere Aufgabe haben, die äußerst wichtig ist und darin besteht, zur Aufrechterhaltung des richtigen Blutdrucks im Körper beizutragen. Ein osmoiischer Druck wird gegen die Membranen der Blutgefäße erzeugt, wodurch es dem Wasser und anderen niedrigmolekularen Materialien des Bluts möglich ist, durch die Membranwände der kleinen Blutgefäße (Kapillaren) hindurchzutreten, wodurch der gewünschte Blutdruck aufrechterhalten wird.

Wenn jedoch ein Patient Blut verliert, gehen auch die Plasmaeiweißstofie, die den Blutdruckausgleich aufrechterhalten, verloren. Wenn eine wesentliche Menge des Plasmaeiweißes aus den Blutgefäßen verlorengeht, erreicht der Blutdruckabfall einen kritischen Wert, und Wasser tritt aus dem Blut in die Gewebe über (Ödem).

Wenn Hämoglobin als Plasmaexpander verwendet werden sollte, hat es leider den Nachteil, daß im Körpersystem die schwachen Bindungen, die die Polypeptidgruppen des Tetraineren verbinden, getrennt werden, so daß das Hämoglobin in Polypeptide von niedrigem Molekulargewicht (17 000) abgebaut und ausgeschieden werden kann.

Es ist erwünscht; über ein Material zu verfügen, das, wenn es in die Blutgefäße eingeführt wird, schnell und s leicht den Blutdruck auf gewünschte vorbestimmte Werte erhöht und jeder Neigung zu Ödemen entgegenwirkt. Ferner ist es überaus erwünscht, ein Plasmaeiweiß-Ersatzmittel auf Basis eines natürlichen Materials verfügbar zu haben, das der Körper leicht aufnehmen und verarbeiten kann. Äußerst erwünscht wäre ferner eine Nutzbarmachung des in den roten Zellen von vollständigem Blut vorhandenen Hämoglobins und hierdurch die Erhaltung dieses wertvollen Eiweißstoffs.

Es besteht außerdem ein Bedürfnis für ein Hämoglobinmaterial, das ungefähr das gleiche Molekulargewicht wie natürliches Hämoglobin hat, jedoch im Blutstrom nicht in einzelne Polypeptideinheiten zerlegt wird.

Die vorstehend genannten, lange vorhandenen Bedürfnisse werden gemäß der Erfindung durch ein Plasmaeiweiß-Ersatzmittel in Form einer intramolekular vernetzten Hämoglobinsubstanz befriedigt, in der wenigstens eine Polypeptideinheit mit einer anderen einzelnen Polypeptideinheit des gleichen Hämoglobinmoleküls durch is ein Vernetzungsmittel der Formel

NH₂ ⁺ NH₂ ⁺

I! I!

RO-C—(CH₂)_m —C —OR

in der m einen Wert von 6 bis 12hatundReinAlkylrestmit 1 bis 8 C-Atomen ist, vernetzt ist, wobei das Vernetzungsmittel an Polypeptideinheiten an ^-Aminogruppen von Lysylresten gebunden ist und das Hämoglobinderivat ein durch Gel-Elektrophorese bestimmtes Molekulargewicht zwischen 68 000 und 85 000 hat.

Es wurde gefunden, daß bei Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung unter Anwendung bestimmter Parameter und eines bestimmtes Typs eines Vernetzungsmittels die Bildung des intramolekular vernetzten Hämoglobins begünstigt wird. In diesem intramolekular vernetzten Hämoglobin ist eine einzelne Polypeptideinheit des Hämoglobintetrameren mit einer anderen Polypeptideinheit des gleichen Hämoglobintetrameren verbunden. Die Erfindung umfaßt somit eine intramolekular vernetzte Hämoglobin verbindung der Struktur

NH₂ ⁺ NH₂ ⁺

0-A-C-(CH₂) —C —Α —Ο (Π)

in der O eine Polypeptideinheit von Hämoglobin, insbesondere eine einzelne Polypeptideinheit, A der Rest einer e-Aminogruppe eines Lysylsrestes und m eine Zahl von 6 bis 12 ist. Hinsichtlich dieses intramolekular vernetzten Hämoglobinmaterials umfaßt die Erfindung also Verbindungen, in denen wenigstens eine Polypeptideinheit eines Hämoglobihtetrameren mit einer anderen Polypeptideinheit des gleichen Hämoglobintetrameren durch in Vernetzungsmittel der Formel

NH₂ ⁺ NH₂ ⁺

I! I!

RO-C-(CH₂) —C —OR

vernetzt ist, wobei dieses Vernetzungsmittel mit den Polypeptideinheiten an c-Aminogruppen von Lysylresten verbunden ist. Das intramolekular vernetzte Hämoglobinmaterial gemäß der Erfindung hat ein entschieden niedrigeres Molekulargewicht als das intermolekular vernetzte Hämoglobinmaterial. Das Molekulargew icht eines intramolekular vernetzten Hämoglobinmaterials liegt allgemein zwischen 68 000 und 85 000.

Die Hämoglobindimer- oder -tetramereinheiten sind somit durch das Vernetzungsmittel nicht mit Hämoglobindimer- oder -tetramereinheiten einer anderen Hämoglobinstruktur verbunden, sondern die Polypeptidein- so heiten der gleichen Hämoglobinstruktur sind miteinander verbunden. Dies bedeutet, daß das Material im wesentlichen das Molekulargewicht von natürlich vorkommendem Hämoglobin hat. Es hat im wesentlichen alle physikalischen Eigenschaften von natürlichem Hämoglobin mit der bemerkenswerten Ausnahme, daß die einzelnen Polypeptideinheiten covalent durch ein Vernetzungsmittel verbunden sind. Bei Einspritzung in den Blutstrom eines Warmblüters oder bei Einführung in anderer Weise hält das Vernetzungsmittel die Polypeptideinheiten unversehrt, so daß das Hämoglobin als Bluteiweiß-Ersatzmittel oder Expander dienen kann und dennoch keine der vielleicht etwas unnatürlichen Reaktionen verursacht, die bei Verwendung von Materialien mit extrem hohen Molekulargewichten eintreten können.

Das vernetzte Hämoglobinmaterial kann leicht zusammen mit den geeigneten anorganischen Salzen in den Blutstrom injiziert werden, wodurch es den gewünschten Blutdruck innerhalb der Blutgefäße aufrechterhält. Mt Durch Vernetzung des Hämoglobins mit Hilfe des Vernetzungsmittels der vorstehend genannten Formel wurde ein Vorteil erzielt. Das Hämoglobin wurde nicht ohne weiteres durch Bindung an eine als Haptoglobin bekannte, im Plasma natürlich vorkommende Substanz nachteilig beeinflußt.

Es wurde festgestellt, daß vernetztes Hämoglobin im Gegensatz zu natürlichem Hämoglobin durch die Anwesenheit von Haptoglobin nicht nachteilig dadurch verändert wird, daß es mit Haptoglobin einen Komplex bildet, der durch die retikuloendothelialen Zellen der Leber und Milz schnell entfernt wird. Darüber hinaus ist das intramolekular vernetzte Hämoglobin völlig verträglich mit den vorher geschaffenen chemischen Bedingungen innerhalb des Körpers, so daß es durch diese Chemikalien nicht leicht angegriffen wird und, wenn es schließlich

abgebaut wird, Aminosäuren bildet, die der Körper leicht verwerten oder ohne Komplikationen ausscheiden kann. Ferner wird vernetztes Hämoglobin nicht leicht aus dem Körper durch die Nieren entfernt, wie es bei \' natürlichem Hämoglobin der Fall ist Der Grund hierfür liegt darin, daß das natürliche Hämoglobin zu Molekülen mit einem mittleren Molekulargewicht von 34 000 und teilweise von 17 000 dissoziiert Dies sind verhältniss mäßig kleine Proteinmoleküle, die von den Nieren leicht ausgeschieden werden, während das vernetzte Hämo-, globin im Gegensatz hierzu nicht ausgeschieden wird.

Das intramolekular vernetzte Hämoglobin wird nach dem folgenden allgemeinen Verfahren hergestellt: , Eine Lösung, die 0,5 bis 1,5 Gew.-% Hämoglobin enthält, wird mit einem Vernetzungsmittel der Formel

R—0-C = NH₂ ⁺

R-O-C=NH₂ ⁺

in der R ein Alkylrest mit 1 bis 8 C-Atomen ist und m den Wert 6 bis 12 hat, bei einem pH-Wert zwischen 7,5 und 8,5, zusammengeführt. Die Zugabe der Reaktionsteilnehmer erfolgt über einen Zeitraum von 1 bis 1,5 Stunden, 50 daß das langkettige Vernetzungsmittel eine starke Neigung zur Bildung intramolekularer Vernetzungsbrükken hat. Das Produkt wird auf pH 7,5 eingestellt und anschließend filtriert Die Fällung oder ein etwaiger Feststoff wird verworfen. Die überstehende Flüssigkeit wird durch Ultrafiltration auf eine Hämoglobinkonzentra tion zwischen 5% und 7%, insbesondere von 6% konzentriert und umfassend gegen eine 0,9%ige Natriumchloridlösung (isotonische Kochsalzlösung) dialysiert. Das in dieser Weise dialysierte Material wird durch ein Millipore-Filter mit einer Porenweite yon 0,2 μ geleitet.

Es ist zu bemerken, daß das Hämoglobin aus roten Blutzellen durch Lyse der roten Blutzellen in bekannter , 25 Weise und Entfernung aller Membranmaterialien durch Zentrifugieren mit hoher Geschwindigkeit hergestellt wird. Das Hämoglobin wird dann mit dem Vernetzungsmittel während einer Zeit bis zu 2 Stunden bei einer Temperatur zwischen 0° und +10⁰C vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen 7,5 und 8,5 umgesetzt.

Es wurde gefunden, daß, wenn das Vernetzungsmittel verhältnismäßig langkettig ist, wie es beispielsweise der Fall ist, wenn m einen Wert von 6 bis 12, insbesondere von 6 bis 8 hat, und der Hämoglobinreaktant in einer Menge von 1% vorhanden ist, ein intramolekular vemetztes Hämoglobinmaterial erhalten wird, dessen Polypeptideinheiten durch das Vernetzungsmittel verbunden sind. Die Verbindung des Vernetzungsmittels mit den Polypeptideinheiten befindet sich an den ο Aminogruppen von Lysylresten an jeder Polypeptideinheit. Es wird angenommen, daß durch Verwendung eines langkettigen bifunktionellen Vernetzungsmittels die Kettenlänge sich von einer einzelnen Untereinheit des Hämoglobins zu einer anderen Untereinheit erstreckt. Das Ergebnis ist, daß ein Produkt mit einem mittleren Molekulargewicht von etwas mehr als 68 000 erhalten wird, worin die Untereinheiten durch das Vernetzungsmittel verbunden sind. Durch Wahl eines langkettigen Vernetzungsmittels werden die Gelegenheiten zur Verbindung der funktionellen Gruppe der Vernetzungsmittel mit t-Aminogruppen von Polypeptideinheiten dergleichen Hämoglobinstruktur deutlich gesteigert Es wird angenommen, daß die Erscheinung nicht in einem größeren Ausmaß stattfindet, wenn m den Wert 1 bis 5 hat, weil die Länge des Vernetzungsmittels nicht genügt, um die -OR-Gruppen mit dem Wasserstoffatom an der t-Aminogruppe in Berührung zu bringen und die Bindung Zustandekommen zu lassen. Die Bindungen zwischen den Atomen des

Vernetzungsmittels sind dann nicht genügend elastisch, um dem Vernetzungsmittel die Möglichkeit zu geben, ! den Abstand zwischen den Polypeptideinheiten der gleichen Hämoglobinstruktur zu überbrücken.

Es wurde gefunden, daß die Konzentration des Hämoglobins in der Lösung, in die das Vernetzungsmittel gege-

> 45 ben wird, eine wichtige Rolle in der Lenkung des Prozesses und hinsichtlich der Bestimmung des erhaltenen

Produkts spielt. Wenn das Hämoglobin in einer Menge zwischen 0,5 bis 1,5 Gew.-% in der Lösung vorhanden ist, ist das ver-

netzte Hämoglobin weitgehend intramolekular vernetzt. Das synthetisierte vernetzte Hämoglobin hat bei Verwendung einer solchen verdünnten Hämoglobinlösung ein Molekulargewicht zwischen 68 000 und 85 000, d.h. im wesentlichen die gesamte Vernetzung findet innerhalb der Polypeptid-Untereinheiten der gleichen Hämoglobinstruktur statt.

Als Vernetzungsmittel eignen sich für die Zwecke der Erfindung die Verbindungen der vorstehend genannten Formel, insbesondere beispielsweise Dimetiiylmalonsäureimidat, Diäthylbernsteinsäureimidat, Dimethylglu-

tarsäureimidat, Dimethyl- oder Diäthyladipinsäureimidat, Dimethylpimelinsäureimidat, Dimethylkorksäure imidat, Diniethylazelainsäureimidat, Dimethylsebacinsäureimidat, Dimethyldecandicarbonsäureimidat und

Dimethyldodecandicarbonsäureimidat, sämtlich als Hydrochloride.

Von den vorstehend genannten Vernetzungsmitteln wird das Dimethylsebacinsäureimidat, in dem m den Wert 8 hat, besonders bevorzugt. Der Grund hierfür liegt darin, daß die Sebacinsäureimidateinheit die am meisten gewünschte Länge hat und der Länge zwischen Lysylgruppen benachbarter Polypeptideinheiten am nächsten kommt.

Durch die iniiamuiekuiare Vemeizungsreaktion wird eine positiv geladene c-NHj -Gruppe entfernt und durch eine Imidatgruppe NH⁺ ersetzt, wodurch die Oberflächenladungseigenschaften des Hämoglobinmoleküls nicht verändert werden. Dies ist ein entschiedener Vorteil, da man bestrebt ist, viele der Eigenschaften des Hämoglobinmaterials möglichst genau bei denen des natürlichen Materials zu halten und hierdurch nicht irgendwelche Oberflächenladungseigenschaften seines Proteins zu verändern.

Das Verfahren wird unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes zwischen 7,5 und 8,5 zweckmäßig durchgeführt, indem geringe Mengen Triäthylamin kontinuierlich in das Reaktionsgemisch eingeführt werden. Triäthylamin erwies sich als außergewöhnlich wertvolle Base, die zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes innerhalb des vorste-

hend genannten Bereichs verwendet wird. Nach beendeter Reaktion braucht kein weiteres Triäthylamin mehr zugesetzt zu werden. Die Vollendung der Reaktion läßt sich leicht unter Verwendung eines pH-Messers feststellen. Normalerweise würde die Reaktion kontinuierlich zum Verbrauch von basischen Materialien neigen, wodurch der pH-Wert gesenkt wird. Die Erniedrigung des pH-Wertes wird durch das Triäthylamin ausgeglichen. Wenn alle Reaktionsteilnehmer umgesetzt sind, findet keine pH-Senkung statt, ein Zeichen, daß die Reaktion vollendet und der Zusatz von Triäthylamin nicht mehr notwendig ist.

Wenn das vernetzte Hämoglobin in Mischung mit anorganischen Salzen vorliegt, ist somit ein vernetztes Hämoglobinprotein-Ersatzmittel gebildet worden, das die folgenden Komponenten enthält: 5 bis 6% Polyhämoglobin in einer 310milliosmolaren Lösung von Natriumphosphat in Wasser mit einem pH-Wert der Lösung von 7,5. (»Milliosmolar« bezeichnet die Zahl der Millimole, die zur Einstellung eines bestimmten osmotischen Drucks erforderlich ist. 3 lOmilliosmolar ist die Konzentration anorganischer Salze, die dieser Salzkonzentration im normalen Blutplasma entsprechen würde.) Es können jedoch 4 bis 8 Gew.-% Polyhämoglobin in einer wäßrigen Salzlösung von pH 7,5, die isotonisch zu Blut ist, verwendet werden.

Wie die vorstehenden Ausführungen zeigen, ist das Hämoglobinmolekül ein kompliziertes Molekül, das in Wirklichkeit aus vier Polypeptideänheiten besteht, von denen jede lose an die anderen Einheiten gebunden ist. is Im Molekül des Hämoglobintetrameren, das ein Molekulargewicht von etwa 68 000 hat, sind zwei a-Polypeptideinheiten und zwei ^8-Polypeptideinheiten vorhanden.

In den nachstehenden Formeln ist die i>Aminogruppe jeder Untereinheit, die reagiert, dargestellt. Wenn eine intramolekulare Vernetzung, d. h. eine Vernetzung zwischen zwei oder mehr einzelnen Untereinheiten innerhalb des gleichen Hämoglobinmoleküls stattfindet, verläuft die Reaktion in der nachstehend dargestellten Weise:

HN- M-- (?0 — N H

HN- fa)~ -(ft)—NH

NH

+ RO —C—(CH₂)_m —C —OR

25 30

H C—(CH₂)_m—C H

I/ \l

N N

H C—(CH₂)_m—C H

-N NH₂ ⁺

(CH₂L

/I!

«I NH₂ ⁺

35 40 45 50

H₂ ⁺N

NH₂ ⁺

Die Reaktion kann auch zwischen a_r undjSj- und./?,- und a₂-Gnippen stattfinden, wenn das Vernetzungsmittel langkettig genug ist.

Hierdurch wird das Vernetzungsmittel wirksam ausgenutzt. Zusätzlich hat das so gebildete intramolekular vernetzte Hämoglobin eine nützliche Bindung, so daß das vernetzte Hämoglobin nicht dem Angriff durch das im Blut vorhandene Haptoglobin oder einer Dissoziation in niedrigmolekulare Einheiten unterliegt.

Die Plasmaersatzmittel gemäß der Erfindung sind besonders vorteilhaft in Krisensituationen, bei denen der Blutdruck im Körper schnell wieder auf die gewünschte Höhe gebracht werden soll. Das Material arbeitet wenigstens teilweise in dergleichen Weise wie das Serumalbumin. Die intramolekular vernetzten Hämoglobine gemäß der Erfindung nutzen jedoch zusätzlich das Hämoglobin der roten Blutzellen, das andernfalls verworfen würde, nutzbringend aus. Sie sind mit dem menschlichen Blutkreislaufsystem vollständig verträglich, so daß sie äußerst vorteilhaft und erwünscht sind, da sie nicht die bei rein synthetischem Blutplasmaersatzmitteln oder Plasmaexpandern auftretenden Probleme hinsichtlich ihrer natürlichen Elimination aus dem Körper aufwerfen. Ferner bilden die neuen Plasmaexpander keine Antikörper. Diese Antikörperbildung ist ein charakteristischer Nachteil anderer bisher hergestellter Plasmaersatzmittel.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Bei den in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Versuchen wurde Diäthylmalonsäureimidathydrochlorid als Vernetzungsmittel verwendet. Es wurde jedoch gefunden, daß auch andere Vernetzungsmittel der vorstehend genannten Formel verwendet werden können. Hierzu gehören Dimethyladipinsäureimidat und Dimethylkorksäureimidat.
5

Intramolekular vernetztes Hämoglobin
Beispiel 1

0,44 g Diäthylmalonsäureimidathydrochlorid wurde in fünf gleichen Teilen unter Rühren zu 100 ml einer l%igen Lösung von menschlichen Hämoglobin bei 5⁰C gegeben, wobei der pH-Wert durch Zusatz von Triethylamin bei 8,5 gehalten wurde. Nach 1 bis 2 Stunden benötigte die Lösung kein Triäthylamin mehr für die Aufrechterhaltung des pH-Wertes. Die Lösung wurde mit verdünnter Salzsäurelösung auf pH 7,5 gebracht und zur Entfernung von etwaigem unlöslichem überschüssigem Reagens zentrifugiert. Die modifizierte Hämoglobinlösung wurde durch Ultrafiltration eingeengt, bis die Hämoglobinkonzentration 5 bis 6% erreichte, und weitgehend gegen mehrmals ausgetauschte 0,9%ige NaCl-Lösung dialysiert.

Beispiel 2

Die Reaktion wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise unter Verwendung von 0,52 g Dimethyladipinsäureimidathydrochlorid pro 100 ml l%ige Hämoglobinlösung durchgeführt.

Beispiel 3
25

Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde unter Verwendung von 0,57 g Dimethylkorksäureimidathydrochlorid pro 100 ml l%ige Hämoglobinlösung wiederholt.

Beispiel 4

Die in Beispiel 1 beschriebene Reaktion wurde unter Verwendung von 0,63 g Dimethylsebacinsäureimidathydrochlorid pro 100 ml l%ige Hämoglobinlösung wiederholt.

Um den Grad der intramolekularen Vernetzung zu bestimmen, wurden die ungefähren Molekulargewichte der gemäß den vorstehenden Beispielen hergestellten modifizierten Hämoglobine durch Filtration durch eine Chromatographiesäule bestimmt, die mit dem Produkt »Sepharose 6B« (Pharmacia Co.) gefüllt und mit einer Anzahl von Proteinen von bekanntem Molekulargewicht einschließlich nichtmodifiziertem menschlichem Hämoglobin, das ein Molekulargewicht von 68 000 hat, standardisiert war. Wenn sie mit einer l%igen Hämoglobinlösung zusammengebracht und in mehreren Portionen zugesetzt wurden, ergaben diesen Reagentien ein Produkt, das zu 85 bis 90% ein ungefähres Molekulargewicht von 68 000 hatte, obwohl etwa 30 der insgesamt 44

40 Lysinreste mit dem Reagens reagiert hatten.

Da es das Ziel dieser Versuche war, ein intramolekular vernetztes Hämoglobintetrameres herzustellen, das nicht zu Untereinheiten von niedrigerem Molekulargewicht dissoziiert, wurde das Ausmaß einer möglichen Dissoziation gemessen, indem jedes modifizierte Hämoglobin der dissoziierenden Wirkung von Natriumdodecylsulfat während der Elektrophorese an Polyacrylamidgel unterworfen wurde. Nach der Färbung jeder Proteinbande und Entfärbung wurde die relative Verteilung der dissoziierbaren Einheiten mit einem Abtastdensitometer und durch Vergleich mit Proteinen von bekanntem Molekulargewicht der Untereinheiten gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt. Sie veranschaulichen die Wirksamkeit der Diimidate mit längerer Kette bei der intramolekularen Vernetzungsreaktion.

Verteilung von diisoziierbaren Untereinheiten von vernetzten Hämoglobinen durch Natriumdodecylsulfat

Dissoziierbare Untereinheit Vergleichs- DEM-Hb*) DMA-Hb*) DMS-Hb·) DMSb-Hb*)

Hämoglobin

Monomeres 100,0

Dimeres 0

Trimeres 0

⁶⁰ Tetrameres 0

>Tetrameres 0

*) DEM = Diäthylmalonsäureimidat

₆₅ DMA = Dimethyladipinsäureimidat

DMS = Dimethylkorksäureimidat

DMSb = Dimethylsebacinsäureimidat

Hb = Hämoglobin.

37,4	31,9	6,8	2,6
31,2	35,5	19,1	10,2
0,5	11,5	25,3	18,8
0,0	6,6	21,4	33,6
30,0	14,2	27,2	34,6

Claims

Patentansprüche:

1. Intramolekular vernetztes Hämoglobin, in dem wenigstens eine Polypeptideinheit mit einer anderen einzelnen Polypeptideinheit des gleichen Hämoglobinmolekül durch ein Vernetzungsmittel der Formel

RO-C-(CHJ_1n-C-OR

in der m für 6 bis 12 steht und R ein Alkylrest mit 1 bis 8 C-Atomen ist, vernetzt ist, wobei das Vernetzungsmittel an die Polypeptideinheiten an ^Aminogruppen von Lysylresten gebunden ist und das Hämoglobinderivat ein durch Gel-Elektrophorese bestimmtes Molekulargewicht zwischen 68 000 und 85 000 hat.

2. Intramolekular vernetztes Hämoglobin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß m den Wert 8 hat.

is 3. Verfahren zur Herstellung von intramolekular vernetztem Hämoglobin nach Ansprüchen 1 bis 2,

dadurch gekennzeichnet, daß man Hämoglobin als 0,5- bis 1,5 gew.-%ige Lösung mit einem Vernetzungsmittel der allgemeinen Formel