DE2436010C2

DE2436010C2 -

Info

Publication number: DE2436010C2
Application number: DE2436010A
Authority: DE
Inventors: David Clarence Schenectady N.Y. Us Golibersuch
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 1973-08-15
Filing date: 1974-07-26
Publication date: 1987-07-02
Also published as: GB1475125A; US3904367A; DE2436010A1; NL7410914A; US3904362A; FR2241073A1; NL179003B; NL179003C; AT331975B; ATA672374A; AU7251374A; FR2241073B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Anwe senheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biolo gischen Probe mit den folgenden Stufen:

Aufbringen eines Metallüberzugs auf ein Substratmaterial,
Inberührungbringen des überzogenen Substratmaterials mit einer Lö sung eines mit dem genannten spezifischen Protein spezifisch reagie renden Proteins, um das Substratmaterial mit dem spezifisch reagie renden Protein zu beschichten,
Inberührungbringen des beschichteten Substratmaterials mit der bio logischen Probe und
Untersuchen des beschichteten Substratmaterials, um zu bestimmen, ob das spezifische Protein daran haftet oder nicht, wobei
a) auf das Substrat ein Metallüberzug aufgebracht wird, der ausge wählt ist aus Indium, Gold, Silber, Zinn oder Blei, und
b) das Untersuchen des mit Protein beschichteten Substrates durch einfaches Betrachten dahingehend erfolgt, um festzustellen, ob eine oder mehr Proteinschichten auf dem Substrat vorhanden sind, nach Pa tent 23 30 702.

In dem älteren Patent 23 30 702 ist ausgeführt, daß ein will kürlich ausgewähltes Protein nur in einer monomolekularen Schicht auf einem Substrat haften wird, so daß kein anderes willkürlich ausgewähltes Protein auf dieser Proteinschicht haften wird. Anderer seits wird das spezifisch reagierende Protein sich immunologisch mit dem ersten Protein, das an dem Substrat adsorbiert ist, verbinden. Im Einklang mit der Lehre dieses Patents wird diese Feststellung da zu benutzt, medizinische diagnostische Apparate zu bilden, in denen ein Substrat, an dem eine monomolekulare Schicht eines Proteins ad sorbiert ist, verwendet wird, um Lösungen, in denen das damit spezi fisch reagierende Protein vermutet wird, zu testen. Wenn das spezi fisch reagierende Protein in der Lösung zugegen ist, trägt das Sub strat nach dem Eintauchen in die Lösung eine bimolekulare Protein schicht. Wenn das spezifisch reagierende Protein in der Lösung nicht vorhanden ist, weist das Substrat nach dem Eintauchen lediglich die ursprüngliche monomolekulare Proteinschicht auf. Optische, elektri sche und chemische Vorrichtungen zur Unterscheidung zwischen einer bimolekularen Proteinschicht und einer monomolekularen Protein schicht werden in dem obigen Patent ebenfalls beschrieben.

In zwei Ausführungsformen der diagnostischen Apparate, wie sie in dem obengenannten Patent beschrieben wurden, wird die optische Unterscheidung zwischen monomolekularen und bimolekularen Protein schichten durch Beobachtungen der Substrate mit dem bloßen Auge durchgeführt. Der beschriebene chemische Nachweis erfolgt unter Ver wendung eines Substrates, das eine Oberfläche eines Materials hat, das mit Quecksilber ein sichtbares Amalgam bildet, und hängt, was seine Durchführbarkeit anbetrifft, davon ab, daß ein Quecksilber tropfen, der auf eine bimolekulare Proteinschicht aufgebracht wird, etwa zehnmal so viel Zeit braucht, um durch diese Schicht zu dif fundieren, wie ein Quecksilbertropfen, der auf eine monomolekulare Proteinschicht aufgebracht wird. Der elektrische Nachweis beinhaltet die Verwendung eines elektrisch leitfähigen Substratmaterials und das Aufbringen einer Elektrode auf der Proteinschicht; die Kapazität zwischen den beiden leitfähigen Elementen wird dann gemessen, wobei dessen Wert die Dicke des dielektrischen Proteinfilms, die sie trennt, angibt, und damit aussagt, ob solch ein Film monomolekular oder bimolekular ist. Hieraus ist ersichtlich, daß die in dem obi gen Patent beschriebenen elektrischen und chemischen Ausführungsfor men es erforderlich machen, daß das aufzufindende Protein, wenn es in der Testlösung zugegen ist, eine vollständige zweite monomoleku lare Schicht auf dem Substrat bildet.

Einige Partikel, deren Nachweis äußerst wichtig ist, sind in physiologischen Proben jedoch nur in sehr verdünnten Konzentrationen enthalten. In einem solchen Fall wird nur eine kleine Anzahl solcher Teilchen an dem Substrat gebunden, so daß ihre Nachweisbarkeit nur in begrenztem Umfange erfolgen kann.

In der immunologischen Literatur ist es bekannt, daß Antikör permolekule als Antigene funktionieren, wenn sie in das System eines Wirbeltieres, für welches sie artfremde Proteine darstellen, einge geben werden. Dementsprechend können spezifisch reagierende Antikör per für einen gegebenen Antikörper leicht hergestellt werden. Diese Möglichkeit wurde in der Literatur ausgenutzt, um als Hilfsmaßnahme zum Nachweis bestimmter Arten von Mikroorganismen fluoreszierende Moleküle an den immunologisch komplexen Proteinen anzubringen (vgl. "Science Progress", Nr. 3415, Seiten 417 bis 422, November 1969, und "Ärztliches Laboratorium", 18, 133 bis 142, 1972). Beispielsweise können Antikörper zu menschlichen Immunglobulinen hergestellt und chemisch mit fluoreszierenden organischen Molekülen, wie beispiels weise Isothiocyanaten, kombiniert werden. Dieser sogenannte mar kierte Antikörper wird dann verwendet, um eine immunologische Reak tion unter einem UV-Mikroskop sichtbar zu machen. Einer der wichtig sten Verwendungszwecke für solche Antikörper gegenüber Antikörpern, die in der Literatur bekannt sind, ist der serologische Test für Sy philis gemäß dem Verfahren von Coons, das als FTA-STS-Verfahren in der Literatur bekannt ist. Bei dem FTS-STS-Verfahren wird eine be stimmte Menge von Treponema pallidum (T. pallidum) auf einem Sub strat getrocknet. Das Substrat wird dann in eine Blutprobe einge taucht. Das Substrat wird anschließend in eine Lösung von markier tem Immunglobulin eingetaucht. Das Anti-Menschen-Immunglobulin ver bindet sich nicht mit dem T. pallidum; entsprechend wird das Sub strat, wenn es unter einem UV-Mikroskop beobachtet wird, nur dann fluoreszieren, wenn die Probe Antikörper für T. pallidum enthielt.

In "J. Am. Chem. Soc.", Band 59, 1406 (1937) wird die optische Messung der Dicke eines aus einer Lösung adsorbierten Films be beschrieben. In diesem Zusammenhang ist ausgeführt, daß manchmal auf einanderfolgend alternierende Schichten aufgebaut werden können. Dies bedeutet, daß sich die beiden Schichten immer wiederholen und setzt das Vorhandensein ausreichend großer Mengen der dafür erfor derlichen Materialien voraus.

Die bekannten Verfahren erfordern einen relativ hohen appara tiven Aufwand.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Nachweis empfindlichkeit immunologischer Reaktionen auf einfachere Weise zu verbessern.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit das beschichtete Substrat nach dem Inberührungbringen mit der biologischen Probe in eine Lö sung eines dritten Protein eingetaucht wird, das mit dem nachzuwei senden zweiten Protein immunologisch reagiert, und daß das Unter suchen dahingehend erfolgt, daß man durch Beobachten des Substrates zwischen der Anwesenheit dreier Schichten oder nur einer Schicht darauf unterscheidet.

Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung finden sich in den Unteransprüchen.

Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeich nung näher erläutert. Im einzelnen zeigen

Fig. 1 eine schematische Darstellung des Haftens einer Viel zahl von Proteinschichten auf dem Substrat,

Fig. 2 ein Querschnitt eines Aufrisses eines Substrates, das vier monomolekulare Proteinschichten trägt, und

Fig. 3 eine Schnittansicht eines Aufrisses eines Substrates, das gemäß einer Ausführungsform der Erfindung herge stellt wurde und die Vervollständigung einer mono molekularen Schicht auf einem Substrat zeigt.

Fig. 1 zeigt ein Substrat 10, das eine Oberfläche eines dia gnostischen Objektträgers bildet, an der eine Vielzahl von will kürlich ausgewählten Proteinmolekülen oder anderen Partikeln, wie beispielsweise Viren oder Hepatitis assoziierte Antigenpartikel 11, adsorbiert ist. Eine Vielzahl von Molekülen oder anderen Parti keln 11 sind immunologisch mit ihren spezifisch reagierenden Anti körpermolekülen, wie allgemein bei 21, 22 gezeigt, komplexiert. Die Antikörpermoleküle 21 und 22 sind schematisch dargestellt, um eine Erklärung ihrer Struktur zu erleichtern. Die ursprüngliche Partikelschicht wird im Anschluß hieran der Einfachheit halber mit "Moleküle" bezeichnet, es sei denn, daß dies durch den spezifischen Zusammenhang anders erforderlich ist, wobei es sich versteht, daß andere Partikel auch mit in den Umfang der vorliegenen Erfin dung eingeschlossen sind.

Die fünf Hauptklassen von Antikörpern enthalten die Immunglobuline, die mit IgG, IgM, IgA, IgD und IgE bezeichnet wurden. Der über wiegende Anteil an Immunglobulin ist IgG, welches etwa 85% der Immunglobuline im normalen menschlichen Serum darstellt und das auch in einem, überschlagmäßig geschätzt, ähnlichen Überschuß im normalen Serum anderer Wirbeltiere gefunden wurde. Ein IgG-Par tikel enthält zwei schwere (lange) Peptidketten und zwei leichte (kurze) Peptidketten, die mittels Disulfidbindungen miteinander so verbunden sind, daß sie ein allgemein wie ein "Y" gestaltetes Antikörpermolekül bilden. Die IgG-Antikörpermoleküle sind immuno logisch zweiwertig; d. h. jedes Molekül hat zwei aktive Antikör perstellen. Die Antikörperstellen 21 a 1 und 21 a 2 des Moleküls 21 und 22 a 1 und 22 a 2 des Moleküls 22 sind an den extremen Enden der Arme des Y-förmigen Moleküls angeordnet. Die aktiven Stellen er möglichen die immunologische Bindung des Antikörpers an ein Mole kül von dessen assoziiertem Antigen, wie es beispielsweise in Fig. 1 gezeigt wird, wo die aktiven Stellen 21 a 1, 22 a 1 und 22 a 2 an eine Vielzahl von Proteinmolekülen 11 gebunden sind. Wie schon oben angegeben, wirken Antikörpermoleküle auch als Antigen, wenn sie in das System eines Wirbeltieres eingeführt werden, für welches sie ein artfremdes Protein darstellen. Dadurch stimulieren sie die Herstellung von Antikörpern, die spezifisch für den Antikörper als Antigen sind. Ein Antikörper zum IgG-Antikörper ist ein wei terer IgG-Antikörper, der deshalb also auch zwei aktive Stellen hat. Diese aktiven Stellen verbinden sich mit spezifischen, immuno logisch aktiven Stellen am ersten Antikörper. Die immunologisch aktiven Stellen sind andererseits als immunologische Determinanten oder Epitopen bekannt. Wie oben angegeben, beträgt die Anzahl der aktiven Stellen im Antikörper von einem IgG-Antikörper zwei. Die Anzahl von Epitopen, die mit einem IgG-Molekül assoziiert sind, ist nicht genau bekannt, aber man weiß, daß die Anzahl von Epi topen wenigstens zwei beträgt. Es ist bekannt, daß Epitopen am Schwanz des Y-förmigen Moleküls vorhanden sind und daß sie wahr scheinlich auch an dessen Armen zugegen sind. Zum Zwecke der Illustration des Prinzips des erfindungsgemäßen Verfahrens sind drei Epitope entlang der schweren (langen) Peptidketten jedes Antikörpermoleküls, wie sie in Fig. 1 illustriert werden, gezeigt. Die Epitopen des Antikörpermoleküls 21 sind mit 21 e 1, 21 e 2 und 21 e 3 bezeichnet. Die Epitopen des Antikörpermoleküls 22 sind mit 22 e 1, 22 e 2 und 22 e 3 bezeichnet.

Die Adsorption der Moleküle 11 am Substrat 10 und das Ein tauchen des proteinbeschichteten Substrates in eine Lösung von Antikörpern gegenüber dem Protein 11, um Moleküle 21 und 22 immunologisch daran zu binden, bildet den Kern der in der obigen DT-PS beschriebenen Erfindung. Gemäß der Praxis der vorliegenden Erfindung wird eine bestimmte Menge einer Lösung von Antikörpern vom Typ, wie sie durch 21 und 22 repräsentiert werden, an ein Wirbeltier verabreicht, um die Produktion von Antikörpern dazu zu stimulieren. Die hergestellten Antikörper werden mit Hilfe von bekannten Verfahren gesammelt und eine Lösung davon wird beim verbesserten diagnostischen Verfahren gemäß der vorliegenden Er findung verwendet. Das Substrat wird in eine Lösung von Anti- Antikörpern getaucht, und wenn Moleküle 21 und 22 an Moleküle 11 gebunden werden, wird eine Vielzahl von Molekülen 31, 32, 33, 34 und 35 immunologisch an Moleküle 21 und 22 gebunden. Wenn anderer seits Antikörper vom Typ der Moleküle 21 und 22 nicht in der Lösung vorhanden sind, in welche das Substrat zuerst eingetaucht wird, werden auch nach dem Eintauchen in die Lösung, die solche Moleküle enthält, keine Moleküle 31 bis 35 auf dem Substrat vorhanden sein, weil Moleküle 31 und 35 spezifisch mit Molekülen 21 und 22 reagieren und sich nicht mit den Molekülen 11 verbinden. Zu diesem Zeitpunkt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Nachweisbarkeit der Moleküle 21 und 22 dadurch entsprechend ver bessert, daß ihre Gegenwart bestimmt wird, indem man zwischen einer Schicht von Molekülen 11 und einer Schicht von Molekülen 11, 21, 22, 31, 32, 33, 34 und 35 unterscheidet, im Gegensatz zu der Bestimmung, bei welcher man zwischen einer Schicht von Molekü len 11 und einer Schicht von Molekülen 11, 21 und 22 unterschei det. Erfindungsgemäß kann das Verfahren wiederholt werden, um zusätzliche Proteinschichten aufzutragen, um die Sensitivität des Nachweises weiter zu steigern, wie beispielsweise durch die selektive Bindung der Moleküle 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 und 53 an die Moleküle 31, 32, 33, 34 und 35.

Antikörpermoleküle 31, 32, 33, 34 und 35 haben die aktiven Stel len 31 a 1, 31 a 2 bzw. 32 a 1, 32 a 2 bzw. 33 a1, 33a 2, bzw. 34 a 1, 34 a 2 bzw. 35 a 1 und 35 a 2. Antikörper 31 ist durch die Befestigung der aktiven Stelle 31 a 2 an Epitop 21 e 2 immunologisch an Antikörper 21 gebunden. Antikörper 32 ist durch die Verbindung der aktiven Stelle 32 a 1 an Epitop 21 e 1 immunologisch gebunden an Antikörper 21. Antikörper 33 ist durch die Verbindung der aktiven Stelle 33 a 2 an Epitop 22 e 2 immunologisch an Antikörper 22 gebunden; Antikörper 34 ist durch die Verbindung der aktiven Stelle 34 a 1 an Epitop 22 e 1 an Antikörper 22 gebunden; Antikörper 35 ist durch die Verbindung der aktiven Stelle 35 a 1 an Epitop 22 e 3 an Antikörper 32 gebunden. Wie auf der linken Seite von Fig. 1 im Hinblick auf die Proteinkette, die mit Antikörper 21 beginnt, gezeigt, ist jeder Antikörper mit zwei aktiven Epitopen ange geben. Das bedeutet, daß jeder Antikörper als Antigen zwei Anti körper bindet. Somit hat Antikörper 21 Antikörper 31 und 32 gebunden, die wiederum Antikörper 41, 42, 43 und 44 an sich ge bunden haben. Dies stimmt mit der bekannten Minimalzahl von aktiven Epitopen pro IgG-Antikörpermolekül überein. Auf der rechten Seite von Fig. 1 hat die Proteinkette, die mit Anti körper 22 beginnt, drei aktive Epitopen pro Antikörper. So ist ersichtlich, daß die Verbesserung der Empfindlichkeit, wie sie in Übereinstimmung mit dieser Erfindung erhalten wird, proportional der Anzahl an aktiven Epitopen pro Antikörper-Molekül und der Anzahl von Eintauchvorgängen des Substrates in aufeinander folgende Lösungen mit Antikörpern ist.

In einem Beispiel von serumimmunologischen Reaktionen, die er findungsgemäß durchgeführt wurden, wurde eine Schicht von Rinder serum-Albumin an einem Substrat adsorbiert. Das Substrat wurde dann in eine Lösung von Kaninchen-Antiserum gegenüber dem Rinderserum-Albumin eingetaucht, wonach das Substrat die ursprüngliche Rinderserum-Albumin-Schicht aufwies, die immuno logisch gebunden dazu eine Schicht von Kaninchen-IgG-Immun globulin-Antikörper zum Rinderserum-Albumin enthielt. Das Sub strat wurde als nächstes in eine Lösung von Ziegen-Antiserum zum Kaninchen-IgG getaucht, wonach das Substrat eine Schicht von Rinderserum-Albumin, eine Schicht von Kaninchenanti-BSA-IgG und eine Schicht von Ziegenanti-Kaninchen-IgG-Antikörpern aufwies. Der nächste Schritt war das Eintauchen des Substrates in eine Lösung von Kaninchen-Antiserum zum Ziegen-IgG, um eine vierte Schicht von Kaninchenanti-Ziegen-IgG-Molekülen auf dem Sub strat hinzuzufügen. Es versteht sich, daß die letzten beiden Schritte, d. h. das Eintauchen in Ziegen-Antiserum zum Kaninchen- IgG gefolgt von Kaninchen-Antiserum zum Ziegen-IgG, beliebig oft wiederholt werden können, um einen Film zu bilden, der eine n-mole kulare Proteinschicht enthält.

In einem weiteren Beispiel gemäß dem vorliegenden Verfahren wurde eine bestimmte Menge von Hepatitis-assoziierten Antigenparti kelchen an einem Substrat adsorbiert. Das Substrat wurde dann in eine Probe mit menschlichem Serum eingetaucht. Das Sub strat wurde als nächstes in eine Lösung von Kanichen-Antikörpern gegenüber dem menschlichen Hepatitis-Antikörper eingetaucht. Wenn das menschliche Testserum also Hepatitis-Antikörper ent hielt, wies das Substrat Hepatitis-assoziertes Antigen auf, an welchem Hepatitis-Antikörper immunologisch gebunden waren, und außerdem Kaninchen-Anti-Menschenhepatitis-Antikörper, die immunologisch an die Hepatitis-Antikörper gebunden waren. Wenn andererseits die Serumprobe negativ wäre, würde das Substrat le diglich die ursprünglich aufgebrachten Hepatitis-assoziierten Antigenpartikel aufweisen. Es wurde gefunden, daß dies Verfahren der vorliegenden Erfindung die Nachweisbarkeit von menschlicher Hepatitis gegenüber dem Verfahren, in welchem der Hepatitis-Anti körper allein an das Hepatitis-assoziierte Antigen gebunden wurde, wesentlich verbesserte. Dieses Beispiel zeigt auch, daß das er findungsgemäße Verfahren eine besondere Anwendbarkeit in solchen Fällen hat, in denen das ursprüngliche proteineinschließende Partikel, das auf dem Substrat aufgebracht wird, wesentlich größer ist als dessen spezifisch reagierendes Protein.

Fig. 2 zeigt einen Schnitt eines Aufrisses, der einen multi molekularen Proteinfilm auf einem Substrat zeigt. Am Sub trat 60 kann beispielsweise, in Übereinstimmung mit dem ersten, oben angegebenen Beispiel, eine monomolekulare Schicht 61 aus Rinderserum-Albumin adsorbiert sein. Das Eintauchen in Kaninchen- Antiserum zum Rinderserum-Albumin wird eine zweite monomolekulare Schicht 62 über der Schicht 61 durch spezifische immunologische Reaktionen aufbringen. Das anschließende Eintauchen in Ziegen- Antiserum zum Kaninchen-IgG wird eine monomolekulare Schicht 63 immunologisch an Schicht 62 binden, wenn Schicht 62 vorhanden ist. Auf ähnliche Weise wird Schicht 64, die Kaninchenanti-Ziegen- IgG enthält, gebildet, indem IgG durch Eintauchen in Kaninchen- Antiserum zum Ziegen-IgG an das Substrat gebunden wird. Wie oben angegeben, kann dieses Verfahren fortgesetzt werden. Aber da das Binden von Schichten eine spezifische, immunologische Reak tion ist, wird das Verfahren unwiderruflich unterbrochen, wenn eine der Schichten nicht gebildet wird. Die Struktur von Fig. 2 hat eine spezifische Verwendbarkeit zum hochempfindlichen Nach weis des Proteins, das in Schicht 62 enthalten ist. Schicht 61 ist durch Adsorption, das ein nicht spezifisches Verfahren ist, auf Substrat 60 aufgetragen. Alle nachfolgenden Verfahren sind je doch spezifisch. Wenn also eine Testprobe das spezifisch rea gierende Protein zu dem Protein von Schicht 61 enthält, wird Schicht 62 gebildet und entsprechend der vorliegenden Erfindung kann eine Proteinschicht in n-molekularer Ausführung darauf ge bildet werden. Wenn andererseits die Testprobe kein immunoligisch reaktionsfähiges Protein zu dem Protein von Schicht 61 enthält, wird Schicht 62 nicht gebildet und weitere Schichten können deshalb auch nicht gebildet werden. Deshalb kann ein Protein, das von besonderem Interesse in einer Probe ist, mit jedem be liebigen Grad der Empfindlichkeit nachgewiesen werden, indem man zwischen einer monomolekularen Proteinschicht auf einem Substrat und einer Schicht von irgendeiner beliebigen Dicke unter scheidet.

Fig. 3 zeigt einen Querschnitt eines Aufrisses eines Substrates, der eine weitere Verwendbarkeit für das erfindungsgemäße Ver fahren illustriert. Fig. 3 illustriert die Verwendbarkeit der vorliegenden Erfindung zum Nachweis von Proteinen, die in physiologischen Proben in Konzentrationen vorhanden sind, die zu verdünnt sind, um eine vollständige Schicht auf einem Substrat zu bilden. Als ein Beispiel für die Verwendung spezifischer Proteine, ohne dieses Beispiel auf diese Proteine zu begrenzen, hat Substrat 70 eine monomolekulare Schicht von menschlichen Hepatitis-Antikörpern 71 adsorbiert. Dieses Substrat wird in eine Blutprobe eingetaucht und eine Vielzahl von Hepatitis- assoziierten Antigenpartikeln 77 werden immunologisch daran gebunden, wenn sie in der Probe zugegen sind. Das Substrat wird dann in eine Lösung von Affen-Hepatitis-Antikörpern getaucht, um eine Schicht von Molekülen 72 daraus an die Hepatitits-asso ziierten Antigenpartikel zu binden, so daß eine weitere Schicht auf dem Substrat aufgebracht wird. Das Substrat wird als nächstes in eine Lösung von Kaninchen-Antiserum zum Affen-IgG getaucht, um eine Schicht von Molekülen 73 über den Affen-Hepa titis-Antikörpermolekülen zu binden. Es versteht sich, daß die Schicht von Molekülen 72 auch aus menschlichen Hepatitis-Anti körpern 71 gebildet werden könnte. Wenn dies jedoch getan würde, müßte die nächste Schicht aus Anti-Menschen-IgG-Molekülen be stehen, die jedoch nicht nur mit jenen Antikörpern, die die Hepatitis-assoziierten Antigenpartikel 77 umgeben, sondern auch mit der ursprünglichen Schicht von Molekülen 71 reagieren würden, wodurch der Zweck des erfindungsgemäßen Verfahrens verfehlt wäre. Das nächste Eintauchen des Substrates könnte beispielsweise in Ziegen-Antiserum zum Kaninchen-IgG erfolgen, um eine Schicht von Molekülen 74 daran zu bilden. Dieses Verfahren wird mehrfach wiederholt, wie allgemein durch das Volumen 75 angegeben ist, bis ein Punkt erreicht wird, bei welchem eine letzte monomole kulare Proteinschicht 76 alle freien Räume zwischen den Par tikeln 77 auf dem Substrat ausfüllt. Dies Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt die Bildung einer Proteinschicht von wenigstens bimolekularer Dicke auf der Gesamtoberfläche des Substrates und ist insbesondere verwendbar für chemische und elektrische Nachweismethoden, wie sie in der oben angegebenen älteren Patentanmeldung beschrieben sind.

Claims

1. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit ei nes spezifischen Proteins in einer biologischen Probe mit den fol genden Stufen:

Aufbringen eines Metallüberzuges auf ein Substratmaterial,
Inberührungbringen des überzogenen Substratmaterials mit einer Lösung eines mit dem genannten spezifischen Protein spezifisch reagierenden Proteins, um das Substratmaterial mit dem spezifisch reagierenden Protein zu beschichten,
Inberührungbringen des beschichteten Substratmaterials mit der biologischen Probe und
Untersuchen des beschichteten Substratmaterials, um zu be stimmen, ob das spezifische Protein daran haftet oder nicht, wobei
a) auf das Substrat ein Metallüberzug aufgebracht wird, der ausgewählt ist aus Indium, Gold, Silber, Zinn oder Blei, und
b) das Untersuchen des mit Protein beschichteten Substrates durch einfaches Betrachten dahingehend erfolgt, um festzu stellen, ob eine oder mehr Proteinschichten auf dem Substrat vorhanden sind, nach Patent 23 30 702,

dadurch gekennzeichnet, daß zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit das beschichtete Sub strat nach dem Inberührungbringen mit der biologischen Probe in eine Lösung eines dritten Proteins eingetaucht wird, das mit dem nachzuweisenden zweiten Protein immunologisch reagiert, und daß das Untersuchen dahingehend erfolgt, daß man durch Beobachten des Substrates zwischen der Anwesenheit dreier Schichten oder nur einer Schicht darauf unterscheidet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die weiteren Stufen:

Zubereiten einer Lösung von Antikörpern für das Protein, das immunologisch mit dem nachzuweisenden Protein reagieren kann, und
Eintauchen des Substrates in diese Antikörper-Lösung.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das nachzuweisende Protein in physiologischen Flüssigkeitsproben in so stark ver dünnten Konzentrationen zugegen ist, daß innerhalb einer annehmbaren Zeit eine nachweisbar vollständige bimolekulare Schicht auf dem Substrat nicht gebildet wird, sondern vielmehr an jedes Partikel auf dem Substrat immunologisch gebunden wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, gekennzeichnet durch die weiteren Stufen:

Zubereiten einer Reihe von Lösungen von Antikörpern, in welcher jede Lösung der Reihe Antikörper für die Antikörper der unmittelbar vorangegangenen Lösung der Reihe enthält, und
nacheinander Eintauchen des Substrates in jede Lösung der Reihe.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vielzahl von monomolekularen Proteinschichten des nach zuweisenden Proteins an jedes Partikelchen auf dem Substrat immunologisch gebunden wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Vielzahl von monomolekularen Proteinschichten ausreicht, um das Substrat mit wenigstens einer bimolekularen Protein schicht auf den gesamten Oberflächen zu überziehen.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vielzahl von monomolekularen Proteinschichten an einer bimolekularen Proteinschicht immunologisch gebunden wird, wenn die bimolekulare Schicht auf dem Substrat vorhanden ist, so daß der Nachweis des nachzuweisenden Proteins da durch erreicht wird, daß man zwischen einer monomolekularen Proteinschicht und einer multimolekularen Proteinschicht auf dem Substrat unterscheidet.