DE2522087A1 - Biologische analyse - Google Patents

Biologische analyse

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Description

Paienicnrwräli·
Dr.-Ing. Wilhelm Reichel Dipl-Ing. Wolfgang Reiahel
6 Frankfurt a. M. 1
Paiksiraße 13
8192
Technicon Instruments Corporation, Tarrytown, N.Y. VStA
Biologische Analyse
Die Erfindung bezieht sich auf die Analyse von biologischen Fluiden, beispielsweise von Harn oder Serum, zur Bestimmung der Anwesenheit, der Menge und/oder der Natur von Antikörpern, Antigenen und Antikörper: Antigen-Komplexen.
Der Einfachheit halber werden im folgenden die Symbole "Ak", "Ag" und "Ak:Ag" für "Antikörper", »Antigen" bzw. "Antikörper:Antigen-Komplex" benutzt.
Bekanntlich ist es wichtig, daß man biologische Fluide auf Ak, Ag und Ak:Ag-Komplexe analysiert. So sind beispielsweise viele Krankheiten durch die Anwesenheit von Ak:Ag-Komplexen im Kreislauf gekennzeichnet« Bei dem Ag kann es sich um eine große Vielfalt von Proteinen handeln, und zwar einschließlich von solchen Proteinen, die auf die Gegenwart von Bakterien oder Viren
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zurückzuführen sind, oder von solchen Proteinen, die von menschlichen Geweben oder Krebszellen freigesetzt sind. Die Ak sind natürlich für das besondere Ag spezifisch, und es handelt sich vorwiegend um Immunglobuline der Klasse IgG, die durch das Lymphsystem des Lebewesens synthetisiert sind. Der Nachweis von Ak:Ag-Komplexen im Blut sowie ihre Trennung und Charakterisierung liefern wertvolle Information, die beispielsweise zur Diagnose von Krankheiten verwendet werden kann.
Zur Feststellung und quantitativen Bestimmung von Ag, Ak und Ak:Ag-Komplexen sind zahlreiche Verfahren bekannt, Dies trifft insbesondere auch für die Bestimmung der Natur und Menge des vorhandenen Ag zu. Diese quantitativen Bestimmungsverfahren werden Immunprüfverfahren genannt.
Es ist seit einiger Zeit bekannt, daß zwei natürlich vorkommende Substanzen, nämlich rheumatischer Faktor, im folgenden mit RF bezeichnet, und eine besondere Komponente von Komplement, nämlich C1q, die Eigenschaft haben, sich mit Ak:Ag-Komplexen zu vereinigen, jedoch nicht mit einem freien Ag oder einem freien Ak. Obwohl es bereits vorgeschlagen wurde (Agnello et al, J. Exp. Med., 1J4, 228, 1971) diese Eigenschaft in einer besonderen Weise zur Feststellung von Ak:Ag-Komplexen auszunützen (allerdings nicht zur quantitativen Analyse oder absoluten Bestimmung), hat man bisher nicht erkannt, daß RF und C1q potentiell außerordentlich nützliche Reagenzien zur Analyse von Ak, Ag und Ak:Ag-Komplexen sind.
Es wurde nun überraschend herausgefunden, daß RF und C1q in unlöslich gemachter Form in einem sehr weiten Bereich einsetzbare Reagenzien für analytische
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Verfahren sind, die Ak, Ag und bzw. oder Ak:Ag-Komplexe betreffen. Die Verwendung dieser Reagenzien führt zu einfacheren und genaueren Iminunprüfverfahren.
RF ist ein bekanntes Material, und Verfahren für seine Gewinnung und Trennung sind bekannt. Es ist im Blut eine Anzahl von Tierarten einschließlich des Menschen vorhanden oder kann darin hervorgerufen werden. Normalerweise gewinnt man es von Ziegen oder Kaninchen durch intradermale Injektionen ihrer eigenen gereinigten Immunglobuline, die vorher durch eine zehnminütige Wärmebehandlung bei etwa 63 0C angehäuft worden sind. RF wird dann aus dem von den Tieren gewonnenen Serum isoliert,indem man das Serum durch eine Säule von angehäuften Imraunglobulinen leitet, an denen RF zurückgehalten wird. RF kann dann aus der Säule eluiert werden, indem man als Eluent eine Lösung mit einem geeigneten pH-Wert oder einer geeigneten Salzkonzentration verwendet.
C1q ist ein natürlich umlaufendes Protein, und Verfahren zu seiner Trennung und Reinigung sind bekannt. Man gewinnt es im allgemeinen aus dem Serum des Menschen, Kaninchens oder Rindes, und zwar durch ein Verfahren, das als Euglobulinausfällung bekannt und beispielsweise in der Druckschrift J. Immunol., 106. 304-413 (1971) beschrieben ist.
Ein Verfahren zum Analysieren einer biologischen Fluidprobe auf Ak, Ag oder AkiAg-Komplexe zeichnet sich nach der Erfindung im wesentlichen dadurch aus, daß der Probe vor oder nach der Zugabe von anderen Reagenzien eine Lösung von RF oder Q1q zugegeben wird, um eine Bindung mit den in der Probe befindlichen Ak:Ag-Komplexen zu erreichen.
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Es gibt eine große Anzahl von Möglichkeiten, •dieses grundsätzliche Verfahren auszuführen. Dazu gehören auch die folgenden bevorzugten Verfahren: (i) Ein Verfahren zum Überprüfen eines Ak oder Ag in einer biologischen Fluidprobe zeichnet sich durch die folgenden Schritte aus:
(a) Der Probe wird ein Überschuß eines Ag oder eines Ak zugesetzt, das bzw. der gegenüber dem Ak bzw. dem Ag in der Probe spezifisch ist, um einen Ak:Ag-Komplex zu bilden,
(b) dem unter (a) gebildeten Gemisch wird eine bekannte Menge einer Lösung von RF oder C1q zugesetzt, und zwar mit einem Überschuß gegenüber derjenigen Menge, die erforderlich ist, um mit dem gesamten genannten vorhandenen Ak:Ag-Komplex eine Bindung einzugehen, wobei das gebildete RF/Ak:Ag oder C1q/Ak:Ag in dem Gemisch eine Agglomeration bilden,
(c) von dem Bemisch wird das angehäufte oder agglomerierte RF/Ak:Ag oder C1q/Ak:Ag getrennt und
(d) die Menge an RF oder C1q, die in dem Gemisch nach dem Schritt (c) verbleibt oder die von dem Gemisch beim Schritt (c) getrennt worden ist, wird gemessen und daraus wird die Menge des in der ursprünglichen Probe vorhandenen Ak oder Ag berechnet.
Der Schritt (d) zeichnet sich vorzugsweise dadurch aus,
(i) daß dem Gemisch, das nach dem Schritt (c) , verbleibt, eine bekannte Menge eines Komplexes Ak':Ag1 zugesetzt wird, die einen Überschuß gegenüber der Menge darstellt, die zum Binden des gesamten RF oder C1q in dem Gemisch erforderlich ist, wobei der Komplex Ak^Ag1 eine Identifizierungskennung trägt, und
(ii) daß die in dem Gemisch frei bleibende, mit RF oder C1q nicht gebundene Menge an Ak1:Ag1 gemessen wird. Bei diesem Verfahren ist die Identifizierungsken-
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nung vorzugsweise ein Enzym oder ein Koenzym, und zwar von einer solchen Art, daß die Aktivität des Enzyms oder Koenzyms beim Binden des Ak1:Ag'-Komplexes mit RF oder C1q gesperrt wird, und die Menge des freien Ak1:Ag1 durch Messen der Enzym- oder Koenzymaktivität des Gemisches bestimmt wird, ohne daß zuerst das RF/AkMAg1 oder Ciq/Ak'xAg1 entfernt werden muß. (ii) Ein Verfahren zum Untersuchen eines Ak:Ag-Komplexes in einer biologischen Fluidprobe zeichnet sich durch die folgenden Schritte aus:
(a) Der Probe wird eine bekannte Menge einer Lösung von RF oder C1q zugesetzt, die einen Überschuß gegenüber der Menge darstellt, die zum Binden des gesamten Ak:Ag-Komplexes in der Probe erforderlich ist, um RF/Ak:Ag oder C1q/Ak:Ag zu bilden, wobei in dem Gemisch das RF/Ak:Ag oder C1q/Ak:Ag agglomeriert,
(b) von dem Gemisch wird das agglomerierte RF/Ak:Ag oder C1q/Ak:Ag getrennt und
(c) die Menge an RF oder C1q, die nach dem Schritt (b) in dem Gemisch verbleibt oder die durch den Schritt (b) aus dem Gemisch getrennt worden ist, wird gemessen und daraus wird die Menge des ursprünglich in der Probe vorhandenen Ak:Ag-Komplexes berechnet·
(iii) Ein Verfahren zum Untersuchen von Ak oder Ag in einer biologischen Fluidprobe zeichnet sich aus durch:
(a) Der Probe wird ein Überschuß eines Ag1 oder Ak1 zugesetzt, das bzw. der gegenüber dem Ak bzw. Ag in der Probe spezifisch ist, um einen Ak:Ag·-Komplex oder einen Ak':Ag-Komplex zu bilden, wobei Ak' oder Ag' eine Identifizieningskennung tragen,
(b) dem aus dem Schritt (a) hervorgehenden Gemisch wird eine Lösung von RF oder C1q in einer Menge zugesetzt, die mindestens ausreicht, den gesamten Ak:Ag1- oder Ak1:Ag-Komplex in dem Gemisch zu binden, und
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(c) die Menge des Ak' oder Ag1, die in dem Gemisch frei ist oder die an RF oder C1q gebunden ist, wird gemessen und daraus wird die Menge an ursprünglich in der Probe vorhandenem Ak oder Ag berechnet.
(iv) Ein Verfahren zum Untersuchen eines Ak:Ag-Komplexes in einer biologischen Probe ist durch die folgenden Schritte gekennzeichnet:
(a) Der Probe wird eine bekannte Menge eines Ak1:Ag-Komplexes, der eine Identifizierungskennung trägt, und eine Lösung von RF oder C1q in einer Menge zugesetzt, die unzureichend ist, um die Gesamtmenge der Ak: Ag- und Ak1: Ag'-Komplexe in dem Gemisch zu binden, und
(b) die Menge des Ak1:Ag', die in dem Gemisch frei ist oder die an RF oder C1q gebunden ist, wird gemessen und daraus wird die in der ursprünglichen Probe vorhandene Menge an Ak:Ag berechnet.
(v) Ein Verfahren zum Untersuchen eines Ak oder Ag in einer biologischen Fluidprobe zeichnet sich dadurch aus,
(a) daß der Probe ein Ag oder Ak zugesetzt wird, das bzw. der in bezug auf den Ak bzw. das Ag in der Probe spezifisch ist, um einen Ak:Ag-Komplex zu bilden,
(b) daß dem beim Schritt (a) entstehenden Gemisch eine bekannte Menge des zu bestimmenden Ak oder Ag zugesetzt wird, welche Menge eine Identifizierungskennung trägt,
(c) daß dem beim Schritt (b) gebildeten Gemisch eine Lösung von RF oder C1q in einer Menge zugesetzt wird, die wenigstens ausreicht, um den gesamten Ak:Ag-Komplex in dem Gemisch zu binden, und
(d) daß die Menge des kenntlich gemachten Ak pder Ag, die frei in dem Gemisch verbleibt oder die an RF oder C1q gebunden ist, gemessen wird.
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(vi) Ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Ak:Ag-Komplexes in einer biologischen Pluidprobe zeichnet sich dadurch aus, daß der Probe eine Lösung von RF oder C1q und ein. Material zugesetzt werden, das bei Berührung mit RF oder C1q zur Agglutination veranlaßt wird, und daß festgestellt wird, ob eine Agglutination des Materials auftritt.
(vii) Ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines besonderen AK oder Ag in einer biologischen Fluidprobe zeichnet sich dadurch aus, daß der Probe ein Ag oder Ak zugesetzt wird, das bzw. der in bezug auf den besonderen Ak oder das besondere Ag, dessen Anwesenheit bestimmt werden soll, spezifisch ist, um mit irgend einem des genannten besonderen, vorhandenen Ak oder Ag einen Ak:Ag-Komplex zu bilden, und daß die Anwesenheit oder Abwesenheit dieses Komplexes durch das oben beschriebene Verfahren bestimmt wird.
(viii) Ein Verfahren zur Immunüberpriifung einer biologischen Fluidprobe im Himblick auf Ak, Ag oder Ak:Ag-Komplexe zeichnet sich durch die folgenden Schritte aus:
(a) Der Probe wird ein eine Enzymkennung tragender Ak, Ag oder Ak:Ag-Komplex zugesetzt,
(b) eine Lösung von RF oder C1q wird zugesetzt, um mit irgendeinem vorhandenen Ak:Ag-Komplex eine Bindung einzugehen, und
(c) der Inhibitionseffekt von RF oder C1q auf die Enzymaktivität irgendeines kenntlich gemachten Ak:Ag-Komplexes, der mit RF oder C1q verbunden ist, wird ausgenützt, um die Probe zu untersuchen.
Die allgemeine Verfahrenstechnik, die beim Ausführen dieser Verfahren benützt wird, ist dem Fachmann geläufig, so daß eine Einzelbeschreibung nicht erforderlich ist.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Überprüfung auf Ak, Ag und Ak:Ag-Komplexe (beispielsweise die Verfahren (i) bis (v) und (viii)) wird eine Lösung von RF oder C1q benützt. Das RF oder C1q verbindet sich mit den Ak:Ag-Komplexen, jedoch nicht mit den freien Ak oder dem freien Ag. Das RF und C1q sind daher wirksam, um die Ak:Ag-Komplexe herauszutrennen bzw. zu binden, um RF/Ag:Ak oder C1q/Ag:Ak zu bilden.
In gewissen Fällen hat es sich gezeigt, daß bei der Bildung von RF/Ag:Ak oder C1q/Ag:Ak eine Tendenz zur Agglomeratbildung besteht und daß in diesem Fall das agglomerierte RF/Ag:Ak oder C1q/Ag:Ak durch Zentrifugieren oder Filterung entfernt werden kann, um eine klare Lösung zu hinterlassen. Diese Lösung enthält entweder
a) RF oder C1q, jedoch keine Ak:Ag-Komplexe, oder
b) Ak:Ag-Komplexe, jedoch kein RF oder C1q. Dies hängt davon ab, ob ein Überschuß oder ein Mangel an RF und C1q bestand. In den Fällen, bei denen diese effiziente Entfernung von RF/Ak:Ag oder C1q/Ak:Ag möglich ist, wird die quantitative Untersuchung erleichtert, da es nämlich nur noch erforderlich ist, die in der Lösung verbleibende oder die aus der Lösung entfernte Menge an RF oder C1q oder Ak:Ag zu messen. Das entfernte RF/Ag: Ak und C1q/Ag:Ak kann man mit Puffern behandeln, um das Ak:Ag aus dem RF oder C1q freizugeben. Die oben genannten Messungen können in einfacher Weise dadurch vorgenommen werden, daß Materialien verwendet werden, die eine Identifizierungskennung tragen, beispielsweise ein radioaktives Atom, ein Enzym, ein Koenzym oder eine Fluoreszenzgruppe. Die Verwendung solcher Kennungen ist für Ak, Ag und Ak:Ag-Komplexe bekannt, obwohl sie zuvor zur Kenntlichmachung von RF oder C1q nie verwendet wurde. Die Erfindung beinhaltet folglich auch eine Lösung von RF oder C1q, bei der RF oder C1q eine Identifizierungskennung tragen.
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Wenn ein Ak:Ag-Komplex (entweder am Ak oder am Ag) eine Enzyrakenniing trägt und das betreffende Enzym ein Substrat mit einem sehr großen Molekulargewicht hat, wie es beispielsweise für Amylase der Fall ist, dessen Substrat Stärke ist, hat es sich gezeigt, daß bei einer Bindung des Komplexes mit RF oder C1q die Aktivität des Enzyms gehemmt wird. Eine derartige Enzymkennung kann entweder mit dem Ak oder dem Ag verbunden werden, und zwar entsprechend der in Nature, 219. 186 (1968), von Miles und Haies beschriebenen Technik. Wenn eine solche Hemmung auftritt, ist es bei den Untersuchungs- bzw. Analyseverfahren nicht mehr erforderlich, das RF/Ak:Ag oder C1q/Ak:Ag aus dem Testgemisch zu entfernen, da die gesamte enzymatische Aktivität des Gemisches nur noch auf dem kenntlich gemachten Ak oder Ag beruht, was nicht an RF oder C1q gebunden ist. Dies stellt eine äußerst vorteilhafte Maßnahme bei der Verwendung von RF und C1q zur Immunprüfung mit enzymatischer Kennung dar. Bisher war es erforderlich, den Ak:Ag-Komplex aus dem Testgemisch zu entfernen, bevor die enzymatische Aktivität bestimmt werden konnte. Wenn RF und C1q in Verbindung mit einem geeigneten enzymatisch kenntlich gemachten Ak- oder Ag-System verwendet werden, ist es nicht mehr erforderlich, den Ak;Ag-Komplex zu entfernen. Diese Vereinfachung vereinfacht in einem hohen Maße Analysenverfahren, die auf dem kontinuierlichen Durchflußprinzip beruhen.
Lösungen von RF und C1q sind für alle Arten von Immunprüfungen nützlich. Sie können beispielsweise für Analysen auf Ak oder Ag verwendet werden, bei denen die gesamten Ak oder Ag in einen Ak:Ag-Komplex umgesetzt werden, oder sie können für konkurrierende Bindungstests Verwendung finden. Bei diesen auf einem Wettbewerb beruhenden Bindungsprüfungen sind Verfahren, bei denen einem Testgemisch eine unzureichende Menge an RF
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oder C1q zugesetzt wird, um den gesamten Ak:Ag-Komplex und den kenntlich gemachten Ak:Ag-Komplex zu binden. Die Menge des kenntlich gemachten Komplexes, der an das RF oder C1q gebunden ist oder der ungebunden bleibt, wird dann bestimmt, um die in der ursprünglichen Testprobe befindliche Menge an Ak, Ag oder Ak:Ag zu ermitteln» Bei einer anderen Art von konkurrierendem Bin- . .dungstest findet der Wettbewerb bzw. die Konkurrenz zwischen beispielsweise einem kenntlich gemachten und einem nicht kenntlich gemachten Ag im Hinblick auf eine begrenzte Menge von Ak statt. Das RF und C1q werden benutzt, um den auf diese Weise gebildeten Komplex zu binden und um ihn in wirksamer Weise von dem nicht gebundenen Ag zu trennen.
Lösungen von RF und C1q sind insbesondere zur kontinuierlichen Durchflußanalyse von biologischen Fluidproben nützlich, und die Erfindung umfaßt daher diese Art der Anwendung.
Einige der oben erwähnten Verfahren werden im folgenden im einzelnen beschrieben.
Konkurrierender Bindungstest
Dieser Bindungstest betrifft den Wettbewerb zwischen zwei Ak:Ag-Komplexen in bezug auf eine begrenzte Menge von RF oder C1q. Wenn beispielsweise ein Überschuß von einem -kenntlich gemachten Ak:Ag-Komplex einer begrenzten Menge von RF oder C1q zugesetzt wird, wird das gesamte RF oder C1q an den Komplex gebunden. Wenn dann zusätzlich zu dem kenntlich gemachten Komplex eine Serumprobe zugefügt wird, die einen nicht kenntlich gemachten Ak:Ag-Komplex enthält, kommt es zwischen dem kenntlich gemachten und dem nicht kenntlich gemachten
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Komplex zu einem Wettbewerb auf einer molaren Basis in bezug auf die begrenzte Menge an RF oder C1q. Wenn nach Erreichen des Gleichgewichts das RF oder C1q zusammen mit den gebundenen Komplexen entfernt wird, zeigt das Vorhandensein (oder das Vorhandensein einer besonderen minimalen Menge) des kenntlich gemachten Komplexes in der verbleibenden Lösung an, daß die Serumprobe einen Ak:Ag-Komplex enthielt. Dieses Verfahren kann zur quantitativen Bestimmung eingesetzt werden, um die Menge des Komplexes in der Serumprobe zu messen, und man kann es heranziehen, um das Vorhandensein eines besonderen Ag oder Ak nachzuweisen, indem man die Gegenwart eines Ak:Ag-Komplexes nach der Zugabe des spezifischen Ag oder Ak erstellt.
Bei dem obigen Verfahren kann man·das an RF oder C1q gebundene Ak:Ag entfernen, wenn es unlöslich ist oder anderweitig selektiv aus der Lösung entnommen werden kann. Wenn man andererseits von der enzymatisehen Kennung Gebrauch macht, und es zu einer Hemmung der enzymati sehen Aktivität bei der Bindung an RF oder C1q kommt, braucht das gebundene Ak:Ag nicht mehr entfernt zu werden.
Nachweis und Analyse eines Antigens
Ein Antigen, beispielsweise Morphin, kann wie folgt nachgewiesen und analysiert werden. Morphin wird mit einem Enzym, beispielsweise Amylase, kenntlich gemacht. Spezifische Antimorphin-Antikörper Ak" werden zubereitet. Die auf Morphin zu untersuchende -Probe aus Serum oder Harn wird mit dem Ak" gemischt. Irgendein vorhandenes Morphin bildet mit dem Ak" einen Komplex. Dann wird das durch ein Enzym kenntlich gemachte Morphin zugesetzt. Dies ist lediglich in der Lage, mit dem Ak" entsprechend der Konzentration des Morphins in dem Serum oder Harn zu komplexieren. Eine Lösung von RF oder
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C1q wird dann zugesetzt.
Das RF oder C1q verbindet sich mit den Komplexen, die zwischen dem Ak" und dem ggf. in dem Serum vorhandenen Morphin und dem kenntlich gemachten Morphin gebildet werden. Es entstehen Agglomerate. Das Ergebnis davon ist, daß die Komplexe aus dem Ak" und dem kenntlich gemachten Morphin infolge ihrer Bindung ihre enzymatische Aktivität verlieren, so daß es nur noch notwendig ist, die enzymatische Aktivität des freien kenntlich gemachten Morphins in der Lösung zu messen. Wenn es erwünscht ist, kann man die agglomerierten RF/Ak":Morphin-Komplexe aus der Lösung entfernen, obwohl dies nicht notwendig ist. Ein ähnliches Verfahren kann man für andere Antigene und mutatis mutandis Antikörper verwenden.
Dieses Verfahren veranschaulicht eine äußerst nützliche Eigenschaft, die bei der Verwendung von Lösungen von RF und C1q auftritt, daß nämlich bei einer Bindung an Ak: Ag-Komplexe, in denen der Ak oder Ag durch gewisse. Enzyme kenntlich gemacht ist, eine Agglomeration auftritt, und zwar mit dem Ergebnis, daß die Aktivität des Enzyms gehemmt wird.
Allgemeines Immunprüfverfahren
Es ist oft erwünscht, daß die in einer Probenflüs- <* sigkeit vorhandene Menge eines Ak, Ag oder Ak:Ag-Komplexes gemessen wird. Es sind Verfahren (Immunprüfverfahren) bekannt, die dies ermöglichen. Es hat sich herausgestellt, daß RF und C1q für Immunprüfverfahren eingesetzt werden können, und zwar mit großem Vorteil sowohl im Hinblick auf die Vereinfachung des Gesamtverfahrens als auch im Hinblick auf eine höhere Zuverlässigkeit und Genauigkeit der Ergebnisse.
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Im folgenden wird an Hand eines allgemeinen Beispiels die Verwendung einer Lösung von RF oder C1q in einem Immunprüfverfahren beschrieben. Unabhängig von diesem Beispiel können RF und C1q mit großem Vorteil auch in anderen Immunprüfverfahren verwendet werden.
Bei einem typischen bekannten radiometrischen Immunprüfverfahren zum Überprüfen eines Antigens Ag wird der Lösung des Ag eine bekannte Menge desselben Ag hinzugefügt, das jedoch radioaktiv kenntlich gemacht ist und hiermit Ag* bezeichnet ist. Weiterhin wird eine bekannte Menge des spezifischen Antikörpers Ak für das Ag (und Ag*) zugesetzt. Es werden Komplexe Ak:Ag und Ak:Ag* gebildet. Diese Komplexe werden herausgetrennt, so daß eine Flüssigkeit mit Ag und Ag* verbleibt. Die Menge des Ag*, die entweder in den herausgetrennten Komplexen ist oder die in der Flüssigkeit verbl&ben ist, kann gemessen werden. Daraus kann man dann das ursprünglich in der Probe vorhandene Ag berechnen.
Obwohl dieses bekannte Verfahren nutzbar ist, ist seine Ausführung äußerst mühsam, da für jedes besondere, zu messende Ag (oder Ak) das radioaktiv kenntlich gemachte Ag* (oder Ak*) ermittelt werden muß.
Durch Verwenden einer Lösung von RF oder C1q kann man diesen Nachteil überwinden. Der das zu bestimmende Ag enthaltenden Probe wird beispielsweise zuerst ein Überschuß des spezifischen Antikörpers Ak zugesetzt. Folglich wird ein Komplex Ak:Ag gebildet. Es wird dann eine bekannte Menge einer Lösung von Rf oder C1q zugesetzt, die die Menge übertrifft, die zum Binden des gesamten Ak: Ag-Komplexes notwendig ist. Das gebildete RF/Ak:Ag agglutiniert und kann entfernt werden. In der Lösung verbleibt
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somit der Überschuß an RF oder C1q, d.h. die ursprünglich zugesetzte Menge abzüglich der an den Ak:Ag-Komplex gebundenen Menge. Die verbleibende Überschußmenge kann dann gemessen werden, so daß die ursprünglich in der Probe vorhandene Menge des Ag berechnet werden kann.
Die Überschußmenge von RF (oder C1q) kann beispielsweise derart gemessen werden, daß man kenntlich gemachtes RF oder C1q verwendet oder daß das überschüssige RF einer bekannten überschüssigen Menge eines kenntlich gemachten Ag1:Ak'-Komplexes zugesetzt wird, beispielsweise einem Komplex, der mit Katalase (das ist ein Antigen) und Antikalase-Serum gebildet ist. Das RF in der Lösung bindet den kenntlich gemachten Komplex Ag':Ak1, und die darin befindliche Menge RF kann dann berechnet werden, beispielsweise durch Messen der enzymatischen Aktivität der Lösung, und zwar mit der Option, daß vorher der Komplex entfernt wird. Es kann allerdings nicht wesentlich sein, den Komplex zu entfernen, da, obwohl die Enzymkatalase in bezug auf den Ak verhältnismäßig groß ist und beim Bilden des Komplexes Ak:Ag keinen Verlust an Aktivität erleidet, ein Verlust an Aktivität auftritt, wenn der Komplex mit RF oder CIq. gebunden wird und Agglomeration auftritt·
Es sei bemerkt, daß bei dem obigen Verfahren unter Verwendung von RF oder C1q abgesehen von dem spezifischen Antikörper Ak alle Reagenzien Standardstoffe sind, d.h. das RF und der kenntlich gemachte Komplex Ak1:Ag1. Diese Reagenzien können für die quantitative Analyse irgendeines Ag oder (mutatis mutandis) Ak oder eines Komplexes selbst verwendet werden. Wenn die Analyse für den Komplex selbst erfogt, wird der oben beschriebene anfängliche Schritt, nämlich der Zusatz des Antikörpers Ak, weggelassen.
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Charakterisierung
Viele der oben beschriebenen Verfahren, bei denen eine Lösung von RF oder C1q verwendet wird, können zur Vorbereitung der Charakterisierung von Ak, Ag oder Ak:Ag-Komplexen benutzt werden. Einige der Verfahren führen direkt zu einer Identifikation von beispielsweise einem besonderen Ak oder Ag. Dabei handelt es sich beispielsweise um solche Verfahren, bei denen die Gegenwart eines besonderen Ak vermutet wird und dies dann auch durch Zugabe des besonderen Ag bestätigt und das Vorhandensein des Ak:Ag-Komplexes bestimmt wird.
RF und C1q sind zur Charakterisierung von· Ak, Ag und Ak:Ag-Komplexen äußerst nützliche Reagenzien. Dazu wird auf die folgenden Ausführungen verwiesen.
Die Identifikation (d.h. Charakterisierung) eines Antigens wird im allgemeinen mit verschiedenartigen Verfahren vorgenommen, beispielsweise durch Spektrofotometrie, um das Vorhandensein einer Nukleinsäure festzustellen, durch Elektronenmikroskopie, um Viren zu identifizieren, und durch Immunfluoreszenz mit spezifischen Antiseren, die gegen Virus- oder Gewebeantigene gerichtet sind· Für gewisse Anwendungen kann es zweckmäßig sein, das RF oder C1q (gelöst oder in nicht löslich gemachter Form)
125 kenntlich zu machen. Dies kann beispielsweise mit J , einem Fluoreszenzstoff oder einem Koenzym (NADH) geschehen.
Lösungen von RF und C1q vereinigen sich nicht nur mit Ak:Ag-Komplexen, sondern auch mit angehäuften Immunglobulinen. Diese Tatsache sollte man bei der Ausführung der oben beschriebenen Verfahren im Gedächtnis behalten. Angehäufte Immunglobuline kann man beispielsweise mit radioaktivem Jod oder mit einem Fluorchrom kenntlich ma-
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chen, und man kann sie bei den oben beschriebenen analytischen Verfahren anstelle der .kenntlich gemachten Ak: Ag-Komplexe verwenden, beispielsweise beim Analysenverfahren anstelle des kenntlich gemachten Ak1:Ag'-Komplexes,
Hemmung von Agglutination
Sowohl RF als auch C1q verursachen Agglutination von roten Blutzellen. Ferner verursachen sie die Agglutination von Stoffen, die beispielsweise einen überzug oder eine äußere Oberfläche aus Immunglobulinen haben, wie Polystyrolteilchen, die mit Immunglobulin überzogen sind· Solche Überzüge können durch immunolagische Reaktionen zwischen Ak und Membran-Antigenen gebildet werden oder durch physikalische Adsorption oder durch chemische Reaktion. Mit Immunglobulin überzogene Polystyrolteilchen sind handelsüblich, können aber auch sehr leicht selbst hergestellt werden.
Wenn diese überzogenen Teilchen oder roten Blutzellen mit RF oder C1q in Berührung kommen, beginnt das Auftreten der Agglutination. Wenn allerdings in der Lösung auch ein Ak:Ag-Komplex vorhanden ist, reagiert dieser mit RF oder C1q verhältnismäßig schneller, so daß das RF und C1q mit dem in der Lösung befindlichen Ak:Ag-Komplex gebunden wird und als Folge davon keine Agglutination der überzogenen Teilchen (oder roten Blutzellen) auftritt. Das,. Vorhandensein von Ak:Ag-Komplexen im Serum kann man somit beispielsweise dadurch nachweisen, daß das Serum mit (löslichem) RF und C1q sowie mit Teilchen in Berührung gebracht wird, die mit Immunglobulin überzogen sind. Wenn eine Agglutination beobachtet wird, enthält das Serum keine AkiAg-Komplexe.
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Dies ist ein sehr einfacher und zuverlässiger Test, der zum Nachweis von allen Ak:Ag-Koinplexen angewendet werden kann. Es folgt ein Beispiel des Verfahrens :
50 /Ul Serum werden 50 All einer Lösung von löslichem C1q oder RP zugesetzt, und das Gemisch wird mit 50 All einer Suspension von Polystyrolteilchen vereinigt, die mit Immunglobulinen überzogen sind. Eine auftretende Agglutination der Teilchen kann sehr leicht festgestellt werden.
Der beschriebene Test kann auch zum Nachweis der Anwesenheit eines besonderen Ag oder Ak im Serum benutzt werden. Wenn man beispielsweise eine Überprüfung auf ein besonderes Antigen Ag1 vornehmen will, wird dem Serum der geeignete spezifische Antikörper Ak1 zugesetzt, und dann wird der Test im Hinblick auf das Vorhandensein eines Ak:Ag-Komplexes, nämlich Ak1:Ag1, durchgeführt. Wenn das Serum ursprünglich andere Ak:Ag-Komplexe enthält, müssen diese zuerst entfernt werden, beispielsweise durch Verwendung von unlöslich gemachtem RF oder C1q, wie es in einer gleichzeitig eingereichten Anmeldung der Anmelderin beschrieben ist, auf die hiermit Bezug genommen wird.
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden im folgenden Ausführungsbeispiele erläutert.
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Beispiel 1
Bestimmung von Thyroxin
400 /Ul einer Probe mit T^ wurden 100 ml einer Lösung mit 60 ng RF und 1,00 ml Kaninchen-Antihuman-T^-Serum zugesetzt, das in geeigneter Weise verdünnt worden ist. Das Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert und anschließend für 5 min. bei 3000 g zentrifugiert. Das Obenstehende wurde mit einer Pasteur-Pipette entfernt und in ein Röhrchen gegeben, das 25 /Ul aminierte Ägarose (AH-Sepharose) enthielt, mit dem zuvor angehäuftes IgG kovalent verbunden worden ist. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur für 15 min. inkubiert und dann zentrifugiert, um die Agaroseteilchen zusammenzupacken. Das Obenstehende wurde entfernt, und der Rest wurde mit 1 ml einer 0,5-n wäßrigen Ammoniumrhodanidlösung geschüttelt. Das Obenstehende wurde dann quantitativ nach einem üblichen Verfahren auf IgM analysiert*
Die Konzentration des T^ war der endgültigen- Konzentration des verbleibenden IgM oder RF umgekehrt proportional .
Beispiel 2
Bestimmung von IgE
0,1 ml der zu untersuchenden Probe wurde mit einer Pipette in ein 5-ml-Zentrifugenrohr gegeben, und 1,0 ml Kaninchen-Antihuman-IgE-Antiserum (verdünnt 1:128) sowie 0,1 ml von handelsüblichem J125 IgE (60000 Zählungen/min.) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 37 0C für 1 h inkubiert, und anschließend wurden 0,1 ml einer RF-Lösung mit 100 ng RF zugesetzt. Die Inkubation wurde für eine weitere Stunde fortgesetzt, und das Gemisch wurde dann bei 2000 UpM für 5 min. zentrifugiert. Das Obenstehende wurde entfernt, und
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die Radioaktivität wurde mit einem Gammazähler gemessen. Die Konzentration des IgE war umgekehrt abhängig von der radioaktiven Zählung und konnte an Hand einer zuvor aufgenommenen Eichkurve ermittelt werden.
Beispiel 3
Bestimmung von IgE
0,1 ml einer Probe mit IgE wurde mit einer Pipette in ein 5-JBl-Rohr gegeben, und es wurde 1,0 ml des Kaninchen-Antihuman-IgE-Antiserums (verdünnt 1:128) zugesetzt. Das Gemisch wurde für 1 h bei 37 0C inkubiert. Es wurde 1 ml einer Lösung zugegeben, die 60000 Latexteilchen mit einem Durchmesser von 0,8 ai enthielt. Die Teilchen wurden zuvor in einer physiologischen Salzlösung mit 1 mg IgG/ml inkubiert. Das Gemisch wurde geschüttelt, und es wurde 0,1 ml einer Lösung mit 600 ng RF (oder C1q) zugesetzt.
Das Gemisch wurde über Nacht inkubiert und dann in einem Teilchenzähler verarbeitet, der Teilchen, die einen Durchmesser von mehr als 1 Mikron haben, nicht berücksichtigt. Die Konzentration des IgE war dem Teilchenzählwert umgekehrt proportional und konnte an Hand einer zuvor aufgenommenen Eichkurve ermittelt werden, die man mit Lösungen erhalten hatte, die bekannte Konzentrationen von IgE enthielten.
Beispiel 4
Automatische Analyse auf Ct^-Fetusprotein
Eine zu untersuchende Probe wird mit einem Durchfluß von 0,1 ml/min, in ein automatisches, nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip arbeitendes Analysen-
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gerät gepumpt, und zwar zusammen mit einer denselben Durchfluß aufweisenden Lösung mit 60000 Latexteilchen/ml. Die Latexteilchen hatten einen Durchmesser von 0,8 Mikron, und die Lösung war zuvor mit einem Ct1-Feturprotein-Antiserum inkubiert worden, das mit einer physiologischen Salzlösung 1:64 verdünnt worden war. Die gemischten Ströme wurden mit Luft segmentiert, die mit einem Durchfluß von 0,32 ml/min. in das System gepumpt wurde. Nach der Zufuhr der Luft wurde eine Lösung von C1q mit einem Durchfluß von 0,4 ml/min, eingeführt.
Der luftsegmentierte Strom wurde für 10 min. "bei 37 0C wärmebehandelt und anschließend für 2 min. auf 63 0C erhitzt, um das C1q zu zerstören und damit alle durch C1q gebundenen Latexteilchen freizugeben. Dies betrifft allerdings nicht diejenigen, die durch Ag:Ak gebunden sind.
Der Strom wurde dann durch einen Teilchenzähler geleitet, der Teilchen unberücksichtigt ließ, die einen Durchmesser von mehr als 1 Mikron hatten. Die Konzentration des cCj -Fetusproteins war umgekehrt proportional dem Teilchenzählwert und konnte an Hand von zuvor aufgenommenen Eichkurven ermittelt werden, die mit Lösungen mit bekannten Konzentrationen von CX^»Fetusprotein erstellt worden waren.
Beispiel 5
Bestimmung von Tetanusanotoxin-AgsAk-Komplexen
100 Ml einer Lösung mit 400 ng RF (oder C1q) wurden 100 ml eines Serums zugesetzt, von dem man annahm, daß es Tetanusanotoxin-Antigen enthalten würde* Das Gemisch wurde für 1/2 h bei Zimmertemperatur geschüttelt und dann bei
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2000 g für 5 min. zentrifugiert. Das Obenstehende wurde entfernt, und das restliche RF (oder C1q) wurde mit aminierter Agarose bestimmt, wie es im Beispiel 1 beschrieben ist.
Beispiel 6
Herstellung von kenntlich gemachtem RF oder C1q)
200 ml von 50-mmolarem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 wurden 100 /Ug rf (oder C1q) zugegeben.
Das Gemisch wurde in 20-/ul-Aliquote aufgeteilt, und Jedem Aliquot wurden 10 /uC J ^ gefolgt von 50 /Ug Chloramin-T zugegeben. Für 30 s wurde ein Fortschreiten der Oxydation zugelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 50 /ul einer wäßrigen Natriummetabisulfitlösung mit 50 /Ug Salz unterbrochen.
Das kenntlich gemachte RF (oder C1q) wurde dann
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von dem J ^ getrennt, indem das oben beschriebene Gemisch durch eine Säule aus Sephadex G25 geleitet wurde und das gewünschte kenntlich gemachte Material mit dem oben angegebenen Phosphatpuffer ausgewaschen wurde. Die Eluatfraktionen wurden auf Gammaaktivität überprüft, und die Fraktionen mit einer Spitzenaktivität wurden zusammengebracht, verschlossen und bis zur Verwendung eingefroren.
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Claims (35)

  1. - 22 - 252208
    Patentansprüche
    1 J Verfahren zum Analysieren einer biologischen Fluidprobe auf Ak, Ag oder Ak:Ag-Komplexe, dadurch gekennzeichnet, daß der Probe vor oder nach der Zugabe von anderen Reagenzien eine Lösung von RF oder C1q zugesetzt wird, um zwischen diesen Stoffen und den vorhandenen Ak:Ag-Komplexen eine Bindung zu bewirken.
  2. 2. Verfahren zum Bestimmen eines Ak oder Ag in einer biologischen Fluidprobe,
    dadurch gekennzeichnet,
    (a) daß der Probe ein Überschuß eines gegenüber dem in der Probe befindlichen Ak spezifischen Ag oder eines gegenüber dem in der Probe befindlichen Ag spezifischen Ak zugesetzt wird, um einen Ak:Ag-Komplex zu bilden,
    (b) daß dem beim Schritt (a) gebildeten Gemisch eine bekannte Menge einer Lösung von RF oder C1q zugesetzt wird, die einen Überschuß gegenüber derjenigen Menge darstellt, die zum Binden des gesamten vorhandenen Ak:Ag-Komplexes erforderlich ist, wobei das in dem Gemisch gebildete RF/Ak:Ag oder C1q/Ak:Ag agglomeriert,
    (c) daß das agglomerierte RF/Ak;Ag oder C1q/Ak: Ag von dem Gemisch abgetrennt wird und
    (d) daß die Menge des RF oder C1q, die nach Ausführen des Schrittes (c) in dem Gemisch verbleibt oder die durch den Schritt (c) von dem Gemisch getrennt wurde, gemessen wird und aus dem erhaltenen Meßergebnis die in der ursprünglichen Probe vorhandene Menge des Ak oder Ag berechnet wird.
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  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2,
    dadurch gekennzeichnet, daß zur Durchführung des Schrittes (d)
    (i) dem nach dem Schritt (c) übrigbleibenden Gemisch eine bekannte Menge eines Komplexes Ak':Ag' zugesetzt wird, die einen Überschuß gegenüber derjenigen Menge darstellt, die zum Binden des in dem Gemisch befindlichen gesamten RF oder C1q erforderlich ist, wobei der Komplex Ak1:Ag' eine Identifizierungskennung trägt, und
    (ii) die Menge des Ak1:Ag1 gemessen wird, die ohne Bindung an RF oder C1q in dem Gemisch frei vorhanden ist.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 3,
    dadurch gekennzeichnet, daß als Identifizierungskennung ein Enzym oder Koenzym gewählt wird, derart, daß die Aktivität des Enzyms oder Koenzyms nach erfolgter Bindung des Ak1:Ag'-Komplexes mit RF oder C1q gehemmt ist, und daß die Menge des freien AkMAg1 durch Messen der Enzym- oder Koenzymaktivität des Gemisches bestimmt wird, ohne daß vorher das RF/Ak'rAg1 oder Ciq/AkMAg' entfernt wird.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Ak'rAg1 als Identifizierungskennung Katalyse oder Amylase trägt,
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 3t
    dadurch gekennzeichnet, daß das RF/Ak'tAg« oder C1q/Ak':Ag! aus dem Gemisch entfernt wird und anschließend die in dem Gemisch verbleibende Menge an Ak1:Ag· gemessen wird.
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  7. 7. Verfahren zum Bestimmen eines Ak:Ag-Komplexes in einer biologischen Fluidprobe,
    dadurch gekennzeichnet,
    (a) daß der Probe eine bekannte Menge einer Lösung von RF oder C1q zugesetzt wird, die einen Überschuß gegenüber derjenigen Menge darstellt, die zum Binden des gesamten in der Probe befindlichen Ak:Ag-Komplexes benötigt wird, um RF/Ak:Ag oder C1q/Ak:Ag zu bilden, wobei das in dem Gemisch gebildete RF/Ak:Ag oder Ciq/AkiAg agglomeriert,
    (b) daß von dem Gemisch das agglomerierte RF/Ak:Ag oder C1q/Ak:Ag entfernt wird und
    (c) daß die Menge von RF oder C1q, die nach dem Schritt (b) in dem Gemisch verbleibt oder die durch den Schritt (b) von dem Gemisch getrennt wird, gemessen wird und aus diesem Meßergebnis die in der ursprünglichen Probe vorhandene Menge des Ak:Ag-Komplexes berechnet wird,
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7,
    dadurch gekennzeichnet, daß zum Durchführen des Schrittes (c)
    (i) dem nach dem Schritt (b) verbleibenden Gemisch eine bekannte Menge eines Komplexes Ak1:Ag1 zugesetzt wird, die einen Überschuß gegenüber derjenigen Menge darstellt, die zum Binden des gesamten in dem Gemisch befindlichen RF oder C1q benötigt wird, wobei der Komplex Ak1:Ag» eine Identifizierungskennung trägt, und (ii) die Menge des Ak1:Ag» gemessen wird, die ungebunden an RF oder C1q in dem Gemisch frei verbleibt.
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  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8,
    dadurch gekennzeichnet, daß als Identifizierungskennung ein Enzym oder Koenzym ausgewählt wird, derart^daß die Aktivität des Enzyms oder Koenzyms nach erfolgter Bindung des Ak': Ag •-Komplexes mit RF oder C1q gehemmt ist, und daß die Menge des freien Ak1 :Ag* durch Messen der Enzym- oder Koenzymaktivität des Gemisches bestimmt wird, ohne daß zuvor das RF/Ak'tAg* oder C1q/Ak':Ag· entfernt wird.
  10. 10· Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Ak1 :Ag* als Identifizierungskennung Katalyse oder Amylase trägt.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 8,
    dadurch gekennzeichnet, daß das RF/Ak':Ag* oder Ciq/Ak'rAg1 aus dem Gemisch entfernt wird und daß danach die in dem Gemisch verbleibende Menge an Ak1 :Ag* gemessen wird.
  12. 12. Verfahren zum Bestimmen eines Ak oder Ag in einer biologischen Fluidprobe,
    dadurch gekennzeichnet,
    (a) daß der Probe ein Überschuß eines gegenüber dem in der Probe befindlichen Ak spezifischen Ag* oder eines gegenüber dem in der Probe befindlichen Ag spezifischen Ak1 zugesetzt wird, um einen Ak :Ag* -Komplex oder einen Ak* :Ag-Komplex zu bilden, wobei Ak* oder Ag* eine Identifizierungskennung tragen,
    (b) daß dem im Schritt (a) gebildeten Gemisch eine Lösung von RF oder C1q in einer solchen Menge zugesetzt wird, die unzureichend ist, um den gesamten Ak: Ag '-Komplex oder den gesamten Ak* :Ag-Komplex in dem Gemisch zu binden, und
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    (c) daß die Menge an Ak1 oder Ag1, die frei in der Probe ist oder die an RF oder C1q gebunden ist, gemessen wird und aus diesem Meßergebnis die in der ursprünglichen Probe vorhandene Menge von Ak oder Ag berechnet wird.
  13. 13· Verfahren nach Anspruch 12,
    dadurch gekennzeichnet, daß als Identifizienmgskennung ein Enzym oder Koenzym gewählt wird, derart, daß die Aktivität des Enzyms oder Koenzyms nach erfolgter Bindung des Ak* :Ag-Komplexes oder des Ak:Ag·-Komplexes an RF oder C1q gehemmt ist, und daß die Menge des freien Ak1 oder Ag1 durch Messen der Enzym- oder Koenzymaktivität in dem Gemisch bestimmt wird, ohne daß zuvor das mit RF oder C1q gebundene Ak':Ag oder Ak:Ag' entfernt wird.
  14. 14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Ak* oder Ag* als Identifizierungskennung Kataläse oder Amylase trägt.
  15. 15. Verfahren nach Anspruch 12,
    dadurch gekennzeichnet, daß das mit RF oder C1q gebundene Ak':Ag oder Ak:Ag1 aus dem Gemisch entfernt wird und daß danach die in dem Gemisch verbleibende Menge von Ak1 oder Ag1 gemessen wird.
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  16. 16. Verfahren zum Bestimmen eines Ak:Ag-Komplexes in einer biologischen Probe,
    dadurch gekennzeichnet,
    (a) daß der Probe eine bekannte Menge eines
    Ak1:Ag'-Komplexes, der eine Identifizierungskennung trägt, und eine Lösung von RF oder C1q in einer solchen Menge zugesetzt werden, die unzureichend ist, um die Gesamtmenge an Ak: Ag- und Ak1: Ag'-Komplexen in dem Gemisch zu binden, und
    (b) daß die Menge des Ak':Ag', die in dem Gemisch frei ist oder die an RF oder C1q gebunden ist, gemessen wird und aus diesem Meßergebnis die in der ursprünglichen Probe vorhandene Menge an Ak:Ag berechnet wird.
  17. 17. Verfahren nach Anspruch 16,
    dadurch gekennzeichnet, daß als Identifizierungskennung ein Enzym oder Koenzym gewählt wird, derart, daß die Aktivität des Enzyms oder Koenzyms nach erfolgter Bindung des Ak1:Ag'-Komplexes an RF oder C1q gehemmt ist, und daß die Menge des freien Ak':Ag' durch Messen der Enzym- oder Koenzymaktivität des Gemisches bestimmt wird, ohne daß zuvor das an RF oder C1q gebundene Ak':Ag oder Ak:Ag' entfernt wird.
  18. 18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Ak':Ag' als Identifizierungskennung Katalyse oder Amylase trägt.
  19. 19. Verfahren nach Anspruch 16,
    dadurch gekennzeichnet, daß das RF/Ak1:Ag' oder C1q/Ak':Ag' aus dem Gemisch entfernt wird und daß anschließend das in dem Gemisch verbleibende Ak1:Ag' gemessen wird.
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  20. 20. Verfahren zum Bestimmen eines Ak oder Ag in einer "biologischen Fluidprobe,
    dadurch gekennzeichnet,
    (a) daß der Probe ein in bezug auf den in der Probe befindlichen Ak spezifisches Ag oder ein in bezug auf das in der Probe befindliche Ag spezifischer Ak zugesetzt wird, um einen Ak:Ag-Komplex zu bilden,
    (b) daß dem sich beim Schritt (a) ergebenden Gemisch eine bekannte, eine Identifizierungskennung tragende Menge des zu bestimmenden Ak oder Ag zugesetzt wird,
    (c) daß dem beim Schritt (b) gebildeten Gemisch eine Lösung von RF oder C1q in einer Menge zugesetzt wird, die wenigstens ausreicht, um den gesamten Ak:Ag-Komplex in dem Gemisch zu binden, und
    (d) daß die Menge des kenntlich gemachten Ak oder Ag, die frei in dem Gemisch verbleibt oder die an RF oder C1q gebunden ist, gemessen wird.
  21. 21. Verfahren nach Anspruch 20,
    dadurch gekennzeichnet, daß als Identifizierungskennung ein Enzym oder Koenzym gewählt wird, derart daß die Aktivität des Enzyms oder Koenzyms nach erfolgter Bindung des kenntlich gemachten Ak- oder Ag-Komplexes mit RF oder C1q gehemmt ist, und daß die Menge des freien, kenntlich gemachten Ak oder Ag durch Messen der Enzym- oder Koenzymaktivität in dem Gemisch bestimmt wird, ohne daß zuvor das mit RF oder C1q gebundene Ak:Ag entfernt wird.
  22. 22. Verfahren nach Anspruch 21,
    dadurch gekennzeichnet, daß das Ak1 oder Ag1 als Identifizierungskennung Katalase oder Amylase trägt.
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  23. 23. Verfahren nach Anspruch 20,
    dadurch gekennzeichnet, daß das mit RF oder C1q gebundene Ak:Ag aus dem Gemisch entfernt wird und daß danach die Menge des in dem Gemisch verbleibenden, kenntlich gemachten Ag oder Ak gemessen wird·
  24. 24. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Morphinbestimmung das im Schritt (b) zugesetzte, kenntlich gemachte Morphin als Identifizierungskennung das Enzym Amylase trägt.
  25. 25. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Ak:Ag-Komplexes in einer biologischen Fluidprobe,
    dadurch gekennzeichnet, daß der Probe eine Lösung von RF öder C1q und ein Material zugesetzt wird, das bei Berührung mit RF oder C1q zur Agglutination veranlaßt wird, und daß festgestellt wird, ob eine Agglutination des Materials auftritt.
  26. 26. Verfahren nach Anspruch 25,
    dadurch gekennzeichnet, daß das Material ein Immunglobulin enthält, mit dem inerte Trägerteilchen überzogen sind.
  27. 27. Verfahren nach Anspruch 26,
    dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen Polystyrol enthalten.
  28. 28. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit eines besonderen Ak oder Ag in einer biologischen Fluidprobe, dadurch gekennzeichnet, daß der Probe ein in bezug auf den besonderen, zu bestimmenden Ak spezifisches Ag oder ein in bezug auf das
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    besondere, zu bestimmende Ag spezifischer Ak zugesetzt wird, um mit irgendeinem der besonderen vorhandenen Ak oder Ag einen Ak:Ag-Komplex zu bilden, und daß die Gegenwart oder Abwesenheit eines solchen Komplexes durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27 festgestellt wird.
  29. 29. Verfahren zur Immunprüfung einer biologischen Fluidprobe auf Ak, Ag oder Ak:Ag-Komplexe, dadurch gekennzeichnet,
    (a) daß der Probe ein eine Enzymkennung tragender Ak, ein eine Enzymkennung tragendes Ag oder ein eine Enzymkennung tragender Ak:Ag-Komplex zugesetzt wird,
    (b) daß eine Lösung von RF oder C1q zugesetzt wird, um mit irgendeinem vorhandenen Ak:Ag-Komplex eine Bindung einzugehen, und
    (c) daß zur Prüfung der Probe' der Hemmungseffekt von RF oder C1q auf die Enzymaktivität irgendeines mit RF oder C1q gebundenen, kenntlich gemachten Ak:Ag-Komplexes verwendet wird.
  30. 30. Lösung von RF oder C1q,
    dadurch gekennzeichnet, daß das RF oder C1q eine Identifizierungskennung trägt.
  31. 31. Lösung nach Anspruch 30,
    dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Identifizierungskennung um ein radioaktives Atom, ein Enzym, ein Koenzym, ein Enzyminhibitor oder eine Fluoreszenzgruppe handelt.
  32. 32. Verfahren zur kontinuierlichen Durchflußanalyse biologischer Fluidproben,
    dadurch gekennzeichnet, daß den Proben eine Lösung von RF oder C1q zugesetzt
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  33. 33. Verfahren zur Analyse einer biologischen Fluidprobe, im wesentlichen wie in einem der Beispiele 1 bis 3 und 5 beschrieben.
  34. 34. Lösung aus kenntlich gemachtem RF oder C1q, im wesentlichen wie im Beispiel 6 beschrieben.
  35. 35. Verfahren zur kontinuierlichen Durchflußanalyse, im wesentlichen wie im Beispiel 4 beschrieben.
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