DE2527884C2 - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von po­ rösen Trägermaterialien mit immobilisierten biologisch aktiven Substan­ zen, beispielsweise Enzymen.

Biologisch aktive Substanzen, wie beispielsweise Enzyme, sind in gewissen Verfahren (z. B. Amyloglucosidase bei der Herstellung von Glucose aus Stärke) als Katalysatoren brauchbar. Dadurch wird in der Praxis häufig festgestellt, daß biologisch aktive Substanzen, wie beispielsweise Enzym­ präparate, lediglich in solchen Formen verfügbar sind, die wasserlöslich sind. Dies bedeutet, daß eine derartige Substanz bei Beendigung eines Verfahrens nicht ökonomisch isoliert werden kann, mit dem Ergebnis, daß die Substanz entweder in der erschöpften Flüssigkeit verlorengeht oder das Produkt verunreinigt.

Es kann daher vorteilhaft sein, eine biologisch aktive Substanz einem Trägermaterial zu immobilisieren, so daß diese aus den Reaktionsmedien durch physikalische Techniken, wie beispielsweise durch Filtration oder Se-dimentation abgetrennt werden kann. Außerdem sind biologisch aktive Substanzen, die auf einem Trägermaterial immobilisiert sind, für eine "lokalisierte" Verwendung, beispielsweise als Bett in einer Säule, ver­ fügbar.

Eine biologisch aktive Substanz wird auf einem Trägermaterial als immobi­ lisiert angesehen, wenn sie an dieses Material in einer derartigen Weise fixiert ist, daß es ermöglicht wird, zumindest einen Hauptanteil der Sub­ stanz durch das Trägermaterial unter den besonderen Verfahrensbedingun­ gen, bei denen das Trägermaterial und die biologisch aktive Substanz ein­ gesetzt werden, zurückzuhalten.

Es wurden bereits verschiedene Verfahren für ein "Fixieren" oder "Immobi­ lisieren" (oftmals auch als "Unlöslichmachen" bezeichnet) von biologisch aktiven Substanzen auf Trägermaterialien vorgeschlagen. So ist zum Bei­ spiel aus der US-PS 37 96 634 ein Verfahren zur Immobilisierung von Enzy­ men bekannt, bei dem die biologisch aktiven Substanzen als Monolayer­ schicht auf kolloidalen Teilchen absorbiert werden und auf diese Weise das Teilchen einhüllen. In einem zweiten Schritt werden die absorbierten Protein-Moleküle zur Verfestigung mit einem quervernetzenden Reagens ver­ netzt.

Ein ähnliches Verfahren beschreibt die US-PS 37 05 084, wobei jedoch makroporöse Trägermaterialien verwendet werden. Diese müssen jedoch gege­ benenfalls noch mit einem die Absorption fördernden Material vor Auf­ bringen des Enzymmaterials vorbeschichtet werden.

Jedoch sind diese Verfahren insofern nicht zufriedenstellend, als die Produkte aus diesen Verfahren Nachteile aufweisen. Beispielsweise wird die biologisch aktive Substanz entweder bei der Verwendung aus dem Trä­ germaterial "ausgelaugt", und/oder es ist die physikalische, chemische oder mikrobiologische Stabilität der Substanz/Trägermaterial-Kombination nicht zufriedenstellend, mit dem Ergebnis, daß die Substanz für eine fortgesetzte Wiederverwendung über längere Zeiträume hinweg, nicht ver­ fügbar ist.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Her­ stellung eines porösen Trägermaterials mit immobilisierenden biologisch aktiven Substanzen anzugeben. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit dem in den Ansprüchen bezeichneten Verfahren gelöst.

Der Ausdruck "biologisch aktive Substanz", wie er in dieser Beschreibung angewandt wird, umfaßt unter anderem protein­ haltige Substanzen (z. B. Enzyme), und schließt Substanzen ein, die als solche biologisch aktiv sind und solche, die es nicht sind, die jedoch nach Immobilisierung aktiviert werden können, um sie biologisch aktiv zu machen.

Außerdem soll der Ausdruck "biologisch aktive Substanz" so verstanden werden, daß er unter anderem diejenigen Substanzen umfaßt, welche im Stande sind, an spezifischen Wechselwir­ kungen teilzunehmen, wobei derartige Substanzen beispiels­ weise solche biologischen Ursprungs und solche, die auf den lebenden Organismus einwirken, umfassen. Substanzen synthe­ tischen Ursprungs, die sich an Reaktionen beteiligen können, einbezogen spezifische Wechselwirkungen analog denjenigen, die bei natürlich vorkommenden Substanzen auftreten können, werden ebenfalls in den Ausdruck "biologisch aktive Substanz" einbezogen.

Bei der Immobilisierung einer biologisch aktiven Substanz wird diese Substanz zeitweilig auf dem Trägermaterial zurück­ gehalten, derart, daß eine wesentliche Konzentration an die­ ser Substanz auf dem Träger für eine Immobilisation durch Vernetzung verfügbar ist. Der Ausdruck "zeitweiliges Zurück­ halten" soll sich im besonderen nicht auf die Verweilzeit der Substanz auf dem Träger beziehen, sondern er soll die Natur dieser Retentionsstufe von der permanenteren Immobi­ lisierung unterscheiden, die durch die Vernetzung erhalten wird.

Wenn auch eine Adsorption von biologisch aktive Substanz durch das Trägermaterial während einer zeitweiligen Reten­ tion erfolgen kann, wurde jedoch gefunden, daß die Verwen­ dung einer Adsorption allein zur Erzielung einer zeitweili­ gen Retention eine niedrige Ausbeute an immobilisierten Enzym liefern kann. Daher umfaßt die zeitweilige Retention gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung das Behandeln der Substanz derart, daß mehr als eine bloße adsorptive Retention durch das Trägermaterial erfolgt.

Die zeitweilige Retention von biologisch aktiver Substanz auf dem Trägermaterial kann beispielsweise durch Ausfällen aus einer Lösung einer biologisch aktiven Substanz unter Ver­ wendung eines Fällungsmittels bewirkt werden. Wahlweise kann Gefriertrocknung in Verbindung mit einem Fällungsmittel zur Erzielung einer zeitweiligen Retention angewandt werden.

Die Gefriertrocknung kann auch allein angewandt werden, um eine zeitweilige Retention zu erreichen, obgleich festgestellt wurde, daß dies weniger wirksam sein kann, als wenn man ein Fällungsmittel verwendet.

Obwohl ein Teil einer biologisch aktiven Substanz an der Oberfläche eines Trägermaterials immobilisiert werden kann, ist es in den meisten Fällen in hohem Maße wünschenswert, die Poren eines porösen Trägermaterials nutzbar zu machen da auf diese Weise das Verhältnis von Oberflächenbereich/Vo­ lumen des Trägermaterials erheblich vergrößert und so eine größere Menge an biologisch aktiver Substanz immobilisiert wird.In diesen Fällen sollte die Porengröße und Porenstruk­ tur des porösen Trägermaterials so beschaffen sein, daß das Eindringen der zu immobilisierenden Substanz und gegebenenfalls das Eindringen von Stoffen, mit denen die immobilisierte Substanz in Wechselwirkung treten soll, ermöglicht wird.

Daher ermöglicht es das Verfahren der vorliegenden Erfindung bei Verwendung eines porösen Trägermaterials und einer bio­ logisch aktiven Substanz, die in die Poren derselben ein­ dringen kann, die biologisch aktive Substanz in den Poren eines porösen Trägermaterials zu immobilisieren. Daher wird nach einer zeitweiligen Retention und Vernetzung die auf dem porösen Trägermaterial immobilisierte biologisch aktive Substanz in den Poren des Materials als auch auf seiner Oberfläche zugegen sein. Beispielsweise ist zu erwarten, daß im Falle eines teilchenförmigen porösen Trägermaterials ein Hauptanteil der immobilisierten Substanz eher in den Po­ ren als auf der Oberfläche der Teilchen vorhanden ist.

Erfindungsgemäß wird die zeitweilige Retention durch Ausfällung bewirkt und die Ausfällungs- und Vernetzungsverfahren werden nacheinander durch Behandeln der vorher auf das poröse Trägermaterial eingeführten biologisch aktiven Substanz mit einem Fällungs­ mittel und anschließend einem Vernetzungsmittel zur Ver­ netzung der biologisch aktiven Substanz, durchgeführt.

Es wurde gefunden, daß es möglich ist, viele biologisch ak­ tive Substanzen mit einem Fällungs- und einem Vernetzungs­ mittel, oder -mitteln gleichzeitig zu behandeln. Dies ist möglich im Falle von Enzymen (z. B. Amyloglucosidase), wobei die Zeit, die für das Ablaufen der Vernetzung erforderlich ist, die Zeit, die zur Ausfällung des Enzyms benötigt wird, weit übersteigt.

Die zeitweilige Retention von einigen biologisch aktiven Substanzen kann durch Vorbehandeln der Substanz zur Erzie­ lung eines Grades an Vernetzung erleichtert werden, in sol­ chen Fällen kann ein gewisser Vernetzungsgrad der Ausfällung vorangehen.

Bevorzugt wird ein poröses Trägermaterial zuerst zu einer konzentrierten Lösung einer biologisch aktiven Substanz (z. B. eines Enzyms) zugegeben und anschließend mit einem Fällungsmittel, das die Substanz nicht denaturiert, zur zeitweiligen Retention der biologisch aktiven Substanz auf dem porösen Trägermaterial, und einem Vernetzungsmittel zur Vernetzung und Immobilisierung der Substanz auf dem porösen Trägermaterial, behandelt.

Gemäß der Erfindung wird ein poröses Trägermaterial zu einer konzentrierten Lösung von biologisch aktiver Substanz (z. B. einem Enzym) zugegeben, die biologisch aktive Substanz zeitweilig auf dem porösen Trägermaterial durch Gefriertrock­ nen gebunden und das poröse Trägermaterial und die zeitweilig gebundene biologisch aktive Substanz mit einem Vernetzungs­ mittel unter Bedingungen derart behandelt, daß im wesentlichen keine temporär gebundene Substanz in Lösung geht, um eine Vernetzung und Immobilisierung der Substanz auf dem Träger­ material zu bewirken.

Gegebenenfalls kann nach der zeitweiligen Bindung der Sub­ stanz an das poröse Trägermaterial durch Gefriertrocknen weitere biologisch aktive Substanz auf das poröse Träger­ material vor der Vernetzung durch Eintauchen in eine kon­ zentrierte Lösung der Substanz und temporäre Bindung durch Behandeln mit einem Fällungsmittel aufgebracht werden.

Es ist ohne weiteres ersichtlich, daß bei der Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung mit einem porösen Trägermaterial biologisch aktive Substanz in Lösung einge­ führt werden kann, um das Porenvolumen des Materials auszu­ füllen und dann in einer solchen Weise behandelt werden kann, daß wesentliche Mengen der Substanz nicht aus den Poren ver­ drängt werden, und so die aus der Lösung kommende Substanz hierdurch veranlaßt wird, sich zeitweilig an das Trägermateri­ al zu binden. Die temporär gebundene Substanz, die auf dem Trägermaterial "lokalisiert" ist, wird nachfolgend zur Immo­ bilisierung derselben in den Poren vernetzt.

Die Immobilisierung von biologisch aktiven Substanzen auf einem Trägermaterial gemäß dem Verfahren der vorliegenden Er­ findung bezieht Sorption, Einschluß und Vernetzung ein.

Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde Amyloglucosidase unter Verwendung von Gallusgerbsäure als Fällungsmittel und Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel an den folgenden anorganischen Materialien, die jedoch ledig­ lich beispielsweise angegeben sind, immobilisiert: Poröse Titanerde-Kügelchen, poröse Calciumphosphat-Kügelchen, porö­ se Tonerde-Kügelchen, poröse Zirkonerde-Kügelchen, Glas mit kontrollierter Porenweite (Corning-Glastypen CPG10-240; 10-370; 10-1250; 30-370 und 30-2000), gemahlener Thermalit­ block, Laporte Spent Catalyst, Crossfield Spent Catalyst (Laporte Spent Catalyst und Crossfield Spent Catalyst ent­ halten poröse Aluminosilicat-Teilchen). Es ist selbstver­ ständlich, daß neben den vorerwähnten Beispielen auch andere Materialien für eine Verwendung als Trägermaterialien geeig­ net sind. Beispielsweise sind poröse natürliche Erden, wie zum Beispiel Celite, geeignete Trägermaterialien und es wur­ den gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren an porösen, aus Celite hergestellten Kügelchen, wie beispielsweise Holz, Viskose, Sephadex (ein vernetztes Dextran) und Biogel (ein Polyacrylamidgel) als Trägermaterialien verwendet werden. Beispielsweise wurde Amyloglucosidase an Holzspänen unter Verwendung von Gallusgerbsäure als Fällungsmittel und Glutar­ aldehyd als Vernetzungsmittel immobilisiert. Das Trägerma­ terial sollte wünschenswerterweise im wesentlichen unter den Verfahrensbedingungen und in den Reaktionsmedien, in denen das Trägermaterial und die biologisch aktive Substanz einge­ setzt werden, unlöslich sein.

Nachfolgend sind Beispiele von biologisch aktiven Substanzen angegeben, die bereits an porösen Titanerde-Kügelchen (mit einer Teilchengröße von 500 µm Durchmesser, wobei 60% der Porendurchmesser im Bereich von 0,27 µm bis 1 µm) unter Verwendung von Gallusgerbsäure als Fällungsmittel und Glutar­ aldehyd als Vernetzungsmittel immobilisiert wurden: Amylo­ glucosidase (4 Typen), Lactase (4 Typen), α-Amylase, Chymo­ trypsin, Trypsin, Urease, Glucoseoxydase, Lipoxydase, Glucose­ isomerase und Papain.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann mehr als eine biolo­ gisch aktive Substanz an dem gleichen Träger immobilisiert werden. So wurden Amyloglucosidase und α-Amylase zusammen immobilisiert.

Eine Anzahl von verschiedenen Reagenzien wurden bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als Fällungs­ mittel benutzt. So wurde unter Verwendung von Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel eine kommerziell verfügbare Amylogluco­ sidase (verfügbar unter dem Namen "Agidex") an porösen Titan­ erde-Kügelchen (Teilchengröße und Porengröße wie oben ange­ geben) immobilisiert, wobei man die folgenden Beispiele von Fällungsmitteln anwandte: Gallusgerbsäure in 70% Äthanol, Gallusgerbsäure in 50% Aceton, Gallusgerbsäure in 2 : 1 Wasser/Isopropanol, synthetische Polyphenole in 50% Aceton (verfügbar unter den Nahmen Tannia, Fixoflex, Fixin, Hysolad von Harshaw Chemicals Ltd.), Aceton, LT 24 Floccular (ein Flockungsmittel, erhältlich von Allied Colloids Ltd.), wässe­ rige Lösungen von Gallusgerbsäure, Salminsulfat, Alginsäure, Protaminsulfat, Pektin, Gallussäure, Pyrogallol, Polyäthylen­ glykol, DEAE-Dextran, Dextransulfat, Polygalacturonsäure und Polyäthylenimin.

Amyloglucosidase (Agidex) wurde ebenfalls gemäß der vorlie­ genden Erfindung an porösen Titanerde-Kügelchen (Teilchengröße und Porengröße wie oben angegeben) unter Verwendung von Formaldehyd als Vernetzungsmittel und Gallusgerbsäure als Fällungsmittel immobilisiert, und, zusätzlich, unter Ver­ wendung von Diäthylpyrocarbonat als Vernetzungsmittel und jedem der nachfolgenden Beispiele von Fällungsmitteln: Wässe­ rige Gallusgerbsäure, Salminsulfat, Alginsäure, Protamin­ sulfat, Pektin und Gallusgerbsäure in 70% Äthanol. Zusätz­ lich wurde Amyloglycosidase (Agidex) an porösen Titanerde- Kügelchen (Teilchengröße und Porengröße wie oben angegeben) unter Verwendung von Gallusgerbsäure als Fällungsmittel und alkalischer Oxidation zur Erzielung einer Vernetzung immobili­ siert. Andere Vernetzungsmittel umfassen Glyoxal und Bis­ diazoniumsalze.

Ebenso wurde gemäß der vorliegenden Erfindung Glucoseoxydase an Titanerde-Kügelchen unter Verwendung von Gallusgerbsäure und Diäthylpryocarbonat und Papain an Titanerde-Kügelchen unter Verwendung von Gallusgerbsäure und Formaldehyd immobi­ lisiert.

Die optimalen Bedingungen für die Immobilisierung biologisch aktiver Substanzen gemäß der vorliegenden Erfindung hängen, zumindest zum Teil, von den biochemischen Eigenschaften der Substanz ab. Demzufolge wird die Auswahl von beispielsweise dem Fällungsmittel, dem Vernetzungsmittel und der Vernetzungs­ zeit am günstigsten durch einen Versuch ermittelt.

Die Zeit für eine Immobilisierung kann zwischen etwa 0,5 Stunden bis 24 Stunden variieren, je nach der biologisch aktiven Substanz.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 4°C durchgeführt. Es wurde beobachtet, daß eine Inaktivierung von gewissen biologisch aktiven Substanzen bei höheren Temperaturen erfolgen kann. Jedoch hängt dies von der Substanz ab und es können höhere oder niedrigere Temperaturen geeignet sein.

Es wurde festgestellt, daß man bei der Immobilisierung von Amyloglucosidase (Agidex) an porösen Titanerde-Kügelchen (Teilchengröße und Porengröße wie oben angegeben) durch Fäl­ lung und Vernetzung vom Standpunkt der Enzymaktivität des immobilisierten Enzyms am besten so vorgeht, daß man Gallus­ gerbsäure als Fällungsmittel und Glutaraldehyd als Ver­ netzungsmittel anwendet. Beispielsweise wurde gefunden, daß unter Verwendung dieser besonderen Kombination von Fäl­ lungsmittel und Vernetzungsmittel die augenscheinliche En­ zymaktivität von an porösen Titanerde-Kügelchen immobili­ sierter Amyloglucosidase (Agidex) bis zu 20% der Enzymak­ tivität der als Quelle der Amyloglucosidase eingesetzten wässerigen Enzymzubereitung betragen kann.

Es wurde unter Verwendung von 5% Gallusgerbsäure in 5 : 1 Aceton/Wasser als Fällungsmittel und Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel eine Charge von an porösen Titanerde-Kü­ gelchen (Teilchengröße und Porengröße wie oben angegeben) immobilisierter Amyloglucosidase aus ∼110 g Titanerde-Kügel­ chen und 30 ml Agidex hergestellt und unter Bildung eines Bettes in eine 60 cm hohe Säule mit einem Volumen von 100 ml gepackt.

Eine mit Säure behandelte Stärkelösung wurde durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von zwischen 52 und 230 ml/ Stunde hindurchgeführt. Die Säule wurde während 8 Tagen auf einer Temperatur von 60° gehalten, während welcher Zeit 9 Liter der Lösung behandelt wurden.

Das Dextrose-Äquivalent (D.E.) des Produktes aus der Säule war so hoch wie dasjenige, das man erwartete, wenn ein lös­ liches Enzym für das gleiche Umwandlungsverfahren eingesetzt wird. Der Hydrolysegrad des Produktes war während 7 Tage des ständigen Gebrauchs der Säule konstant.

Es wurde eine Säule von an porösen Titanerde-Kügelchen immo­ bilisierter Amyloglucosidase kontinuierlich für die Hydroly­ se einer Dextrinlösung während eines Zeitraums von 7,5 Tagen eingesetzt. Das Produkt aus der Säule hatte einen konstan­ ten D.E.-Wert, der eine nahezu totale Umwandlung des Aus­ gangsmaterials anzeigte. Nachfolgend wurde die Säule von der Dextrinlösung freigewaschen, 5 Wochen bei Raumtemperatur aufbewahrt und für das gleiche Hydrolyseverfahren wiederver­ wendet. Es wurde gefunden, das der D.E.-Wert des Produktes der gleiche wie derjenige Wert war, den man vorher erhalten hatte. Die Säule wurde weitere 11 Wochen lang gelagert und es wurde gefunden, daß kein ernsthafter Verlust der Enzym­ aktivität auftrat.

Es wurde festgestellt, daß Titanerde-Kügelchen mit daran immobilisierter Amyloglucosidase gemäß der vorliegenden Erfindung entweder als Bettpackung, wie oben beschrieben, in einem Wirbelbettreaktor oder in einem gerührten Tankreak­ tor eingesetzt werden können. Es ist durchaus zu erwarten, daß dies in gleicher Weise auch für viele teilchenförmige Trägermaterialien mit daran gemäß der vorliegenden Erfindung immobilisierten, biologisch aktiven Substanzen Gültigkeit hat.

Amyloglucosidase wurde an porösen Titanerde-Kügelchen (Teil­ chengröße und Porengröße wie oben angegeben) unter Anwen­ dung der Gefriertrocknung und eines Fällungsmittels zur Erzielung einer zeitweiligen Retention und Glutaraldehyd zur Erzielung einer Vernetzung, immobilisiert.

Enzyme wurden in situ an einer Säule von porösen Titaner­ de-Kügelchen immobilisiert.

Während der in situ-Immobilisierung kann die überschüssige, biologisch aktive Substanz, die nicht temporär an das Träger­ material gebunden ist, für ein Im-Kreis-Führen durch Waschen des Trägermaterials (z. B. mit Aceton/Gallusgerbsäure) vor dem Vernetzen, zurückgewonnen werden.

Verbrauchtes immobilisiertes Enzym wurde von Titanerde-Kügel­ chen entfernt und die Kügelchen für eine weitere Immobili­ sierung wiederverwendet. Konzentrierte Salpetersäure, kon­ zentriertes Natriumhydroxid oder Erhitzen in einem Ofen sind zur Entfernung des Enzyms von den Kügelchen geeignet.

Es kann ein weiter Bereich von biologisch aktiven Substanzen auf einem weiten Bereich von Trägermaterialien gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisiert werden. Demzufolge bietet die vorliegende Erfindung den Vorteil der Flexibili­ tät über bekannte Immobilisierungsverfahren insofern, als ein Trägermaterial aus einem weiten Bereich von Materia­ lien auf Basis seiner Eigenschaften ausgewählt werden kann, um für eine besondere Anwendung geeignet zu sein.

Die vorliegende Erfindung wird nun durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Agidex-Lösung (1 ml) wurde in einem Eisbad zu porösen Titan­ erde-Kügelchen (3 ml; 500 µm Teilchengröße mit 60% der Poren im Bereich von 0,27 µm bis 1 µm Durchmesser) zugegeben, und man ließ die Lösung sich gleichmäßig über die Kügelchen ver­ teilen. Es wurde eine vorher in einem Eisbad gekühlte 5%ige Lösung von Gallusgerbsäure in 5 : 1 Aceton : Wasser (1,5 ml) zugegeben, gefolgt von einer 50%igen wässerigen Lösung von Glutaraldehyd (0,25 ml). Der Flüssigkeitsspiegel war dann unmittelbar oberhalb der Oberflächen der porösen Titankügel­ chen. Nach 5 Stunden wurden die Kügelchen aus dem Eisbad entfernt, gewaschen und in eine Säule gepackt, so daß man die Enzymaktivität untersuchen konnte. Zur Untersuchung der Eigenschaften der Säule wurde eine Lösung von Dextrin ver­ wendet und man erhielt, wenn man die Aktivität der ursprüng­ lichen Agidex-Lösung als 100% annimmt, eine augenscheinliche Aktivität des immobilisierten Enzyms in der Säule von 20%.

Beispiel 2

Eine Agidex-Lösung (4,5 ml) wurde wie in Beispiel 1 über poröse Titanerde-Kügelchen (15 ml) verteilt. Es wurde eine gekühlte, 2%ige Lösung von Gallusgerbsäure in Aceton (6,75 ml), in welche erst kurz vorher eine 50%ige wässerige Lösung von Glutaraldehyd (1,05 ml) gemischt worden war, zugegeben und die erhaltene steife Aufschlämmung sorgfältig gemischt. Nach 5 Stunden wurden die Kügelchen gewaschen und die Enzym­ aktivität wie in Beispiel 1 bestimmt. Die augenscheinliche Enzymaktivität des immobilisierten Enzyms wurde als ähnlich dem Wert, wie er in Beispiel 1 erhalten wurde, befunden.

Beispiel 3

Eine Agidex-Lösung, die an einem Verhältnis von 1 : 1 mit Wasser (8 ml) verdünnt worden war, wurde über poröse Titan­ erde-Kügelchen (10 ml); Teilchengröße und Porengröße wie in Beispiel 1) verteilt und gefriergetrocknet (lyophilisiert). Die Agidex-Lösung (1,5 ml) wurde über 5 ml dieser lyophili­ sierten Kügelchen verteilt und eine gekühlte 2%ige Lösung von Gallusgerbsäure in Aceton (2,25 ml) und 50% Glutaralde­ hyd (0,35 ml) in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 zuge­ geben. Es wurde gefunden, daß die augenscheinliche Aktivität des immobilisierten Enzyms um 15% höher lag als die Aktivi­ tät eines immobilisierten Enzyms, das unter Verwendung von porösen Titanerde-Kügelchen, jedoch ohne Gefriertrocknungs­ stufe hergestellt worden war.

Beispiel 4

Eine Agidex-Lösung (2 ml) wurde auf einem Eisbad zu 5 ml porösen Glasteilchen (Corning CPG 10 bis 1250, 36 bis 75 µ Teilchengröße) zugegeben und gut verteilt. Es wurde eine ge­ kühlte 5%ige Lösung von Gallusgerbsäure in 5 : 1 Aceton : Wasser (3 ml) zugegeben, gefolgt von einer 50%igen wässe­ rigen Lösung von Glutaraldehyd (0,5 ml). Nach 5 Stunden wur­ den die Glaspartikelchen gewaschen und die Enzymaktivität in einem kleinen gerührten Ansatzreaktor untersucht. Die augenscheinliche Aktivität des immobilisierten Enzyms betrug 93% der Aktivität des immobilisierten Enzyms auf porösen Titanerde-Kügelchen vom Typ, wie sie in den Beispielen 1, 2 und 3 verwendet worden waren.

Beispiel 5

Eine Agidex-Lösung (1 ml) wurde über poröse Titanerde-Kügel­ chen (3 ml) wie in Beispiel 1 gut verteilt. 1,5 ml einer gekühlten, 10%igen Lösung von Fixoflex (ein synthetisches Polyphenol) in 5 : 1 Aceton : Wasser wurden zugegeben, ge­ folgt von einer 50%igen wässerigen Lösung von Glutaraldehyd (0,25 ml). Nach 5 Stunden wurden die Kügelchen gewaschen und es wurde nach einer Untersuchung des immobilisierten Enzyms wie in Beispiel 1 gefunden, daß sie 82% der Aktivität des immobilisierten Enzyms besaßen, das mit Gallusgerbsäure in einer Aceton : Wasser-Mischung als Fällungsmittel hergestellt worden war.

Beispiel 6

1 ml einer wässerigen Lösung von Lactase (Maxilact 75 mg/ml) wurde zu 3 ml porösen Titanerde-Kügelchen zugesetzt und gleichmäßig verteilt. Eine gekühlte, 0,25%ige Lösung von Gallusgerbsäure in 5 : 1 Aceton : Wasser (1,5 ml) wurde zuge­ setzt, gefolgt von einer 20%igen wässerigen Lösung von Glu­ taraldehyd (0,1 ml). Nach 20 Minuten wurden die Perlen ge­ waschen und in eine Säule gepackt. Die augenscheinliche Akti­ vität des immobilisierten Enzyms betrug 11% der Aktivität des löslichen Enzyms, wenn o-Nitrophenyl-β-D-galactosid als Substrat verwendet wurde.

Beispiel 7

Eine Agidex-Lösung (1,5 ml) wurde zu porösen Titanerde-Kügel­ chen (500 µ, 5 ml) auf einem Eisbad zugegeben und gleich­ mäßig über die Kügelchen verteilt. Eine gekühlte, 2%ige Lösung von Gallusgerbsäure in Aceton (2,25 ml) wurde zuge­ setzt, gefolgt von einer 37%igen wässerigen Lösung von Formaldehyd (0,35 ml). Nach 5 Stunden wurden die Kügelchen gewaschen und das immobilisierte Enzym wie in Beispiel 1 geprüft. Es wurde gefunden, daß es eine Enzymaktivität auf­ wies, die 56% derjenigen eines in ähnlicher Weise immobili­ sierten Enzyms entsprach, das unter Verwendung von Glutar­ aldehyd als Vernetzungsmittel hergestellt worden war.

Beispiel 8

Agidex (1 ml) wurde über ein Büschel von Weichholz-Spänen, die ein Volumen von 3 ml hatten, auf einem Eisbad verteilt. Eine gekühlte, 2%ige Lösung von Gallusgerbsäure in Aceton (1,5 ml), in welche eine 50%ige Lösung von Glutaraldehyd (0,25 ml) kurz vorher eingemischt worden war, wurde zugesetzt und die Reagenzien sorgfältig gemischt. Nach 5 Stunden wur­ den die Späne gewaschen und lose in eine kleine Kolonne ge­ packt, damit sie auf ihre Enzymaktivität wie in Beispiel 1 geprüft werden konnte. Die Späne hatten eine Enzymaktivität, die 74% der Aktivität des immobilisierten Enzyms von Beispiel 2 betrug.

Beispiel 9

Man ließ eine wässerige Lösung von Glucoseisomerase-Enzym (1,5 ml, erhalten durch wässerige Extraktion von Maxazyme- GI 14 000Zellen) in 5 g poröse Titanerde-Kügelchen (Teil­ chengröße 500 µ Durchmesser, 60% der Porendurchmesser im Bereich von 0,22 bis 1 µm) auf einem Eisbad eindringen.

Das Enzym wurde mittels einer 3%igen Lösung von Gallusgerb­ säure in Aceton (2,25 ml) und 50%igem wässerigen Glutaralde­ hyd (0,05 ml) ausgefällt und vernetzt.

Nach einer Reaktionszeit von 1,5 Stunden auf einem Eisbad wurden die Kügelchen gewaschen und die Enzymaktivität über­ prüft.

Es wurde gefunden, daß die Kügelchen 35% der Enzymaktivität, die in der Ausgangslösung des Enzyms vorhanden war, aufwiesen.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung eines porösen Trägermaterials mit einer in den Poren und auf der Oberfläche durch Aufbrin­ gen, temporäres Binden und Vernetzen immobilisierten biolo­ gisch aktiven Substanz, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das temporäre Binden durch Ausfällung und/oder Gefriertrocknung erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die in die Poren des porösen Trägermate­ rials eingeführte biologische aktive Substanz gleichzeitig mit einem Ausfällungsmittel und einem Vernetzungsmittel oder -mit­ teln behandelt wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz vor der Ausfällung bis zu einem gewissen Grad vorvernetzt wird.