DE2534317A1

DE2534317A1 - Antikoerper, antigene bzw. antisera einschliessende fasern, verfahren zu deren herstellung und zur anwendung derselben

Info

Publication number: DE2534317A1
Application number: DE19752534317
Authority: DE
Inventors: Francesco Bartoli; Onofrio Lostia
Original assignee: SnamProgetti SpA
Current assignee: SnamProgetti SpA
Priority date: 1974-07-31
Filing date: 1975-07-31
Publication date: 1976-02-12
Also published as: CH628519A5; NL7509169A; AU502914B2; ZA754949B; DD120665A5; NO752690L; IL47845A0; DK145346B; FR2280353A1; US4031201A; JPS5144627A; NL177839C; NO147676B; FR2280353B1; LU73121A1; CS209481B2; GB1513169A; DE2534317B2; DK347875A; IL47845A

Description

Dr. F. Zumstein sen. - Or. E. AssTienn - Or. R. Koenigsberger Dipl.-Phys. R. Holzbauer - Dipl. Ing. F. KJingseissn - Dr. F. Zumstein jun.

PATENTANWÄLTE

TELEFON: SAMMEL-NR- 225341

TELEX 529979

TELEGRAMME: ZÜMPAT POSTSCHECKKONTO: MÜNCHEN 91139-8O9. BLZ 7CXD100 80 BANKKONTO: BANKHAUS H. AUFHÄUSER

KTO.-NR. 397997. BLZ 70030600

8 MÜNCHEN 2,

BRÄUHAUSSTRASSE 4

Case 37 468

SNAMPROGETTI S.ρ.Α., Mailand, Italien

"Antikörper, Antigene bzw. Antisera einschließende Fasern, . Verfahren zu deren Herstellung und zur Anwendung derselben".

Die Erfindung betrifft Antikörper, Antigene bzw. Antisera einschließende Fasern und Verfahren zu deren Herstellung.

Bekanntlich bezieht sich der Ausdruck "Antikörper" auf proteinartige Substanzen, die in einem V/irbeltier aus besonderen Zellen (Plasmazellen) als Rückwirkung auf die Verabreichung eines Antigens entstehen und mit diesem spezifisch reagieren.

Die Forschung über die Reaktion zwischen Antigen und Antikörper

6 0 9 B 8 7 / Ü 9 9 1

weist große theoretische Bedeutung zwecks besserer Kenntnis der Interaktion zwischen zwei Molekülen auf, ist aber auch für die Praxis wichtig, weil sie stets verbesserte Verfahren zur Diagnose von Infektionskrankheiten und zur Nachweisung von Infektionserregern bietet. Dabei wird ein Bestandteil analisiert, während der andere bereits bekannt ist. In Bezug auf Antigene und Antikörper sind Beschreibungen einiger Techniker zur Unlösbarmachung durch chemische Bindungen zwischen obigen in einem wässrigen Lösungsmittel unlösbaren 1 olymererzeugnissen und -stoffen bekannt.

Aber derartige Präparate sind mit den Kachteilen des ständigen Kontaktes mit der äußeren Umgebung, der Möglichkeit einer Dispersion derselben in der Reaktionsmasse und somit einer Verunreinigung desselben Endproduktes behaftet. Außerdem muß hervorgehoben werden, daß das Entstehen chemischer Bindungen die chemische Natur desselben Stoffes verändert und dessen Wirksamkeit negativ beeinflussen kann.

Andererseits ist auch bekannt, daß es möglich ist, poröse, Enzyme einschließende Pasern herzustellen, welche den auf diese Art immobilisierten Enzymen ihre katalytischen Eigenschaften bewahren, während der Austritt des Enzyms, dessen Dispersion in der Reaktionsmasse und daher auch die Möglichkeit einer Verunreinigung des Reaktionsproduktes verhindert werden. Die dabei verwendbaren fadenartigen Körper und das Verfahren zur Einschließung des Enzyms sind in der italienischen Patentschrift Nr. 836.4-62/beschrieben, nach welcher die Enzym einschließenden Fasern dadurch hergestellt werden können, daß man ^ und in der DT-PS 1932426

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von" Lösungen eines Polymers ausgeht, das Fasern ergibt, in welchen Enzympräparate als kleinste Tropfen der Größenordnung der Emulsionen eingeschlossen werden. Die so erhaltene Emulsion kann naß oder trocken gesponnen werden, um eine Faser zu bilden, welche in ihrem Inneren kleinste Höhlungen aufweist, in welchen die Enzyme eingebettet sind, welche von der Umgebung durch eine sehr dünne Membrane getrennt werden, die ein Austreten des Enzyms und dessen Dispersion in der Reaktionsmasse verhindert und trotzdem zuläßt, daß das Enzym seine katalytische Aktion entfaltet.

Wir haben nun gefunden, daß die Anwendung ähnlicher Techniken, wie die> die für die Enzyme bekannt sind, die Möglichkeit bietet, Antigene, Antikörper, Antisera, als solche oder polymerisiert, in poröse Gebilde einzubauen, wobei die so erhaltenen Präparate die oben erwähnten Nachteile nicht aufweisen, ohne daß dabei die Wirksamkeit der frischen Proteine in beeinträchtigendem Maße abnimmt;

Die so erhaltenen üebilcfe erweisen sich deswegen als hoch aktiv, weil das Verhältnis Fläche/Volumen ein hohes ist, während das Herstellungsverfahren sehr wirtschaftlich sowie leicht auszuführen ist und dazu die Möglichkeit bietet, auch Stoffe nicht hohen Reinheitsgrades einzubauen.

Die erfindungsgemäßen fadenartigen, Antikörper, Antigene und Antisera einschließenden Gebilde kommen für verschiedene Anwendungsgebiete infrage, bei welchen stets das Prinzip der gegenseitigen spezifischen Reaktivität verwertet wird. So können sie in Bezug auf Antisera und Antikörper dazu verwendet werden,

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um der äußeren Umgebung Antigene, Aptene (unvollständige Antigene), oder mit Proteinen und/oder Polypeptiden verbundene Substanzen zu entziehen, oder man kann unter Anwendung von eingeschlossenen polymerisieren Antigenen mehr oder weniger spezifische Antikörper entziehen. Außerdem können die vorerwähnten fadenartigen Gebilde dazu eingesetzt werden um Extraktionen auf industrieller Ebene mittels selektiver Fixierung und etwaiger Abtrennung der fixierten Substanz (Antigene, Antikörper usw.) vorzunehmen, so z.B. die Extraktion von Enzymen, wie Amylase, Protease, Invertase u.a.m.. Auch ist eine Verwendung bei der Technik der Chromatographie möglich, insbesondere bei der Affinitätschromatographie. z.B. um iso-enzymatische Substanzen in der Art der Kolinesterase zu trennen.

Die Differenz des Molekulargewichtes zwischen den in den Kleinst-ι höhlungen im Faserinneren eingeschlossenen Proteinen und den mit diesen zu bindenden Stoffen muß ausreichend sein, um eine Diffusion der zu bindenden Substanz bzw. Substanzen zu gestatten, bis die Substanz mit höherem Gewicht erreicht wird, die infolge ihres höheren Molekulargewichtes in der Faser eingeschlossen bleibt.

Das Verfahren zur Herstellung der obigen fadenartigen Gebilde wird - wie bereits erwähnt - ähnlich angewandt wie die Einbettung der Enzyme.

Insbesondere ist beim erfindungsgemäßen Verfahren nachstehende

Reihenfolge der Vorgänge vorgesehen:

a) Zubereitung des infrage kommenden einzubauenden Stoffes

unter Überprüfung der nichtspezifischen Fixierung am Faser-

5 0 9 8 8 7/0991

werkstoff sowie der fehlenden "bzw. nicht ins Gewicht fallenden Inaktivität infolge der Behandlung mit den Spinnlösungsmitteln,

b) Auflösung bzw. Suspension des Stoffes (a) in V/asser oder Wasser/Glycerin-Gemischen,

c) Zugabe der Lösung oder Suspension (b) an einen gelösten Polymer,

d) Rühren, bis eine homogene Emulsion entsteht,

e) Verspinnen der Emulsion (d) durch eine in einem Koagulationsbad tauchende Spinndüse,

f) Entfernen des Koagulationsbades und des Lösungsmittels des Polymers aus der Faser durch Behandlung in strömender Luft oder nötigenfalls in einem anderen Gas.

Die Spinnverhältnisse und die Eigenschaften der verwendbaren Polymere sind die gleichen, wie die, die bereits in der oben angeführten italienischen Patentschrift erwähnt sind.

unter den für die Herstellung der erfindungsgemäßen Fasern bevorzugten Stoffen sind die Cellulosenpolymere, veresterte, ätherisierte oder nitrierte Cellulosenpolymere und insbesondere die Polymere des Cellulose-Triacetats zu erwähnen. Weitere infrage kommende Polymere sind Polyäthylen, Polyamide, Polymere bzw. Kopolymere des Akrylnitritils, Butadien oder Isopren, Akrylate, Metakrylate, Vinylester, Vinylchloride, Polymere bzw. Kopolymere des Vinylidenchlorids, Styrol, Vinylbutyrat, V-Methylglutamat und dgl.

Auf jeden lall treten alle Vorgangseigenschaften aus den fol-

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genden erklärenden Beispielen deutlicher hervor, welche·jedoch nicht als Einschränkungen zu verstehen sind.

BEISPIEL 1

I. Zubereitung der Antisera

Die Antisera werden aus Meerschweinchen oder Kaninchen oder sonstigen Tieren gewonnen.

Die Substanz gegen die das zuzubereitende Antiserum wirken soll (Antigen oder konjugiertes Apten) wird mit komplettem Freund'schem Adjuvans vermischt und in die Medialfacies des Schenkels des Hinterbeines des Tieres eingespritzt. Nach 15 und nach 30 Tagen wird die Einspritzung mit gleicher Dosis des immunizierenden Agens (Antigen + Freund¹sches Adjuvans) wiederholt. Nach weiteren 15 Tagen wird eine weitere Immunisierung mit halber Dosis vorgenommen. Dann werden in Abständen von je 15 Tagen intrakardiale Blutentnahmen gemacht und am daraus gewonnenen Serum bestimmt man den AntiKörpergehalt. Letzterer wird durch reihenweise Verdünnungen des Antiserums mit Veronalpuffer 0,02 M pH 8,4 gemessen, in dem 0,5$ Serum-Menscheneiweiß (s.a.h.) und 0,5$ Normalserum enthalten sind.

Anhand der Techniken der radioimmunologischen Dosierung (RIA) wird die Verdünnung ermittelt, der ein Verhältnis

= 1

F entspricht.

Ebenfalls anhand der RIA-Techniken wird auch die Affinität des erhaltenen Antiserums bestimmt. ■

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II. Vorversuche ■ ^iJJHJ ' '

A) Versuche der nichtspezifischen Fixierung

B) Versuche der Antiserum-Inaktivierung durch Behandlung mit den für das Spinnen verwendeten Lösungsmitteln.

A) Versuche der nichtspezifischen Fixierung

In Röhrchen'aus Kunststoff wurden ca. 50 mg der sich aus den Vorgängen des Spinnens, der Koagulation und der Lösungsmittelabscheidung ergebenden Faser abgewogen.

Die Faser enthielt keine Antisera oder sonstige Sequestranten (Verbindungen, die mit Metallionen stabile Komplexe bilden).

Drei Reihen Röhrchen wurden vorbereitet mit folgendem Inhalt:

a) 50 mg Faser + 2,0 ml Phosphatpuffer (wie blank)

b) 50 mg Faser + 1,5 ml Phosphatpuffer + 0,5 ml markierten Antigens (Ag-I ^)

c) 50 mg Faser + 0,5 ml Phosphatpuffer + 1,0 ml einer Lösung

Ochseneiweißserum (BSA) V Fraktion 2,5$ in Phosphatpuffer

125 ' + 0,5 ml markierten Antigens (Ag-I ).

Verwendet wurde Phosphatpuffer 0,04 M pH 7,4- mit 0,5$ BSA.

125

Das markierte Antigen bestand aus Insulin-I ^J mit spezifischer Wirksamkeit lOOxtC/leg, welches im Verhältnis von 0,1/λ.0/50 mg Faser zugegeben wurde.

125

Es wurde auch Digoxin-I ^y in einer Äthanollösung mit Wirksamkeit 0,25/^0/0,5 ml verwendet und davon wurden 0,025/<Ό/50 mg Faser zugegeben.

Beide Stoffe wurden mit Phosphatpuffer zu der gewünschten Verdünnung gebracht. BLn Fasernteil wurde vor der Zugabe des markierten Antigens 1 Stunde lang mit der 2,5/6 BSA enthaltenen

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Lösung in Berührung gebracht. 2 5 3 4 317

Die Berührungsdauer der Paser mit dem markierten Antigen schwankte zwischen 40 Minuten und 48 Stunden.

Die Wirksamkeitswerte der die Pasern enthaltenden Röhrchen wurden mit einem Y-Counter gezählt.

Nach Beendigung der Berührungszeit wurden die Pasern fünfmal mit je 2 ml Phosphatpuffer gewaschen und dann wurde die restliche Radioaktivität mit dem ^-Counter gemessen.

Später wurden die Pasern von neuem fünfmal mit je 2 ml Phosphatpuffer gewaschen und die Radioaktivität wieder gemessen.

Daiin wurden die Pasern mit 2 ml Phosphatpuffer unter Rühren bei 37 G 17 Stunden lang in Berührung gehalten und daraufhin wurde die restliche Radioaktivität gemessen. Derselbe Vorgang wurde noch zweimal wiederholt. Darnach wurde Folgendes festgestellt:

a) Die mit den Pasern verbundene Radioaktivität nimmt allmählich zu, wenn die Dauer der Berührung mit dem markierten Antigen von 4-0 Minuten auf 4-8 Stunden steigt.

b) Die einstündige Vorinkübation mit BSA 2,5$ verringert die mit der Paser verbundene Radioaktivität.

c) Die zusätzliche Radioaktivität in den Röhrchen nimmt infolge der Waschungen bei zunehmender Anzahl der Waschungen sowie bei Verlängerung der Berührungsdauer der Paser mit dem Waschpuffer ab. Ein kleiner Anteil bleibt nach den beschriebenen Waschvorgängen zurück.

Daraus konnte, geschlossen werden, daß auch diese Paser - wie die meisten Stoffe - einen kleinen Anteil der bei der Zubereitung des markierten Antigens anwesenden Radioaktivität adsor-

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bierte und daß die Adsorption durch das BoA verringert wurde, welches einen Teil der in der Faser vorhandenen Aufn^hmehöhlungen füllte.

B) Inaktivierungsversuche des Antiserums durch Behandlung mit den für das Verspinnen verwendeten Lösungsmitteln

Verwendet wurden zwei Fläschchen mit einem Anti-Insulin-Antiserum, wie solche die in den handelsmäßigen KITS für "radioimmunoassay" (in Meerschweinchen erzeugtes Schwein-Anti-Insulin-Antiserum) geliefert werden, und in jedes KLäschchen wurden 5 ml zweimal destilliertes HpO gegeben, so daß eine Anti-Insulin-Antiserum-Lösung entstand, die mit Abρ bezeichnet wurde. Dann wurden 20 ml eines Gemisches von 4-0:60 (v:v) Wasser und Glycerin zubereitet, das man mit Gl,-₀ bezeichnete.

Dann wurden folgende Gemische zubereitet: a) 2,5 ml Ab₂

	+	2,5	ml	H₂O dest.
		5,0	ml	Ab₁
b)		7,3	ml	Ab₂
	+	7,3	ml	^G160
		14,6	ml	Ab₁Gl₃₀
c)		5	ml	Ab₁Gl₃₀
	+	32,	1 ml	Methylenchlorid

37,5 ml von zwei Phasen, die 15 Minuten lang bei O⁰G unter Rühren in inniger gegenseitiger Berührung gehalten wurden5

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nach anschließender Zentrifugation bei Raumtemperatur wurde die wässrige Phase entnommen, aus der das Methylenchlorid mit einer Stickstoffströmung ausgeschieden wurde. Erhalten wurden somit 15 ml einer als Ab₁Gl₃₀H bezeichneten Lösung.

d) 5 ml Ab₁Gl₃₀ + 2 ml Toluol

7 ml von zwei Phasen, die 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Rühren in inniger gegenseitiger Berührung gehalten wurden. Nach Zentrifugation bei Raumtemperatur wurde die wässrige Phase entnommen, aus der das Toluol mit einer Stickstoff strömung ausgeschieden wurde. Man erhielt somit 5 ml einer als AXl₃₀T bezeichneten Lösung.

Unter Anwendung der normalen RIA-Techniken wurden die Eichkurven im Konzentrationsabstand von 0-200 I-tU/ml menschliches Standardinsulin eingetragen, wobei das in'den vier verschiedenen Weigen behandelte Antiserum zur Verwendung kam, das oben mit Ab₁

• ^Abi ^G130 Ab₁ Gl₃₀M

Ab₁ Gl₃₀T bezeichnet wurde.

Aus den beiliegenden Eichkurven (Fig. 1) geht hervor, daß praktisch keine Abnahme des Bindevermögens des Antikörpers durch die Behandlung des Antiserums mit den für das Verspinnen verwendeten Lösungsmitteln eintritt,

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- Tl -

III. Zubereitung der Fasern

200 mg Cellulosetriacetat (Fluka) werden in 2,65 g Methylenchlorid (reines Reagens von C.Erba) bei Raumtemperatur aufgelöst.

Das einzubauende Produkt wird in HqO bzw. in HpO-Glycerin-Gemischen aufgelöst und dispergiert.

0,4 ml dieses wässrigen Mittels werden der vorher auf 0 G gekühlten Polymerlösung zugesetzt. Dann wird solange gerührt, bis eine gleichmäßige Emulsion entsteht, die man dann 20 Minuten lang ruhen läßt.

Diese Zubereitung erfolgt in einem Glaskolben, der oben mit einer Stickstofflasche verbunden ist und nach unten in eine Düse ausläuft, die in ein Toluol enthaltendes Koagulationsbad taucht.

Wird mit Stickstoff ein Druck ausgeübt, tritt die Emulsion durch die Düse heraus und gerinnt im Toluolbad. Der entstandene !Faden wird auf eine Rolle aufgewickelt und anschließend mit Luft angeblasen, um Toluol und Methylenchlorid zu entfernen.

IV. Einschluß des Anti-Insulin-Antikörpers

Nach der oben beschriebenen Technik wurde ein Anti-Insulin-Antiserum in Meerschweinchen erzeugt, dessen Antikörpergehalt bei der Bestimmung 150.000 betrug.

Zu 0,2 ml dieses Antiserums wurden 0,15 ml Veronal-Puffer 0,02 M, pH 8,4, der 0,5$ Menscheneiweißserum enthielt, sowie 0,15 ml Glycerin (G. Erba- R.P.) zugegeben.

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0,4- ml dieser Lösung wurden in den oben beschriebenen Faser-Zubereitungsverhältnissen dem Polymer zugegeben.

Mit derselben Einrichtung wurde eine Kontrollfaser gesponnen, in der anstelle von 0,2 ml der Antiserumlösung 0,2 ml Veronal-Puffer 0,02 M, pH 8,4 mit 0,5$ Menscheneiweißserum verwendet wurden. In Kunststoffröhrchen, wie diejenigen, die für die radioimmunologischen Dosierungen verwendet wurden, sind verschiedene Mengen Pasern eingefüllt worden, wie in Tabelle 1 wiedergegeben, wo

a) die Kontrollfaserreihe,

b) die Faserreihe mit Antiserum, wie sie aus dem Spinnvorgang kommt,

c) die Faserreihe mit Antiserum, die nach dem Spinnvorgang im Veronal-Puffer 0,02 M, pH 8,4 mit 0,5$ Menscheneiweißserum konserviert und fünfmal mit jeweils 2 ml Veronal-Puffer gewaschen wurde, bevor der Versuch beginnt» darstellen.

In jedes Röhrchen wurden eingegeben:

- 1,6 ml Phosphatpuffer 0,04 M, pH 7,4 mit 0,5/έOchseneiweißserum,

- 0,2 ml Insulin-I ^ mit spezifischer Wirksamkeit 100 /UCi/^Ug in einer Verdünnung, welche die zum Zeitpunkt der Zubereitung gemessene Wirksamkeit auf 0,01i«.0i/0,1 ml brachte,

- 0,2 ml menschliches Standard-Insulin in der Konzentration

Nach Vermengen wurden die Röhrchen 24 Stunden bei 4⁰C gehalten. Dann sind aus jedem Röhrchen 1,5 ml Lösung entnommen worden, deren Radioaktivität mit einem Y-Counter (Packard Mod. 256)

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i25
dessen Leistungsfähigkeit fur I ' ^vj^LV^ betrug, gemessen wurde.

Die Fasern wurden dreimal mit 2 ml j'hosphat-i.-uff er gewaschen, worauf die in den Fasern fixierte Radioaktivität mit dem /-Counter, wie bereits erwähnt, gemessen wurde. An denselben Faserproben wurden die Zugaben der Reaktivstoffe (-uffer, Insu-

Ί25
lin-I , Standardinsulin), die Waschungen sowie die lüadioakti-

vitätsmessungen viermal wiederholt.

IjS wird darauf hingewiesen, daß das als Auf spürer (Tracer) be-

Ί 25
nutzte Insulin-I ^J 5,j des als Carrier benutzten menschlichen otandardinsulins nicht übersteigt. Die erzielten Ergebnisse sind in tabelle 1 angeführt, woraus hervorgeht, daß die Fixierung des Insulins, die wir hier als nichtspezifisch bezeichnen, in den keine Antikörper enthaltenden Kontrollfasern einen Höchstwert beim ersten Versuch erreicht und in den darauffolgenden Versuchen praktisch konstant bleibt, während die Insulinfixierung in den, den Antikörper einschließenden Fasern .jedesmal zunimmt, wenn die Zugabe der 2eaktivstoffe wiederholt wird.

iiachdem die Kontrollfaser bei den genau gleichen Bedingungen wie die den Antikörper einschließende Faser zubereitet wurde, muß das unterschiedliche Verhalten ausschließlich der Bildung der Antigen-Antikörper-Bindung im Faserinneren zwischen dem eingeschlossenen Anti-Insulin-Antikörper und dem im Medium vorhandenen Antigen zugeschrieben werden.

(Tabelle 1 folgt)

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Reihe mit Antiserum

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- VIr -

BEISPIEL 2

Nach den gleichen oben beschriebenen Techniken wurde ein Anti-HGH-Antiserum in Meerschweinchen erzeugt, dessen Antikörpergehalt bei der Messung 2000 betrug.

Einer Menge von 2,0 ml dieses Antiserums sind 0,15 ml Veronal-Puffer 0,02 M, pH 8,4 mit 0,5$ Menscheneiweißserum sowie 0,15 ml Glycerin (G. Erba-R.P.) zugegeben worden.

Stets mit der gleichen Einrichtung wurde das Spinnen einer Kontrollfaser vorgenommen, bei der anstelle von 2,0 ml Antiserumlösung, 2,0 ml Veronal-Puffer 0,20 M, pH 8,4 mit 0,5# Menscheneiweißserum verwendet wurden.

In Kunststoffröhrchen gleicher Bauart wie die für die radioimmunologischen Dosierungen eingesetzten, wurden Mengen verschiedener Fasern gefüllt, wie in Tabelle 2 eingetragen, wo:

a) die Reihe der Kontrollfasern, und

b) die Reihe der Antiserum enthaltenden Pasern, nach dem Spinnvorgang darstellt.

Den beiden Reihen Röhrchen (8 Röhrchen je Reihe) wurden zugesetzt:

- 1,6 ml Borat-Puffer, 0,13 M, pH 8,4 mit 0,5$ BSA,

- 0,2 ml HGH-I ^ mit spezifischer Wirksamkeit 150/U-CiA^g in

einer Verdünnung,, die die im Zeitpunkt der Zubereitung gemessene Wirksamkeit auf 0,015 M-Ci/0,1 ml brachte, - 0,2 ml Standard-HGH in den in der Tabelle 2 eingetragenen Verdünnungen.

Nach Vermengung wurden die Röhrchen 24 Stunden bei 4 C gehalten, daraufhin sind jedem Röhrchen 1,5 ml Lösung entnommen worden,

Ö09887/U991

wovon die Radioaktivität mittels eines ^-Counters (Packard Mod. 256) mit Leistungsfähigkeit für I ^ gleich 54$ gemessen wurde.

Die Fasern wurden dreimal mit je 2 ml Borat-Puffer gewaschen und anschließend wurde die in den Fasern fixierte Radioaktivität mit obigem ^-Counter gemessen.

An denselben Faserproben wurden ein weiteres Mal die Zugaben der Reaktivstoffe (Puffer, HGH-I¹²⁵, Standard-HGH), die Waschungen und die Radioaktivitätsmessungen wiederholt. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Man kann daraus ersehen, daß in den Anti-HGH-Antikörper enthaltenden Fasern - vornehmlich nach dem zweiten Versuch - eine Menge Radioaktivität in allen Stufen der Konzentration vom zugesetzten Standard-HGH vorhanden ist, welche größer als in den entsprechenden Kontrollfasern ist, welche in ihrem Inneren kein Antiserum enthalten, aber sonst genau so behandelt wurden, wie die das Antiserum einschließenden Fasern.

Dazu ist zu bemerken, daß das verwendete Anti-HGH-Antiserum einen Gehalt gleich 2000 aufweist, und daß daher die Erscheinung der spezifischen "Sequestrierung" weniger auffällt als beim Versuch des Beispiels 1, wo ein Anti-Insulin-Antiserum mit Gehalt 150 000 verwendet wurde.

Die der Antigen-Antikörperverbindung zuzuschreibende spezifische Fixierung ist aber in den Anti-HGH-Antikörper enthaltenden Pasern auch in diesem Fall unzweideutig.

(Tabelle 2 folgt)

SG9887/0991

Tabelle 2

	Faser	Gewicht (mg)	Konzentrierung des zugesetzten Standard-HGH (g/ml)	Versuche	1. Counts/10'	2. Counts/10'
Kontrollreihe	Probe Nr.	10, 1 10,0	1,25 10	5.186 5.772	6.453 5.959
Reihe mit Antiserum	^ai a 2	10,2 9,7	10	5.739 4.080	7.529 4.523
*i	10, 1 9,6	20	5.093 3.799	6.756 4.783
a	9,7 9,9	50	3.970 4.500	4.890 5.233
a	9,6 10,4	1,25	6.239 6.029	9.169 9.492
	10,2 10,5	10	6.266 5.616	9.112 8.779 Κ-"¹
^b4	10,0 10,2	20	5.259 5.653	Ul 7-739 co 8.163 ⁴^ co
	9,8 9,8	50	4.943 5.366	6.736 ^ 7.899
*8

BEISPIEL 3

Kach den gleichen bereits beschriebenen Techniken wurde ein Anti-Triiodothyronin-Antiserum dadurch erzeugt, daß Triiodothyronin (T^), mit Menscheneiweißserum gebunden, Kaninchen eingeimpft wurde. Am gewonnenen Antiserum wurde ein Antikörpergehalt gleich 4000 festgestellt. Einer Menge von 0,2 ml Serum wurde 0,15 ml Veronal-Puffer 0,08 M, pH 7,5 mit 0,5 g/l henschenoiweißserum sowie 0,15 ml Glycerin zugegeben.

0,4- ml dieser Lösung wurden in 2oo mg Gellulose-Triacetat gemäß der bereits beschriebenen Faserzubereitungstechnik eingeschlossen.

i;ach derselben Technik wurde eine Kontrollfaser hergestellt, in die anstelle der Antiserumlösung in 200 mg Oellulose-Triacetat, 0,4- ml einer Lösung eingeschlossen wurde, die durch Vermengen von 0,55 ml Veronal-f^:uff er 0,08 M, pH 7,5 mit 0,5 g/l henscheneiweißserum sowie 0,15 ml Glycerin angesetzt wurde.

50 mg der den Antikörper enthaltenden Faser und 50 mg der Faser ohne Antikörper wurden in zwei Kunststoffröhrchen gefüllt und fünfmal mit 2 ml des oben beschriebenen Veronal-Puffers gewaschen.

Jedem Röhrchen wurden dann zugegeben:

- 2 ml Veronal-Puffer 0,08 M, pH ^O ^mit °>5 g/1 Menscheneiweißserum und 4- ltg/1 T,,

- 0,2 ml Τ-,-ΐ'¹ ^ _mit spezifischer Wirksamkeit 90 yttCiAUg,

die bis zu einer Wirksamkeit gleich 0,1 Lt^Gi/ml verdünnt wurden.

Nach Vermengung sind die Röhrchen 24- Stunden bei 4-⁰G gehalten

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worden.

Daraufhin wurden die Fasern von der die Reaktivstoffe enthaltenden Lösung befreit und fünfmal mit je 2 ml des bereits beschriebenen Veronal-Puffers gewaschen.

iiann wurden die Zugaben der Reaktivstoffe und die uaschungen - wie oben beschrieben - ein zweites FIaI wiederholt.

Schließlich wurde die in den Fasern vorhandene Radioaktivität mittels dem vorerwähnten Y-Counter gemessen.

An der Faser ohne Antikörper wurden 45 000 Gounts/10¹ gemessen, an der den Antikörper enthaltenden Faser 146 000 Gounts/10¹.

3EISrIEL 4

Gemäß den vorbeschriebenen '.Techniken wurde ein Anti-X Leichtketten-Antikörper und K in der Konzentration 25 mg/ml in physiologischer Pufferlösung pH 7,3 mit Natriumphosphat 0,01 Pl zubereitet.

Einer Menge von 0,35 ml dieser Lösung wurden 0,15 ml Glycerin zugegeben.

0,4- ml der letztgenannten Lösung wurden in 200 mg Cellulose-Triacetat gemäß der vorbeschrxebenen Technik eingeschlossen. Unter Anwendung desselben Soinnvorganges wurden 0,4 ml des vorbeschrxebenen Puffers in eine Kontrollfaser eingeschlossen.

100 mg der den Antikörper enthaltenden Faser und 100 mg der Kontrollfaser sind in zwei Kunststoffröhrchen eingeführt worden. Die Fasern wurden fünfmal mit 2 ml Phophat-Puffer 0,01 M, pH 7,3 gewaschen.

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Daraufhin ist 1 ml ihosphat-Puffer 0,01 M, pH 7,3 mit 0 Natriumchlorid und 0,5 mg/ml Λ-Leichtketten und K eingefüllt worden.

Die Röhrchen ruhten 2 Stunden bei 22 G und weitere 22 Stunden bei 4⁰G.

Nach der Inkubation wurden die Lösungen aus den Röhrchen genommen und die Fasern fünfmal mit 1 ml Phosphat-Puffer 0,01 M, pH 7*3 mit 0,9$ Natriumchlorid gewaschen.

Die Waschflüssigkeit wurde mit den, den Röhrchen nach der Inkubation entnommenen Lösungen zusammengetan und die Iroteinkonzentrierung an der so erhaltenen Lösung nach dem Lowry-Verfahren dosiert.

In den Lösungen, die in Berührung mit der Kontrollfaser standen, wurden 0,447 mg Proteine dosiert. In den Lösungen, die mit der den Antikörper enthaltenden Faser in Berührung standen, wurden 0,385 mg Proteine dosiert.

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Claims

1. Antikörper, Antigene oder Antisera in ursprünglichem Zustand oder polymerisiert, einschließende Fasern.

2. Antikörper, Antigene oder Antisera einschließende Pasern nach Anspruch 1, die aus Polymeren gewonnen werden, welche unter Cellulosepolymeren, veresterten, äthersierten oder nitrierten Oellulosepolymeren gewählt werden.

3. Antikörper, Antigene oder Antisera einschließende Fasern nach Anspruch 1. die aus lolymeren gewonnen werden, welche unter i-olyäthylen, Polyamiden, Polymeren bzw. Kopolymeren von Acrylonnitril, Butadien oder Isopren, Acrylaten, Metacrylaten, Vinylestern, Vinylchloriden, Polymeren und Kopolymeren von Vinylidenchlorid, Styrol, Vinyl-Butyrat, % -Metylglutamat gewählt werden.

4. Verfahren zur Zubereitung von Antikörper, Antigene oder Antisera einschließenden Fasern nach den vorhergehenden Ansprüchen, welches folgende Stufen umfaßt:

a) Zubereitung des infrage kommenden einzubauenden Stoffes unter überprüfung der nichtspezifischen Fixierung am Faserwerkstoff sowie der fehlenden bzw. nicht ins Gewicht fallenden Inaktivität infolge der Behandlung mit den Spinnlösungsmitteln,

b) Auflösung bzw. Suspension des Stoffes (a) in Wasser oder Wasser/Glycerin-Gemischen,

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c) Zugabe der Lösung oder Suspension (b) an einen gelösten rolymer,

d) Rühren bis eine homogene Emulsion entsteht,

5. Verfahren zum Herbeiführen von Reaktionen der Art Antigen-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionen unter Verwendung von Fasern ausgeführt werden, welche Antikörper, Antigen oder Antisera gemäß Anspruch 1, 2, 3 einschließen.

S09bÖ7/ü991