DE2534317B2

DE2534317B2 - Poröse, biologische Wirkstoffe einschließende Chemiefasern, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

Info

Publication number: DE2534317B2
Application number: DE2534317A
Authority: DE
Inventors: Francesco Bartoli; Onofrio Lostia
Original assignee: SnamProgetti SpA
Current assignee: SnamProgetti SpA
Priority date: 1974-07-31
Filing date: 1975-07-31
Publication date: 1979-08-09
Also published as: FR2280353A1; IT1008202B; DK145346C; JPS5144627A; NO752690L; YU196375A; LU73121A1; DK145346B; NL7509169A; IL47845A0; DD120665A5; CH628519A5; DK347875A; US4031201A; AU502914B2; NO147676C; FR2280353B1; CA1060342A; IL47845A; SE7508702L

Description

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Es ist bekannt. Antigene und Antikörper, d. h. proteinartige Substanzen, die von Wirbeltieren aus 4> besonderen Zellen (Plasmazellen) bei Verabreichung eines Antigens entstehen und mit diesem spezifisch reagieren, durch chemische Bindungen an Polymere unlöslich zu machen. Derartige Präparate befinden sich jedoch ständig in Kontakt mit der äußeren Umgebung, w können in der Reaktionsmasse dispergiert werden und somit Endprodukte verunreinigen. Außerdem wird durch die chemischen Bindungen die chemische Natur verändert, was die Wirksamkeit negativ beeinflussen kann. ¹S

Es ist auch möglich, poröse. Enzyme einschließende Fasern herzustellen, in denen die so immobilisierten Enzyme ihre katalytischen Eigenschaften bewahren, während der Austritt dt-s Enzyms, dessen Dispersion in der Reaktionsmasse und daher auch die Möglichkeit μ einer Verunreinigung des Reaktionsproduktes verhindert werden. Die dabei verwendbaren fadenartigen Körper und das Verfahren zur Einschließung des Enzyms sind in der IT-PS 8 36 462 und in der DE-PS 19 32 426 beschrieben, wonach die Enzym einschließen- M den Fasern dadurch hergestellt werden können, daß man von Lösungen eines Polymers ausgeht, das Fasern ergibt, in welchen Enzympräparate als kleinste Tropfen der Größenordnung der Emulsion eingeschlossen werden. Die so erhaltene Emulsion kann naß oder trocken gesponnen werden, uin eine Faser zu bilden, welche in ihrem Inneren kleinste Höhlungen aufweist, in welchen die Enzyme eingebettet sind, welche von der Umgebung durch eine sehr dünne Membrane getrennt werden, die ein Austreten des Enzyms und dessen Dispersion in der Reaktionsmasse verhindert und trotzdem zuläßt, daß das Enzym seine katalytische Aktion entfaltet

Es wurde nun gefunden, daß die Anwendung ähnlicher Techniken, wie die, die für die Enzyme bekannt sind, die Möglichkeit bietet. Antigene, Antikörper, Antisera, als solche oder polymerisiert, in poröse Gebilde einzubauen, wobei die so erhaltenen Präparate die oben erwähnten Nachteile nicht aufweisen, ohne daß dabei die Wirksamkeit der frischen Proteine in beeinträchtigendem Maße abnimmt.

Da nach dem bekannten Verfahren Enzympräparate eingeschlossen wurden, bei denen es sich um Katalysatoren handelt, die nur in kurzen Kontakt mit Substraten kommen, was es nicht zu erwarten, daß auch eine Sequestrierungswirkung von Antigenen, Antikörpern und Antisera beim Einschluß in poröse Chemiefasern innerhalb der Faser vollzogen werden kann, d. h. daß die eingeschlossenen Wirkstoffe unverändert reaktionsfähig bleiben.

Gegenstand der Erfindung sind daher die in den Ansprüchen beschriebenen Antikörper, Antigene oder Antisera enthaltenden porösen Chemiefasern, deren Herstellung und Verwendung. Die erfindungsgemäßen Fasern sind hoch aktiv, da das Verhältnis Fläche/Volumen hoch ist; das Herstellungsverfahren ist wirtschaftlich und leicht auszuführen und bietet dazu die Möglichkeit, auch Stoffe einzubauen, die keinen hohen Reinheitsgrad aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Antikörper, Antigene und Antisera einschließenden Chemiefasern kommen für verschiedene Anwendungsgebiete in Frage, bei welchen stets das Prinzip der gegenseitigen spezifischen Reaktivität verwertet wird. So können sie in bezug auf Antisera und Antikörper dazu verwendet werden, um der äußeren Umgebung Antigene, Aptene (unvollständige Antigene), oder mit Proteinen und/oder Polypeptiden verbundene Substanzen zu entziehen, oder man kann unter Anwendung von eingeschlossenen polymerisierten Antigenen mehr oder weniger spezifische Antikörper entziehen. Außerdem können die vorerwähnten fadenartigen Gebilde dazu eingesetzt werden, um Extraktionen auf industrieller Ebene mittels selektiver Fixierung und etwaiger Abtrennung der fixierten Substanz (Antigene, Antikörper usw.) vorzunehmen, so z. B. die Extraktion von Enzymen, wie Amylase, Protease, Invertase u.a.m. Auch ist eine Verwendung bei der Technik der Chromatographie möglich, insbesondere bei der Affinitätschromatographie, z. B. um isoenzymatische Substanzen in der Art der Cholinesterase zu trennen.

Die Differenz des Molekulargewichtes zwischen den in den Kleinsthöhlungen im Faserinneren eingeschlossenen Proteinen und den mit diesen zu bindenden Stoffen muß ausreichend sein, um eine Diffusion der zu bindenden Substanz bzw. Substanzen zu gestatten, bis die Substanz mit höherem Gewicht erreicht wird, die infolge ihres höheren Molekulargewichtes in der Faser eingeschlossen bleibt.

Beim erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren sind die Spinnbedingungen und die Eigenschaften der

verwendbaren Polymeren die gleichen wie die in der vorstehend genannten IT-PS erwähnten.

Unter den für die Herstellung der erfindungsgemäßen Fasern bevorzugten Stoffen sind die Cellulosepolymeren und insbesondere die Polymeren des Cellulosetriacetats zu erwähnen. Beispiele für weitere Polymere sind Polyäthylen, Polyamide, Polymere bzw. Copolymere von Acrylnitril, Butadien oder Isopren, Acrylaten, Methacrylaten, Vinylestern, Vinylchloridan, Polymere bzw. Copolymere des Vinylidenchlorids, Styrol, Vinylbu- ι ο ty rats, j»-J<iethylgIutamats.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1
I. Zubereitung der Antisera

Die Antisera werden aus Merrschweinchen oder Kaninchen oder sonstigen Tieren gewonnen.

Die Substanz gegen die das zuzubereitende Antiserum wirken soll (Antigen oder konjugiertes Apten) wird mit komplettem Freund'schem Adjuvans vermischt und in die Medialfacies des Schenkels des Hinterbeines des Tieres eingespritzt. Nach 15 und nach 30 Tagen wird die Einspritzung mit gleicher Dosis des immunizierenden Agens (Antigen + Freund'schen Adjuvans) wiederholt. _>■> Nach weiteren 15 Tagen wird eine weitere Immunisierung mit halber Dosis vorgenommen. Dann werden in Abständen von je 15 Tagen intrakardiale Blutentnahmen gemacht und am daraus gewonnenen Serum bestimmt man den Antikörpergehalt. Letzterer wird jii durch reihenweise Verdünnungen des Antiserums mit Veronalpuffer 0,02 M pH 8,4 gemessen, in dem 0,5% menschliches Serumalbumin und 0,5% Normalserum enthalten sind.

Anhand der Techniken der radioimmunologischen r> Dosierung (RIA) wird die Verdünnung ermittelt, der ein Verhältnis

3indungskomponentc B _
freie Komponente F

entspricht.

Ebenfalls anhand der RIA-Techniken wird auch die Affinität des erhaltenen Antiserums bestimmt.

II. Vorversuche

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A) Versuche der nichtspezifischen Fixierung

B) Versuche der Antiserum-lnaktivierung durch Behandlung mit den für das Spinnen verwendeten Lösungsmitteln.

A) Versuche der nichtspezifischen Fixierung

In Röhrchen aus Kunststoff wurden ca. 50 mg der sich aus den Vorgängen des Spinnens, der Koagulation und der Lösungsmittelabscheidung ergebenden Faser abgewogen.

Die Faser enthielt keine Antisera oder sonstige Sequestranten (Verbindungen, die mit Metallionen stabile Komplexe bilden).

Drei Reihen Röhrchen wurden vorbereitet mit folgendem Inhalt:

a) 50 mg Faser+ 2,0 ml Phosphatpufier (wie blank)

b) 50 mg Faser+1,5 ml Phosphatpuffer+ 0,5 ml markierten Antigens (Ag-J¹²⁵)

c) 50 mg Faser+ 0.5 ml Phosphatpuffer+1,0 ml einer Lösung Ochseneiweißserum (BSA) V Fraktion 2,5% in Phosphatpuffnr +0,5 ml markierten Antigens(Ag-]'²⁵).

Verwendet wurde Phosphatpuffer 0,04 M pH 7,4 mit 0,5% BSA.

Das markierte Antigen bestand aus Insulin-]¹²⁵ mit spezifischer Wirksamkeit ΙΟΟμΟμ^ welches im Verhältnis von 0,1 μΟ50 mg Faser zugegeben wurde.

Es wurde auch Digoxin-J¹²⁵ in einer Äthanollösung mit Wirksamkeit 0,25 μ(1/0,5 ml verwendet und davon wurden 0,025 μΟ50 mg Faser zugegeben.

Beide Stoffe wurden mit Phosphatpuffer zu der gewünschten Verdünnung gebracht Ein Fasernteil wurde vor der Zugabe des markierten Antigens I Stunde lang mit der 2,5% BSA enthaltenen Lösung in Berührung gebracht.

Die Berührungsdauer der Faser mit dem markierten Antigen schänkte zwischen 40 Minuten und 48 Stunden.

Die Wirksamkeitswerte der die Fasern enthaltenden Röhrchen wurden mit einem y-Counter gezählt.

Nach Beendigung der Berührungszeit wurden die Fasern fünfmal mit je 2 ml Phosphatpuffer gewaschen und dann wurde die restliche Radioaktivität mit dem y-Counter gemessen.

Später wurden die Fasern von neuem fünfmal mit je 2 ml Phosphatpuffer gewaschen und die radioaktivität wieder gemessen.

Dann wurden die Fasern mit 2 ml Phosphatpuffer unter Rühren bei 37"C 17 Stunden lang in Berührung gehalten und daraufhin wurde die restliche Radioaktivität gemessen. Derselbe Vorgang wurde noch zweimal wiederholt. Dernach wurde folgendes festgestellt:

a) Die mit den Fasern verbundene Radioaktivität nimmt allmählich zu, wenn die Dauer der Berührung mit dem markierten Antigen von 40 Minuten auf 48 Stunden steigt.

b) Die einstündige Vorinkubation mit BSA 2,5% verringert die mit der Faser verbundene Radioaktivität.

c) Die zusätzliche Radioaktivität in den Röhrchen nimmt infolge der Waschungen bei zunehmender Anzahl der Waschungen sowie bei Verlängerung der Berührungsdauer der Faser mit dem Waschpuffer ab. Ein kleiner Anteil bleibt nach den beschriebenen Waschvorgängen zurück.

Daraus konnte geschlossen werden, daß auch diese Faser — wie die meisten Stoffe — einen kleinen Anteil der bei der Zubereitung des markierten Antigens anwesenden Radioaktivität adsorbierte und daß die Adsorption durch das BSA verringert wurde, welches einen Teil der in der Faser vorhandenen Aufnahmehöhlungen füllte.

B) Inaktivierungsversuche des Antiserums

durch Behandlung mit den für das Verspinnen

verwendeten Lösungsmitteln

Verwendet wurden zwei Fläschchen mit einem Anti-Insulin-Antiserum, wie solche die in den handelsüblichen Einrichtungen zur Radioimmunountersuchungcn (in Meerschweinchen erzeugtes Schweiü-Anti-Insulin-Antiserum) geliefert werden, und in jedes Fläschchen wurden 5 ml zweimal destilliertes H2O gegeben, so daß eine Anti-Insulin-Antiserum-Lösung entstand, die mit Ab2 bezeichnet wurde. Dann wurden 20 ml eines Gemisches von 40 :60 (Vol.) Wasser und Glycerin zubereitet, das man mit Gl<,obezeichnete.

Dann wurden folgende Gemische /übereilet:

2,5 ml
+ 2,5 ml

Ab₂
H₂Odest.

5,0 ml

7,3 ml

+ 7,3 ml

14,6 ml

5 ml

+ 32,1 ml

Ab,
Ab₂

AbiGbo
Methylenchlorid

37,5 ml von zwei Phasen, die 15 Minuten lang bei 0°C unter Rühren in inniger gegenseitiger Berührung gehalten wurden; nach anschließender Zentrifugation bei Raumtemperatur wurde die wäßrige Phase entnommen, aus der das Methylenchlorid mit einer Stickstoffströmung ausgeschieden wurde. Erhalten wurden somit 15 ml einer als AbiGboH bezeichneten Lösung.

d) 5 m!
+ 2 ml

Ab₁Gl₃₁
Toluol

7 ml von zwei Phasen, die 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Rühren in inniger gegenseitiger Berührung gehalten wurden. Nach Zentrifugation bei Raumtemperatur wurde die wäßrige Phase entnommen, aus der das Toluol mit einer Stickstoffströmung ausgeschieden wurde. Man erhielt somit 5 ml einer als A1GI30T bezeichneten Lösung.

Unter Anwendung der normalen RIA-Techniken wurden die Eichkurven im Konzentrationsabstand von 0—200 μυ/ml menschliches Standardinsulin eingetragen, wobei das in den vier verschiedenen Weisen behandelte Antiserum zur Verwendung kam, das oben mit

Ab,

Ab]GUo
Ab-GI₃₀M
Ab₁Gl₃₀T

bezeichnet wurde.

Aus den Eichkurven (Fig.) geht hervor, daß praktisch keine Abnahme des Bindevermögens des Antikörpers durch die Behandlung des Antiserums mit den für das Verspinnen verwendeten Lösungsmitteln eintritt.

1Π. Zubereitung der Fasern

200 mg Cellulosetriacetat werden in 2.65 g Methylenchlorid (reines Reagens) bei Raumtemperatur aufgelöst.

Das einzubauende Produkt wird in H2O bzw. in FbO-Glycerin-Gemischen aufgelöst und dispergiert.

0,4 ml dieses wäßrigen Mittels worden der vorher auf 0⁰C gekühlten Polymerlösung zugesetzt. Dann wird so lange gerührt, bis eine gleichmäßige Emulsion entsteht, die man dann 20 Minuten lang ruhen läßt.

Diese Zubereitung erfolgt in einem Glaskolben, der oben mit einer Stickstoffflasche verbunden ist und nach unten in eine Düse ausläuft, die in ein Toluol enthaltendes Koagulationsbad taucht

Wird mit Stickstoff ein Druck ausgeübt, tritt die Emulsion durch die Düse heraus und gerinnt im Toluolbad. Der entstandene Faden wird auf eine Rolle aufgewickelt und anschließend mit Luft angeblasen, um Toluol und Methylenchlorid zu entfernen.

IV. Einschluß des Anti-Insulin-Antikörpers

Nach der oben beschriebenen Technik wurde ein Anti-Insulin-Antiserum in Meerschweinchen erzeugt, dessen Antikörpergehalt bei der Bestimmung 150 000 betrug. (Bei dem »Gehalt« handelt es sich um einen Vergleichswert; eine unbekannte Menge Antigen wird mit einer vorgewählten bekannten Menge Antigen

umgesetzt, worauf Serienverdünnungen des Antikörpers durchgeführt werden, bis feststeht, welche Menge an Antikörper mit 50% der bekannten Menge an Antigen reagieren. Dieser Wert wird als »Gehalt« j bezeichnet.) Zu 0,2 ml dieses Antiserums wurden 0,15 ml Veronal-Puffer 0,02 M, pH 8,4, der 0,5% Menscheneiweißserum enthielt, sowie 0,15 ml Glycerin zugegeben.

0,4 ml dieser Lösung wurden in den oben beschriebenen Faser-Zubereitungsverhältnissen dem Polymer zugegeben.

Mit derselben Einrichtung wurde eine Kontrollfaser gesponnen, in der anstelle von 0,2 ml der Antiserumlösung 0,2 ml Veronal-Puffer 0,02 M, pH 8,4 mit 0,5% Menscheneiweißserum verwendet wurden. In Kunststoff röhrchen, wie diejenigen, die für die radioimmunoiogischen Dosierungen verwendet wurden, sind verschiedene Mengen Fasern eingefüllt worden, wie in Tabelle 1 wiedergegeben, wo

a) die Kontrollfaserreihe,

b) die Faserreihe mit Antiserum, wie sie aus dem Spinnvorgang kommt,

c) die Faserreihe mit Antiserum, die nach dem Spinnvorgang im Veronal-Puffer 0,02 M, pH 8,4 mit 0,5% Menscheneiweißserum konserviert und fünfmal mit jeweils 2 ml Veronal-Puffer gewaschen wurde, bevor der Versuch beginnt, darstellen.

In jedes Röhrchen wurden eingegeben:

— 1,6 ml Phosphatpuffer 0,04 M, pH 7,4 mit 0,5% Ochseneiweißserum,

— 0,2 ml Insulin-J¹²⁵ mit spezifischer Wirksamkeil 100 μCi/μg in einer Verdünnung, welche die zum Zeitpunkt der Zubereitung gemessene Wirksamkeit auf 0,01 μα/0,1 ml brachte,

— 0,2 ml menschliches Standard-Insulin in der Konzentration 200 μυ/ml.

Nach Vermengen wurden die Röhrchen 24 Stunden bei 4°C gehalten. Dann sind aus jedem Röhrchen 1,5 ml Lösung entnommen worden, deren Radioaktivität mit einem )'-Zähler, dessen Leistungsfähigkeit für J¹²⁵ 54% betrug, gemessen wurde.

Die Fasern wurden dreimal mit 2 ml Phosphat-Puffer gewaschen, worauf die in den Fasern fixierte Radioaktivität mit dem j'-Counter, wie bereits erwähnt, gemessen wurde. An denselben Faserproben wurden die Zugaben der Reaktivstoffe (Puffer, Insulin-J¹²⁵, Standardinsulin), die Waschungen sowie die Radioaktivitätsmessungen viermal wiederholt.

■><> Es wird darauf hingewiesen, daß das mit J¹²⁵ markierte Insulin-]¹²⁵ 5% der als Carrier benutzten menschlichen Standardinsulins nicht übersteigt. Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 1 angeführt, woraus hervorgeht, daß die Fixierung des Insulins, die wir hier als nichtspezifisch bezeichnen, in den keine Antikörper enthaltenden Kontrollfasern einen Höchstwert beim ersten Versuch erreicht und in den darauffolgenden Versuchen praktisch konstant bleibt, während die Insulinfixierung in den, den Antikörper einschließenden

bo Fasern jedesmal zunimmt wenn die Zugabe der Reaktivstoffe wiederholt wird.

Nachdem die Kontrollfaser bei den genau gleichen Bedingungen wie die den Antikörper einschließende Faser zubereitet wurde, muß das unterschiedliche Verhalten ausschließlich der Bildung der Antigen-Antikörper-Bindung im Faserinneren zwischen dem eingeschlossenen Anti-Insulin-Antikörper und dem im Medium vorhandenen Antigen zugeschrieben werden.

Tabelle 1

Faser
Probe Nr.

Versuche; Zählungsergebnisse während 10 Minuten Gewicht 1. 2. 3. 4. 5.

mg

Kontrollreihe

a, 7,0 6.822 5.059 2.703 2.579 2.718 a₂ 12,5 12.716 11.162 5.567 4.966 5.127 a₃ 18,4 15.328 13.405 5.132 5.543 6.314 a₄ 25,0 16.060 16.595 6.594 6.983 7.059 a₅ 33,7 15.317 20.919 9.564 8.474 7.915 a₆ 41,8 22.412 22.695 11.668 11.960 10.396

Reihe mit Antiserum

b, 7,1 22.895 39.895 48.025 57.800 64.907 b₃ 12,7 44.149 73.026 80.498 87.945 94.489 b₃ 16,1 28.299 49.550 58.295 66.435 74.112 b₄ 22,1 45.831 79.268 90.734 100.182 113.027 b₅ 33,6 54.870 119.867 135.862 150.248 166.087 b₆ 40,5 50.910 116.575 135.154 152.010 170.242

Reihe mit Antiserum vor Gebrauch

gewaschen

C₁ 9,8 32.593 52.763 67.770 74.800 85.678

C₂ 11,3 39.403 65.432 79.011 84.292 91.836

cj 12,3 43.554 66.607 83.098 97.018 107.592

C₄ 12,1 42.794 68.325 82.929 94.203 105.739

C₅ 40,1 50.883 104.108 121.027 132.263 148.442

C₆ 42,7 - 66.490 89.960 99.300 111.166

C₇ 32,4 - 53.654 70.901 82.805 93.805

Beispiel 2

Nach den gleichen oben beschriebenen Techniken wurde ein Anti-HGH-Antiserum in Meerschweinchen erzeugt, dessen Antikörpergehall bei der Messung 2000 betrug.

Einer Menge von 2,0 ml dieses Antiserums sind 0,15 ml Veronal-Puffer 0,02 M, pH 8,4 mit 0,5% Menscheneiweißserum sowie 0,15 ml Glycerin zugegeben worden.

Stets mit der gleichen Einrichtung wurde das Spinnen einer Kontrollfaser vorgenommen, bei der anstelle von 2,0 ml Antiserumlösung, 2,0 ml Veronal-Puffer 0,20 M, pH 8,4 mit 0,5% Menscheneiweißserum verwendet wurden.

In Kunststoffröhrchen gleicher Bauart wie die für die radioimmunologischen Dosierungen eingesetzten, wurden Mengen verschiedener Fasern gefüllt, wie in Tabelle 2 eingetragen, wo:

a) die Reihe der Kontrollfasern, und

b) die Reihe der Antiserum enthaltenden Fasern, nach dem Spinnvorgang darstellt

Den beiden Reihen Röhrchen (8 Röhrchen je Reihe) wurden zugesetzt:

1,6 ml Borat-Puffer, 0,13 M, pH 8,4 mit 0,5% BSA₁
0,2 ml HGH-I¹²⁵ mit spezifischer Wirksamkeit 150μCi/μg in einer Verdünnung, die die im Zeitpunkt der Zubereitung gemessene Wirksamkeit auf 0,015 Ci/0,1 ml brachte.

— 0,2 ml Standard-HGH in den in der Tabelle 2 eingetragenen Verdünnungen (HGH = somatotropes Hormon).

Nach Vermengung wurden die Röhrchen 24 Stunden bei 4°C gehalten. Daraufhin sind jedem Röhrchen 1,5 ml Lösung entnommen worden, wovon die Radioaktivität mittels eines >>-Zählers mit Leistungsfähigkeit für J¹²⁵ gleich 54% gemessen wurde.

Die Fasern wurden dreimal mit je 2 ml Borat-Puffer gewaschen und anschließend wurde die in den Fasern fixierte Radioaktivität mit obigem y-Zähler gemessen.

An denselben Faserproben wurden ein weiteres Mal die Zugaben der Reaklivstoffe (Puffer, HGH-j¹²⁵, Standard-HGH), die Waschungen und die Radioaktivitätsmessungen wiederholt. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Man kann daraus ersehen, daß in den Anti-HGH-Antikörper enthaltenden Fasern — vornehmlich nach dem zweiten Versuch — eine Menge Radioaktivität in allen Stufen der Konzentration vom zugesetzten Standard-HGH vorhanden ist, welche größer als in den entsprechenden Kontrollfasern ist, welche in ihrem Inneren kein Antiserum enthalten, aber sonst genau so behandelt wurden, wie die das Antiserum einschließenden Fasern.

Dazu ist zu bemerken, daß das verwendete Anti-HGH-Antiserum einen Gehalt von 2000 aufweist, und daß daher die Erscheinung der spezifischen »Sequestrierung« (der spezifischen reziproken Antigen-Antikörper-Wirkung) weniger auffällt als beim Versuch des

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Beispiels I, wo ein Anti-Insulin-Antiserum mit Gehall von 150 000 verwendet wurde (der »Gehalt« wurde, wie unter IV beschrieben, bestimmt).

Die der Antigen-Antikörperverbindung zuzuschrei-

Tabelle 2

bende spezifische Fixierung ist aber in den Anti-HGH-Antikörper enthaltenden Fasern auch in diesem Fall unzweideutig.

Faser	Gewicht	Konzentration des	Versuche;	2.
Probe Nr.	(mg)	zugesetzten Standard-HGH	Zählungen/10 Min.
		(g/ml)	1.	6.453
Kontrollreihe	10,1			5.959
ai	10,0	1,25	5.186	7.529
a:	10,2	10	5.772	4.523
a₃	9,7	10	5.739	6.756
a₄	10,1	-	4.080	4.783
as	9,6	20	5.093	4.890
a₆	9,7	-	3.799	5.233
a₇	9,9	50	3.970
a₈		-	4.500	9.169
Reihe mil Antiserum	9,6			9.492
b.	10,4	1,25	6.239	9.112
b₂	10,2	-	6.029	8.779
b₃	10,5	10	6.266	7.739
b.	10,0	-	5.616	8.163
bs	10,2	20	5.259	6.736
b₆	9,8	-	5.653	7.899
b₇	9,8	50	4.943
b₈	-	5.366

Beispiel 3

Nach den gleichen bereits beschriebenen Techniken wurde ein Anti-Triiodothyronin-Antiserum dadurch erzeugt, daß Triiodothyronin (T3), mit Menscheneiweißserum gebunden, Kaninchen eingeimpft wurde. Am gewonnenen Antiserum wurde ein Antikörpergehalt gleich 4000 festgestellt. Einer Menge von 0,2 ml Serum wurde 0,15 ml Veronal-Puffer 0,08 M, pH 7,5 mit 0,5 g/l Menscheneiweißserum sowie 0,15 ml Glycerin zugegeben.

0,4 ml dieser Lösung wurden in 200 mg Ccllulose-Triacetat gemäß der bereits beschriebenen Faserzubereitungstechnik eingeschlossen.

Nach derselben Technik wurde eine Kontrollfaser hergestellt, in die anstelle der Antiserumlösung in 200 mg Cellulose-Triacetat, 0,4 ml einer Lösung eingeschlossen wurde die durch Vermengen von 0,35 ml Veronal-Puffer 0,08 M, pH 7,5 mit 0,5 g/l Menscheneiweißserum sowie 0,15 ml Glycerin angesetzt wurde.

50 mg der den Antikörper enthaltenden Faser und 50 mg der Faser ohne Antikörper wurden in zwei Kunststoffröhrchen gefüllt und fünfmal mit 2 ml oben beschriebenen Veronal-Puffers gewaschen.

Jedem Röhrchen wurden dann zugegeben:

- 2 ml Veronal-Puffer 0,08 M, pH 7,5 mit 0,5 g/l Menscheneiweißserum und ·* ng/1 Tj,

— 0,2 ml T3-I¹²⁵ mit spezifischer Wirksamkeit 90μ(3/μ§, die bis zu einer Wirksamkeit gleich 0,1 μΟί/πιΙ verdünnt wurden.

Nach Vermengung sind die Röhrchen 24 Stunden bei 4°C gehalten worden.

Daraufhin wurden die Fasern von der die Reaktivstoffe enthaltenden Lösung befreit und fünfmal mit je 2 ml des bereits beschriebenen Veronal-Puffers gewaschen.

Dann wurden die Zugaben der Reaktivstoffe und die Waschungen — wie oben beschrieben — ein zweites Mal wiederholt.

Schließlich wurde die in den Fasern vorhandene Radioaktivität mittels dem vorerwähnten y-Counter gemessen.

An der Faser ohne Antikörper wurden 45 000 Counts/10' gemessen, an der den Antikörper enthaltenden Faser 146 000 Counts/10'.

Beispiel 4

Gemäß den vorbeschriebenen Techniken wurde ein Anti-ALeichtketten-Antikörper und K in der Konzentration 25 mg/ml in physiologischer Pufferlösung pH 7,3 mil Natriumphosphal 0,01 M zubereitet (zu den Werten λ und K vgl. Bellanti, »Immunology« Sounders, Philadelphia, 1971,Seiten 101 bis 107, insbes. S. 104).

Einer Menge von 0,35 ml dieser Lösung wurden 0,15 ml Glycerin zugegeben.

0,4 ml der letztgenannten Lösung wurden in 200 mg Cellulose-Triacetat gemäß der vorbeschriebenen Technik eingeschlossen. Unter Anwendung desselben Spinnvorganges wurden 0,4 ml des vorbeschriebenen Puffers in eine Kontrollfaser eingeschlossen.

100 mg der den Antikörper enthaltenden Faser und 100 mg der Kontrollfaser sind in zwei Kunststoffröhrchen eingeführt worden. Die Fasern wurden fünfmal mit 2 ml Phosphat-Puffer 0.01 M, pH 7,3 gewaschen.

Daraufhin ist 1 ml Phosphat-Puffer 0,01 M, pH 7,3 mit 0,9% Natriumchlorid und 0,5 mg/ml A-Leichtketten und

K eingefüllt worden.

Die Röhrchen ruhten 2 Stunden bei 22°C und weitere 22 Stunden bei 4°C.

Nach der Inkubation wurden die Lösungen aus den Röhrchen genommen und die Fasern fünfmal mit 1 ml Phosphat-Puffer 0,01 M, pH 7,3 mit 0,9% Natriumchlorid gewaschen.

Die Waschflüssigkeit wurde mit den, den Röhrchen

nach der Inkubation entnommenen Lösungen zusammengetan und die Proteinkonzentrierung an der so erhaltenen Lösung nach dem Lowry-Verfahren dosiert.

In den Lösungen, die in Berührung mit der Kontrollfaser standen, wurden 0,447 mg Proteine dosiert. In den Lösungen, die mit der den Antikörper enthaltenden Faser in Berührung standen, wurden 0,385 mg Proteine dosiert.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Poröse, biologische Wirkstoffe einschließende Chemiefasern aus cellulosischer! oder synthetischen Polymeren, deren Poren von solcher Art sind, daß ein Entweichen der eingeschlossenen Wirkstoffe verhindert wird, während ein Eindringen der mit den Wirkstoffen umzusetzenden Substanzen möglich ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Fasern als biologische Wirkstoffe Antikörper, Antigene oder Antisera enthalten.

2. Fasern nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Cellulosetriacetat bestehen.

3. Verfahren zur Herstellung der porösen Fasern nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die einzubauenden Antikörper, Antigene oder Antisera unter Überprüfung der nichtspezifischen Fixierung am Faserwerkstoff sowie der fehlenden bzw. nicht ins Gewicht fallenden Inaklivität infolge der Behandlung mit den Spinnlösungsmitteln, zubereitet,

b) die unter a) erhaltene Substanz in Wasser oder Wasser/Glycerin-Gemischen auflöst oder suspendiert,

c) die Lösung der Suspension b) zu einem gelösten Polymeren fügt,

d) zur Bildung einer homogenen Emulsion rührt,

e) die Emulsion d) durch eine in ein Koagulationsbad tauchende Spinndüse verspinnt und

f) das Koagulationsbad und das Lösungsmittel für das Polymere aus der Faser durch Behandlung in strömender Luft oder einem anderen Gas entfernt.

4. Verwendung der Fasern gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Durchführung von Reaktionen der Art der Antigen-Antikörper-Reaktionen.

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