DE2538322A1

DE2538322A1 - Verfahren zur herstellung von dextrose unter verwendung von immobilisierten enzymen

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Publication number: DE2538322A1
Application number: DE19752538322
Authority: DE
Inventors: Richard A Johnson; Norman E Lloyd; Kenneth N Thompson
Original assignee: Standard Brands Inc
Current assignee: Standard Brands Inc
Priority date: 1974-08-26
Filing date: 1975-08-26
Publication date: 1976-03-11
Also published as: US4102745A; NL7510099A; US4011137A; FR2283225A1; GB1521112A; FR2283225B1; CA1045569A; BE832776A; NL188103B; NL188103C

Description

1BERLIN33 8MUNCHEN80

Auguste-Viktoria-Straße65 r-> DIIO/^LJU'C B DADTMCD PienzenauerstraBe2

Pat.-Anw. Dr. Ing. Ruschke LT. KUoOnNt Ot ΓΆΚΙΙΝεΚ Pat-Anw Dip!-Ing

o£f ^ARÜÄ'-^rn9· PATENTANWÄLTE ^{Hana E}· ^Ruschke _{98 03 24}

Telefon: 030/ ms« BERLIN - MÜNCHEN ^'"^S/e "SS

Telegramm-Adresse:

Quadratur Berlin Telegramm-Adresse:

S 1606

Standard Brands Incorporated, New York, N„Y., V,St_oA_c

Verfahren zur Herstellung von Dextrose unter Verwendung von

immobilisierten Enzymen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Umsetzung von Stärke in Dextrose₀ Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Umsetzen von Stärke in Dextrose unter Verwendung eines Enzymsystems aus immobilisierter Glucoamylase und Alpha-Amylase aus der aus löslicher Alpha-Amylase, immobilisierter Alpha-Amylase und deren Mischungen bestehenden Gruppe.

Verfahren zum Hydrolysieren von Stärke zu Dextrose sind aus der Technik bekannt. Diese Verfahren lassen sich zu zwei allgemeinen Gruppen zusammenfassen, nämlich die Säure-Enzym- und die Enzym-

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~^z~ ph λ 83??

Enzym-L^;msetzungsv'erfahren„ Beim Säure-.onzym-Verfahren wird die Stärke zunächst teilweise hydrolysiert oder verflüssigt, indem man bspw. eint- wäßrige Suspension mit 35 bis 40 ^ Stärke herstellt und in diese eine Säure wie Salzsäure aufnimmt, dann die Suspension auf eine verhältnismäßig hohe Temperatur erwärmt, um die Stärke teilweise zu hydrolysieren, und dann abkühlt und das Produkt mit einer Glucoamylasezubereitung unter geeigneten .bedingungen behandelt, bei denen die teilweise hydrolysierte Stärke sich enzymatisch zu. Dextrose verwandelt. Dieses Säure-Enzym-Verfahren ist bspw. in den US-PSn 2»304.168, 2.531.999, 2„893ο921 und"-3i042.584 offenbart.

Die Glucoamylas-e ist im Stand der Technik auch als Glucoamylase, Glucogenenzym, Stärkeglucogenase und Gamma-Atnylas'e bezeichnet worden_o Glucoamylase ist ein exoamylolytische3 Enzym, das die sequentielle Hydrolyse der Glucoseanteile aus den nichtreduzierenden Enden von Stärke- oder Amylodextrinmolekülen katalysiert» Glucoamylase wird von vielen Arten von Mikroorganismen hervorgebracht — bspw_o bestimmten Arten von Pilzen der gillus-Gruppe wie die zur Gruppe Aspergillus niger und Aspergillus awamori gehörenden Stämme, bestimmte Stämme der Spezies Rhizopus sowie bestimmte Stämme der Spezies ilndomyces.

Beim Enzym-Ünzym-UmsetzTrerfahren stellt man im allgemeinen eine Stärkeaufschlämmung her, gibt ein Stärke verflüssigendes Enzym wie bspwβ bakterielle Alpha—Amylase zu und erwärmt die Stärkeaufschlämmung auf eine Temperatur im Bereich von 80 bis 90⁰G, um

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die Stärke teilweise zu hydrolysieren. Die teilhydrolysierte Stärke, die im allgemeinen ein Dextroseäquivalent (DA) im Bereich von etwa 10 bis 20 hat, wird dann mit Glucoamylase behandelte

Alpha-Amylase ist ein endo-amylolytisches Enzym, das ein fast regelloses Aufbrechen von alpha—1,4-glucosidischen Bindungen im dtärkemolekül bewirken kann, Alpha-Amylase wird von vielen Arten von Mikroorganismen hervorgebracht - bspw«. kitgliedern der dpezies Bacillus subtilis, Aspergillus niger und anderen öpezies der Gattung Aspergillus sowie gemälzten Getreidekörnern«

Alpha-Amylase wirkt nicht in wesentlichem Ausmaß auf die Alpha-1,6-glucosid-Bindungen im Stärkemolekül. Glucoamylase wirkt zwar auf diese Bindungen, aber langsamer, als für die gewerbliche Nutzung erwünscht ist.

Seit kurzem hat man der Verwendung von Starkeentzweigungsenzymen für die Dextroseproduktion erhebliches Interesse zugewandt. Der Einsatz solcher Enzyme erhöht die gebildete Stärkemenge, da sie sehr leicht auf Bindungen im Stärkemolekül einwirken, die die Alpha-Amylase' nicht oder die Glucoamylase nur langsam angreifen. Diese Entzweigungsenzyme ("debranching enzymes") werden allgemein als Alpha-1,6-Glucosidasen bezeichnete Jiine Anzahl von ünzymen mit erheblich unterschiedlichen Spezifizitäten sind in der Technik als zur Hydrolyse von Alpha-1,6-Glucosidbindungen fähig identifiziert worden,, Von diesen sind die in gewerblicher

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Hinsicht vermutlich, wichtigsten die Pullulanase und die Isoamylase _β Der Hauptunterschied hinsichtlich der Spezifizität dieser Enzyme ist, daß Pullulanase das lineare Polysaccharid Pullulan abbaut, während Isoamylase dies nicht zu einem wesentlichen Grad tut.

Es liegt eine Anzahl von Patentschriften vor, die Verfahren zur Herstellung von Isoamylase und Pullulanase und deren Verwendung offenbaren. Die CA-PS 852.196 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Isoamylase durch Züchten eines Stammes von Escherichia intermedia in einem Kulturmedium aus Dextrinen, Pepton und anorganischen Salzen» Die US-PS 3.»490.955 offenbart ein Verfahren zur Herstellung zellgebundener Pullulanase aus Aerobacter aerogenes in einem Kulturmedium, in dem die Kohlenstoffquellen Maltose und Pullulan oder Glyzerin sind» Die US-PS 3β560.345 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Isoamylase durch Fortpflanzung von Pseudomonas amyloderamosa in einem Kulturmedium, das als Kohlenstoffquellen Stärke, Stärkederivate oder Maltose enthält.

Seit einiger Zeit hat sich ein erhebliches Interesse an immobilisierten Enzymen gezeigt. Immobilisierte Enzyme haben gegenüber löslichen Enzymen eine Anzahl erheblicher Vorteile - bspw. ihre Verwendbarkeit in kontinuierlichen Umsatzsystemen.

Beispielhaft Druckschriften, die den Stand der Technik hinsichtlich der Enzymimmobilisierung zusammenfassen, sind folgende:

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Goldstein, in Fermentation Advances, Academic Press, New York, JS.Y. (1969), pp. 391-424»

Goldstein et al., Ζ» Anale Chem_o . 243, PP« 375-396 (1968);

Kay, Process Biochem., 3_ (⁸)> PP" 36-39 (1968);

Tosa et al., Kagaku To Seibutsu, 7 (3), PP» 147-1.55 (1967) ι Silman et al., Ann. Revo Biochem_o , 3_5_ (2), pp. 873-908 (1966) f Gryszkiewicz, Folia Biologica, 19_ (1), PP. 119-150 (1971) J Zaborsky, "Immobilized Enzymes", CRC Press, Cleveland,

Ohio (1973)f

In der Technik der Enzymimmobilisierung hat man der Immobilisierung von Glucoamylase erhebliches Interesse zugewandt, und zwar vermutlich, weil in vielen gewerblich genutzten Enzymverfahren Glucoamylase in großen Mengen eingesetzt wirdo Die Literatur enthält eine große Anzahl von Patent- und Druckschriften, die auf die Immobilisierung von Glucoamylase gerichtet sindι Beispiele hierfür sind:

die U.3. Patente 2«,717«852, 3.619.371, 3*627.638, 3.672.955, 3.715.277, die japanischen Patentschriften 1360/60 und 23560/68, die GB-Patentschriften 1.183»259 und 1«183»260, die DT-Patentschriften 2.062.246, 2.146.390 und 2„2O6.36O. Auch: Usami et al., Hakko Kyokaishi, 25., pp_ö 513-516 (1967) f Barker et al», Carbohyd» Res., 9_, PP« 257-263 (1969); Wilson et al., Biotechnol, Bioeng., H, pp. 349-362 (1969); Usami et al., J. Ferment. Tech., 4j3, pp. 506-512 (1970);

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Gruesbeck, Doktordissertation an der Univ» Texas (1970)}

Bachler et al«, Biotechnol. Bioeng_o , 12, pp_e 85-92 (1970)j Maeda et al., Nippon Nogei Kagaku Kaishi, 44. (12), pp_o 547-

555 (1970);

Maeda et al., Hakko Kyokaishl. 28 (10), pp. 391-397 (1970);

Smiley, Biotechnol,, Bioeng.. 1_3_, PP. 309-317 (1971);

Sorenson, Magister-Dissertation an der Purdue Univ» (1971 )| Miyamoto et al*, Hakko Kogaku Zasshi. 4£ (6), pp_e 565-573 (1971); Usami et al,, Hakko ,Kyokaishi. 29_ (4), pp. 195-199 (1971); O'Neill et al», Biotechnol. Bioeng.. J£, pp. 337-352 (1971)?

Emery et al... Ohem. En^» (London), No. 258, pp, 71-76 (i972); Gruesbeck et al», Ind_g Eng» Ohem. Prodo lies» Develop., 11 (1 ),

pp. 74-83 (1972);

Beck, Doktordissertation an der Univ. Texas (1972); Gestrelius et al., Bioehem. Biophys. Acta, 276 (2), PP. 339-343 (1972);

Maeda et al., Agr» Biol. Qhem.,36 (9), PP* 1581-1594 and PPo 1839-1842 (1972);

Weetal et al., Biotechnol. Bioeng» Symp», No. 3, pp. 241-266 (1972);

Christison, Ohgm. & Ind. (London), (5), pp* 215-216 (1972);

Hough et al., Nature, 235. P-. 389 (1972); Gorno et al., Die.Stael&e, 24, pp. 420-424 (1972);

Martensson et al», Biotechnol, Bioeng,, U (5), pp.715-724 (1972)*,

Park et al·, J. good Sei,, 28, pp_o 358-359 (1973).

6-6 9 d 1 1 / 0 β β 6

neiterhin liegt eine Anzahl von Druck— und Patentschriften vor, die die Immobilisierung von Alpha-Amylase offenbaren. Beispiele hierfür sind:

Die U.3.-Patentschriften 3.627.638 und 3.715.278;

die DT-Patentschriften 1.282.579, 1.94-3.490, 2.062.246 und

2o206o360.

Auch: Grubhofer et al., Naturwissenschaften, 40. 508, (1953);

Manecke, Pure Appl« Chem.. 4, pp. 507-520 (1962)9

Manecke et al., Makromol. Chem., 51, pp. 199-216 (1962)}

Bernfeld et al., Science. 142, pp. 678-679 (196J)I

Manecke et al., Makromol, Ohenu, 9_1» PP· 136-154 (1966);

Fukushi et al., J. Biochem., 64, pp. 283-292 (1968);

Barker et al., Oarbohyd. Res., 8, pp. 491-497 (1968);

Ledingham et al., Fed, üurop. Biochem« Soc.Lett., 5., pp. 118-120 (1969)»

Barker et al., Oarbohyd. fies.. 14, pp. 323-326 (1970); Barker et al., Process Biochem.. £ (8), pp· 14-15 (1970); Barker et al_e, Oarbohyd. Res.« t4, pp. 287-296 (1970);

Hough et al., Nature, 235, p. 389 (1972);

Epton et al., Oarbohyd. Res.. 22. pp. 301-306 (1972).

Schließlich liegen mehrere Patent- und Druckschriften vor, die auf die Immobilisierung von Alpha-1,6-Glucosidase gerichtet sind - bspwo:

GB-PS 1 ο258.095; Martensson et al., Biotechnol. Bioeng., (5), PP. 715-724 (1972)c

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Aus diesen Patent- und Druckschriften ergibt sich, daß eine Anzahl von Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen beschrieben worden ist» Nach diesen Verfahren bindet man ein Enzym covalent an einen geeigneten Träger, kapselt das Enzym in ein Material ein, das für das Enzym undurchlässig, für das Substrat und die Produkte der katalysierten .Reaktion jedoch durchlässig ist, adsorbiert ein- Enzym an einen unlöslichen Träger oder schließt ein Enzym in ein poröses Polymerisatmaterial ein, dessen Poren groß genug sind, um dem Substrat und den Produkten der katalysierten Reaktion freien Zugang zu geben, aber klein genug, um ein Entweichen des Enzyms zu verhindern»

Bei geringen Konzentrationen des Stärkesubstrats, bspwo etwa 1 ftf setzen Glucoamylasezubereitungen unhydrolysierte Stärke in wesentlichen Mengen zu Dextrose um, Marshall u.a_o (in ffed» Europ» Bioohenu Soc Lett., 9_ (2.), S. 85-88 (1970)) und Fukui u.a. (in Agr. Biol. Chem, £2 (£)» S 884-891 (1969)) haben berichtet, daß Grlucoamylasezubereitungen an sich Alpha-Amylase enthalten. Als man die Alpha-Amylase aus diesen Zubereitungen entfernte und die alpha-amylasefreie Glucoamylase zum Verzuckern einer einprozentigen Stärkelösung verwendete, bildeten sich kleinere Mengen Dextrose als beim Einsatz von Glucoamylasezubereitungen, die die Alpha-Amylase noch enthielten.

Immobilisiert man eine Glucoamylasezubereitung, ist die resultierende immobilisierte Zubereitung nicht mehr in der Lage, teilweise hydrolysierte Stärke im gleichen Ausmaß umzusetzen wie die

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Glucoamylase, aus der das immobilisierte Enzym hergestellt wurdeβ Weiterhin verlaufen Reaktionen, die die immobilisierte Glucoamylasezubereitung katalysiert, für eine vorgegebene Anzahl von eingesetzten Glueoamylase-Einheiten - insbesondere während der späteren Stufen der Reaktionszeit nicht so schnell wie Reaktionen, die die für die Immobilisierung eingesetzte Glucoamylase-Zubereitung katalysiert«

Es ist folglich ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, nach dem sich unter Einsatz eines immobilisierten Enzymsystems eine im wesentlichen vollständige Umsetzung von teilweise hydrolysierter Stärke zu Dextrose erreichen läßt.

Dieses und andere Ziele der vorliegenden Erfindung, wie sie sich aus der folgenden Beschreibung ergeben, lassen sich nach der Erfindung erreichen, indem man eine teilhydrolysierte Stärkelösung mit mindestens 10 °f> hydrolysierter Stärke mit einem Enzymsystem, das immobilisierte Glucoamylase sowie Alpha-Amylase aus der aus löslicher Alpha-Amylase, immobilisierter Alpha-Amylase sowie deren Mischungen bestehenden Gruppe aufweist, unter Bedingungen kontaktiert, die eine im wesentlichen vollständige Umsetzung der hydrolysierten Stärke zu Dextrose gewährleisten*

Wie oben erwähnt, setzt bei Einsatz einer immobilisierten Glucoamylasezubereitung diese die teilhydrolysierte Stärke nicht

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so schnell oder vollständig um wie die lösliche Glucoamylase-Zubereitung, aus"'der die immobilisierte Glucoamylase hergestellt wurde. Es hat sich herausgestellt, daß während der Immobilisierung einer Glucoamylase—Zubereitung die in dieser an sich vorliegende Alpha-Amylase unabhängig vom eingesetzten Immobilisierungsverfahren im wesentlichen unwirksam gemacht wird. Dieser Befund ist im licht der vielen unterschiedlichen Verfahren überraschend, die für die Immobilisierung von Alpha-Amylasen offenbart worden sind» Obgleich hier keine Einschränkung auf eine bestimmte Theorie erfolgen soll, wird dafür gehalten, daß die Verfahren, die man für die Immobilisierung von Glucoamylase geeignet gefunden hat, für die Immobilisierung der in Glucoamylase-Zubereitungen an sich enthaltenen Alpha-Amylase nicht geeignet sind β Anscheinend hat die kleine Menge Alpha-Amylase, die an sich iö, Zubereitungen löslicher Glucoamylase vorliegt, einen günstigen Effekt auf die Umsetzung von dtärke zu Dextrose mit Glucoamylase insgesamt» Um also eine maximale Nutzung der immobilisierten Glucoamylase bei der Umsetzung teilhydrolysierter Stärke zu Dextrose zu erreichen, muß während der Umsetzung auch lösliche und/oder immobilisierte Alpha-Amylase zugegen sein, überraschenderweise gilt dieser Befund selbst dann, wenn die teilhydrolysierte Stärke durch Behandlung unmodifizierter Stärke mit Alpha-Amylase hergestellt worden ist und man annehmen Küßte, sie sei der Umsetzung mit Glucoamylase durch eine derartige Behandlung leicht zugänglich» Weiterhin hat sich herausgestellt, daß immobilisierter Glucoamylase zugesetzte Alpha-Am_vlase die Umsetzung teilhydrolysierter Stärke zu Dextro-

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se selbst in den späteren Stufen der Umsetzung verbesserte Anscheinend bilden sich während der anfänglichen Stufen der Hydrolysereaktion verzweigte Dextrine, die sich von der immobilisierten Glucoamylase nicht leicht hydrolysieren lassen, aber von Alpha-Amylase leicht hydrolysiert werden, auf welche 'weise der G-esamtumsetzungsgrad des Stärkehydrolysats sich verbesserte

Im vorliegenden Verfahren kann die teilhydrolysierte Stärke nach einem Enzym- oder einem Säureverfahren hergestellt werden« Bei einer Enzymbehandlung sollte die teilhydrolysierte Stärke ein DA im Bereich von etwa 10 bis etwa 60 haben_e Bei wesentlich höheren DÄ-Werten ist die sich bildende Dextrosemenge vermutlich infolge des Vorliegens von Sacchariden beschränkt, die einer Einwirkung durch die immobilisierte G-lucoamylase nicht leicht zugänglich sind, während bei niedrigeren DÄ-Werten die hydrolysierte Stärke die Tendenz zeigt, sich rückzuentwickeln ("to retrograde"), einschließlich der Bildung eines Niederschlags, der UoU. die immobilisierten Enzyme so weit abdecken kann, daß ihre Wirksamkeit schädlich beeinflußt wirdo Setzt man ein partielles Säurehydrolysat im vorliegenden Verfahren ein, sollte das DA im Bereich von etwa 10 bis etwa 30 liegen. Bei höheren DÄ-Werten liegen erhebliche Mengen von Reversionsprodukten vor, auf die das vorliegende Enzymsystem keine Wirkung ausübt»

Der pH-Wert des behandelten Teilhydrolysats kann im Bereich von etwa 3»5 bis etwa 6,5 liegen und liegt vorzugsweise im Bereich

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von etwa 4 "bis etwa 6_O

Die Temperatur des im vorliegenden Verfahren behandelten Teilhydrolysats kann innerhalb eines verhältnismäßig breiten Bereiches schwanken, sollte aber nicht so hoch sein, daß die Enzyme nach bereits kurzer Zeit inaktiv werden. Temperaturen im Bereich von etwa 50° bis etwa 60 G sind geeignet, vorzugsweise Temperaturen im Bereich von etwa 50 bis etwa 60 Co Bei diesen Temperaturen ist die Möglichkeit eines unerwünschten Wuchses von Mikroorganismen in der hydrolysierten Stärke gering und man erhält unter normalen Arbeitsbedingungen eine optimale katalytische Aktivität der Enzyme.

Das vorliegende Verfahren läßt sich auf verschiedene V/eise durchführen» Bspw. kann man lösliche oder immobilisierte Alpha-Amylase und immobilisierte Glucoamylase gleichzeitig oder nacheinander verwenden,» Vorzugsweise setzt man sie gleichzeitig ein - bspw_o indem man teilhydrolysierte Stärke mit einer Mischung von immobilisierter Glucoamylase und immobilisierter Alpha-Amylase kontaktierte Es ist natürlich einzusehen, daß man die Alpha-Amylase und die Glucoamylase auf oder in dem gleichen Träger immobilisieren kann, und die erhaltenen Ergebnisse sind denen von Mischungen von Alpha-Amylase und Glucoamylase, die auf getrennten Trägern immobilisiert sind, im wesentlichen gleichwertig. Werden die Enzyme nacheinander eingesetzt, umfaßt der Umsetzungsprozeß mindestens drei Schritte in der folgenden Aufeinanderfolge: (1) Kontaktierung des Teilhydrolysats mit der immobilisierten

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Glueoamylase, (2) Kontaktierung des resultierenden Hydrolysate mit einer löslichen oder immobilisierten Alpha-Amylase und (3) Kontaktierung des resultierenden Hydrolysate mit immobilisierter Glucoamylase» Die beiden letzteren Schritte der Folge lassen sich mehrfach wiederholen, und zwar in der Häufigkeit abhängig von den Bedingungen, unter denen die Reaktionen ablaufen,. Der gleichzeitige Einsatz der Enzyme ergibt die Umsetzung größerer Mengen der teilhydrolysierten Stärke zu Dextrose als ein Einsatz nacheinander, es sei denn, daß man die im Folgebetrieb durchgeführten Schritte sehr oft wiederholt.

Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der immobilisierten Alpha-Amylase zum Einsatz im Verfahren nach der vorliegenden Erfindung ist die covalente Bindung der Alpha-Amylase an Träger wie Cellulose, poröse Keramik, makroporöse Kunstharze, vernetztes Dextran und ähnliche Materialien_e

Die G-lucoamylase läßt sich nach einem der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren immobilisieren, obgleich für das Verfahren nach der Erfindung vorzugsweise eine G-lucoamylase verwendet wird, die auf einem Cellulosederivat wie DEAE-Cellulose oder durch covalente Bindung an einen inerten Träger immobilisiert worden istο

Es läßt sich eine Anzahl unterschiedlicher Alpha-Amylasearten einsetzen? vorzugsweise benutzt man eine verzuckernde Alpha-Amylase oder eine Alpha-Amylase der Bauchspeicheldrüseο

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-H-

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Mikroorganismen wie Bacillus subtilis var₀ amylosacchariticus iPukumoto erzeugen verzuckernde Alpha-Amylase,, Im allgemeinen weisen die zur Immobilisierung gedachten Alpha-Juaylase-Zubereitungen vorzugsweise einen S/L-V/ert (vergib die Definition weiter unten) von mindestens etwa 3» vorzugsweise mindestens etwa 50 und meist bevorzugt von mindestens etwa 100 auf.

Das Verhältnis der Aktivitäten der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Enzyme sollte typischerweise oberhalb eines bestimmten Minimums liegen, um eine optimale katalytische Wirkung zu erzielen. In dieser Hinsicht sollten die Mengen der immobilisierten Glucoamylase und der Alpha-umylase, die eingesetzt werden können, ausreichen, um ein Verhältnis der Dextrinieraktivität (weiter unten definiert) zur Glucoamylaseaktivitat (weiter unten definiert) von mindestens 0,2 Liquefon ("liquefons") pro Grlucoamylaseeinheit zu erreichen« Vorzugsweise reichen die vorliegenden Enzymmengen aus, um mindestens 1 Liquefon pro Glucoamylaseeinheit zu erreichen, und mit größtem Vorzug werden die vorliegenden Mengen ausreichen, um pro Grlucoamylaseeinheit mindestens 3 Liquefon zu erzielen»

Verwendet man das erfindungsgemäße Bnzymsystem in einer Kolonne oder im Bett oder auf andere Weise, die einen kontinuierlichen Einsatz gestattet, ist es wichtig, alles im Stärketeilhydrolysat vorliegende unlösEche Material zu entfernen, damit dieses Material die Kolonne nicht verstopft oder die immobilisierten Enzyme in einem Ausmaß überdeckt, das den Wirkungsgrad des

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Enzymsystems erheblich reduzierte Die Entfernung des unlöslichen Materials läßt sich auf irgendeine geeignete Weise erreichen bspwe durch Ausfiltern, Zentrifugieren oder dergl.

Auch immobilisierte Alpha-1,6-Glucosidasen lassen sich für das erfindungsgemäße Verfahren verwenden. Beispielhaft für das bevorzugte Enzym dieser Klasse ist Pullulanase₀ Vorzugsweise wird die Pullulanase durch covalente Bindung an einen inerten Träger immobilisiert.

Um das Wesen der vorliegenden Erfindung klarer zu beschreiben, folgen nun spezielle Ausführungsbeispiele« Diese sollen jedoch nur als Beispiele dienen, nicht aber den Umfang der Erfindung abstecken oder den Geltungsbereich der angefügten Ansprüche einschränken.

Die in der vorliegenden Beschreibung benutzten Ausdrücke und hier beschriebenen Verfahrensweisen sollen zunächst definiert werden:

Dextroseäquivalent (DA)

Das Dextroseäquivalent wurde nach dem Verfahren E-26 in "Standard Analytical Methods of the Member Companies of the Corn Industries Research Foundation", Corn Refiners Association, Inc., 1001 Connecticut Avenue, M_eW._f Washington D₀C_β 20036, bestimmte

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Dextrosegehalt

Der Dextrosegehalt wurde mit dem Matiiew-Index berechnete Vergl,

Cayle & VielDrock, Oereal, Chem,, 43« 3. 237 (1966).

Der Mathew-Index wurde aus Messungen der optischen Drehung und des reduzierenden Zuckergehalts der umgesetzten Lösungen "bestimmt. Die umgesetzten Lösungen wurden auf etwa 3 ?° Trockenfeststoffanteil verdünnt und die optische Drehung (R) in Kreisgraden in einer auf 25⁰C gehaltenen 0,2 dm-Mantelzelle unter Verwendung eines automatischen Polarimeters (Bendix Scientific Instruments, Modell HPL) mit grüner Lichtquelle (546,1 nm) bestimmt» Ein Teil der für die Polarimetrie entnommenen Lösung wurde vierfach verdünnt und nach dem oben angegebenen Verfahren zur Bestimmung des DÄ-Werts in 25 ml Pehlingsche Lösung titriert. Der so erhaltene Titer (T) ist die Anzahl der ml verdünnter Lösung, der reduzierende Zucker in einer 0,12 g Dextrose äquivalenten Menge enthält. Aus der Drehung (R) und dem Titer (T) wurde der Mathew-Index (M) wie folgt

M= RT/4,

und dann aus dem Mathew—Index der prozentuale Dextroseanteil (aschenfrei, Trockensubstanz) nach folgender Beziehung berechnet:

Dextroseanteil (#) = (170 - 20M)/(0,2167M + 1,0784)

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Zubereitung der teilhydrolysierten Stärkelösung

Die in den verschiedenen Analysebestimmungen und den folgenden Beispielen verwendeten teilhydrolysierten Stärkelösungen wurden nach folgendem allgemeinem Verfahren hergestellt:

Eine Aufschlämmung von Maisstärke in Wasser von 18 Be wurde mit Kalk ("lime") auf pH 7,0 eingestellt und ihr Alpha-Amylase (von B. subtilis, 33 Liquefon pro Gramm Trockenstärke) zugegeben. Die Mischung wurde durch Mischen mit Dampf in einem Mischstrahl momentan auf 88⁰G erwärmt, um die Stärke zu gelatinieren und die Enzymtätigkeit anzuregen, und dann etwa 1 Stde auf 88 G gehalten. Sodann wurde die Mischung durch Mischen mit Druckdampf in einem Mischstrahl auf 149°C erwärmt, etwa 1 min. auf 149°C gehalten und dann in einer Vakuumkammer auf 88⁰C abgekühlt. Der Mischung wurde bei 88⁰G weitere Alpha-Amylase (11 Liquefon pro Gramm Trockenstärke) zugegeben und die Hydrolyse bis zum Erreichen des gewünschten DA' fortgesetzt» Nach dem Abkühlen auf 60⁰C wurde die Lösuug mit 4-M-Salzsäure auf pH 3,5 bis 4 eingestellt und dann 90 min_o auf 100⁰C gehalten, um die restliche Alpha-Amylaseaktivität zu beseitigen,, Danach wurden 3 i> Filterhilfsmittel zugegeben und das heiße Hydrolysat gefiltert, um unlösliches Protein und Fett zu entfernen. Diese Verfahrensweise ergab eine teilhydrolysierte Stärkelösung mit einem DA von 12 bis 20 und 31 bis 34 $> Trockenfeststoff anteil.

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G-lucoamylaseaktivität

Eine Glucoamylase-Aktivitätseinheit (GL·) ist definiert als diejenige Menge des Enzyms, die in den unten beschriebenen die Herstellung vein einem Gramm Dextrose pro Stunde bei 6O⁰G und einem pH 4,5 Verfahren katalysiert.

Als Zubereitung der Substratlösung für die Bestimmung der Glucoamylaseaktivität wurde trommelgetrocknete teilhydrolysierte Stärke verwendet_o Eine teilhydrolyaierte Stärkelösung mit einem DA von 12 wurde 45 min. lang bei 6O⁰G mit aktivierter Kohle (Nucchar CEE der Pa₀ West Virginia Pulp and Paper Co <,) behandelt, dann die Kohle abgefiltert und das FiItrat erneut auf die gleiche Weise mit Kohle behandelt und gefiltert, das Filtrat dann auf etwa 50 $> Trockenfeststoffanteil konzentriert, auf einem dampfbeheizten Trommeltrockner getrocknet und gemahlen. Die trommelgetrocknete teilhydrolysierte Stärke enthielt 1,7 /° Feuchtigkeit und 0,5-^ Asche«, Substratlösungen für die Bestimmung der Gluooamylaseaktivität wurden mit 10g der getrockneten hydrolysieren Stärke und 2 ml einer Pufferlösung von 1-M-Natriumacetat pro 100 ml Lösung mit einem pH-Wert von 4,5 hergestellt.

Aktivität der löslichen Glucoamylase

10 ml der Substratlösung wurden in ein bedecktes Reaktionsgefäß pipettiert, das auf 6O⁰C gehalten wurde, dann 1 ml Glucoamylase-Lösung mit 0,03 bis 0,15 GE zugegeben und eingemischt und die

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Iviischung 1 Std. auf 6O⁰G vorgehalten. Am ünde der einstündigen Inkubationszeit wurde die Jsnzymwirkung durch Zugeben eines vor-"be stimmt en Volumens von 1-M-Natriumhydroxidlösung zu einem pH 8,5 bis 10,5 angehalten und die kischung auf Raumtemperatur abgekühlt.

2,5 ml der so ernaltenen Hydrolysatprobe wurden in 25 ml ffehlingscher Lösung einpipettiert, die zubereitet worden war, wie es oben für die Di-Bestimmung beschrieben ist«, Die kischung wurde zum Sieden gebracht und dann mit Standard-Dextroselösung mit 5 g Dextrose/Liter titriert, wie es oben für die DÄ-BeStimmung beschrieben ist. üine Bezugsmischung wurde genau so zubereitet und titriert, wie es oben für die Probenlösung beschrieben ist; hier wurde jedoch das 1 ml Glucoamylaselöeung der Substratlösung nach der einstündigen Inkubationszeit und nach der Zugabe der liatriumhydroxidlösung zugegebene Die Glucoamylaseaktivität wurde wie folgt berechnet:

GE/ml = 0,002 V (C - A)

mit V = Gesamtvolumen (ml) des Probenhydrolysats (gewöhnlich 11,2 ml), C = Volumen (ml) der Standarddextroselösung, die bei der Titration der Bezugsmischung eingesetzt wurde, und V = Volumen (ml) der beim Titrieren des Probenhydrolysats eingesetzten Standard-Dextroselösung.

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Aktivität der immobilisierten Glucoamylase

Die Aktivität der immobilisierten. Glucoamylase wurde bestimmt nach, einer modifizierten Version des oben angegebenen Verfahrens für die Bestimmung der Aktivität der löslichen Glucoamylase· Hierzu wurden 10 ml der wie oben angegebenen zubereiteten Substratlösung in einem verschlossenen Reaktionsgefäß auf 60⁰C erwärmte Eine abgewogene Menge (W) immobilisierter Glucoamylase mit 3 bis 10 GE wurde in entsalztem Wasser suspendiert und auf 100 ml verdünnt, die Suspension der immobilisierten Glucoamylase gerührt und während des Rührens wurde ein 1-ml-Aliquot der Suspension auf die auf 6O⁰C gehaltenen 10 ml Substratlösung übertragene Die Mischung wurde intermittierend genau 1 Std· auf 6O⁰C gerührt, die immobilisierte Glucoamylase dann abgefiltert, 2,5 ml der so erhaltenen Probenlösung zu 25 ml Fehlingscher Lösung gegeben und mit Standard-Dextrose titriert, wie es oben zur Bestimmung der Aktivität der löslichen Glucoamylase beschrieben ist« Ein Vergleichsfiltrat wurde auf genau die gleiche V/eise zubereitet und titriert - mit Ausnahme der Zugabe von 1 ml Wasser anstelle des 1 ml der Suspension der immobilisierten Glucoamylase. Dann wurde die Aktivität der immobilisierten Glucoamylase wie folgt berechnet:

GE / g = 2,2

mit C₁ = Volumen (ml) der beim Titrieren des Bezugsfiltrats verwendeten Standard-Dextroselösung, A₁ = das Volumen (ml) der

β ο δ a 11 / ο g

"beim Titrieren des Probenfiltrats verwendeten otandard-Dextroselösung und ff = Gewicht (g) der immo"bilisierten G-lucoamylase in den 100 ml Suspension.

Aktivität der Alpha-Amylase

Die Alpha-Amylase wurde auf zwei verschiedene Arten analysiert. Bei der einen Art wurde als Maß für die Dextrinbildungsaktivität die Fähigkeit der Alpha-Amylasezubereitung festgestellt, lösliche Lintner-Stärke zu Dextrinen zu hydrolysieren, die zu klein sind, um mit Jod eine blaue Färbung zu erzeugen_o Bei der anderen Analysenart wurde als Maß für die Verzuckerungsaktivität die Fähigkeit der Alpha-Amylasezubereitung bestimmt, reduzierende Zucker durch Hydrolyse einer reduzierten teilhydrolysierten Stärke zu bilden.

Dextrinieraktivität der löslichen Alpha-Amylase

Die Dextrinieraktivität der löslichen Alpha-Amylase wurde bestimmt nach einer modifizierten Version des Standard-Prüfverfahrens AATCC 103, 19b5, "Bacterial Alpha-Amylase Enzymes Used in Desizing, Assay of" in der Ausgabe 1967 des Technical Manual of the American Association of Textile Chemists and Colorists, Bde 43, S. B-174 und B-175. Das Verfahren wurde dahingehend geändert, daß anstelle der 10 ml Phosphatpufferlösung mit pH 6,6 bei der Herstellung des gepufferten Stärkesubstrats 10 ml eines lM-Natriumacetatpuffers mit pH 5,0 eingesetzt wurden» Weiterhin

0 9311/0888

wurden 0,75 g CaOl₂.2H₂O pro 500 ml des gepufferten Stärkesubstrats zugegeben. Die Ergebnisse wurden in Liquefons berechnet, wobei ein Liquefon gleich 0,35 Bakterienamylaseeinheiten ist_e

Dextrinieraktivität der immobilisierten Alpha-Amylase

Die Dextrinieraktivität der immobilisierten Alpha-Amylasezubereitungen wurde auf die gleiche Weise bstimmt wie oben für die löslichen Alpha-Amylase-Zubereitungen mit der Ausnahme, daß zur Analyse die immobilisierte Alpha-Amylase mit einer 0,005M-Galciumacetatlösung bei 30⁰C "verdünnt" wurde. Ein 5ml-Aliquot der Suspension wurde zu den 10 ml des gepufferten Stärkesubstrats gegeben und die so gebildete Hydrolysiermischung während des Hydrolyseschritts bei 30⁰G fortwährend gerührt. In geeigneten Abständen wurden 2 ml-Aliquots der Hydrolysiermischung entnommen, schnell gefiltert und 1 ml des FiItrats zu 5 ml verdünnter Jodlösung gegebene Die Zeit vom Augenblick der Zugabe des 5ml-Aliquots Suspension zu den 10 ml gepufferten Stärkesubstrats bis· zum Filtern des 2mlvAliquots der Hydrolysiermischung wurde ausgezählt.

Yerzuckerungsaktivität der löslichen Alpha-Amylase

Die Verzuckerungsaktivität der löslichen Alpha-Amylase-Zubereitungen wurde bestimmt unter Verwendung einer reduzierten teilhydrolysierten Stärkelösung (HLS) als Substrat. Eine Einheit

609011/0880

der Verzuckerungsaktivität (S) wurde definiert als die Enzymmenge, die in dem unten beschriebenen Verfahren eine Zunahme von 0,02 Absorbanzeinheiten ("absorbance units") pro Minute bewirkt.

Die RL 3 wurde zubereitet aus einer 1,8-1-Probe von teilhydrolysierter Stärkelösung mit einem DA von 12 und einem Trockenfeststoff anteil von 31 i⁰· Die teilhydrolysierte Stärkelösung wurde zubereitet, wie es oben beschrieben ist - mit der Ausnahme, daß die letzten Schritte, d.h. die Einstellung des pH auf 3,5 bis 4,0, die Erwärmung auf 90⁰C zur Deaktivierung von Alpha-Amylase-Resten und das Filtern weggelassen wurden. Die hydrolysierte Stärkelösung wurde auf pH 6,5 bis 7,0 eingestellt und auf 70⁰C erwärmt. Eine verflüssigende Alpha-Amylasezubereitung von Bosubtilis mit 57000 liquefons wurde zugegeben und die Mischung 3,5 Std. bei 70⁰C vorgehalten, dann der pH auf 3,5 bis 4,0 eingestellt und die Mischung 1 Std«, auf 100⁰C vorgehalten, dann 3 fo .Filterhilfsmittel zugegeben und die Mischung gefiltert, das FiItrat mit 8M-NaOH-Losung auf pH 5,5 eingestellt, 10 g DEAE-Cellulose (Whatman DE 23, Reeve Angel) zugegeben und die Mischung 30 min. bei Umgebungstemperatur gerührte Die Mischung wurde dann 18 Stdo bei 5 C ohne .Rühren vorgehalten, auf 60 C erwärmt und gefiltert,, Das FiItrat wurde zweifach durch 60-minütiges Rühren bei 60⁰C mit 16 g aktivierter Kohle (Nucchar CEE) und etwa 50 g Filterhilfsmittel, gefolgt durch Filtern, gereinigt ο Es ergaben sich 975 ml des doppeltgereinigten Filtrats mit 34,5 ί° Trockenfeststoff anteil und einem Dl von 30,2. 400 ml

Ö09S11 /osae

ORIGINAL INSPECTED

des doppeltgereinigten Filtrats wurden auf etwa 2O⁰G gekühlt und 0,5g-Mengen Natriumborhydrid in Abständen von 30 min. darin gelöst, bis insgesamt §,0 g zugegeben worden waren. Die resultierende Lösung wurde etwa 16 Std„ lang bei Umgebungstemperatur gerührt, auf etwa 2⁰G gekühlt und mit 0,5 g Natriumborhydrid versetzt. Wach weiterem 4-stündigem Rühren wurde eine endgültige Menge von 0,5 g Natriümborhydrid zugegeben und die Lösung 26 Std, bei Umgebungstemperatur gerührt. 435 ml der resultierenden Lösung wurden, i.©. einer Ionaustauschkolonne mit einem 89 χ 2,5 cm-Bett aus Borosorb (Calbiochem, CN 203667) und Durchwaschen der Kolonnencharge mit Wasser gereinigt. Der Abfluß (Charge plus V/a schabgang) wurde auf 800 ml konzentriert und dann in drei Kolonnen gefüllt, die auf folgende Weise in Reihe geschaltet waren: ein Bett von 89 x 2,5 cm aus Borosorb, ein Bett von 26 χ 2,5 cm eines starken Säureharzes in Wasserstofform (Duolite C-3 der tfa. Diamond Shamrock Chemical Co.) und ein Bett von 62 χ 2,5 cm eines schwachen Basenharzes in freier Aminform (Duolite A-6). Die Charge wurde durch die Kolonnen mit Wasser gewaschen und der Ausfluß aufgefangen, bis sich 4>9 Liter ergeben hatten. Dann wurde der Ausfluß auf 450 ml konzentriert, 0,09 g Natriumazid zugegeben und die Mischung durch ein Membranfilter (Nalge Corp.) mit einer maximalen Porengröße von 0,2 ,um gefiltert« Die so hergestellte ELS-Lösung hatte folgende Kennwerte: Dl kleiner als 0,4; pH 6,4; 26,3 ^a/> Trockenfeststoffanteil; 0,03 i> sulfatierte Asche; 1,7-ppm Bor.

eine RL3-oubstratlösung zur Messung der Verzuckerungsaktivität wurde zubereitet derart, daß sie 2 g (Trockenbasis) KLa₁ 2 ml eines lM-Natriumacetatpuffers mit pH 5,0 und 0,147 g CaCl₂-2H₂0 in einem Gesamtvolumen von 100 ml enthielt. Zur Bestimmung der Verzuckerungsaktivität wurden 5 ml der ELS-Substratlösung, die auf 30 G äquilibriert worden waren, mit 5 ml einer Lösung der Alpha-Amylase-Zubereitung gemischt, die auf 0,2 bis 1,0 s/ml, auf 30⁰C äquilibriert, verdünnt worden war. Die Hydrolysiermischung wurde bei 30 G inkubiert und lml-Aliquots eine, drei und fünf Minuten nach dem Zusammentun der iiinzvm- und Substratlösung entnommene Jede Probe wurde sofort mit 1 ml eines Dinitrosalicylsäurereagens versetzt, das nach P. Bernfeld in "Methods of Enzymology", Herausgeber 8.P. Colowick und H.O. Kaplan, Bd. I, S. 149, Academic Press, New York (1955) zubereitet worden war. Die Mischung wurde 5 min. in einem diedewasserbad erwärmt, dann mindestens 10 min. in kaltem laufendem Leitungswasser (etwa 15⁰G) abgekühlte Die Mischung wurde durch Zugabe von 10 ml entsalztem Wasser verdünnt und die Absorbanz der resultierenden Lösung bei 540 nm in einer lcm-Zelle bestimmt. Eb wurde eine Kurve der Absorbanz als .Funktion der Inkubationszeit aufgetragen und die Steigung (Y) der Kurve in Absorbanzeinheiten pro Minute bestimmt. Die Aktivität der verdünnten Lösung der Alpha-Amylase-Zubereitung wurde dann wie folgt berechnet:

Aktivität (S/ml) = 10 Y 60981 1 /Oggg

iS/L-Wert

Die aus.defl verschiedenen Quellen hergestellten Zubereitungen lösliche Alpha-Amylale, wie zur Herstellung der immobilisierten Alpha-Amylase eingesetzt wurden, wurden nach ihrem S/L-Wert klassiert, der als das Tausendfache der Verzuckerungsaktivität in VerzuckerTÄgseinheiten (S) pro Gramm der Alpha-Amylase-Zubereitung, geteilt durch die Dextrinieraktivität in Liquefon pro Gramm Zubereitung definiert ist»

Aktivität der Zubereitungen löslicher Pullulanase

Die Pullulanae'©--Aktivii;ät wurde bestimmt durch ihre hydrolytische Wirkung" auf Pullulan unter Einsatz eines alkalischen Perricyanidreagens zur Erfassung der freigesetzten Maltotriose. Die Aktivität wurde ausgedrückt in Internationalen Einheiten (IE), wobei eine IE diejenige Pullulanase-Menge ist, die die Freisetzung von 1 pM Maltotriose pro Minute aus einer 0,5/'°-igen Lösung von Pullulan bei pH 5,0 und 45°C katalysiert.

Das Ferricyanidreagens wurde hergestellt durch Lösen von 0,85 g Kaliumferricyanid und 10 g Natriumcarbonat in entsalztem Wasser und Verdünnen auf ein Liter. Das .Reagens wurde an Maltotrioselösungen geeicht (Pierce Chemical Co.). 2ml-Aliquots des ierricyanidreagens wurden in .Reagenzgläsern mit 1-ml-Aliquots von MaltotrioselÖsungen gemischt, die 25, 100, 150, 200 oder 250 _yug Maltotriose pro ml enthielten» Die Reagenzgläser wurden in einem

Siedewasserbad 1C min. lang untergetaucht, dann 10 min„ bei Umgebungstemperatur gekühlt und die Absorbanz mit einer lcm-Zelle bei 420 nm gemessen. Die Maltotriosekonzentration wurde als Funktion der Absorbanz aufgetragen und aus der Steigung der Kurve ein Jiichfaktor (C) bestimmt.

Um die Pullulanase-Aktivität zu bestimmen, wurde ein Reagenzglas mit 9,5 ml Substratlösung, mit 8,5 ml 0,02M-Uatriumacetatpuff er bei pH 5,0 und 1,0 ml einer 50 ml Pullulan enthaltenden Lösung 5 min. in einem Wasserbad bei 45⁰C inkubiert, dann ein 0,5-ml-Aliquot der Pullulanaselösung zugegeben und eingemischt. 5, 10, 15 und 20 min. nach der Zugabe der Pullulanaselösung wurden 1 ,0-ml-Aliquots der Reaktionsmischung in Reagenzgläser mit 2 ml des oben genannten geeichten Ferricyanidreagens pipettiert, die Mischungen erwärmt, gekühlt und die jeweilige Absorbanz wie bei der Eichung des Ferricyanidreagens bestimmte Die Absorbanz als Funktion der Zeit wurde aufgetragen und die Steigung (K) der aufgetragenen Kurve bestimmte Die Aktivität der Pullulanaselösung wurde dann nach folgender Formel berechnet:

Aktivität (IE/ml) = 0,0397 CK

mit C = Eichfaktor des Ferricyanidreagens (Mikrogramm Maltotriose pro Milliliter pro Absorbanzeinheit) und K = Steigung der Absorbanzkurve (Absorbanzeinheiten pro Minute).

809811/0888

pn

Aktivität der immobilisierten Pullulan.ase-Zubereitu.ng

Die Aktivität der immobilisierten Pullulanase-Zubereitung wurde nach dem Verfallren bestimmt, ,das oben für die lösliche Pullulanase erläutert ist, aber mit den folgenden Änderungen. Es wurde eine Suspension durch Einrühren von 25 mg der immobilisierten Pullulanase-Zubereitung in 5,0 ml entsalztes Wasser hergestellt und ein 0,5-ml-Aliquot der Suspension in 9>5 ml der Substratlösung zur Herstellung der Reaktionsmischung gegebene Die Reaktionsmischung wurde während der Reaktionszeit fortwährend gerührt, Proben wurden nach 5, 10, 15 und 20 Minuten entnommen, schnell gefiltert und 1,0-ml-Mengen mit 2-ml-Aliquots des Ferricyanidreagens versetzt.

Beispiel I

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von auf DEAE-Gellulose immobilisierter Gluooamylase und von auf Aminoäthylcellulose immobilisierter, aus unterschiedlichen Quellen stammender Alpha-Amylase zum Umsetzen einer teilhydrolysierten Stärkelösung zu Dextrose.

Immobilisierung der Grlucoamylase

53,Og einer Srockenglucoamylasezubereitung (von Aspergillus awamori , frei von Transglucosylaseaktivität) mit einer Glucoamylaseaktivität von 83,2 GE/g wurden in 3»8 1 entionisiertes

V/asser gegeben, die Mischung 30 min, gerührt und mit .Filterhilfsmittel versetzt» Die Mischung wurde dann gefiltert, der Filterkuchen gewaschen, das Filtrat und die Waschabgänge zusammengeführt und der pH der zusammengeführten Lösung mit 4N-HC1 auf 5,5 eingestellte 13,3 g DEAE-Cellulose (Whatman DE 23) wurden zugegeben, die Mischung 60 min. bei Umgebungstemperatur gerührt, dann gefiltert und der Filterkuchen mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der erhaltene feuchte Filterkuchen hatte eine G-lueoamylaseaktivität von 44 G-E/g. Der feuchte Filterkuchen wird in diesem Beispiel als "immobilisierte Glucoamylase" bezeichnet.

Immobilisierung der Alpha-Amyläse

Alpha-Amylase aus unterschiedlichen Quellen wurde durch Koppeln mit aktivierter Aminoäthylcellulose (im folgenden als "aktivierte AÄ" bezeichnet) immobilisiert.

Die aktivierte AÄ wurde zubereitet durch Aufschlämmung von 20 g Aminoäthylcellulose (Cellex-AÄ - hergestellt von der Fa. Bio-Rad Laboratories) in 500 ml eines 0,5M-Phosphatpuffers bei pH 7, Rühren für 20 min, bei Umgebungstemperatur und dann Vorhalten der Mischung für 7 Std„ ohne Rühren. Die Mischung wurde dann gefiltert, der Filterkuchen mit entionisiertem Wasser gewaschen und 12 3tdo in 500 ml eines 0,5M-Phosphatpuffers bei pH 7 suspendiert· 140 ml einer Glutaraldehydlösung (50 fo) wurden der Aufschlämmung zugegeben, die Aufschlämmung 90 min, bei Umgebungstemperatur gerührt, dann gefiltert, der Filterkuchen mit entioni-

60981 1/088S

siertem Wasser gewaschen_e Es ergaben sich 74,9 g Filterkuchen (75,2 jo Feuchtigkeit)«

Die aktivierte AÄ wurde in Mengen von jeweils 16,0 g in 50 ml jeder der folgenden vier Alpha-Amylaselösungen gegeben:

a. Lösung verzuckernder Alpha-Amylase von Bacillus subtilis (var. amylosacchariticus Fukumoto, doppelt rekristallisiert, Miles Laboratories, Ine», S/L = 257) mit 0,33 mg Protein pro ml und einer Aktivität von 134 Liquefom pro ml;

b_e Lösung einer verflüssigenden Alpha-Amylase von Bacillus subtilis (bakteriell, H-A, vierfach kristallisiert, digma Chemical Co., S/L = 5) mit 0,45 mg Protein pro ml und einer Aktivität von 1166 Liquefon pro ml;

ο» Lösung von Pilz-Alpha-Amylase von Aspergillus oryzae (dreifach kristallisiert, Fa. Calbiochem, S/L = 76) mit 0,45 mg Protein pro ml und einer Aktivität von 322 Liquefon pro mlj

de Alpha-Amylase-Lösung aus der Bauchspeicheldrüse von öchweinen (zweifach kristallisiert, Worthington Biochemical Corp., S/L = 227) mit 0,70 mg Protein pro ml und einer Aktivität von 290 Liquefon pro ml·

Die Mischungen wurden 2 Std. gerührt und gefiltert, die Filterkuchen mit 0,005 M-Calc±umacetat bei pH 7 mit kleinen Mengen

" ⁵¹ ~ 2S38322

von 0,5M-NaGl (insgesamt 100 ml) und dann mit etwa 50 ml einer G,005ivi-Calciumacetatlösung gewaschene Die immobilisierten Alphaümylasen zeigten die folgenden Potenzen:

Alpha-Amylase Potenz (Liquefon/g) immobilisierte verzuckernde AA 12,6

imm. verflüssigende AA 125,0

immο PiIz-AA 7,3

imm. Bauchspeicheldrüsen-AA 41,5

In jedes der fünf gerührten Reaktionsgefäße, die im viiasserbad auf 50⁰G gehalten wurden, wurden 138 g teilhydrolysierter Stärkelösung (pH 5,0, DA = 16,9, Trockensubstanzanteil 32,5 >) zugegeben, die nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt, durch eine Gelluloseestermembran (ΗΑΫ/Ρ 04700, 0,45 fi-, üillipore Corp«) gefiltert und dann mit Toluol gesättigt worden war. Das Toluol wurde zugegeben, um einen Bakterienwuchs zu verhindern»

0,51 g immobilisierte GKLueoamylase wurden jedem der Reaktionsgefäße und dann eine ausreichende Menge immobilisierter Alpha-Amylase in vier der Reaktionsgefäße gegeben, um insgesamt 90 Liquefon Alpha-Amylaseaktivität pro Reaktionsgefäß herzustellen. Die Reaktionsgefäße wurden fortwährend gerührt und in unterschiedlichen Zeitabständen Proben entnommen, gefiltert und die Filtrate auf ihren Dextrosegehalt analysiert« Die Ergebnisse dieses Beispiels sind in der Tabelle I zusammengefaßt.

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Tabelle I

Verzuckerung mit immobilisierter Glucoamylase und verschiedenen Arten immobilisierter Alpha-Amylase

Immobilisiertes Eözymsystem mittl* System^-pH-Wert ___ während d,Verzuckerung

Dextroseanteil· (/°) Stdo 70 eStd« 106 8td, 142 Std,

Immobilisierte Glucoamylase (Vergleichssubstanz)

Immobilisierte Glucoamylase Ue imm. verzuckernde Alpha-Amylase

Imnu Glucoamylase und
imm« verflüssigende Alpha-Amylase

5,1 5,1

5,0 71,5 76,3 79,6

92,3 92,9 93,0

89,0 91,5 93,1

80,9

92,7

93,2

Imm» Glucoamylase und
imm_e Pilz-Alpha-Amylase

Imm_e Glucoamylase und
imm· Bauchspeicheldrüsen-Al pha-Amy1as e

5,2 5,1 87,2 89,7 91,5

93,1 94,7

94,9

91,9

94,2

Aus dieser Tabelle ist zu ersehen, daß eine Kombination von immobilisierter G-lücoamylase mit immobilisierter Alpha-Amylase eine vollständige Umsetzung der Stärke zu Dextrose ergab als beim Einsatz von G-lucoamylase allein,, Weiterhin ergab die Kombination der immobilisierten Enzyme eine schnellere Umsetzung der Stärke zu Dextrose„ Weiterhin sind die aus der löslichen Alpha-Amylase-Zubereitung mit hohem S/L-Verhältnis hergestellten immobilisierten Alpha-Amylase-Zubereitungen günstiger für die Umsetzung von teilhydrolysierter Stärke zu Dextrose_o

Beispiel II

Dieses Beispiel erläutert den Effekt des Verhältnisses der Aktivität der immobilisierten Alpha-Amylase zur Aktivität der immobilisierten Glucoamylase auf die gebildete Dextrosemenge.

60 g aktivierter AA nach Beispiel I wurden zu 975 ml einer 0,005M-Hatriumacetatlösung mit 5x10 Liquefon einer Pilz-Alpha-Amylase-Zubereitung von Aspergillus oryzae (Enzeco K 768, Enzyme Development Corp₀) gegeben. Nach dem 2-stündigen Aufschlämmen bei Umgebungstemperatur wurde die Aufschlämmung gefiltert, der Filterkuchen nacheinander mit entionisiertem Wasser, einem Liter teilhydrolysierter Stärkelösung (3,2 fo Trockensubstanz; Dl 16,4; pH 5,0; 0,02 °/o NaN₅) und 200 ml einer 0,02?&- igen NaN,-Lösung gewaschen«, Der feuchte Filterkuchen hatte eine Alpha-Amylase-Aktivität von 33,3 Liquefon/g.

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Verzuckerung mit immobilisierter Glucoamylase und immobilisierter Alpha-Amylase von Aspergillus oryzae

In sechs gerührte Reaktionsgefäße mit jeweils 462 g teilhydrolysierter ötärkelösung (32,0 P Trockensubstanz; DA 16,7? pH 5,1 \ 0,02 /o HaN,) bei 5O⁰G wurden 1,13 g immobilisierter Glucoamylase gegeben^ die nach dem Verfahren des Beispiels I hergestellt worden war und eine Potenz von 64,2 (χώ/g aufwies» Dann wurden in die Reaktionsgefäße jeweils 21,8 gf 10,9 g? 5>45 g; 2,72 g°, 1,36 g bzw» 0 g der immobilisierten Pilz-Alpha-Amylase gegeben, die nach den unmittelbar vorgehenden Angaben zubereitet worden war. Die Reaktionsgefäße wurden bei 5O⁰O fortwährend gerührt und der prozentuale Dextroseanteil zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt.

Verzuckerung mit immobilisierter Glucoamylase und immobilisierter Alpha-Amylase aus Bauchspeicheldrüsen

In sechs gerührte tieaktionsgefäße mit jeweils 121 g teilhydrolysierter Stärkelös.ung (33,4 i° Trockensubstanz; DA 16,9? pH 5,1; mit Toluol gesättigt) bei 50⁰G wurden 0,45 g der nach Beispiel I zubereiteten immobilisierten G-lucoamylase mit einer Potenz von 44 GE/g gegeben, dann jeweils 4,82 g; 2,41 gj 1,20 g 0,60 g", 0,30 g bzw, 0 g der nach dem in Beispiel I angegebenen Verfahren hergestellten immobilisierten Alpha-Amylase aus Bauch speicheldrüsen. Die Heaktionsgefäße wurden bei 50⁰G fortwährend

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gerührt und der prozentuale iJextroseanteil in verschiedenen Zeitpunkten bestimmt.

i»ie Ergebnisse dieser Versuche sind in den Tabellen II und III zusammengefaßte

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	Tabelle II	Dextrose-Anteil (fi)	44 Std,	68 Std«»	92 Std·	116 Std.	140 Std.	ι
Verzuckerung mit immobilisierter		74,9	79,1	81,9	83,2	84,7	V» σ>
Verhältnis der Alpha-Amylase-		80,7	84,8	86,7	87,5	89,1	I
Aktivität zur G-lucoamylase- Aktivität (Idqusfon/G-I) ⁺		83,1	86,4	88,2	89,1	90,4
0 (Vergleich)		85,2	88,0	89,9	90,5	91,5
0,62	Glucoamylase und immobilisierter Pilz-Älpha-Amylase	86,8	89,2	90,6	91,2	92,4
1,25		88,8	90,7	92,1	92,2	92,7
2,5	20 Std»
5,0	63,6
10,0	70,0
73,0
76,2
78,6
80,8

) Jedes Reaktionsgefäß enthielt teilhydrolysierte Stärke mit 0,5

	Verzuckerung mit immobilisierter	Tabelle III	Dextrose-Anteil (#) 68 Std· 92 Std.	80,1 90,1	116 Std.	140 Std.	I -j
			77,1 87,7	93,1	81,6 90,8	82,5 91,2	I
	Verhältnis der Alpha-Amylase- Aktivität zur Glucoamylase- Aktivität (Liquefon/GE)⁺		92,0	94,3 95,2	93,7	93,4
	0 (Vergleich) 0,62		93,4 94,6	95,6	94,3 95,2	94,1 94,7
er» ο- co co	1,25		95,2		95,1	95,6
	2,5 5,0	G-lucoamylase und immobilisierter Bauchspeicheldrüsen-
ο· 00 PTV	10,0	Alpha-Amylase
	20 Std. 44 ötd.
	62,1 72,3 69,2 82,7
77,2 88,4
81,8 91,2 85,1 92,9
87,6 94,0

⁺ ) Jedes Reaktionsgefäß enthielt teilhydrolysierte Stärke mit 0,5 Gil/g

Aus diesen Tabellen ist ersichtlich, daß mit zunehmendem Verhältnis der Alpha-Amylase- zur Grlucoamylaseaktivität die Umsetzung schneller und vollständiger erfolgt. Bei den höheren Verhältnissen ist die Differenz der Umsetzung jedoch gering, was darauf hinweist, daß es ein Maximum dieses Verhältnisses gibt, über dem sich keine wesentliche Umsatzzunahme mehr erreichen läßt.

Beispiel III

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung covalent immobilisierter Glucoamylase und verschiedener anderer immobilisierter Enzyme»

Immobilisierung der Glucoamvlase

20 g DEAE-Cellulose (Whatman DE 23) wurden in 500 ml einer IN-NaOH-Lösung geschlämmt, 30 min. bei Umgebungstemperatur gerührt und die Aufschlämmung gefiltert, der Filterkuchen für 1 min. in 30 ml Azeton mit 4,0 g Cyanurchlorid aufgeschlämmt, danach 600 ml einer 20$igen Essigsäurelösung zugegeben» Nach etwa einer Minute wurde die Aufschlämmung gefiltert, der Filterkuchen mit entionisiertem Wasser gewaschen und in 800 ml einer 50-^(v/v)-Mischung von 0,2-M-Tris(hydroxymethyl)aminomethan und 5W-HCl suspendiert. Bach 7-minütigem Rühren wurden der Aufschlämmung 600 ml einer 2G$igen Essigsäurelösung zugegeben und diese eine weitere Minute gerührt, die Aufschlämmung dann gefiltert und der

8098 1 1/08 06

³⁹ " 2B3B322

Pilterkuclien gründlich mit entionisiertem -rfasser und dann mit 500 ml Azeton gewaschene Der Filterkücheη wurde dann im Unterdruck getrocknet; es ergaben sich 19 g filterkuchen.

Der Filterkuchen wurde in 2000 ml einer Glucoamylaselösung (3,8 GE/ml) gegeben, die frei von Transglueosylase und durch gründliche Dialyse eines G-lucoamylasekonzentrats gegen Leitungswasser und dann gegen eine Boratpufferlösung (0,05 ü) mit pH 8,1 hergestellt worden war,, Uach 20-stündigem Rühren bei Umgebungstemperatur wurde die Aufschlämmung gefiltert und der Filterkuchen gründlich mit entionieiertem Wasser gewaschen. Jer feuchte Filterkuchen wurde dann in 500 ml von IM-NaCl suspendiert, 30 min_e gerührt, gefiltert und mit 500 ml einer IM-NaCl-Lösung und dann mit entionisiertem wasser gewaschen. Der Filterkuchen wog 74,3 g und hatte eine Aktivität von 15 Gü/g.

Immobilisierung der Pullulanase

In einer Kultur von Aerobacter aerogenes ATCG 15050 wurde der pH der Kulturbrühe durch Zugabe einer O,2M-Lösung von NaH₂PO, auf 7 eingestellt, der Brühe dann 80 g Triton X-100 (Hohm & Haas) zugegeben, die Brühe 16 Std. bei 35°C vorgehalten, 10 min. bei 18000 g zentrifugiert und der Niederschlag entfernt. Der Überstand hatte eine Pullulanase-Aktivität von 1,07 IJS/ml.

Der pH-Wert eines 4000-ml-Teils des überstände wurde durch Zugabe einer Lösung von 0,2-M-Na₂HPO₄ auf 7,6 eingestellt und dann 6 g

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DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia) zugegeben, die Aufschlämmung 30 min. bei Umgebungstemperatur gerührt, gefiltert, der Filterkuchen mit 1000 ml entionisiertem Wasser gewaschen und dann in 100 ml einer 0,01-M-Phosphatpufferlösung mit pH 7,0 und 5,4 g NaCl suspendiert und 30 min. gerührt. Die Aufschlämmung wurde gefiltert, das Filtrat auf 290 ml durch Ultrafiltration in einer Ultrafiltrierz-elle des Fabrikats Amicon 401 mit einer Membran des Typs XM-fjQ konzentriert und das Filtrat dann gegen entionisiertes Wasser zu einer lösung mit einer Pullulanase-Aktivität von 10,5 IE/ml dialysiert.

80 g öellulosepulver normaler Qualität (Fa. Whatman) wurde in 500 ml einer 5M-ETaOH-Losung suspendiert und 16 Std„ stehen gelassen, der Überstand dann dekantiert und die Cellulose mehrfach mit entionisieftem Wasser gewaschene Der Überstand wurde wiederum abgegossen, die Cellulose gefiltert und in 500 ml entionisiertem Wasser suspendiert, eine 200-ml-Probe der Suspension mit etwa 20 g Cellulose (Trockensubstanz) durch Zugabe einer IM-NaOH-Lösung auf pH 10,5 eingestellt, dann 50 ml einer 5 g Cyanogenbromid enthaltenden Lösung zugegeben und während einer Reaktionszeit von 45 min. der pH-Wert der Mischung durch periodische Zugabe von lM-SaOH-LÖsung im Bereich von 10,0 bis 10,5 gehaltene Die mit Cyanogenbromid aktivierte Cellulose wurde abgefiltert, der Filterkuchen mit 1000 ml entionisiertem Wasser und dann mit 200 ml einer Ö,01M-]Iatriumphosphatpufferlösung bei pH 7,9 gewaschen»

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200 ml des dialysierten Filtrats mit einer Pullulanaseaktivität von 10,5 IE/ml wurden durch Zugabe von 0,2M-Na₂HPO.-Lösung auf pH 7,9 eingestellt, dann 10 g der cyanogenbromid-aktivierten Cellulose zugegeben, die Suspension 16 Std_ö bei einer Temperatur von etwa 3°C gerührt, gefiltert und der filterkuchen mit 50 ml einer lM-NaCl-Lösung gewaschen. Der gewaschene Filterkuchen hatte eine Pullulanase-Aktivität von 80,2 Iü/g»

Immobilisierung verzuckernder Alpha-Amylase

7 g mit Cyanogenbromid aktivierter Cellulose (nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt) wurden in 99 ml einer kalten 0,1M-Phosphatpufferlösung mit pH 8 gegeben, die eine ausreichende Menge zuckerbildender Alpha-Amylase (von B.subtilis var. amylosacchariticus) enthielt, um eine Aktivität von 260 Liquefon/ ml zu erzeugen. Die Suspension wurde 20 Std. auf 5⁰C gerührt, dann gefiltert, der Filterkuchen nacheinander mit einer 0,1M-Phosphatpufferlösung, mit entionisiertem Wasser, mit einer 2#igen Lintnerstärkelösung bei pH 5 und schließlich wieder mit entionisiertem Wasser gewaschen.

Der gewaschene Filterkuchen hatte eine Alpha-Amylase-Aktivität von 74 Liquefon/ge

Einsatz der immobilisierten Enzyme

Vier gerührte ßeaktionsgefäße mit j eweils 400 ml teilhydrolysierter Stärkelösung (25,6 ^Lß> Trockensubstanz·, DA 12,1; pH 5,2) wurden angesetzt, dann die wie oben beschriebenen hergestellten immobilisierten Enzyme in die Reaktionsgefäße gegeben und der .Rührvorgang begonnen. In regelmäßigen Abständen wurden die DA-Werte der umgesetzten Lösungen bestimmt. Nach 70 Std. wurden die G-efäßinhal-te gefiltert, die Filterkuchen gründlich mit entionisiertem Wasser gewaschen und dann in 400 ml teilhydrolysierter Stärkelösung (30,8 $ Trockensubstanz; DA 12,1} pH 5,2; 0,02 M in Acetatpufferlösung) gegeben. In regelmäßigen Abständen wurden die DÄ~Werte der umgesetzten Lösungen bestimmt_o Nach 94 Std, wurden die Gefäßinhalte gefiltert, die Filterkuchen mit entionisierteiE Wasser gründlich gewaschen und dann in 400 ml einer teilhy<ii«ölysierten Stärkelösung (30,8 fö Trockensubstanz; DA 12,1; pH 5,2, 0,02 M in Acetatpufferlösung) gegeben. Die DA-Werte der umgesetzten Lösungen wurden in regelmäßigen Abständen bestimmte Diese Ergebnisse dieser Versuche sind in den Tabellen IV bis VII zusammengefaßt.

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Tabelle I? Zuckerbildung mit immobilisierter G-lucoamylase

O OO OO

Imm. Enzymsystem

10,7 g imm. Glucoamylase (l.Einsatz) mit einer Gesamtaktivität von 160,5 GS

Filterkuchen aus imm· Glucoamylase (2.Einsatz), nach 70 Std. aus umgesetzter Lösung (oben) gewonnen

filterkuchen aus imm· Glucoamylase (3„Einsatz), nach 94 Std. aus umgesetzter Lösung (oben) gewonnen Dextroseäquivalent Stdo 4-6 Std„ 70 Std. 94 Std,

70,3

74,6

74,8

77,8

78,8

82,4

79,8

80,9

84,9

86,5

Tabelle V Zuckerbildung mit immobilisierter G-lucoamylase und Pullulanaee

Dextroseäqulvalent Imm· Bnzymgyatem ■ 22 Std» 46 Std» 70 Std· 94 Std

10,7 g 1mm· Glucoamylase, 0,5 g imm· Pullulaffesamtaktiv!tat 160,5 GI nase, Gesamtaktlvität

» {l»SixuiatB) 4 Il (l.Elneat*) 80,5 85,1 87,1

t£> ■ ''■■. '■■..■' '^:

ao· Pilterkuoheii aus imni. öluooamylase und 3PuIIuIanase

-*■ (2«Binsatz), nach 70 Std· aus umgesetzter Lösung

-*- (oben) gewonnen 80,0 84,4 86,2 87,7

S ,

oo Filterkuchen aus imm«, Glucoamylase und Pullulanase

⁰^ (3_#Einsatz) nach 94 Std· aus umgesetzter Lösung

°> (oben)· gewonnen 79,4 84,2 88,6 .

Tabelle VI

Zuckerbildung mit immobilisierter Glucoamylase, Pullulanase und zuckerbildender Alpha-Amylase

Iran« Enzymsystem

Pilterkuclien aus imm_eGlucoamylase, Pullulanase und Alpha-Amylase (2*3insatz), nach. 70 Std„ aus obiger umgesetzter Lösung gewonnen

Filterkuchen aus imrn, Glucoamylase, Pullulanase und Alpha-Amylase (3«Einsatz), nach 94 Std« aus obiger umgesetzter Lösung gewonnen

Dextroseäquivalent Std. 46 Std. 70 Std. 94 Std.

10,7 g inrauGluco- 0,5 g imm,Pullula- 2,5 g immeAlphaamylase,Ge8amtaknase, Gesamtakti- Amylase, GesamttiTität 160,5 GE vität 4 IE aktivität 18,5

Liquefon 96,9

91»2

96,8

95,0

86,0 92,4

95,8

95>4

93»2

95,4

Tabelle TII

Zuckerbildung mit immobilisierter Glucoamylase und zuckerbildender

Alpha-Amylase

Daxtroaeäquivalent Imm« Emsymsystem ' 22 Std, 46 Std. 70 Std, 94 Std,

10,7 g imm. Glucoamylase 2,5 g imm.Alpha-Amylase

_ mit einer Gesamtaktivität mit einer Gesamtaktivi-

_o von 160,5 GE(leEinsatz) tat von 18.5 Liquefon

α> (1.Einsatz) 95,5 96,4 95,9

Il Filterkuchen aus imnu Glucoamylase und Alpha-Amylase

>^ (2,Einsatz) aus der umgesetzten Lösung (oben) nach

ο 70 Std. 88,4 93,1 94,6 95,1

o* Filterkuchen aus imm_oGlucoamylase und Alpha-Amylase

(3«Einsatz) aus umgesetzter Lösung (oben) nach

94 Std· 83,0 89,4 90,7

Claims

Patentansprüche

m\ ) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose, dadurch gekennzeichnet, daß man eine teilweise hydroIysierte otärkelösung, die mindestens 10 p hydrolysierte Stärke enthält, mit einem ünzymsystem aus immobilisierter Glucoamylase und einer Älpha-Amylase aus der aus löslicher Alpha-Amylase, immobilisierter Älpha-Amylase und deren Mischungen bestehenden Gruppe unter Bedingungen in Berührung bringt, bei denen eine im wesentlichen vollständige Umsetzung der hydrolysierten Stärke zu Dextrose erfolgt·

2o) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzte Alpha-Amylase immobilisierte Alpha-Amylase iste

3e) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Mengen der immobilisierten G-lucoamylase und der Alpha-Amylase derart gewählt sind, daß sich ein Verhältnis der Dextrinieraktivität zur Glucoamylaseaktivität von mindestens 0,2 Liquefon ("liquefons") pro Glucoamylaseeinheit ergibt·

4.) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Mengen der immobilisierten G-lucoamylase und der Alpha-Amylase derart gewählt

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sind, daß das, Verhältnis der Dextrinieraktivität zur Glucoamylaseaktivität mindestens 1 Liquefon pro Glucoamylaseeinheit beträgtβ

5.) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Mengen der immobilisierten Glucoamylase und der Alpha-Amylase derart gewählt sind, daß das Verhältnis der Dextrinieraktivität zur Glucoamylaseaktivität mindestens 3 Liquefon pro Glucoamylaseeinheit beträgt«

6e) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierte Alpha-Amylase aus einer Zubereitung löslicher Alpha-Amylase mit einem S/L-Wert von mindestens etwa 3 hergestellt wird«

7.) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierte Alpha-Amylase aus einer Zubereitung löslicher Alpha-Amylase mit einem S/L-Wert von mindestens etwa 50 hergestellt wird,

8.) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die immobilisierte Alpha-Amylase aus einer Zubereitung löslicher Alpha-Amylase mit einem S/L-Wert von mindestens etwa 1Ό0 herstellt.

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9β) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die teilhydrolysierte Stärke mit einer Mischung von immot>ilisierter Glucoamylase und immobilisierter Alpha-Amylase in Berührung bringt _o

10.) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Alpha- und die Glucoamylase auf oder in dem gleichen Träger immobilisiert sindo

11.) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die teilhydrolysierte Stärkelösung nacheinander mit immobilisierter Glucoamylase, immobilisierter Alpha-Amylase und immobilisierter Glucoamylase in Berührung bringt«

12o) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die teilhydrolysierte Stärkelösung mit einer Snzymbehandlung herstellt und sie ein Dextroseäquivalent von etwa 10 bis etwa 60 aufweist.

13·) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die teilhydrolysierte Stärkelösung durch eine Säurebehandlung hergestellt wird und ein Dextroseäquivalent von etwa 10 bis etwa 30 aufweist.

14·) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur der mit dem

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iSnzymsystem in Berührung gebrachten teilhydrolysierten Stärkelösung etwa 30⁰C bis etwa 60⁰C beträgt.

15o) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-v/ert der mit dem Enzymsystem in Berührung gebrachten teilhydrolysierten Stärkelösung etwa 3*5 bis etwa 6 beträgt.

16t) Verfahren zur Umsetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzymsystem eine immobilisierte Alpha-1,6-G-lucosidase enthält.

17») Verfahren zur Umeetzung von Stärke zu Dextrose nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierte Alpha-1 ,6-Grlucosidase immobilisierte Pullulanase ist«

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