DE2603319C3 - Verfahren zur Fixierung von biologisch aktiven Proteinen an Trägern - Google Patents

Verfahren zur Fixierung von biologisch aktiven Proteinen an Trägern

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    • Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent

Description

R-C = N-R1
Cl r.
worin R und Ri aliphatische, aromatische oder aliphatischaromatische Reste darstellen, von denen wenigstens einer den Molekülteil zwischen dem dem N-Atom einer ursprünglichen sekundären Amino- ><> gruppe benachbarten C-Atom und einer benachbarten Iminchloridgruppe darstellt, und das so erhaltene Produkt
a) in wäßrigem Lösungsmittel direkt mit einem biologisch aktiven Protein umgesetzt wird oder r>
b) mit einer wenigstens eine primäre Aminogruppe enthaltenden bifunktionellen Verbindung, gegebenenfalls in einem wäßrigen oder organischen Lösungsmittel, umgesetzt wird, und das dabei erhaltene Produkt mit Gruppen der to allgemeinen Formel Il
R C=N-R1
NU
worin R2 eine Alkylengruppe, eine Λ,ω-Dioxyalkylengruppe oder eine Dicarbonsäureamidgruppe mit 2 bis 8 C-Atomen und X eine primäre Aminogruppe oder eine zur Protein- 4(1 bindung geeignete Funktion bedeutet, entweder zuerst mit einem bifunktionellen Proteinreagens und danach mit dem Protein oder direkt mit dem Protein zur Reaktion gebracht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- αί zeichnet, daß feste Polymere als Trägermaterialien verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial Polyamide verwendet werden. r>o
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protein als Träger verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Chlorierungsmittel PCI5, PCb, SOCI2, COCl2, POCl2 oder SO2Cl2 verwendet wer- π den.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R und Ri sekundäre Aminogruppen, tertiäre Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen, Sulfhydrylgruppen, Carboxylgruppen, Hydro- mi xylgruppen und/oder lminchloridgruppen enthalten.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß R und Ri geradkettige, verzweigte oder/und cyclische Alkylgruppen bzw. Alkylengruppen mit 1 — 12 C-Atomen, Phenylgruppen bzw. iv> Phenylengruppen oder Alkylphenylgruppen bzw. Alkylphenylengruppen mit bis zu 6 C-Atomen in der oder mehrere sekundäre oder tertiäre Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen oder Iminchloridgi uppen verbunden sind
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Acetalgruppe, Estergruppe, Nitrilgruppe oder Olefingruppe darstellt
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das bifunktionelle Proteinreagens ein Dialdehyd, Dihydroxysuccinimidester, Diacetal, Bismaleinimid, bifunktioneller Iminoester, Diepoxid oder/und Dicarbonsäuredichlorid, Diisocyanat oder/und Diisothiocyanat ist
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Trägermaterial verwendet wird, welches eine mit Polyamidflints, -fasern oder -flocken beflockte Oberfläche aufweist
Aikylgruppc darstelle
miteinande
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Fixierung von Proteinen, insbesondere von biologisch aktiven Proteinen an flüssigen oder festen Trägermaterialien.
Die Fixierung bzw. Immobilisierung von biologisch aktiven Proteinen wie Enzymen, Hormonen, zur Teilnahme an Antigen-Antikörperreakiionen und Hapten-Antikörperreaktionen befähigten Substanzen, Gerinnungsfaktoren und dergleichen, insbesondere im Rahmen der präparativen und der analytischen Chemie, hat in den vergangenen Jahren große Bedeutung erlangt. Es wurden bereits zahlreiche Fixierungsverfahren entwickelt. Trotzdem zeigt es sich, daß ständig neue Fixierungsprobieme auftauchen, die mit den bisher bekannten Methoden nicht befriedigend gelöst werden können. Hierauf ist es auch zurückzuführen, daß bisher trotz der ohne weiteres einsehbaren Vorteile der Fixierung von biologisch aktiven Proteinen an Trägermaterialien auf vielen Gebieten die Einführung der fixierten Proteine in die Praxis nur zögernd erfolgte und sich der erwartete breite Durchbruch noch nicht realisierte.
Hinzu kommt weiter, daß die meisten Immobilisierungsmethoden nur für bestimmte Trägermaterialien brauchbar sind oder die Herstellung des Trägers durch Polymerisation aus wäßriger Lösung in Gegenwart des biologisch aktiven Proteins erfordern (Protein-Copolymerisation), was ebenfalls die brauchbaren Trägermaterialien stark beschränkt.
Von besonderem Interesse als Trägermaterialien für immobilisierte aktive Proteine wären Substanzen, welche sekundäre Aminogruppen enthalten. Hierzu gehören einerseits verschiedene Polymerisate, die sich durch besonders günstige mechanische und chemische Eigenschaften auszeichnen, wie z. B. die Polyamide, Polyurethane, und andererseits polypeptidartige Strukturen, wie Polyaminosäuren und dergleichen. Derartige Substanzen mit sekundären Aminogruppen weisen eine gewisse chemische Ähnlichkeit mit den Proteinstrukturen auf, insbesondere hinsichtlich ihrer Ladungsverteilung, so daß hier negative Auswirkungen auf die biologische Aktivität der daran immobilisierten Enzyme nicht zu erwarten sind oder gering bleiben, soweit keine sonstigen Gruppen darin vorhanden sind, welche besonders nachteilig auf die Aktivität von Proteinen
urch eif.c einw %r\e f
Es ist bereits bekannt daß Imidoester, die sich leicht aus sekundären Aminen erhalten lassen, spezifisch mit den Aminogruppen von Proteinen unter Bildung von Amidinostrukturen reagieren (vgL z.B. Colowick-Ka ρ I an »Methods in Enzymology«, Band 25, Seite 646 bis 648; DE-OS 24 37 870). Es ist auch bekannt daß man Polyamide mit starken Alkylierungsmitteln in die Polyiminoester überführen kann (US-PS 33 40 210). Ein wesentlicher Nachteil derartiger Iminoester für die Proteinfixierung besteht jedoch darin, daß sie in den Lösungsmitteln löslich oder zumindest quellbar sind. Dies führt zu starker Klebrigkeit die insbesondere das Arbeiten mit Granulat Folien, Schläuchen und ähnlichen Formkörpern wegen der auftretenden Verklebung stark erschwert oder gar unmöglich macht Ferner lassen die Aktivitätsausbeuten aufgrund der extremen Hydrolyseempfindlichkeit der Imidoester zu wünschen übrig.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, weiches die Fixierung von biologisch aktiven Proteinen unter Aktivitätserhalt an Substanzen, die mindestens zwei sekundäre Aminogruppen enthalten, ermöglicht und welches die obenerwähnten Nachteile der bekannten Verfahren nicht aufweist.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Proteine, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Verbindung mit mindestens zwei sekundären Aminogruppen bei Temperaturen zwischen —80 und 200C mit einem Chlorierungsmittel umgesetzt wird unter Überführung von sekundären Aminogruppen in Iminchloridgruppen der allgemeinen Formel I
R- C N-R1
Ci
worin R und Ri aliphatische, aromatische oder aliphatischaromatische Reste darstellen, von denen wenigstens einer den Molekülteil zwischen dem dem N-Atom einer ursprünglichen sekundären Aminogruppe benachbarten C-Atom und einer benachbarten Iminchloridgruppe darstellt, und das so erhaltene Produkt
a) in wäßrigem Lösungsmittel direkt mit einem biologisch aktiven Protein umgesetzt wird oder
b) mit einer wenigstens eine primäre Aminogruppe enthaltenden bifunktionellen Verbindung, gegebenenfalls in einem wäßrigen oder organischen Lösungsmittel, umgesetzt wird und das dabei erhaltene Produkt mit Gruppen der allgemeinen Formel II
RC -N-R1
NH R, X
worin R2 eine Alkylengruppe, eine Λ,ω-Dioxyalkylengruppe oder eine Dicarbonsäureamidgruppe mit 2 bis 8 C-Atomen und X eine primäre Aminogruppe oder eine zur Proteinbindung geeignete Funktion bedeutet, entweder zuerst mit einem bifunktionellen Proteinreagens und danach mit dem Protein oder direkt mit dem Protein zur Reaktion gebracht wird.
Die erfindungsgemäße Iminchlorierungsreaktion wird vorzugsweise an flüssigen oder festen Polymeren vorgenommen, welche die sekundären Aminogruppen enthalten. Besonders bevorzugt werden hierunter wiederum die Polyamide wie Nylon und Perlon und ähnliche. Ein anderes Beispiel für sekundäre Aminogruppen enthaltendes Polymer ist Polyurethan.
Die Erfindung ist jedoch nicht auf Polymere beschränkt sondern generell auf alle Verbindungen anwendbar, die als Träger für biologisch aktive Proteine in Betracht kommen und eine Mehrzahl von sekundären Aminogruppen enthalten wie z. B. Peptide.
Bevorzugtes Chlorierungsmittel für die Herstellung des Iminchlorids ist PCI5. Andere geeignete Chlorierungsmittel sind z. B. PCl3, SOCI2, COCI2. POCl3 und SO2Cl2. Die beiden letzteren sind zwar nicht so reaktionsfähig wie PCI5, sie haben gegenüber letzterem jedoch den Vorteil, daß sie flüssig sind und daher ohne Lösungsmittel eingesetzt werden können. Bei der Umsetzung mit PCI5 ist dagegen ein Lösungsmittel erforderlich. Geeignet sind halogenierte Lösungsmittel wie Dichloräthan, Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und ähnliche. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Herstellung des Iminchlorids mit PCI5 in Dichloräthan bei Temperaturen zwischen —38 und 00C Diese bevorzugten Bedingungen lassen sich leicht durch Zugabe von Trockeneis zur Dichloräthanlösung (oder der Lösung in einem anderen halogenierten Lösungsmittel) einstellen. Selbstverständlich sind aber auch andere Kühlungsmethoden geeignet.
R und Ri sind aliphatische aromatische oder aliphatischaromatische Reste. Diese können weitere sekundäre und tertiäre Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen, Sulfhydrylgruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen oder Iminchloridgruppen enthalten. Vorzugsweise bedeuten R und Ri geradkettige, verzweigte oder/und cyclische Alkylgruppen bzw. Alkylengruppen mit 1 — 12 C-Atomen, Phenylgruppen bzw. Phenylengruppen oder Alkylphenylgruppen bzw. Alkylenphenylengruppen mit bis zu 6 C-Atomen in der Alkylgruppe, die miteinander durch eine oder mehrere der vorstehend erwähnten Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen oder Iminchloridgruppen verbunden sind, Peptidketien aus natürlichen und/oder synthetischen Aminosäuren oder dergleichen. Typische Beispiele für Verbindungen, weiche erfindungsgemäß über die Bildung von Iminchloridgruppen mit biologisch aktiven Proteinen gekoppelt werden können, sind 6-Polyamid, 6,6-Polyamid, 6,10-Polyamid, 11-Polyamid, 12-Polyamid, Polycyclamide wie Poly (1,4-cyclohexylendimethylen-superamid), Polydodecanollactam, Wolle, Kasein, Naturseide, Polyarginin und ähnliche. Unter den synthetischen Polymeren werde solche bevorzugt, in denen R und Ri Alkylen- und Cycloalkylengruppen mit 6—12 C-Atomen darstellen, welche durch Amidgruppen miteinander verbunden sind.
Das Iminchlorid kann erfindungsgemäß direkt in einem wäßrigen Lösungsmittel mit dem biologisch aktiven Protein umgesetzt werden. Das biologisch aktive Protein wird dabei zweckmäßig in einem geeigneten wäßrigen Puffer gelöst, mit dem festen Iminchlorid zusammengegeben und abreagieren gelassen. Eine derartige Arbeitsweise empfiehlt sich vor allem dann, wenn das Grundgerüst des Imins verzweigt ist, beispielsweise also bei Polyamiden, die Komponenten mit 3, 4 oder noch mehr Funktionen enthalten. Durch die dort auftretenden sterischen Verhältnisse wird die direkte Reaktion zwischen dem Iminchlorid und dem Protein begünstigt.
Bei geradkettigen Polymeren hingegen erfolgt die
Reaktion mit dem Protein zweckmäßig über eine Zwischenverbindung, welche mindestens eine primäre Aminogruppe enthält (Spacer).
Die primäre Aminogruppe kann direkt mit einem Kohlenstoffatom verbunden sein oder als Hydrazidgruppe vorliegen, also an e;ue Säureamidogruppe gebunden vorliegen. Liegen zwei primäre Aminogruppen vor, so sollen die beiden Aminogruppen vorzugsweise durch eine Alkylen-, α,ω-Dioxialkyien- oder Dicaroonsäureamidgruppe mit 2—8 C-Atomen voneinander getrennt sein.
Wird anstelle eines Diamids ein Monoamid verwendet, so enthält dieses noch eine weitere funktionelle Gruppe, vorzugsweise eine zur Herstellung einer Bindung mit einem Protein geeignete Gruppe. Diese zweite Gruppe der Zwischenverbindung, gleichgültig ob es sich um eine primäre Aminogruppe oder eine andere Gruppe handelt, kann wieder mit einem bifunktionellen Proteinreagens umgesetzt werden, ehe die endgültige Bindung des Proteins erfolgt Derartige Verbindungen sind z. B. Dialdehyde wie Glutardialdehyd, Dihydroxysuccinimidester, Diacetale, Bismaleinimide, bifunktionelle Iminoester wie Diäthylmalonimidat, Dimethyladipinimidat, Diepoxide, Dicarbonsäurechloride, insbesondere «, JJ-ungesättigte Dicarbonsäuredichloride, Diisocyanate, Diisothiocyanate und dergleichen. Sie enthalten zweckmäßig 2 bis 12 C-Atome, können jedoch auch längerkettig sein. Ein solches zweites Zwischenglied kann entfallen, wenn die lminchloridgruppe direkt mit einem heterobifunktionellen Reagens umgesetzt wird, dessen eine Funktion aus der primären Aminogruppe und die andere Funktion aus einer geschützten Funktion besteht, die in freier Form mit Proteinen reagieren kann, z. B. Acetal, sauer bzw. hydrogenolytisch bzw. schwach basisch verseifbare Ester, oder einer unreaktiven Vorstufe für eine solche Funktion wie z. B. Nitril für Iminoester, Olefine zu Epoxiden und andere.
Die Umsetzung des Iminchlorids mit der wenigstens eine Aminogruppe enthaltenden bifunktionellen Zwischenverbindung erfolgt in einem organischen Lösungsmittel, wenn die Zwischenverbindung (Spacer) nicht selbst flüssig ist, anderenfalls zweckmäßig in der Zwischenverbindung selbst als flüssige Phase. Auch eine Umsetzung in wäßrigem Medium ist möglich, da die primäre Aminogruppe rascher mit dem Iminchlorid reagiert als die OH-Gruppe. Ist die primäre Aminogruppe an eine Säureamidgruppe gebunden, handelt es sich also um ein Hydrazid, so wird in Lösungsmitteln wie Dimethylsulfoxid, Formamid und Dimethylformamid gearbeitet. Auch andere stark polare Lösungsmittel können in diesem Falle verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Immobilisierung bzw. die Fixierung biologisch aktiver Proteine an Trägermaterialien, die sich durch einen Gehalt von sekundären Aminogruppen im Molekül auszeichnen, in besonders schonender Weise und unter Erhalt der vorteilhaften Eigenschaften insbesondere der Oberflächeneigenschaften dieser Trägermaterialien. Das Verfahren eignet sich sowohl zur direkten Kupplung der Proteine an die intermediär gebildeten Iminchloridgruppen als auch zur Kupplung der Proteine über Zwischenverbindungen (Spacern), die es erlauben, das Protein in einem gewissen Abstand zum eigentlichen Trägermolekül zu halten.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, eine Trägeroberfläche wie ein Gewebe, Fäden, Reagensgläser oder andere beliebige gewünschte Oberflächen mit einer Kleberschicht zu versehen und nach dem Verfahren der elektrischen Beflockung Polyamidflints, -flocken u.dergi. aufzubringen. Die derartig hergestellte große Oberfläche ergibt dann bei der Proteinfixierung, gemäß Erfindung, eine hohe ί spezifische Aktivität pro qcm des beflockten Trägers.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:
Beispiel 1 und 2
ίο Je 2 Meter Nylon-ö-Schlauch, Innendurchmesser
1 mm werden mit absolutem Methanol und anschließend mit absolutem Methylenchlorid gespült um Feuchtigkeitsspuren zu entfernen. Dann wird der Schlauch auf -40°C vorgekühlt und mit einer -400C
r< kalten 5°/oigen Lösung von PCl5 in CCl4 gefüllt. Die exakte Einhaltung der Temperatur ist nicht kritisch, jedoch werden tiefe Temperaturen ab — 200C bevorzugt Die PCI5-Lösung wird nach 5 Std. abgesaugt und mit trockenem CCI4 wird überschüssiges Reagens
2(i ausgespült. Dann wird Äthylendiamin (bzw. eine 2%ige Lösung von Oxalsäure-dihydrazid in Dimethylsulfoxid) eingefüllt. Nach 2stündigem Stehen mit Amin (bzw. Hydrazid-Lösung) wird der Schlauch über Nacht mit Wasser gespült Dann wird der Schlauch mit absolutem
y, Dioxan gespült, um Wasserreste zu entfernen und eine Lösung von 50 mg Äthylenglykol-bis-propionsäure-bishydroxysucciminidester in 2,5 ml Dioxan + 0,5 ml N-Äthylmorpholin eingefüllt Nach 30 Minuten wird die Lösung abgesaugt und mit 0,1 molarem Triäthanolamin-
Jd Puffer, pH 8,5, gespült Dann wird eine Lösung von 2 mg Glucosedehydrogenase in 1 ml Triäthanolamin-Puffer, pH 8,5, eingefüllt und 3 Std. bei 4" C stehen gelassen. Danach wird mit 5 1 0,1 molarem Triäthanolamin-Puffer, pH 8,5, der einmolar an NaCI ist, gespült. Der Schlauch
π weist anschließend eine Aktivität von !,5 U/m (Aminschlauch) bzw. 1,6 U/m (Oxaisäurehydrazid-Schlauch) auf.
Beispiel 3
■40 2 Meter Nylon-6-Schlauch werden wie in Beispiel 1 aktiviert. Bei der Enzymfixierung wird eine Lösung von
2 mg GOD in 1 ml Phosphat-Puffer, pH 7,8, verwendet und wie in Beispiel 1 anschließend gespült. Wenn mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 7 ml/min getestet
•1 ■. wird, weist der Schlauch eine Aktivität von 1,5 U/m auf.
Beispiel 4
50 g Nylon-6-Granulat werden mit absolutem Methanol und anschließend mit absolutem Methylenchlorid gespült, um Feuchtigkeitsspuren zu entfernen. Das auf -400C vorgekühlte Granulat wird mit einer -400C kalten 5%igen Lösung von PCI5 in CCU versetzt und gerührt. Nach 5 Std. Rühren bei -400C wird abgesaugt und mit trockenem CCI4 überschüssiges Reagens ausgewaschen. Dann wird das Granulat mit einer 20%igen Lösung von Hexamethylendiamin in CH3OH versetzt und nach 2 Sld. abgesaugt. Anschließend wird das Granulat in eine Säule gefüllt und über Nacht mit Wasser gespült. Dann wird das Granulat 12 Min. mit einer 10%igen Glutardialdehyd-Lösung in 0,2molarem Borat-Puffer, pH 8,5, gerührt. Anschließend wird abgesaugt und mit 0,1 molarem Phosphat-Puffer, pH 7,8, gespült. 10 g des aktivierten Granulats werden dann mit einer Lösung von 80 mg GOD in 40 ml 0,1 molarem Phosphat-Puffer, pH 7,8, versetzt und 3 Std. bei 4°C gerührt. Das Granulat wird anschließend in eine Säule gefüllt und mit O.lmolarem Phosphat-Puffer, pH 7,8, der
einmolar an NaCl ist, gewaschen. Das Granulat weist anschließend eine Aktivität von 240 U/g auf.
Beispiel 5
2 m Nylynschlauch. Innendurchmesser 1 mm wurden ai:f -30' C gekühlt und mit einer -300C kalten lOVoigen Lösung von PCI5 in CCL, gefüllt Nach 5 Std. wird mit trockenem Methylenchlorid gespült und sofort anschließend eine wäßrige Lösung von Glucoseoxidase κ; mit einer Konzentration von 5 mg GOD/ml 0,3molarem TRA-Puffer, pH 8,0, eingefüllt Nach 3 Std. bei 4°C wird der Schlauch mit einer 1 molaren Lösung von NaCl in 0,1 molarem Phosphat-Puffer, pH 7,0, gespült Die Aktivität des so hergestellten GOD-Schlauches liegt bei 0,15 U/m, wenn mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 7 ml/min getestet wird.
Beispiel 6
2 in Nylonschlauch werden wie in Beispiel 1 aktiviert Als Spacer wird Bernsteinsäurehydrazid (0,3-proz.-Lösung in Dimethylsulfoxid) und als bifunktionelles Proteinreagens Glutardialdehyd verwendet Zur Fixierung wird eine Lösung von 2 mg Glycerokinase in 1 ml Phosphat-Puffer, pH 7, 8, verwendet und anschließend, wie in Beispiel 1, gespült Wenn mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 7 ml/min getestet wird, weist der Schlauch eine Aktivität von 0,4 U/m auf.
Beispiel 7
5 g Nylon-6-Granulat werden in 20 ml Tetrachlorkohlenstoff suspendiert Dann wird bei Raumtemperatur 25 Minuten lang Phosgen durch die Suspension durchgeper!t, anschließend das Nylongranulat mit Tetrachlorkohlenstoff gewaschen und das erhaltene Nylonpolyminchlorid mit einer Lösung von 10 mg Glucoseoxidase in 10 ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,8, versetzt Das Granulat weist nach Waschen, wie in Beispiel 4, eine Aktivität von 50 U/g auf.
Beispiel 8 (nachgereicht)
Mit Klebstoff versehene und anschließend mit Nylonflints beflockte Fäden werden, wie in Beispiel 1, mit Phosphorpentachlorid aktiviert Als Spacer wird Äthylendiamin und als bifunktionelles Proteinreagens Glutardialdehyd verwendet Zur Fixierung wird eine Lösung von 2 mg GOD in 1 ml Phosphat-Puffer, pH 7,8, verwendet und anschließend gespült Ein cm des beflockten Fadens weist anschließend eine Aktivität von 0,73 U auf. Wird dasselbe Verfahren ohne Verwendung eines Spacers durchgeführt und das aktive Polyiminchlorid-Derivat direkt zur Fixierung der GOD verwendet, so wird nach dem Waschen eine Aktivität von 0,35 U/cm des beflockten Fadens festgestellt
909634/268

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Proteine, daduich gekennzeichnet, r> daß eine Verbindung mit mindestens zwei sekundären Aminogruppen bei Temperaturen zwischen —80 und 200C mit einem Chlorierungsmittel umgesetzt wird unter Überführung von sekundären Aminogruppen in lminchloridgruppen der allgemeinen Formel 1
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