DE2620693A1

DE2620693A1 - Polarographische analyse von cholesterol und anderen makromolekularen substanzen

Info

Publication number: DE2620693A1
Application number: DE19762620693
Authority: DE
Inventors: Jun Leland C Clark
Original assignee: Cincinnati Childrens Hospital Medical Center
Current assignee: Cincinnati Childrens Hospital Medical Center
Priority date: 1976-03-12
Filing date: 1976-05-07
Publication date: 1977-09-15
Also published as: JPS52110691A; CA1033810A; US4040908A; DE2620693C2; GB1541047A; JPS6026978B2

Description

liclier, membranimpermeabler Natur wie hochmolekulare Stärken. oder Proteine, welche einer enzymatischen Reaktion unter Erzeugung von schlieBlich Wasserstoffperoxid unterliegen, können durch Anwendung dieser polarographischen Technik analysiert werden·

Analytischen Techniken für biomedizinische und industrielle Anwendungen sind bisher bereite beträchtliche Anstrengungen und Untersuchungen gewidmet worden. Analytische Techniken sind auf diesen Gebieten der Anwendung, einschließlich der klinischen Diagnose, von entscheidender Bedeutung. Zum Beispiel hat sich während der vergangenen beiden Jahrzehnte der Zusammenhang zwischen Cholesterol, Triglycerid und Arteriosclerose (atherosclerosis) bestätigt und geklärt. Die Ermittlung einer Erhöhung von Cholesterol oder Triglycerid zu Beginn führt zu einer detaillierteren Bewertung der bei Diagnose und Behandlung geeigneten Lipid- und Lipoprotein-Elassen. Screening-Prozeduren zur quantitativen Erfassung des Plasmacholesterols sind äußerst wichtig als erste Näherung zu einer Linderung der Arteriosclerose. Wegen der engen Beziehung von Cholesterol und Arteriosclerose sind mannigfaltige Wege zur Messung des Plasmacholesterols geprüft worden. Zur Zeit sind kolorimetrische Methoden, einschließlich Isopropanolextraktion und Verseifung, weit verbreitet in Gebrauch und automatisiert worden, um eine vernünftige Präzision und Genauigkeit bei einem Durchsatz von 3o Proben pro Stunde zu gewährleisten. Die kolorimetrische Methodik ist teuer, verhältnismäßig unspezifisoh, unterliegt Störungen selbst bei geringfügigen änderungen der Feuchtigkeits- und Bilirubinspiegel und erfordert die Verwendung stark korrodierender Mittel wie konzentrierter Schwefelsäure, Essigsäureanhydrid und Essigsäure. Kolorimetrische Methode" erfordern auch Blutproben von mindestens 5 bis 1o al mit der notwendigen Venipunkt ur.

In jüngerer Zeit sind zwei HauptnMherungen zur Verbesserung der Methodik zur Choleeterolbestimating vorgenommen worden, die die

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Gas-Flüssig-Chromatographie (GLC) und enzymatische Messung benutzen. Die GLC-Techniken sind äußerst spezifisch für Cholesterol, präzise, genau und sehr empfindlich. Es ist keine vorbereitende Extraktion mit organischem Lösungsmittel erforderlich, die Verseifung ist jedoch ein notwendiger Schritt. Die GLC-Methoden sind ebenfalls echte Mikromethoden, die nur 1o bis 5o Mikroliter Plasma benötigen, was noch im Bereich der Eapillarprobennahme liegt. Die GLC-Methoden erfordern dennoch verhältnismäßig teure apparative Ausrüstungen, die automatisiert werden können, und eine erfahrene technische Aufsicht, um die Genauigkeit aufrechtzuerhalten.

Die bisher angewendeten enzymatischen Methoden haben zwei Enzyme, Cholesterol-oxidase (CO) und Cholesterolesterhydrolase (CE) mit kolorimetrischen Techniken kombiniert. Diese kolorimetrischen Methoden beruhen auf der enzymatischen Umwandlung von Cholesterol oder seiner Ester in Cholestenon und Wasserstoffperoxid und der ! anschließenden Reaktion des Peroxids mit verschiedenen Verbindun-; gen unter Erzeugung meßbarer Chromogene oder Fluorogene. !

i Vor etwa 15 Jahren wurde über enzymgekoppelte Elektroden zur pola rographischen Analyse von Substanzen berichtet. Zum Beispiel wird in der eigenen US-PS 3 539 4-55 ein polarographisches Membran-Elektrodensystem und -verfahren zur schnellen und genauen quantitativen Analyse von Substanzen beschrieben, die zuvor bei der direkten Analyse nach polarographischen Methoden Schwierigkeiten bereiteten. Nach der Beschreibung in diesem Patent werden Substanzen mit kleinem Molekulargewicht wie Glucose mit einem polarographischen Membran-Elektrodensystem gemessen. Durch Verwendung von Cellulose oder einer anderen Membran, die für kleine Moleküle wie !Glucose permeabel, für Proteine jedoch impermeabel ist, hält die JMembran Glucoseoxidaee-Ensym auf der Seite der Membran mit der Anode für die Umsetzung mit Glucose. Wenn man daher zum Beispiel leine Blutprobe auf die der Elektrode gegenüberliegende Membraniseite bringt, wobei sich auf der Elektrodenseite der Membran eine !wäßrige Lösung des Enzyms und Sauerstoff befindet, treten die niedermolekularen Materialien wie Glucose aus den Blutproben durch die Membran zur enzymatischen Reaktion in der Umgebung der Elek-

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trode. Nach einer gewissen Zeitspanne ist ein Fließgleichgewicht erreicht, wenn die Wasserstoffperoxidkonzentration der Glucosekonzentration direkt proportional ist, und die Zelle erzeugt einen Stromfluß als Funktion der gebildeten Menge Wasserstoffperoxid, welcher als Anzeige für die vorhandene Menge Glucose dient. Wie in dem Aufsatz des Autors mit Titel "Electrode Systems for Continuous Monitoring in Cardiovascular Surgery", N.Y. Academy of Sciences, Bd. 1o2, S. 29-^(1962), berichtet wird, kann die Clark-Sauerstoffelektrode so angeordnet werden, daß sie gegenüber Glucose empfindlich wird aufgrund der Tatsache, daß Sauerstoff durch enzymatische Umsetzung im Verhältnis zum Glucosegehalt verbraucht wird. Bei einer solchen Anordnung ist die innere Membran für Glucose impermeabel und wird die Reaktion anhand des Sauerstoffabfalls kontrolliert. Diese bisherigen polarographischen Membran-Techniken zur Messung des Nebenproduktes HpOp waren jedoch auf die Messung und Erfassung kleiner Moleküle beschränkt, welche durch die Membran zur enzymatischen Reaktion mit einem auf der Elektrodenseite der Membran enthaltenen Enzym hindurchtreten konnten.

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß eine polarographisehe Membran* anode, selbst wenn sie eine für Makromoleküle impermeable Membran aufweist, wie Cholesterol-Moleküle, für präzise, genaue, empfindliche und spezifische Messungen solcher Makromoleküle eingesetzt werden kann. Insbesondere wurde gefunden, daß, wenn solche Makromoleküle durch mindestens ein Enzym unter Erzeugung von schließlich Wasserstoffperoxid in einer Probenkammer auf der der Elektrode entgegengesetzten Seite der Membran umgewandelt werden, mindestens ein Teil des Wasserstoffperoxids in die Membran diffundiert und in Eontakt kommt mit der Elektrode und der durch die Zelle fließende Strom als Maß für die Geschwindigkeit der Wasser-

stoffperoxid-Bildung und als Anzeige der vorliegenden Menge an !Makromolekülen in dem zu analysierenden Material ermittelt werden: kann.

Ziel und Aufgabe der Erfindung war daher die Entwicklung einer Technik zur quantitativen Analyse von Makromolekülen, deren quan-j

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der
titative Bestimmung nach: polarographischen Membran-Technik bisher nicht für möglich gehalten worden war. Es sind keine Membranen bekannt, welche die gewünschte Permeabilität für Makromoleküle sseigen, um hierdurch die Verwendung bisheriger polarographischer Membran-Techniken zu ermöglichen. Es wurde jedoch gefunden, daß eine Umsetzung zwischen einem Enzym und einem Makromolekül, obwohl nicht durch eine polarographische Membran passierbar, entweder innerhalb der Membran oder in einer solchen innigen Nachbarschaft zur selben eintreten kann, daß die Geschwindigkeit der Bildung von H₂Og durch eine polarographische Anode in genauer Anzeige der vorhandenen Menge des Makromoleküls gemessen werden kann. Ein solches Ergebnis war auf dem Gebiet der polarographischen Membran- -Technik bisher nicht vorhersehbar oder zu erwarten gewesen.

Durch die Erfindung wird ein© Reihe von Vorteilen erreicht. Im Falle des Oholesterols ist, wie oben dargelegt, das heute weit verbreitet angewendete Meßverfahren eine automatisierte kolorimetrische Methode und in der Ausführung teuer, unterliegt Störungen durch eine Reihe üblicher Substanzen und erfordert die Verwendung stark korrodierender Reagentien. Sie benötigt auch Blutproben von mindestens 5 bis 1ο ml ; das Abnehmen solcher Proben ist ziemlich teuer und schmerzhaft. Im Gegensatz hierzu verwendet das erfindungsgemäße Verfahren eine einfache und billige Vorrichtung, erlaubt eine präzise_f genaue, empfindliche und spezifische Messung _ des oholesterols in "Io bis 5© Mikrolitern oder weniger Plasma ohne die Notwendigkeit zur Verseifung, ohne korrodierende Reagentien oder erhebliche technische Erfahrung. Daher sind die Vorbei-: Ie und Vorzüge dieser Erfindung,insbesondere im Hinblick auf die : Bestimmung von Cholesterol, sowohl des gesamten als auch des freien Cholesterols im Plasma,in einzigartiger Weise erheblich leichter zu realisieren. Da das gewünschte Ansprechen der Elektrode von der Messung der Reaktionsgeschwindigkeit und nicht von einer vollständig stöchiometrisch ablaufenden Umwandlung des Cholesteroij.-esters zu Cholesterol und des Cholesterols zu Peroxid abhängt, können die meisten Bestimmungen in weniger als 4 Minuten erfolgen. Somit können Makromoleküle quantitativ erfaßt werden, die bisher durch präzise und schnelle Maßnahmen nicht erfaßbar waren.

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Andere Makromoleküle können nach den Prinzipien dieser Erfindung analysiert werden. Zum Beispiel können Makromoleküle der Stärke durch Amylase und bestimmte weitere hydrolytische Enzyme gespalten werden, worauf die kleineren Nebenprodukte wie Glucose oder Galactose unter Reaktion mit Glucose-oxidase umgesetzt werden können, was wiederum Wasserstoffperoxid für die Bestimmung auf der entgegengesetzten Seite der Membran als Anzeige der vorhandenen Stärkemenge liefert. Die Erfindung schlägt daher ein Verfahren zur quantitativen polarograpMschen Bestimmung solcher Makromoleküle vor«, die durch mindestens ein Enzym unter sohließlicher Erzeugung von Wasserstoffperoxid umwandelbar sind» Zur Klasse solcher Substanzen zählen Sterole, einschließlich Cholesterol, beta-Sitosterol, Oampesterol und Stigmaster©! 5 wS/@tere Makromoleküle wie Polysaccharide, einschließlich Stärken; Proteine, Polypeptide und andere polymere Materialien. Im lalle des E&sjrms Oholesterol-oxidase liegt Spezifität für Sterol© mit eimer &4— oder Δ* 5-Doppelbindung und 3-beta-Hydr©sygruppe as Awning vor. Die enzymatische Methode i ist deshalb sehr spezifisch für Blutcholesterol, da es das vor- ' herrschende 3-beta-Hydroxysterol in menschlichem Blut ist. Andere' Enzym-EskroEolekulare Umsetzungen können jedoch für quantitative

en, !

Beetimaung-'mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgenutzt werden, j

Die Erfindung ist daher ganz allgemein gerichtet auf ein Verfahren zur quantitativen polarograph^ sehen (voltamperemetrischen) •Bestimmung einer Substanz, welche durch mindestens ein Enzym unjter schließlicher Erzeugung von Wasserstoffperoxid umwandelbar list. Eine polarographisohe Zelle ist mit mindestens einer, gegenüber Wasserstoffperoxid empfindliehen Elektrode und einem Elektro-fjlyt ausgestattet. Die Meßelektrode ist hinter einer Membran angeordnet, welche sowohl für Wasserstoffperoxid permeabel als auch jfür die zu bestimmende Substanz impermeabel ist. Mindestens ein ■Enzym ist in der Zelle auf der Probenkammerseite der Membran, !entgegengesetzt zur Elektrode, zur enzymatisohen Reaktion mit der zu analysierenden Substanz unter Erzeugung von schließlich Wasser-f stoffperoxid enthalten. An die Zelle wird ein Potential angelegt, so daß Strom erzeugt wird, der der erzeugten Menge Wasserstoffperoxid proportional ist. In ein· solche polarograph!««!!® Kerntest ze- msⁱä^irse-feGci7l£2j#e^Ic^^

haltenden Materials gegeben zur enzymatischen Reaktion auf der Sei·* te der Membran, die der Elektrode gegenüberliegt, um eine Diffusion mindestens eines Teils des Wasserstoffperoxids in die Membran und zum Kontakt mit der Elektrode zu bewirken. Bann wird der durch die Zelle fließende Strom als Funktion der gebildeten Menge Wasserstoffperoxid und als Anzeige der Substanzmenge in dem Material bestimmt. Der fließende Strom ist ein Maß für die Ge« schwindigkeit der Wasserstoffperoxidbildung mittels enzymatischer Reaktion mit der zu analysierenden Substanz.

Gemäß einer bevorzugten Form zur quantitativen polarographischen Bestimmung von Cholesterol hängt das Verfahren von der nacheinanderfolgenden oder gleichzeitigen Reaktion von Gholesterol-oxidase (00) und Oholesterol-esterase (OE) mit Cholesterol und seinen Estern unter Erzeugung von Cholestenon und Wasserstoffperoxid ab, welches dann mittels einer auf Wasserstoffperoxid ansprechenden polarographischen Platinanode erfaßt wird. Wenn es erwünscht ist, zunächst eine Substanz, wie freies Cholesterol, zu messen,kann das Enzym Cholesterol- oxidase zuerst verwendet ; werden; dann kann eine zweite Substanz wie Cholesterolester unter Verwendung von Cholesterolesterase bestimmt werden, um die j Ester in freies Cholesterol zu überführen. Alternativ können bei4 de Enzyme konzertiert verwendet werden, so daß alle Reaktionen zur gleichen Zeit ablaufen; zum Beispiel liefern Esterase und Oxidase, die gleichzeitig zugesetzt werden, ein Elektrodensignal, daß demjenigen entspricht, welches mit zeitlich getrennter Einwirkung auf das Enzym erhalten wird.

Das Verfahren ist besonders geeignet zur Messung von Cholesterol in Serum, wobei die oben beschriebenen Vorteile erhalten werden. Gemäß einer weiteren Aueführungsfora des Verfahrens können ganze Blutproben analysiert werden. Wenn zum Beispiel Enzym zu der Probenkammerlösung zugesetzt wird, die vollständige Blutproben enthält, führt die hohe Katalaseaktivität des Blutes zur Zerstörung des Wasserstoffperoxids und zwar so schnell,wie es durch die Oxidase gebildet wird. Es wurde gefunden, daß jedoch die Katalaseaktivität von leicht hämolysiertem Plasma durch Anwendung eines

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Mittels wie Natriumazid behoben werden kann. Zum Beispiel kann leicht Mmolysiertem Blut mit etwa 2o - 2oo mg# Hämoglobin Azid oder ein ähnliches Mittel zugesetzt werden, um die Katalaseaktivität au inhibieren. Es wurden auch gefunden, daß das Azid die spontane Zersetzung von Wasserstoffperoxid inhibiert und aufgrund seiner bakterioziden Eigenschaften auch Puffer erhält, der zur pH-Regelung zugesetzt wird. Daher macht das erfindungsgemäße Verfahren neuartige, schnelle Mittel zur Messung von Cholesterol in Plasma und leicht hämolysiertem Plasma möglich.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung können Gesamtblutproben unter Verwendung einer neuen Elektrodenstruktur und eines Verfahrens zur Bestimmung von Makromolekülen nach der polarographischen Membran-Technik analysiert werden. Wie bereits dargelegt wurde, findet die enzymgerichtete Reaktion zur Bestimmung von Cholesterol "außerhalb" der polarographischen Membran statt, d.h. auf der der Elektrode gegenüberliegenden Seite, und das Enzym ist ebenfalls auf jener Seite enthalten. Daher können die Enzyme der Zellösung auf der Membranseite gegenüber der Elektrode zugesetzt werden. Wenn die Enzyme nicht immobilisiert werden, müssen sie nach jeder Messung verworfen werden, was die Kosten für jede Analyse wesentlich erhöht. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung wurde gefunden, daß die Enzyme durch Binden eines oder mehrerer von ihnen an der Außenfläche der Elektrodenmembran oder in der Probenkammer immobilisiert werden können. In dieser Form, mit immobilisierten Enzymen, können die Elektroden erneut verwendet werden; dies ermöglicht die Verwendung von sogar teureren, hochreinen Enzymen, welche auch die Geschwindigkeit und Empfindlichkeit der Elektrode verbessern. Außerdem unterstützt die Immobilisierung als solche die Stabilisierung labiler Enzyme, so daß sie reproduzierbarere Ergebnisse liefern und weniger Kontrollmessungen ausgeführt werden brauchen. Die membranimmobilisierten Enzyme gestatten ebenfalls eine Analyse von Gesamt-» blutproben auf direktem Wege.

Die Erfindung sollte aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den Zeichnungen besser verständlich werden, die die Vorteile

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Al

der Erfindung zu würdigen gestatten.

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer polarographischen Apparatur und weiterer Mittel, die beim Verfahren dieser Erfindung benutzt werden; sie zeigt die Gesamtanordnung des elektrischen Kreises, der polarographischen Zelle und Probenkammer, wobei die Probenkammer teilweise im Querschnitt abgebildet ist.

Fig. 2 zeigt eine wahlweise Ausgestaltung des Typs der in Fig. 1 wiedergegebenen Elektrodensonde und veranschaulicht die Enzymimmobilisierung.

Fig. 3 ist eine polarοgraphische Kurve, die ein Diagramm des Stromes gegen die Zeit für eine Plasmaprobe und eine künstliche Plasmaprobe zeigt.

Fig. 4 zeigt ein Diagramm des Stromes gegen die Cholesterolkonzentration von vorher bestimmten Referenzproben sowohl für die Elektrode des Aufbaus nach Fig. 1 als auch für die Elektrode des Aufbaus nach Fig. 2 mit gebundenem Enzym.

Die Prinzipien der vorliegenden Erfindung lassen sich anhand der Analyse von Plasma auf Cholesterolgehalt erläutern. Der Cholesterolester im Plasma wird durch Oholesterolester-hydrolase (OE) nach der folgenden enzymatischen Reaktion 1 umwandeln:

OE
Oholesterolester + EUO ■■■ ■ Cholesterol + Nebenprodukt säure

Sowohl das aus der obigen Esterreaktion freigesetzte Cholesterol als auch das freie Cholesterol im Plasma reagiert in Gegenwart j von Sauerstoff (O₂) und Cholesterol-oxiäase (CO) unter Erzeugung ι von Cholestenon und Wasserstoffperoxid nach Reaktion 2:

CO
Cholesterol ■ Cholestenon + HgOg !

In der polarographischen Apparatur der Fig. 1 oxidiert die Elektrodensonde 5 einen konstanten !Teil des Wasserstoffperoxids an de|r Platinanode 6, höchst wahrscheinlich gemäß Reaktion 3:

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2H⁺ + O₂ + 2e

Der Kreis wird vervollständigt durch eine Silberkathode 7» an welcher Sauerstoff zu Wasser reduziert wird, höchst wahrscheinlich gemäß Reaktion 4:

4H⁺ + O₂ *- 2H₂O - 4e~

Legt man die obigen Reaktionen den Prinzipien des Betriebs in Fig. 1 der Zeichnung zugrunde, dann ist Fig. 1 eine schematische Veranschaulichung einer Apparatur, die die polarographische Zelle 9 mit Elektrodensonde 5 und Probenküvette oder -kammer 8 wiedergibt. Beim speziellen Betrieb, dessen Beschreibung folgt, wurde ein Glucose-Analyzer der Yellow Springs Instrument Company, modifiziertes Model 25, verwendet. Die Zelle ist mit ihrer eigenen Potentialquelle versehen, welche in diesem Fall eine Batterie 1o ist, die eine angelegte Spannung von etwa o,6 Volt verwendet. Der positive Pol der Batterie 1o ist mit der polarographischen Platinanode 6 verbunden, die einen Front( 11 durchmesser von o,5 mm aufweist, während eine benachbarte Silberreferenzka-

thode 7 eine aktive wirksame Oberfläche 12 von etwa o,5 cm aufweist. Die Maximalleistung liegt in der Größenordnung von 1oo Nanoampere. Ein G-25oo Varian Streifenkartenschreiber, nicht gezeigt, wurde verwendet, um die laufenden Messungen zu machen. Die Elektrodensonde 5 ist nur schematisch abgebildet; sie enthält ein Isolationsträgerglied 13 und die Elektroden sind ebenfalls voneinander isoliert. Die Spitze der Elektrodensonde ist durch eine Cellophanmembran 14 abgedeckt (2,86 cm Dialyseschlauch, A.H. Thomas Co., Eat. Nr. 4465-A2), welcher zum Schütze der Elektro- ; den dient und eine Diffusionsstrecke zu diesen aus der Probenkam-j mer 8 mit einem Volumen von o,4o ml dient, die auf 38° C thermostatisiert ist. Membran 14 ist an der Elektrodensonde durch einen O-Ring 15 befestigt. Die Cellophanmembran 14 ist genügend permeabel, so daß Wasserstoffperoxid, Wasser, Sauerstoff und Salz schnell passieren können, jedoch für das zu messende Material, bestimmte störende Substanzen wie Katalase und das Enzym, welches die Reaktion in Gegenwart von Sauerstoff unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid bewirkt, impermeabel. Auf Seite der Probenkam-

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mer 8 ist eine dünne, für Sauerstoff permeable Membran, z.B. aus Silikonkautschuk, angeordnet, welche den Durchtritt von Luft oder Sauerstoff aus einer Rührpumpe in das in der Probenkammer 8 enthaltene Enzym-Elektrolyt-Gemisch gestattet; das Gas wird über die Belüftung eliminiert. Die aktive Front 11 der Anode ist mit Kapillarabstand von der Gellophanmembran 1A- entfernt angeordnet und befindet sich in Kontakt mit dem Elektrolygemisch. Wie erwähnt, ist die Referenzsilberkathodenoberflache 12 der Platinanodenfront*benachbart angeordnet und steht ebenfalls mit dem El ektroly gemisch in Berührung, (x 11)

Eine Spritze zur Injektion der Plasmaprobe ist zusammen mit dem Puffervorrat, der In^ektionsöffnung, dem Septumcord und der Auswurfentfernung gezeigt, womit das Fließschema der Probenanalyse veranschaulicht ist. Ein typisches schematisches elektrisches System enthält ein Galvanometer 16, welches den Strom mißt, der durch die enzymatisehe Cholesterolreaktion über die Erfassung des Nebenproduktes Wasserstoffperoxid der Reaktion erzeugt wird. Der so erzeugte Strom ist dem Cholesterolspiegel in der Plasmaprobe direkt proportional. Eine weitergehende Beschreibung polarogra- ^hfiischer Elektrodensysteme und ihres Aufbaus der in Fig. 1 per Beispiel gezeigten Art findet sich in der US-PS 3 539 4-55, deren Beschreibung hier als Referenz einbezogen sei. -

Betriebsfähig wird die polarographische Membranapparatur der Fig. 1 zur quantitativen Bestimmung von Cholesterol verwendet, das j mittels eines Enzyms unter Erzeugung von schließlich Wasserstoff-! peroxid umsetzbar ist. Wäßriger Elektrolyt und Pufferlösung wer- j den in die Probenkammer 8 gegeben. Oholesterol-oxidase und Este- j rase-Enzyme werden beide in die Probenkammer 8 auf die der Elek- ⁱ ^6ode entgegengesetzte Seite der Membran 14 gegeben zur enzymatischen Reaktion mit dem Cholesterol in einer Plasmaprobe unter schließlicher Erzeugung von Wasserstoffperoxid. Die zu analysierende Plasmaprobe wird in die Kammer 8 mittels der Spritze durch den Septumgummi gegeben. Sauerstoff wird durch die Rührpumpe übei die permeable Silikonkautschukmembran in die belüftete Probenkammer geliefert. Somit befinden sich der Plasmateil, der das zu ena lysierende Cholesterol enthält, und die Enzyme auf der Seite der

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Membran, die der Elektrodensonde 5 entgegengesetzt ist. Wenn das Cholesterol, sowohl das freie als auch das kombinierte, in dem Plasma mit dem Enzymsystem aus CO und CE in Berührung kommt, findet in Gegenwart von Sauerstoff-wie oben beschrieben- die enzymatische Reaktion unter Erzeugung von Cholestenon und Wasserstoffperoxid statt. Das Wasserstoffperoxid wiederum diffundiert in die Cellophanmembran und kommt in Kontakt mit der Platinanode. Zu diesem Zeitpunkt erfolgen die Reaktionen an der Platinanode und der Silberkathode. Es wird ein Strom erhalten, der durch die Zelle fließt und direkt proportional ist der Menge an diffundiertem Wasserstoffperoxid. Die Bestimmung des durch die Zelle fließenden Stromes durch das Galvanometer 16 ist eine Funktion der gebildeten Menge Wasserstoffperoxid und eine Anzeige für die Menge Cholesterol im Plasma. Die enzymatisch^ Reaktion braucht nicht vollständig zu sein, da die polarographische Anode die Geschwindigkeit der Wasserstoffperoxid-Bildung mißt.

Bei der praktischen Durchführung der zur Zeit bevorzugten rungsform der Erfindung verwendet bei der Bestimmung von Cholesterol die folgenden Materialien und Methoden.

Küvettenreagenz: Die Zusammensetzung des Küvettenreagenzes ist in Tab. I zusammengefaßt. Das pH wurde auf 6,6 unter Verwendung der beiden Phosphatsalze eingestellt.

!Tabelle I

Substanz	Konzentration	Funktion	ί
	g/100 ml
KH₂PO₄ (o,5M)	13,o	Puffer
KoHPO₄ (0,5M)	8,7	Puffer
Natriuaazid	0,07	inhibiert Katalase
Natriumtaurocholat	0,30	Hydrolase-Cofaktor
Triton 1-100	0,05	macht Cholesterol i "löslich"
Kaliumchlorid	1,0	stabilisiert Ag- -Kathode

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Die von den Küvettenreagenzbestandteilen ausgeübten Funktionen sind ebenfalls in Tab. I oben zusammengefaßt. Natriumazid, das als Pufferpräservativ und Katalaseinhibitor verwendet wurde, war auch bei der Stabilisierung von in die Küvette injiziertem Wasserstoffperoxid wirksam. Wie oben dargelegt, war es wegen der hohen Katalasegehalte in Gesamtblut nicht möglich, die Bestimmung mit ungebundenem Enzym weder im Gesamtblut noch in Blut, das stark hämolysiert worden war, durchzuführen.

Enzyme: Cholesterol-oxidase (CO) (Enzyme Commission No. 1.1.3.6) stammte aus Nocardia oder Brevi bacterium sp. . Sas CO wurde durch Lösen von 9*4- I.E. Enzym in 1 ml 1$igem Triton X-1oo (ein nichtionischer Alkaryläther der Rohm & Haas ) rekonstituiert; die Enzymaktivität wird in Internationalen Einheiten (I.E.) wiedergegeben. Cholesterolester-hydrolase (CE) (Enzyme Commission No. 3·1·1·13) wurde aus Rinderpankreas hergestellt und durch Lösen von 9»4· I.E. in 1 ml 1#igem Triton X-1oo rekonstituiert.

Cholesterol-Standards: Cholesterol wurde durch Umkristallisieren aus Aceton und Trocknen über Kieselsäuregel gereinigt. Es wurde in der Lösung eines oberflächenaktiven Mittels unter Verwendung von Branson Model J17A-Sonikatoren emulgiert. Geeignete Standard^ von Cholesterolemulsionen werden hergestellt, die 2oo mg$ in 1#iger Stearatlösung mit einem auf 7»1 eingestellten pH oder 2oo mg# in Triton X~1oo enthalten. Technisch hergestellte Standards) wurden auch zur Ableitung von Verdünnungskurven verwendet. Gepooltes Humanplasma, wiederholt voranalysiert nach der kolorimetrischen Methodik AA-II ("Lipid Research Clinics Program", Manual of Laboratory Operations, National Heart and Lung Institute, Bethesda, Maryland, Bd. 1 , 1974) wurde verwendet, um Standardkurven zur Analyse von Humanplasmaproben abzuleiten.

Vor Analysieren der Humanplasmaproben nach der erfindungsgemäßen Cholesterolelektrodenmethode und zum Vergleich mit der kolorimetrischen Technologie AA-II wurden die experimentellen Bedingungen, einschließlich Enzymkonzentration, Temperatur, pH, Reaktionsdauer, usw. und Einstellungen der Apparaturempfindlichkeit

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einzeln und in Kombination abgestimmt, um die optimalen Bedingungen zu ermitteln, und zwar wie folgt:

Oholeaterol-oxidaae-Konzentrationι Initialstudien über das Ansprechen der Elektrode auf CO-Injektion erfolgten unter Verwendung von 5o /ul Hundeplasma und verschiedener Mengen CO. Die stabilsten und reproduzierbarsten Signale wurde mit o,15 I.E. CO bei einer konstanten Ablesung nach 6 bis 8 Minuten beobachtet. Bei Verwendung größerer Mengen CO (1,93, o,99 und o,522 I.E.) konnte eine Feakaktivität nach entsprechend 2, 3 und 4 Minuten erhalten werden, jedoch unterschied sich das Gesamtelektrodensig·+ nal nicht von dem mit o,14 I.E. beobachteten· Bei Verwendung von 5o All Humanplasma wurde optimales Ansprechen der Elektrode mit 0,15 I.E. beobachtet, wobei größere Mengen Enzym variierende Ergenisse hervorbrachten und kleinere Mengen Reaktionen ergaben, die nicht zu einem stabilen Feakniveau führten. ;

Oholesterol-eaterase-Konzentrationi Unter Verwendung von 5o / Humanplasma und o,15 I.E. 00 wurden Serienstudien mit variieren- j den CE-Konzentrationen durchgeführt. Ein maximales Ansprechen der Elektrode wurde im Bereich zwischen o,o94 und o,4o I.E. festgehalten, wobei die reproduzierbarsten Signalkurven bei o,2 I.E. erhalten wurden. Es wurde auch offensichtlich, daß gleichseitige Injektion von CO und CE die gleichen Ablesungen für das Gesamtcholesterol (innerhalb von 6 bis 8 Minuten) ergaben wie eine getrennte Vorinkubation des OE mit Plasma und anschließende Injektion des Plaaaa-CE-Gemisches zusammen mit 00.

Wirkung der Temperatur: Unter Verwendung von 5o /Ul Plasma und der optimalen Konzentrationen CO (o,15 I.E.) und CS (o,2o I.E.) wurden die Temperatureffekte überschlagen. Bei Temperaturen von oder unter 3o°C waren die Reaktionsgeschwindigkeiten sehr gering (12 bis 15 Minuten bis but Erreichung des Elektrodenpeaksignals) und das Gesamtsignal der Elektrode gering. Obwohl lineare Standardkurven bei diesen niedrigeren Temperaturen erhalten werden könnten, waren diese sehr unverläßlioh, so daß eine mäßige Inderung in der Elektrodenanspreohung große Xnderungen im gemessenen Oholesterolgehalt erzeugten, wenn man

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ablas. Bei 5o°G und 6o°0 waren die Reaktionsgeschwindigkeiten

höher (Peakaktivitäten wurden in 2 Minuten erreicht) bei erhöhten Gesamtablesungen des Elektrometers. Bei diesen !Temperaturen wanderte jedoch das Elektrodensignal, wahrscheinlich wegen der raschen Beschädigung der Cellophanmembranen und des Lösens des ^MO"-Ringes, der die Membran hielt. Bei 38⁰O, der zur Zeit verwendeten Temperatur, waren die Reaktionsgeschwindigkeiten mittelmäßig (4 bis 8 Minuten), die Standardkurven linear und es wurde eine ausgezeichnete Membranhaltbarkeit festgestellt, wobei Membranen für Wochen ohne erforderliche Änderungen aktiv eingesetzt wurden.

pH-Optimum: Die enzymatische Reaktion war über einen breiten pH- -Bereich stabil, wie Tab. II zusammengefaßt wiedergibt.

Tabelle II

Wirkung des pH's auf den Elektrodenstrom in Gegenwart von Hundeplasma und Oholesterol-oxidase sowie zugesetzter Cholesterol-oxidase plus Oholesterolester-hydrolase

	Peak-Met er ablesung	Hydrolase	Verhältnis	2,1o
£H_	Oxidase	322	frei/total	2,3o
3,9	154	346	1	1,95
5,o	153	336	1	2,2o
6,1	172	336	1	2,1o
6,8	153	36o	1	2,1o
8,1	174	375	1	2,1o
8,9	182	4o3	1
1o,7	193	1

Das pH des Eüvettenreagenz wurde mit Phosphorsäure- oder einer konzentrierten Kaliumhydroxidlösung eingestellt. Nach Tüllen der Küvette mit dem geeigneten Puffer wurden 50 /ul Hundeplasma injiziert und nachfolgend 00 zugesetzt. Nach Erreichen eines Peakstromes wurde dann OE injiziert und der Strom erneut aufgezeichnet, nachdem der Peak erreicht und stabilisiert war· Das pH von

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6,6, das bei der schließlichen. Analysenmethode verwendet wurde, wurde aus Zweckmäßigkeitsgründen gewählt.

Nach Herleitung der optimalen Küvettenreagentien, Enzymkonzentrationen und Reaktionsbedingungen wurden die folgenden Messungen des Plasmacholesterols unter Auswertung verschiedener vorher bestimmter oder gewogener Standardcholesterollösungen, Ableitung von Verdünnungskurven und Untersuchungen hinsichtlich der Präzision, Genauigkeit, Empfindlichkeit und Spezifität vorgenommen.

Plasma« Probenherstellung und Analyse: Alle Plasmaproben wurden mittels Venipunktur in EDTA enthaltenden Röhrchen nach 12 bis 14— stündigem Fasten gesammelt und das Plasma durch Zentrifugation bei 4- O abgetrennt. Blut von kleinen Tieren wurde durch Orbitalblutung oder Herzpunktur gesammelt. Die Küvette für den Analysator wurde so angeordnet, daß sie zwischen den Analysen wiederholt mit o,5M Phosphatpuffer bei 38°0 und einem pH von 6,6 gespült wurde. Nach dem Spülen wurde die Küvette entleert und mit Küvettenreagenz gefüllt, das die in Tab. I angegebene Zusammensetzung aufwies. Plasma (2o bis 5o /Ul) wurde dann unter Verwendung einer Mikroliterspritze injiziert, gefolgt von 25 /ul Cholesterol-oxidase (o,15 I.E.) und 2o /Ul OE (o,2o I.E.). Das Elektrodensignal wurde nach #4aes Erhalt einer konstanten Stromablesung (4· bis 8 Minuten) abgelesen. Für Messungen des freien und veresterten Cholesterols wurde das Plasma zunächst injiziert, gefolgt von einer OO-Injektion. Nachdem ein stabiles Stromsignal für freies Cholesterol erhalten worden war, wurde das OE injiziert, wobei ein zweites stabiles Signal für die Cholesterolester erhllten wurde. Nach Analyse der jeweiligen Plasmaprobe wurde die Küvette mit Phosphatpuffer dreimal gespült und die nächste Probe eingegeben.

^! Zu Beginn wurden Gholesterolsuspensionen mit der Apparatur der Fig. 1, wie oben beschrieben, gemessen. Wie Fig. 3 zusammenfaßt,

■ war die polarographische Kurve für kristallines Cholesterol in j 1#igem Triton X-1oo fast identisch mit derjenigen für Plasma.

! Dann wurden Verdünnungskurven unter Verwendung bekannter kristal+ liner Oholesterolproben_in Ilfigeml Triton. XrI.oo (Kurve A) und :

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verdünnter vorher analysierter Standardplasmaproben (Kurve B) erhalten (Pig. 4·). Die Meterablesungen der Fig. 4 repräsentieren lediglich den nichtkalibrierten Stromfluß bei Strompeaks für jede der Proben, aufgetragen gegen den vorher bestimmten Oholesterolgehalt der jeweiligen Probe. Die Verdünnungskurven der Fig. 4· waren äußerst linear (r » o,999» o,993) von 12,5 bis 3oo mg/ioo ml. Demgemäß waren die Stromablesungen dem Cholesterolgehalt der Proben direkt proportional und belegen die Güte der Methode· Da keine künstlichen Emulsionen in zufriedenstellender Weise Plasma simulieren können, erfolgten diese Serienuntersuchungen des Cholesterolgehalts von Humanplasma unter Verwendung vorher analysierter Referenzplasma-Standardproben, die nach der oben genannten kolorimetrischen Methode AA-II gemessen wurden.

Bei der Bestimmung von serienmäßigen Standardverdünnungskurven wurde offenbar, daß eine allmähliche und in den meisten Fällen kleinere Herabsetzung der Empfindlichkeit mit der Zeit eintrat, was zu einer Parallelverschiebung nach unten bei der Standardverdünnungskurve ohne Änderung der Steigung oder Linearität führte. Um genauste und präzise Ergebnisse zu gewährleisten, war es notwendig, täglich zwei oder mehrere Standardverdünnungskurven mit einem gelegentlichen Referenzplasma zu fahren, das den unbekannten Proben zugeordnet wurde, um auf Empfindlichkeit zu prüfen.

Die Präzision der Cholesterol-Elektrodenmethode wurde bewertet, ^;

indem mehrere Aliquote von gepoolten, vorher analysierten Refe- j

renzplasmaproben mit Analysen vom gleichen !Dag und Tagespräzi- ;

sion verwendet wurden. Der Koeffizient vom gleichen Tag für die j

Variation wurde berechnet durch Messen des Gholesterolgehalts !

von 2o Aliquoten von einem einzigen voranalysierten Referenz- \

plasmapool bei einem Gesamtcholesterolgehalt von 23o mg/1oo ml. i

Der Variationskoeffizient betrug 1,3 # für diese Analysen vom j gleichen !Pag. Die Präzision zwischen den !Tagen des Cholesterol-Elektrodensystems wurde bewertet, indem mehrere Aliquote von einem voranalysierten Referenzplasmapool von 23o mg/1oo ml verwendet wurden. Der Variationskoeffizient, gemessen in 2 Aliquot ejx von diesem Pool über einen Zeitraum von 1o !Pagen (2o Proben ins-

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Ä.5L

gesamt) , betrug 1,2 #.

Die Genauigkeit der Cholesterol-Elektrodenmethode wurde bewertet, indem paarweise Vergleiche mit Duplikataliquoten nach der obigen kolorimetrischen Methode AA-II ausgeführt wurden. 12o Plasmaproben, die aus Screening-Studien erhalten wurden, wurden verwendet bei einem Wertebereich für Plasmacholesterol von 126 bis 381 mg/1oo ml. Sie nach den beiden Methoden bestimmten Cholesterolwerte zeigten starke Korrelation (r » o,914, ρ · o,ooi), wobei die mittleren + SEM-Werte für die kolorimetrische und elektrodimetrische Methode 175 + 3»3 und 168 + 2,6 mg/1oo ml entsprechend betrugen. Die mittlere Differenz von 7»o6 mg/1oo ml, wobei die kolorimetrische Methode regelmäßig höher als die Oholesterol-Elektrodenmethode ausfiel, war bei paarweisem Testen der Unterschiede bedeutend (p . o,ooi), stellte jedoch nur eine Differenz von 4- % zwischen den Methoden dar. Wenn 25 AiL einer kristallen Gholesterolemulsion (1oo mg/1oo ml) zu 25 /Ul Plasma (115 mg/1oo ml) gegeben wurden, war die Ausbeut© 97 % der erwarteten Werte.

Methode mit gebundenem Enzym;

Das Verfahren mit gebundenem JS&zjm dieser Erfindung wurde beispielsweise ausgeführt unter Benutzung der Sonde 17 der Pig. 2 mit einer Kollagenmembran 18 und Gluaraldehyd-gebundener Oholesterol-oxidase (00) 19. Nach Einpassen der Kollagenmembran 17 ; über die Elektrode, wie bei Fig. 1 beschrieben, wurde die Membran; vorsichtig mit einer sehr dünnen Schicht aus 25#igem Glutaralde- !

< hyd überzogen. Etwa 2o I.E. kristallines GO wurden dann behutsam ; auf die Oberfläche der mit Glutaraldehyd behandelten Membran gesetzt und ein Tropfen Glutaraldehyd oben über das Enzym gegeben. [ Die Elektrode mit gebundenem Enzym wurde dann 3o Minuten an der Luft getrocknet und in die Küvetteilkammer 8 anstelle der Sonde | von Tig. 1 gesetzt. Bei Verwendung des Membransystems mit gebun- !

I denem Enzym wurden Plasma und OE-wie oben angegeben- injiziert, jedoch ohne zusätzliche Injektion des 00· Tür analytische Zwecke . erfolgte, nachdem einmal eine konstante Ablesung nach dieser In-

■ jektion erhalten worden war, die Standardinjektion des 00, um zu bestimmen, welcher Betrag an Enzym-Subatrat-Reaktivität im überachuß zu derjenigen vorlag, die durch das System mit gebundenem

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Enzym gegeben war. Unter Verwendung des Membransystems mit gebundener Cholesterol-oxidase der Fig. 2 und Injektion von Plasma und Öholesterol-esterase wurde ebenfalls eine lineare Plasmastandardkurve (Kurve G) erhalten (Fig. 4·). Das Elektrometersignal entsprach etwa 1/1o des Signals mit der freien injizierten Oxidase.

Das membrangebundene Enzym bietet unerwarteterweise auch ein Mittel zur direkten Analyse des Gesamtbluts ohne notwendige Katalaseinhibierung. Bei einer solchen Analyse kann die Enzymreaktionsgeschwindigkeit (d.h. ^Og-Bildung), die in oder unmittelbar angrenzend an die Enzymschicht 19 eintritt, an der Anode erfaßt werden, um die Cholesterolgehaltein der Gesamtblutprobe zu ermitteln. Laufende Ablesungen waren möglich, obwohl man erwarten sollte, daß H₂O₂ in die Probenkammer unter Zerstörung durch die Katalase diffundiert.

Unter Anwendung der oben für die Bestimmung des Cholesterols in Blutplasma beschriebenen Techniken wurden analoge Analysen des Blutplasmas anderer Tiere durchgeführt, wie in der folgenden Tab. III zusammengefaßt wird.

	Tabelle III	Cholesterol	Cholesterolester	Min. bis
Tierplasma	Freies	Min. bis	Peak-	Peak
	Peak-	Peak	äblesK.	2,o
	ablesR.	o,5	32o	2,o
Maus	112	o,5	288	3,o
Ratte	55	o,8	314	1.3
Gerbil	99	o,8	289
Kaninchen	9o

Die Analysen einer Reihe weiterer Flüssigkeiten sind in Tab. IV wiedergegeben.

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	Probe	IV	Peak-Met erablesung	ester
Tabelle			Freies Cholesterol Cholesterol-	O
	Eidotter 1/4 mit H₂O			474
Mäusehirnhomogenat 1/6	643	O
Schlagsahne	454	141
Buttermilch mit 3,5 # Fett	34o	94
Creme, kein Lebensmittel	1o2	O
Humansamen	5o	O
Hummerschwanzhomogenat 1/6	215	O
Krabbenhomogenat 1/8	121	O
Krabbensaft	111	O
Austerhomogenat 1/3	122
	89

Die Tabellen III und XV enthalten Strompeakwerte für freies Cholesterol und Cholesterolester in tierischen Blutarten und einer Reihe von Flüssigkeiten. Die Verhältnisse aus freiem zu Estercholesterolgehalt stimmen mehr oder weniger mit aus der Literatur verfügbaren Daten überein.

Wie oben diskutiert wurde, befinden sich die Elektroden in elektrisch isolierter Beziehung zueinander und das Elektrolymaterial füllt die Probenkammer, um einen elektrischen Weg zwischen beiden Elektroden zu liefern. Zu typischen Elektrolyten zählen Natrium- oder Kaliumchloridpuffer, einschließlich Carbonate, Phos-< phate, Bicarbonate, Acetate oder Alkali-oder Seltenerdmetall- oder andere organische Puffer bzw. Gemische derselben. Die Lösungsmittel für einen solchen Elektrolyt können sein Wasser, Glykole, Glycerin und deren Gemische. Die oben beschriebenen Elektroden waren eine Platinanode und damit verbundene Silberkatho- , de, diese sind jedoch nur repräsentativ für weitere Elektroden, j die der Fachmann bei der praktischen Durchführung des erfindungs¹-gemäßen Verfahrens verwenden kann. Neben den oben verwendeten Cellophan- und Kollagenmembranen können andere Membranen benutz

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werden, die für die zu untersuchenden Makromoleküle impermeabel, jedoch für Wasserstoffperoxid permeabel sind. Die Erfindung ist nicht auf eine spezielle Membran beschränkt. Außerdem kann die für Sauerstoff durchlässige Membran, die hier aus einem Silikongummi-Plastikmaterial besteht, durch andere Materialien ersetzt werden,.wie in der US-PS 3 539 4-55 beschrieben.

Obwohl die Merkmale der Erfindung hier im einzelnen anhand der Analyse von Blutproben und anderen flüssigkeiten zur Bestimmung des Oholesterolgehalts derselben erläutert wurdet sollte der !Fachmann sofort erkennen, daß die Erfindung aufgrund der vorliegenden Beschreibung weitere Anwendungsbereiche für andere makromolekulare Materialien zur enzymatischen Reaktion auf der Membranseite der Elektrode erfaßt, wobei das Wasserstoffperoxid-Nebenprodukt der Reaktion durch die Membran zur Erfassung mittels der polarographischen Anode dringt. Abänderungen und Modifizierungen der hier beschriebenen Methoden sind daher möglich, ohne daß von Geist und Ziel dieser Erfindung abzuweichen ist.

Pat entansprüche

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Leerseite

Claims

Patentansprüche

Iy Verfahren zur quantitativen polarographischen Bestimmung einer Substanz, die durch mindestens ein "Enzym unter schließlicher Erzeugung von Wasserstoffperoxid umwandelbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß man an eine polarographische Zelle, die mindestens eine gegenüber Wasserstoffperoxid empfindliche Elektrode, welche hinter einer für Wasserstoffperoxid permeablen und für diese zu messende Substanz impermeablen Membran angeordnet ist, einen Elektrolyten und mindestens ein Enzym auf der Seite der Membran, der Elektrode gegenüberliegend, zur enzymatischen Reaktion mit dieser Substanz unter schließlicher Erzeugung von Wasserstoffperoxid enthält, ein Potential anlegt, so daß ein Strom erzeugt wird, der der Menge des erzeugten Wasserstoffperoxids proportional ist, eine bestimmte Menge des diese Substanz enthaltenden Materials zur enzymatischen Reaktion auf die der Elektrode gegenüberlegende Seite der Membran gibt, um eine Diffusion mindestens eines !Teils dieses Wasserstoffperoxids in diese Membran und in Kontakt mit dieser Elektrode zu bewirken, und den durch diese Zelle fließenden Strom als Funktion der gebildeten Wasserstoffperoxidmenge und Anzeige für die Menge dieser Substanz in diesem Material bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu messende Substanz ein Sterol ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Sterol Cholesterol und das Enzym Oholesterol-oxidase ist. i

4-, Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daßj dieses Sterol ein 5-beta-Hydroxysterol und das Enzym Oholesterol-I -oxidase ist.

5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Material Blutplasma und/oder Blutserum und die zu messende Substanz Cholesterol ist.

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6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß dieses Material zusätzlich Cholesterolester enthält und Cholesterolester-hydrolase-Enzym zugegen ist, um diese Oholesterolester in Cholesterol umzuwandeln.

7· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym auf der dieser Elektrode gegenüberliegenden Seite der Membran immobilisiert worden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym auf der Membran immobilisiert worden ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Material Vollblut ist.

10. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Cholesterol-oxidase und/oder Gholesterolester-hydrolase ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß diese Substanz ein Folysaccharid ist, welches durch die enzymatische Reaktion zu Substraten umgewandelt wird, die durch weitere enzymatische Reaktion schließlich Wasserstoffperoxid erzeugen.

12· Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet ^ daß dieses Polysaccharid eine Stärke ist, die durch enzymatische Reaktion zu einer Mono- und/oder Disaccharid-Verbindung umgewandelt wird, und mindestens ein zweites Enzym zur weiteren enzymatischen Reaktion mit diesem Mono- oder Disaccharid zugegen ist, um schließlich Wasserstoffperoxid zu erzeugen.

1?. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daJ^ diese Elektrode eine Fiatin elektrode ist und die Anode darstellt J

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Silberkathode verwendet.

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15- Verfahren but quantitativen Bestimmung von Cholesterol im Blut, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Blut die Blutplasma- und/oder Blutserumkomponente abtrennt, in eine polarographische Zelle, die mindestens eine gegenüber Wasserstoffperoxid empfindliche Elektrode, die hinter einer für Wasserstoffperoxid permeablen und für Cholesterol impermeablen Membran angeordnet ist, enthält, Cholesterol-oxidase auf die dieser Elektrode gegenüberliegende Seite der Membran gibt zur enzymatisohen Reaktion mit Cholesterol unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid, dieser Zelle Sauerstoff zur enzymatischen Reaktion zuführt, an die Zelle ein Potential anlegt, so daß ein Strom erzeugt wird, der der Menge des erzeugten Wasserstoffperoxids proportional ist, eine bestimmte Menge dieser obigen Komponente zur Reaktion mit dem Enzym zusetzt, um eine Diffusion mindestens eines Seils dieses Wasserstoffperoxids in diese Membran und in Eontakt mit dieser Elektrode zu bewirken, und den durch die Zelle fließenden Strom als Punktion der gebildeten Wasserstoffperoxidaenge und '_; als Anzeige für die Cholesterolmenge in dem Blut bestinutt. ;

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, j daß diese Komponente leicht häaolysiert ist und außerdem ein Antikatalasemittel enthält.

17· Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Mittel Natriumazid ist.

18· Verfahren nach Anspruch 15« dadurch gekennzeichnet, daß man auch Cholesterolester-hydrolase zur enzymatischen Reaktion mit dieser Komponente verwendet.

19« Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die polarographische Zelle eine gegenüber Wasserstoffperoxid empfindliche Platinanode und eine benachbarte Silberkathode enthält.

2o. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß diese Membran eine Cellophanmembran ist.

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21. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym auf der Membranseite, der Elektrode entgegengesetzt, immobilisiert worden ist.

22· Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Cholesterol in Vollblut, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer polarographischen Zelle, die mindestens eine gegenüber Wasserstoffperoxid empfindliche Elektrode enthält, die hinter einer für Wasserstoffperoxid permeablen und für Cholesterol impermeablen Membran angeordnet ist, Cholesterol-oxidase auf der Membran auf der dieser Elektrode gegenüberliegenden Seite zur enzymatischen Reaktion mit Cholesterol unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid immobilisiert, dieser Zelle zur enzymatischen Reaktion Sauerstoff zuführt, an diese Zelle ein Potential anlegt, so daß ein Strom erzeugt wird, der der erzeugten Menge Wasserstoffperoxid proportional ist, eine bestimmte Menge dieses Blutes zur Reaktion mit dem Enzym zusetzt, um eine Diffusion mindestens eines Teils dieses Wasserstoffperoxids in diese Membran und in Kontakt mit dieser Elektrode zu bewirken, und den durch die Zelle fließenden Strom als Funktion der gebildeten Wasserstoffperoxidmenge und Anzeige für die Cholesterolmenge in diesem Blut bestimmt.

23· Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß auch Cholesterolester-hydrolase enthalten ist, die auf dieser Membran auf der dieser Elektrode gegenüberliegenden Seite zur enzymatischen Reaktion mit dem Blut immobilisiert worden ist.

1 Blatt Zeichnungen

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