DE2625834B2 - Verfahren zur Bestimmung von Substraten oder Enzymaktivitäten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Substraten oder Enzymaktivitäten unter Anwendung einer Rexod-Reaktion als Meßreaktion.

In der klinischen und pharmazeutischen Chemie, der Biochemie und der Lebensmittelchemie sind Redox-Reaktionen zur Bestimmung von Enzym- bzw. Substrat-Konzentrationen von großem Interesse. Die Auswertung dieser Reaktionen kann über photometrische Messungen erfolgen. Sind in dem Testsystem neben den interessierenden Redox-Partnern nun noch weitere reduzierende Substanzen vorhanden, so ist mit Störungen zu rechnen. Besonders häufig ist im Probenmaterial Ascorbinsäure anzutreffen. Sie gibt als starkes Reduktionsmittel zu Störungen Anlaß, wenn Pharmaka oder physiologische Flüssigkeiten, wie Harn oder Urin, ascorbinhaltige Pflanzensäfte oder sonstige Lebensmittel, wie Ascorbinsäure enthalten oder denen sie zugesetzt wurde, zur Untersuchung kommen. So ist z. B. 5« bekannt, daß folgende Reaktionen durch Ascorbinsäure gestört werden:

A Reaktionen, bei denen H2O2 und ein Wasserstoffdonator mit Peroxidase (POD) umgesetzt werden, Vi werden durch die Reaktion

Ascorbinsäure + H₂O₂

POD Dchydroascoibinsäure + H₂O

gestört.

B Reaktionen, bei denen Tetrazoliumsalze mit Reduktionsmitteln zu Formazanen reduziert werden, werden durch die Reaktion

Ascorbinsäure + Tetrazoliumsalz

-► Formazan + Dehydroascorbinsäure

ecstört.

C Reaktionen, bei denen Phenole mit nucleophilen Reagentien oxidativ gekuppelt werden, werden dadurch gestört, daß Ascorbinsäure in noch nicht geklärter Weise zu Nebenreaktionen führt, so daß uneinheitliche Kupplungsprodukte entstehen, die in ihrem Absorptionsverhalten in normalem und UV-Licht von den normalerweise gebildeten Kupplungsprodukten abweichen.

Zur Entfernung der Ascorbinsäure aus dem Probenmaterial sind die üblichen Oxidationsmethoden in der Regel ungeeignet. Oxidationsmittel greifen auch Substrate und Enzyme an und zerstoßen sie. Ihre Reduktionsprodukte, meist zwei- oder dreiwertige Metallionen, hemmen häufig die Enzyme, die zur Indikatorreaktion benutzt werden. Die Zerstörung der Ascorbinsäure mit Sauerstoff erfordert stark alkalisches Milieu, z. B. 25proz. NaOH. Das führt ebenfalls zur Zerstörung von Substraten und Enzymen.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung von Substraten oder Enzymaktivitäten unter Anwendung einer Redox-Reak tion als Meßreaktion zu schaffen, welches durch Ascorbinsäure nicht mehr gestört wird.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß dem Reaktionsansatz Ascoroatoxidase zugesetzt wird.

Ascorbatoxidase katalysiert die Reaktion:

Ascorbinsäure + '/, O-,

Ascorb.itoxidase Dehydroascorbinsäure + H₂O

Nach den Angaben der Literatur über Ascorbinsäure-Oxidase war zu erwarten, daß sich dieses Enzym nicht für den erfindungsgemäßen Zweck verwenden läßt. Alle bisher gewonnenen Enzympräparate produzieren nämlich in einer Nebenreaktion H₂O₂. Gleicnzeitig unterliegt die Ascorbatoxidase einer sehr raschen Inaktivierung, welche dem gleichzeitig gebildeten H₂O2 zugeschrieben wird (Biochemical Copper Proceedings Symposium Harriman New York 1965, S. 305—337). Das gilt auch für höchstgereinigte Präparationen, die in der Ultrazentrifuge und bei der Elektrophorese keinerlei Verunreinigungen mehr zeigen (Biochem. 4,

Wasserstoffdonator + Η,Ο·, 1362—1370' [1965]). Die Reaktionsinaktivierung wird auf die H^C^-Bildung zurückgeführt (Biochem. Biophys. Acta 56,427 bis 439 [1962]). Nach den Berechnungen der letzteren Autoren kann 1 U Ascorbatoxidase in 1 mMol/1 Ascorbinsäurelösung 0,7 10~² mMol/1 H₂O2 produzieren. Solche Ascorbat-Konzentrationen sind in Probelösungen häufig vorhanden. Das gebildete H₂O₂ steht ohne weiteres für enzymatische Reaktionen zur Verfügung, wie am Beispiel der Katalase nachgewiesen wurde.

In dem S"stem

POD

Farbstoff + 2 H, O

zum photometrischen Nachweis von H₂O₂ bewirkt es bei einem molaren Extinktionskoeffizienten von ca. 20 ΰΐη²/μΜο1 eine Extinktionsdifferenz von 0,14. Da der Meßbereich normaler photometrischer Reaktionen von ca. 0,01 — 1,00 reicht, wird hier ein untragbarer Fehler hervorgerufen. In gleicher Weise werden Reaktionen gestört, bei denen anstelle von H₂O₂ organische Hydroperoxide und anstelle von POD Hämoglobin oder andere Oxidationskatalysatoren verwendet werden.

Aber abgesehen von diesem durch das H₂O₂ hervorgerufenen Fehler war aus der oben zuletzt angeführten Literaturstelle bekannt, daß die Umsetzung der Ascorbinsäure schon lange vor ihrer vollständigen Entfernung zum Stillstand kommt.

Besonders gravierend mußte dies bei all solchen Redox-Reaktionen sein, bei denen H₂O₂ entsteht, da dieses H₂O₂ je einerseits die Inaktivierung des Enzyms noch beschleunigen mußte und andererseits die Neubildung von H₂O₂ durch die Ascorbatoxidase selbst zu völlig unübersichtlichen Erscheinungen führt. Es ist daher höchst überraschend, daß es entgegen den Erwartungen möglich ist, die auf dem Vorhandensein von Ascorbat beruhenden Störungen durch den Ascorbatoxidasezusatz vollständig zu beseitigen, ohne daß andere Störungen auftreten, die den Vorteil der Ascorbatbeseitigung wieder zunichte machen.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren bei enzymatischen Reaktionen angewendet, insbesondere solchen, bei denen H₂O₂ gebildet wird, also bei Reaktionen, die durch Oxidasen wie Glucoseoxidase, Uricase, Cholesterinoxidase und dergleichen katalysiert werden, ferner bei Reaktionen, bei denen Tetrazoliumsalze reduziert werden und bei Reaktionen, bei denen Phenole mit nucleophilen Reagentien oxidativ gekuppelt werden. Die zugesetzte Ascorbatoxidasemenge richtet sich nach der Höhe der zu erwartenden Ascorbinsäuremenge in der Probe. In der Regel werden 0,002 bis 100 U-Ascorbatoxidase/ml, vorzugsweise 0,01 bis 30 U/ml Testansatz eingesetzt werden. Der pH-Wert der Reaktion richtet sich in erster Linie nach dem pH-Wert, welcher für das oder die anderen beteiligten Enzyme erforderlich ist. pH-Werte zwischen 4,0 und 8,5

Vi erwiesen sich dabei für das Verfahren der Erfindung als geeignet. Besonders bevorzugt wird im Rahmen der Erfindung die Verwendung einer Ascorbatoxidase aus Zucchini (Cucurbita pepo medullosa). Aber auch Ascorbatoxidase anderer Herkunft ist geeignet.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur enzymatischen Bestimmung von Substraten oder Enzymaktivitäten, enthaltend ein System zur Bestimmung eines Substrats oder Enzyms mit einer Redox-Reaiktion als Meßreaktion, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es zusätzlich Ascorbatoxidase enthält.

Reagentien dieser Art enthalten, falls Glucose das zu bestimmende Substrat ist, Peroxidase, Glucoseoxidase, o-Dianisidin oder Azino-di-3-äthylbenzylthiazolinsulfo-

•)0 nat (6) zusammen mit Puffer oder Hexokinase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Diaphorase,

NADP, ein Tetrazoliumsalz wie INT: 3-(4-Jodphenyl)-2-(4-nitrophenyl)-5-phenyI-2H-tetrazoliumchlorid und Puffer. Bei Harnsäure aus dem zu bestimmenden Substrat besteht das System aus Peroxidase, Uricase, einem Phenol wie z. B. 2,4-Dichlorphenol, Aminoantipyrin und Puffer. Im Falle der Glutamatbestimmung besteht das System aus Glutamatdehydrogenase, Diaphorase, NAD, INT und Puffer. Für Tyrosin wird

bo Tyrosinase, S-Methyl-ö-kaliumsulfonyl-benzthiazolonhydrazon (2), (2), für die Brenzcatechinbestimmung Diphenoloxidase, S-Methyl-e-kaliumsulfonyl-benzthiazolonhydrazon (2), jeweils zusammen mit Puffer, verwendet. Alle diese Systeme zur Bestimmung von

b5 Substraten sind aber bekannt. An ihrer Stelle können jedoch auch andere bekannte Systeme zur Bestimmung von Substraten oder Enzymen im Rahmen des erfindungsgemäßen Reagens verwendet werden.

Von besonderer Bedeutung ist die Erfindung auch für die Anwendung auf dem Gebiet der Schnelldiagnostika. Derartige Schnelldiagnostika enthalten in der Regel die verschiedenen, für die Durchführung des Verfahrens benötigten Reagentien entweder in einem saugfähigen ■-> Träger imprägniert oder mit einem geeigneten Bindemittel auf einer Trägerfolie als Überzug aufgebracht. Die bevorzugte Ausführungsform ist hierbei der Zusatz der Ascorbatoxidase zum Gemisch der übrigen Reagenzien mit nachfolgender imprägnation auf einem κι saugfähigen Träger. Auf diese Weise werden z. B. durch Ascorbinsäure praktisch nicht gestörte Testpapiere zum Nachweis von Glucose im Harn (z. B. gemäß DE-OS 23 38 932), von Blut im Harn (z. B. gemäß P 24 60 903-8 oder DBP 22 35 152) und von Blut im Stuhl erhalten, r, Daß die Ascorbatoxidase in den Testpapieren für Blut im Harn funktionsfähig und lagerstabil bleibt, muß als höchst überraschend angesehen werden. Diese Testpapiere enthalten nämlich überschüssige Mengen an organischen Hydroperoxiden, von denen ähnlich wie 2« von H2O2 eine Inaktivierung der Ascorbatoxidase zu erwarten gewesen wäre.

Die Ascorbatoxidase kann aber auch auf einem getrennten Träger aufgebracht werden, der mit dem Träger der übrigen Reagentien vereinigt, beispielsweise darübergelegt, verklebt oder gemeinsam eingesiegelt wird. Besonders bevorzugt als Träger für die Ascorbatoxidase wird in diesem Falle ein sogenanntes wasserlösliches Papier (z. B. gemäß DE-OS 24 36 598), das die Farbreaktion auf dem Trägerpapier der anderen jn Reagentien besonders gut erkennen läßt. Diese Ausführungsweise ist besonders dann von Vorteil, wenn in der Reagentienkombination Substanzen vorhanden sind, die mit der Ascorbatoxidase unverträglich sind, beispielsweise stark saure Reagentien, wie sie bei den J5 Verfahren zur Bestimmung von Urobilinogen, Bilirubin und Nitrit verwendet werden.

Bei den obigen Ausführungsformen werden bis zu 5000 U Ascorbatoxidase pro ml Imprägnierlösung, vorzugsweise bis 2000 U/ml Imprägnierlösung für die 4η Reagensherstellung eingesetzt. Weniger als 1 U/ml werden im allgemeinen nicht den angestrebten Effekt sicherstellen.

Weiterhin können auch getrennte Zonen des Trägermaterials mit der Ascorbatoxidase bzw. den anderen Testreagentien imprägniert werden. In diesem Falle wird zweckmäßig der Träger mit der zu untersuchenden Lösung derart in Berührung gebracht, daß die Lösung zuerst mit der ascorbatoxidasehaltigen Zone in Berührung kommt und von dort aus in die Zone gesaugt wird, welche die übrigen Testreagentien enthält.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Ascorbatoxidase nach den bekannten Methoden der Enzymfixierung an unlöslichen Trägern am Trägermaterial gebunden. Geeignete Methoden sind bekannt aus

DE-OS

17 68 512

21 28 743

22 60 185

22 60 184
24 26 988
26 03 319
19 15 970.

60

Methoden, für das das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet ist, sind die Glucosebestimmung mit Peroxidase und Glucoseoxidase und o-Dianisidin oder 2,2'-Azino-di-3-äthylbenzthiazolinsulfonat-(6) (ABTS), die Glucosebestimmung nach der Hexokinase/Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Methode, der Nachweis von Harnsäure mittels Phenol, Aminoantipyrin, Peroxidase und Uricase, die Bestimmung von Thyrosin ode Brenzcatechin mittels SMBTH (4-Methyl-6-kaliumsul fonyl-benzthiazolonhydrazon(2) und Thyrosinase bzw Diphenoloxidase.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Bestimmung von Glucose mit o-Dianisidin, Peroxida se (POD) und Glucoseoxidase (GOD), gemessen in Photometer, Wellenlänge 432 nm, Meßtemperatur 25⁰C.

Küvette Nr.
1 2

Phosphatpufier 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 pH 7,01 M

o-Dianisidin 0,1 0,1 0,! 0,1 0,1

5 mg/ml

POD, 180 U/ml 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 Glucose Lösung 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 1 mg/ml

Ascorbinsäure- - 0,1 0,01 0,1 0,01 lösung 10 mM

Wasser 0,12 0,02 0,11 - 0,09

Ascorbat-Oxidase - - - 0,02 0,02 500 U/ml

1 Min. bei 25 C inkubieren, £, ablesen, dann starten mil GOD 70 U/ml 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 30 Min. bei 25 C inkubieren, E₂ ablesen, aus E₂-E, da; A E berechnen

AE 0,541 0,010 0,316 0,540 0,543

Küvette 1 entspricht einer ungestörten Messung (keine Ascorbinsäure).

Küvette 2 und 3 zeigen, daß 1 bzw. 0,1 μΜοΙ Ascorba den Test praktisch vollständig bzw. zu 41,5% hemmen Küvette 4 und 5 zeigen die vollständige Entstörung dieser Ascorbat-Konzentrationen durch Zusatz von j£ 10 U Ascorbat-Oxidase.

Beispiel 2

Nachweis von Glucose mit 2,2'-Azino-di-[3-äthyl benzthiazolinsulfonat(6)] (ABTS), POD und GOD in Photometer, Wellenlänge: 432 nm, Meßtemperatur 25° C.

Küvette Nr.

12 3 4 5

PhosphatpufTer 2,75 2,75 2,75 2,75 2,75 pH 5,6 0,1 M

ABTS 50 mM 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 POD 250 U/m I 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 Glucose-Lösung 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 mg/ml

Ascorbinsäure- - 0,1 0,01 0,1 0,01 Lösung 1 mM

Wasser 0,12 0,02 0,11 - 0,09

Fortsetzung

Küvellc Nr.
I 2

Ascorbat-Oxidase - - - 0,02 0,02 500 U/ml

1 Min. bei 25 C inkubieren, E\ ablesen, starten mit
GOD 70 U/ml 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

30 Min. bei 25 C inkubieren, E₂ ablesen, aus E₂-E\ das Δ Ε berechnen

AE 0,505 0,000 0,40 0,502 0,504

Küvette 1 entspricht einer ungestörten Messung (kein Ascorbat). Küvette 2 und 3 zeigen, daß 0,1 bzw. 0,01 μΜοΙ Ascorbat den Test vollständig bzw. zu 21% hemmen.

Küvette 4 und 5 zeigen die vollständige Entstörung dieser Ascorbat-Konzentrationen durch je 10 U Ascorbat-Oxidase.

Beispiel 3

Nachweis von Harnsäure mittels Phenol, Aminoantipyrin, POD und Uricase am Analysenautomaten (Auto-Analyzer).

Testprinzip

Harnsäure + O₂ + H₂O
Uricase

30

> Allantoin + H₂O₂

2H₂O₂ + 2,4-Dichlorphenol + 4-Aminoantipyrin
POD

35

40

45

► Chinoider Farbstoff + 2 H₂O

Herstellung der Lösungen

1 Ascorbat-Oxidase-Reagens

In 600 ml bidest. Wasser wird der Inhalt einer Flasche 1 gelöst. Zusatz von 0,3 ml Detergenz auf Basis Polyäthylenglykol-lauxyläther. In dunkler Flasche bei ca. 4⁰C vier Wochen, bei ca. 25° C eine Woche haltbar.

50

2 Uricase-Reagens

In 800 ml bidest. Wasser wird der Inhalt einer Flasche 2 gelöst. Zusatz von 2,0 ml Detergenz auf Basis Polyäthylenglykol-Iauryläther. In dunkler Flasche bei ca. 4° C vier Wochen, bei ca. 25° C eine Woche haltbar.

Konzentrationen der Lösungen

1 50 mM Phosphatpuffer, pH 5,6 f>o Ascorbat-Oxidase > in den aus Fig.2 der Zeichnung ersichtlichen Mengen.

2 31 mM Tris/Citronensäure, pH 8,9

Uricase» 0,08 U/ml POD > 0,015 U/ml

3,0 mM 2,4-Dichlorphenol, 4,0 mM 4-Aminoantipyrin

Zur Durchführung der Bestimmung wird das Schlauchsystem des Automaten gemäß dem in F i g. 1 der Zeichnung dargestellten Fließschema zusammengestellt.

ι F i g. 2 der Zeichnung faßt in graphischer Darstellung die Ergebnisse der Versuche zusammen

Beispiel 4

Nachweis von Glucose mit HK/G6P-DH, NADP, in INT und Diaphorase im Photometer. Meßwellenlänge: 492 nm, Inkubationstemperatur: 25°C.

Küvette Nr.

1 2 3

Phosphatpuffer, pH 7,5 0,1 M

NADP/INTje 1 mg/ml

Diaphorase 5 U/ml

Glucose-Lösung 0,05 mg/ml

Ascorbat-Lösung 10 mM

Ascorbat-Oxidase 35 U/ml

Wasser

3 Min. bei 25 C inkubieren, E₁ ablesen, starten mit

HK/G6P-DH-Lösung 0,05 0,05 0,05

je 56 U/ml

15 Min. inkubieren, E₂ ablesen, aus E₂-E^ das AE berechnen

A E 0,234

1,7	1,7	1,7
0,1	0,1	0,1
0,1	0,1	0,1
0,1	0,1	0,1
—	0,01	0,01
-	-	0,03

0,04 0,03

0,307 0,230

Küvette 1 entspricht einer ungestörten Messung.

Küvette 2 zeigt, daß 0,01 μΜοΙ Ascorbat den Test um 34% zu hoch ausfallen läßt, Küvette 3 zeigt, daß 1 U Ascorbat-Oxidase diese Störung völlig beseitigt.

Beispiel 5

Bestimmung von Glutamat mittels GlDH, NAD/INT/ Diaphorase im Photometer. Meßwellenlänge 492 nm, Temperatur 25° C.

Küvette Nr.

1 2 3

Phosphatpufier, 1,30 1,20 1,29 1,18 1,27 pH 5,6, 0,01 mM

Glutamat-Lösung 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 mg/ml

Ascorbat-Lösung - 0,1 0,01 0,1 0,01 5mM

Ascorbat-Oxidase - 0,02 0,02

100 U/ml

3 Min. bei 25 C inkubieren, dann in die einzelnen Küvetten pipettieren

,0

0,2 M TRA,
0,05 M Kaliumphosphatpuffer,
pH 8,6 mit 1,5%
Detergenz auf
Basis Polyäthylenglykolalkyl-
phenyläther

NAD-Lösung,
5 mg/ml

1,0

1,0 1,0 1,0

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Fortsetzung

Küvette Nr.
I 2

Diaphorase- 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05

Lösung 10 U/ml

GlDH 1000 U/ml 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 E_x ablesen, Reaktion starten mit

INT-Lösung, 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 2 mg/ml

15 Min. bei 25 C inkubieren, E₂ ablesen, aus E₂-E_x das A E errechnen

AE 0,184 1,560 0,380 0,186 0,182

2,77	2,77
0,05	0,05
0,1	0,1
0,02	-
-	0,02
0,05	0,05

1,113 0,728 1,100

PhosphatpulTer, 0,25 M pH 5,2 2,80 2,70 2,68 SMBTHO₁I 0,05 0,05 0,05

Brenzcatechin 0.5 M 0,10 0,10 0,10

10

Phosphatpufler, pH 5,2, 0,25 M 2,77

SMBTH 0,1 M 0,05

Ascorbinsäure-Lösung 1OmM -

Wasser 0,12

Ascorbat-Oxidase 500 U/ml

Tyrosinase 60 U/ml 0,05

1 Min. bei 25 C inkubieren, E₁ ablesen, starten mit

Tyrosin 2 mM 0,05 0,05 0,05

1 Std. bei 25 C inkubieren, E₂ ablesen, aus E₂-E₁ das A E berechnen

Küvette 1 entspricht einer ungestörten Messung, in Küvette 2 erniedrigt 1 μΜοΙ Ascorbat den theoretischen Wert um 35%, in Küvette 3 ist diese Störung durch 10 U Ascorbat-Oxidase völlig beseitigt.

Beispiel 7

Bestimmung von Brenzcatechin mit SMBTH und Diphenol-Oxidase

Küvette Nr.

I 2 3

Küvette Nr.

1 2 3

Küvette 1 entspricht einer ungestörten Messung.

Küvette 2 und 3 zeigen, daß 0,5 bzw. 0,05 μΜοΙ Ascorbat den Test urrl 700 bzw. um 100% zu hoch ausfallen lassen.

Küvette 4 und 5 zeigen die völlige Beseitigung dieser Störung durch 2 U Ascorbat-Oxidase.

25

Beispiel 6

Bestimmung von Tyrosin mit 3-Methyl-6-kaliumsulfonyI-benzthiazolon-hydrazon-(2) (SMBTH) und Tyrosinase im Photometer, Meßwellenlänge 492 nm, Meßtemperatur25°C.

Küvette Nr.

12 3,,

Ascorbat-Lösung 20 mM - 0,1 0,1

Ascorbat-Oxidase 500 U/ml - - 0,02

1 Min. bei 25 C inkubieren, E_x ablesen, starten mit
Diphenol-Oxidase 200 U/ml 0,05 0,05 0,05

17 Min. bei 25 C inkubieren, E₂ ablesen, aus E₂-E_x das A E berechnen

AE 0,890 0,485 0,896

Küvette 1 entspricht einer ungestörten Messung.

In Küvette 2 erniedrigen 2 μΜοΙ Ascorbat den theoretischen Wert um 47%, diese Störung ist in Küvette 3 durch 10 U Ascorbat-Oxidase völlig beseitigt.

Beispiel 8
Testpapier zum Nachweis von Glucose im Harn

Filterpapier wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt und bei 50° getrocknet:

l,2mCitratpuffer,pH5 50,0 ml
9-(y-Dimethylaminopropyi)-6-chlor-

3-aminocarbazol-dihydrochlorid 0,75 g

Glucoseoxidase (104 U/mg) 0,25 g

Peroxidase (63 U/mg) 0,05 g

Ascorbatoxidase (100 U/mg) 1,00 g

Wasser 100,0 ml

Das Testpapier reagiert mit glucosehaltigen Urinen mit rotorangen bis schwärzlichroten Farbtönen. Nach einer Reaktionszeit von 2 Min. geben Urine gleichen Glucosegehaltes mit Ascorbinsäuregehalten bis zu 150 mg/dl praktisch gleiche Reaktionsfarben.

Mit Testpapieren analoger Zusammensetzung, aber ohne Ascorbatoxidase, sind je nach Glucosegehalt die Reaktionsfarben bei Ascorbinsäurekonzentrationen ab 50 mg/dl abgeschwächt oder völlig unterdrückt.

Beispiel 9
Testpapier zum Nachweis von Blut im Harn

Filterpapier wird nacheinander mit folgenden Lösungen imprägniert und bei 40° getrocknet.

Lösung 1

1,2 m Citratpuffer, pH 5,25
Äthylendiamintetraessigsäure,

35,0 ml

Dinatriumsalz	0,1g
Dioctylnatriumsulfosuccinat	0,5 g
2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid
(ca. 70% ig)	1,6 g
Phosphorsäuretrimorpholid	12,7 g
Ascorbatoxidase (100 U/mg)	0,3 g
Methanol	30,0 ml
Wasser	ad 100,0 ml
Lösung 2
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin	0,3 g
Phenanthridin	0,2 g
Toluol/Petroläther(30 :70)	ad 100,0 ml

b5 Mit diesem Testpapier kann die Anwesenheit von 5 Erythrozyten/mm³ im Harn auch in Gegenwart von 30 bis 50 mg Ascorbinsäure/100 ml nachgewiesen werden.

Mit einem Testpapier gleicher Zusammensetzung, aber ohne Ascorbatoxidase gelingt dieser Nachweis schon in Gegenwart von 10—20 mg Ascorbinsäure/100 ml nicht mehr.

Beispiel 10

Testpapier A
Testpapier wie Beispiel 9, ohne Ascorbatoxidase.

Testpapier B

Wasserlösliches Papier aus Carboxymethylcellulose (Flächengewicht 60 g/m²) wird mit einer Lösung von 20% Eisessig in Methanol zwecks Neutralisation getränkt und getrocknet. Danach wird mit einer wäßrigen Lösung von Ascorbatoxidase (10³ U/ml) besprüht und gleich getrocknet.

Testpapier B wird auf Testpapier A gelegt und beide werden zusammen zwischen einer Polyesterfolie und einem Nylonnetz eingesiegelt. Der zu untersuchende Urin wird auf den so hergestellten Teststreifen aufgetropft.

Die Ergebnisse entsprechen denen von Beispiel 9.

Beispiel 11
Testpapier zum Nachweis von Blut im Stuhl

Filterpapier wird nacheinander mit folgenden Lösungen imprägniert und bei 40° getrocknet.

Lösung 1

1,2 m Citratpuffer, pH 5,25
Ascorbatoxidase 100 U/mg
ίο Wasser

Lösung 2

Guajakharz
Toluol

10ml
0,3 g
ad 100,0 ml

3g
ad 100,0 ml

Die Lösung wird filtriert und nur das Filtrat zur Imprägnierung verwendet.

Man erhält ein Testpapier, welches mit Stuhl bestrichen wird. Wird auf die Rückseite eine 3%ige wäßrige Lösung von Wasserstoffperoxid getröpfelt, so erhält man eine blaue Färbung, wenn der Stuhl ca. 2% Blut enthält. Diese Färbung tritt auch bei ascorbinsäurehaltigen Stühlen (ca. 15 mg/100 g) auf, während sie in diesen Fällen bei einem Testpapier ohne Ascorbatoxidase ausbleibt.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (18)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Substraten oder Enzymaktivitäten unter Anwendung einer Redox-Reaktion als Meßreaktion, dadurch gekennzeichnet, daß in Anwesenheit von Ascorbatoxidase gearbeitet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 0,002 bis 100 U Ascorbatoxidase/ml Testansatz eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ascorbatoxidase zusammen mit einem H2O2 bildenden Enzym eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ascorbatoxidase zusammen mit einem Tetrazoliumsalz eingesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ascorbatoxidase zusammen mit einem Phenol, welches mit nucleophilen Reagenzien oxidativ gekuppelt werden kann, eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß bei pH-Werten zwischen 4,0 und 8,5 gearbeitet wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Ascorbatoxidase aus Zucchini (Cucurbita pepo medullosa) verwendet wird.

8. Reagens zur enzymatischen Bestimmung von jo Substraten oder Enzymaktivitäten, enthaltend ein System zur Bestimmung eines Substrats oder Enzyms mit einer Redox-Reaktion als Meßreaktion, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich Ascorbatoxidase enthält. v-,

9. Verwendung des Reagens nach Anspruch 8 für die Glucosebestimmung.

10. Verwendung des Reagens nach Anspruch 8 zur Harnsäurebestimmung.

11. Verwendung des Reagens nach Anspruch 8 zur Glutamatbestimmung.

12. Verwendung des Reagens nach Ansprucn 8 zur Tyrosinbestimmung.

13. Verwendung des Reagens nach Anspruch 8 zur Brenzcatechinbestimmung.

14. Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das System zum Nachweis eines Substrats und die Ascorbatoxidase auf einem saugfähigen Trägermaterial, vorzugsweise Papier, imprägniert vorliegen.

15. Reagens nach Anspruch 14, bestehend aus einem mit Glucoseoxidase, Peroxidase, Ascorbatoxidase, ^(y-DimethylaminopropylJ-ö-chlor-S-aminocarbazolsalz und Puffer imprägnierten Trägerpapier.

16. Reagens nach Anspruch 14, bestehend aus mit Äthylendiamin-tetraessigsäuresalz, Dioctylnatriumsulfo-succinat, 2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid, Phosphorsäuretrimorpholid, Ascorbatoxidase, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, Phenanthridin und Puffer imprägniertem Papier.

17. Reagens nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Ascorbatoxidase auf einem wasserlöslichen blattförmigen Trägermaterial, das System zur Bestimmung eines Substrats auf einem wasserunlöslichen blattförmigen, saugfähigen Trägermaterial imprägniert vorliegt und das wasserlösliche und das wasserunlösliche Trägermaterial aufeinandergeschichtet sind.

18. Verwendung eines Reagens nach Anspruch 14, bestehend aus mit Ascorbatoxidase, Guajakharz und Puffer imprägniertem Papier zum Nachweis von okkultem Blut durch Farbentwicklung bei Zusatz von H2O2.