DE2638764C3

DE2638764C3 - Verwendung eines Austauscherharzes zum Auftrennen von Proteinen

Info

Publication number: DE2638764C3
Application number: DE2638764A
Authority: DE
Inventors: Francois Palaiseau Meiller; Bernard Fresnes Mirabel
Original assignee: Rhone Poulenc Industries SA
Current assignee: Rhone Poulenc Industries SA
Priority date: 1975-08-28
Filing date: 1976-08-27
Publication date: 1981-02-12
Also published as: DK389176A; DE2638764A1; YU209676A; SU688124A3; AU1721776A; SE7609479L; JPS5257200A; DE2638764B2; NL7609562A; MX4333E; IE43536B1; CH602780A5; DK156577B; NL178294C; CA1069843A; DK156577C; US4100149A; NZ181884A; AR209193A1; RO78229A

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Austauscherharzes mit bestimmten Eigenschaften zum Auftrennen von Proteinen.

Die Auftrennung von Proteinen mittels Ionenaustausch ist bereits bekannt Man verwendet hierzu Cellulose oder Dextran mit darauf fixierten bzw. gebundenen teit Aminen oder quaternären Ammoniumgruppen oder Säuregruppen. Diese Ionenaustauscher besitzen aber keine mechanische Festigkeit und können infolgedessen nicht in Säulen oder Kolonnen eingesetzt werden; ihr Volumen verändert sich je nach lonenstärke und pH-Wert des Gebrauchsmediums. Außerdem sind diese Ionenaustauscher biologisch abbaubar und können nicht sterilisiert werden.

0*3 aus der DE-OS 1951 222 bekannte Füllmaterial für chromatographische Säulen besteht aus oberflächlich porösen Makroteilchen, die aus einem undurchlässigen Kern und einem porösen Überzug aufgebaut sind. Der Kern besteht aus anorganischem Material, vorzugsweise Glas und kann 5 bis 500 μΐη weite Kapillare aufweisen. Der poröse Überzug besteht aus aufeinanderfolgenden Monoschichten jeweils entgegengesetzt geladener Mikroteilchen, die nacheinander aufgebracht werden, bis die gewünschte Schichtdicke erreicht ist Die spezifische Oberfläche eines solchen Materials beträgt etwa 0,5 mVg. Verwendet werden soll dieses Fallmaterial für die analytische Chromatographie, z. B. zur Trennung von Nucleotidsystemen. Für die präparative Chromatographie eignet es sich nicht, weil die Bindungen, die die Mikroteilchen des porösen Überzugs zusammenhalten, nicht beständig genug sind für starke Beanspruchung durch große Mengen Lösung und Elutionsmittel.

Auch die aus »Nature«, Bd. 207 (1965), Seite 402-3 bekannten Perlen aus vernetzten! Polystyrol mit Ionenaustauschergruppen an der Oberfläche werden für die analytische Chromatographie eingesetzt Ihre Wirksamkeit wurde mit 1 bis 10 μΙ Mengen von Lösungen von Metallverbindungen oder Farbstoffen getestet

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, für die Aüftferinüng von Proteinen ein Material zur Verfügung zu stellen, das gute mechanische Eigenschaften aufweist, unempfindlich gegenüber lonenstärke und pH-Wert des Gebrauchsmediums ist, biologisch nicht abgebaut wird und sterilisiert werden kann und außerdem die Gewinnung von Proteinen in sehr reiner Form ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch die Verwendung des im vorstehenden Patentanspruch näher- bezeichneten Ionenaustauscherharzes gelöst
Dieses Austauscherharz besteht aus Titanoxid, Tonerde oder Kieselsäure als poröses Trägermaterial, das mit einem Polymerisatfilm überzogen ist, welcher Ionenaustauschergruppen aufweist Die Porosität des Trägermaterials bzw. Kerns bleibt erhalten. Die Proteine können daher in das Innere der

ίο Poren hineindiffundieren und die Austauscherkapazität ist dementsprechend sehr groß. Dieses Austauscherharz kann somit für die Trennung bzw. präparatäve Reindarstellung von Proteinen im technischen Maßstabe eingesetzt werden. Hierauf beruht der technische Fortschritt der erfineungsgemäßen Verwendung.

Zur Erfindungshöhe wird geltend gemacht:
Mit den aus den oben zitierten Druckschriften bekannten Austauschermaterialien ist eine präparative

Reindarstellung von Proteinen im technischen Maßstab nicht möglich. Sie unterscheiden sich von dem erfindungsgemäß verwendeten Austauscherharz prinzipiell dadurch, daß sie keinen porösen Kern aufweisen und infolgedessen keine Diffusion der Proteine in den Kern bzw. das Trägermaterial hinein ermöglichen. Auf dieser unterschiedlichen stofflich-physikalischen Beschaffenheit beruht die andersartige Verwendung der bekannten Stoffe: sie werden, wie schon erwähnt, für analytische Trennungen von Stoffgemischen eingesetzt,

bei denen mit sehr kleinen Stoffmengen gearbeitet wird. Bei der erfindungsgemäßen Auftrennung von Proteinen wird eine proteinhaltige Lösung mit dem Ionenaustauscherharz in Berührung gebracht, das aus Titanoxid, Tonerde oder Kieselsäure als poröses Trägermaterial in

einer Korngröße von 4 μπι bis 5 mm mit einer spezifischen Oberfläche von 5 bis 150 mVg, einem Porendurchmesser von 50 bis 250 nm und einem Porenvolumen von 0,4 bis 2 ml/g und einem filmartigen Überzug in einer Menge von weniger als 15 mg/m² aus einem vernetzten Polymerisat, der entweder Anionenaustauschergruppen wie tertiäre Amine oder quaternäre Ammoniumsalze oder Kationenaustauscher wie Säuregruppen enthält, besteht und eine lonenaustauscherkapazität <2mÄq7g aufweist

Das poröse anorganische Trägermaterial Titanoxid, Tonerde und vor allem Kieselsäure weist vorzugsweise einen mittleren Porendurchmesser von 60 bis 150 nm und eine spezifische Oberfläche von 20 bis 50 mVg auf. Die Korngrößenverteilung richtet sich nach der in Betracht gezogenen Verwendung. Die feinsten Teilchen werden für analytische Zwecke und die gröberen Teilchen für präparative Zwecke verwendet.

Die funktioneilen Gruppen — tertiäre Amine oder quaternäre Ammoniumsalze — lassen sich durch die allgemeinen Formeln

-CH₂-N-CH₂- oder -CH₂-N^)-R

wiedergeben, in denen R gfeich oder verschieden ist und jeweils für eine Alkyigruppe oder Hydroxyalkylgruppe mit I bis 4 Kohlenstoffatomen steht und X ein anorganisches oder organisches Anion bedeutet, z. B. (,5 das Chlorid-, Sulfat-, Nitrat-, Phosphat- oder Citratanion.

Die funktioneilen Säuregruppen leiten sich von Carbonsäuren, Sulfonsäuren oder Phosohonsäuren ah

und entsprechen den allgemeinen Formeln -COOH, -SO₃H. -PO(OH)₂.

Diese funktioneilen Gruppen sind Teil der Kette des vernetzten Polymerisats oder sind an das vernetzte Polymerisat, das die gesamte Trägeroberfläche überzieht, gebunden bzw. fixiert

Die vernetzten Polymerisate, die die Oberfläche des anorganischen Trägermaterials überziehen, sind an sich bekannte Stoffe, die nach beliebig bekannten Polymerisationsverfahren erhalten werden, ausgehend von Monomeren, die entweder selbst vernetzen können oder zusammen mit einem anderen Monomer, gegebenenfalls in Anwesenheit eines Katalysators. Hierzu gehören: Epoxyverbindungen, die mit Polyaminen als Katalysatoren vernetzen; Monomere, die durch Polykondensation ohne Katalysator mit Formaldehyd vernetzen wie

Harnstoff, Melamin, Polyamine, Phenole; Vüiylmonomere wie Vinylpyridin, Styrol und seine Derivate,
Acrylsäure, Methacrylsäure,
Vinylbenzoesäure, die mit polyfunktioneUen

Monomeren vernetzen, beispielsweise mit Mono- oder Polyalkylenglykol-diaqrylat oder

-dimethacrylat,
Divinylbenzol,

Vinyltrialkoxysilan, Vinyltrihalogensilan, bis-Methylenacrylamid,

in Gegenwart eines freie Radikale bildenden Initiators wie organische Peroxide oder Azonitrile oder in Gegenwart von UV-Strahlen.

Das Trägermaterial wird mit einer Lösung des Monomeren oder Monomerengemisches sowie gegebenenfalls des Katalysators getränkt, wodurch eine gute Verteilung der Monomeren auf der gesamten Oberfläche des anorganischen Trägermaterial erreicht wird. Das Lösungsmittel wird dann verdampft und die Monomeren in bekannter Weise polymerisiert Als Lösungsmittel kommen alle Lösungsmittel für die Monomeren und den Katalysator in Frage, deren Siedepunkt vorzugsweise so niedrig wie möglich ist um das anschließende Verdampfen zu erleichtern, beispielsweise Methylenchlorid, Diäthyläther, Benzol, Aceton und Äthylacetat

Ein besonders geeignetes Verfahren zur Herstellung von Kationenaustauscherharzen durch Überziehen eines anorganischen Trägermaterials mit Epoxyverbindungen wird in dem älteren Vorschlag gemäß DE-OS 25 38 358 beschrieben.

Enthält das vernetzte Polymerisat auf der Oberfläche des anorganischen Trägermaterials keine wie oben definierten funktionellen Gruppen in seiner Kette, so muß es auf beliebige, an sich bekannte Weise, modifiziert werden.

Die Menge an eingesetztem Monomeren oder Monomergemisch wird so bemessen, daß das die Oberfläche des Trägers überziehende vernetzte Polymerisat mit funktionellen Gruppen weniger als 15 mg/m², vorzugsweise 1 bis 8 mg/m^J, ausmacht.

Das so erhaltene Austauscherharz besitzt eine Austauschkapazität <2mÄq7g, vorzugsweise im Bereich von 03 bis 1,2 mAqJg.

Es läßt sich auf alle in wäßrigem Medium lösliche Proteine unabhängig von ihrem isoelektrischen Punkt anwenden. Zu diesen Proteinen gehören Polypeptide und Enzyme, beispielsweise Albumin, Lactalbumine, Ovalbumin, Serumalbumin, Hämoglobin, «-, ß- und ^-Globuline, Lactoglobuline, Fibrinogen, Urease, Trypsin, Lysozym, Pepsin, Proteasen und Cytochrom.

Die erfindungsgemäße Verwendung ermöglicht eine sehr leichte Abtrennung der Proteine aus ihren Lösungen wie Milchserum, Bier, Blut, Organextrakten und allen Industrieabwässern, beispielsweise den Abwässern aus Schlachthöfen, Lebensmittelfabriken und Stärkefabriken; sie stellt somit ein ausgezeichnetes Mittel zur Bekämpfung der Umweltverschmutzung dar. Die zu behandelnde Lösung wird bei einer Temperatur, Ionenstärke und einem pH-Wert, die mit dem Protein bzw. den Proteinen verträglich sind, mit dem Austauscherharz in Berührung gebracht Man kann auch nacheinander ein oder mehrere Anionenaustauscherharze und/oder Kationenaustauscherharze einsetzen. Dann werden die in der Lösung enthaltenen Proteine selektiv auf jedem Harz fixiert

Wird das angestrebte Protein aus einer Lösung auf dem Austauscherharz fixiert, so wird anschließend mit einer Lösung eluiert, deren pH-Wert und/oder Ionenstärke sich von der zum Fixieren eingesetzten Lösung unterscheiden. Dadurch wird das Protein nicht nur aus der Lösung abgetrennt sondern auch gereinigt und konzentriert Beispielsweise lassen sich auf diese Weise Albumin, Pepsin und die Proteine des Milchserums mit einem Kationenaustauscherharz und Lysosym mit jo einem Anionenaustauscherharz abtrennen und konzen-. trieren.

Verbleibt das gesuchte oder angestrebte Protein in der erfindungsgemäß behandelten proteinhaltigen Lösung, werden also die anderen Proteine aus dem Gemisch fixiert, so wird die Trennung des gesuchten Proteins von den anderen Proteinen, d.h. seine Reinigung, bewirkt Elution der fixierten Proteine führt zu einer selektiven Trennung des Proteins bzw. der Proteine und zu ihrer Konzentrierung. Dieä txifft u. a. für y-Globulin mit einem ICationenaustaascherAarz zu.

Werden mehrere gesuchte oder angestrebte Proteine gleichheitig auf einem Austauscherharz fixiert so bewirkt die Elution bei von der Fixierungslösung verschiedenen pH· Wert und/oder verschiedener Ionenstärke eine Abtrennung der Proteine aus der Lösung und ihre Konzentrierung. Wird mit Lösungen mit steigendem pH-Wert und/oder steigender Ionenstärke eluiert, so wird zusättlich zu der selektiven Trennung die Reinigung und Konzentrierung (der Proteine) bewirkt Dies trifft vor allem für das Serum des Menschen zu.

Sollen die Proteine entfernt werden, so werden sie aus ihrer Lösung auf einem Austauscherharz fixiert Man erhält proteinfreie, d.h. gerinigte, Lösungen. Das Austauscherharz kann durch Eluieren der gebundenen Proteine regeneriert und darauf wieder eingesetzt werden. Anwendungsgebiete hierfür sind vor allem die Klärung von Bier sowie die Behandlung von Hämoglobin enthaltenden Lösungen mit Anionenaustauscherharzen.

Die Trennung kann mit identischen Ergebnissen diskontinuierlich oder kontinuierlich durchgeführt werden. Bei kontinuierlicher Arbeitsweise ermöglichen die Austauscherharze in leichtes Füllen der Säule, einen f» großen Durchsatz und ein leichtes Eluieren.

Die erzielten Ergebnisse sind praktisch unabhängig von der Konzentration der behandelten Lösung, hängen aber ab von der Beschaffenheit der AustauscheretniDoe

des Hartes, vom pH-Wert, der lonenstärke und der Aufgabemenge bzw. des Durchsatzes sowohl der zu behandelnden Lösungen als auch des Eluens,

Die erfindungsgemäße Verwendung erstreckt sich auf Gebiete der Lebensmittelindustrie, vor allem der Industrie für diätetische Lebensmittel, der pharmazeutischen Industrie und der tierverarbeitenden Industrie.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung. Verwendet wurden dabei die folgendermaßen hergestellten Austauscherharze:

A) 100 g Kieselsäure (Korngröße 100-200 μπι, spezifische Oberfläche 24 mVg, mittlerer Porendurchmesser 140 nm und Porenvolumen 1 ml/g) wurden unter vermindertem Druck 5 h bei 150⁰C getrocknet und in eine Lösung aus 250 ml Methylenchlorid, 60 ml zweifach destilliertem Styrol, 20 ml Vinyltriäthoxysilan und 0,5 g Azobis-isobutyronitril gegeben. Nach Abdampfen des Methylenchlorids bei Raumtemperatur wurde 6 h auf 120°C unter einem Druck von 3 bar erhitzt, um die Vernetzung zu bewirken. Dann wurde die Kieselsäure in 309 m! XyIo! suspendiert, 2 h zum Sieden erhitzt, abfiltriert, mit Aceton gewaschen rad schließlich getrocknet Die Analyse ergab einen Kohlenstoffgehalt von 4 Gew.-%, bezogen auf die beschichtete Kieselsäure. 50 g davon wurden in 180 g Chlormethylather suspendiert, der 6 g Zinn(IV)-chIorid enthielt, und unter Ausschluß von Wasser 4 h unter Rückfluß erhitzt Nach dem Abkühlen, Abschleudern, Waschen mit HCl-haltigem Dioxan-Wasser 50 :50, Wasser und Trocknen betrug der Kohlenstoffgehalt 4,1 % und der Chlorgehalt

Das erhaltene Produkt wurde in 150 ml wäßriger 30%iger Trimethylaminlösung suspendiert und bei Raumtemperatur 8 Tage stehengelassen. Nach dem Abschleudern und Waschen erhielt man ein Austau- r> scherharz mit folgenden funktionellen Gruppen:

CHj

-CH₂—N®—CH₃CI-CH₃

4,8Gew.-%
2Gew.-%
0,9Gew.-%
3,3 mg/m²
O^mAq

und Merkmalen:

Kohlenstoffgehalt
Chlorgehalt
Stickstoffgehalt
Fixiertes Polymerisat
Austauscherkapazität

B) In 150 ml Methylenchlorid, da» 6,5 g N,N-bis(2,3-Epoxvoropyi)-äthyhunin und 3 g Triäthylentetramin gelöst enthielt, wurden 50 g Kieselsäure (Korngröße 40 bis 100 μπι, spezifische Oberfläche 37 mVg, Porendurchmesser 110 ntti, Porenvolumen 1,05 ml/g) gegeben. Das Methylenchlorid wurde bei Raumtemperatur verjagt, die imprägnierte Kieselsäure 60 h auf 6O⁰C erhitzt und dann mit kochendem Wasser und mit Aceton gewaschen.

Das erhaltene Austauscherharz bestand aus Kieselsäure, überzogen mit einem vernetzten Polymerisat mit funktionellen Gruppen

-CH₂-N-CH₂-

40

45

C₂H₅

Kohlenstoff Stickstoff

fixiertes Polymerisat

Austauscherkapazität

8,8%
2,4%

33 mg/m²
1 mÄq./g

C) Es wurde wie unter B) verfahren, jedoch mit einer Kieselsäure mit Korngröße 100 bis 200 μπι und mit 6,5 g N,N-bis(2_r3-EpoxypropyI)-butyIamin anstelle des 64 g N,N-bis(2^-Epoxypropyl)-äthylamins.

Das fertige Austauscherharz bestand aus Kieselsäure, überzogen mit einem vernetzten Polymerisat, das funktioneile Gruppen

-CH₂-N-CH₂-QH₉

aufwies; das Austauscherharz hatte folgende Merkmale:

Kohlenstoff Stickstoff

fixiertes Polymerisat

Austauscherkapazität

S,2Gew.-

3,2 mg/m²
1,1 mAqyg

D) 100 g Kieselsäure (Korngröße 100 bis 200 μπι, spezifische Oberfläche 25 m²/g, mittlerer Porendurchmesser 140 nm und Porenvolumen 1,1 ml/g) wurden mit einer Lösung aus 200 ml Methyleschlorid, 24 g Acrylsäure, 6 g Diäthylenglykol-di-methacrylat und 0,4 g Benzoylperoxid imprägniert Das Methylenchlorid wurde bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck bis zur Gewichtskonstanz verjagt; darauf wurde die imprägnierte Kieselsäure 6 h auf 80⁰C erhitzt um die Polymerisation zu bewirken und dann in 300 ml Wasser suspendiert und 6 h gekocht Nach dem Abfiltrieren wurde die Kieselsäure mit Aceton gewaschen und unter vermindertem Druck bei 80° C getrocknet

Man erhielt ein Austauscherharz mit funktionellen Gruppen — COOH, das folgende Merkmale aufwies:

Kohlenstoff

gebundenes Polymerisat
Austauscherkapazität

10,55 Gew.-%
12. rng/m²
1,05 mÄq/g

mit folgenden Kennzeichen:

E) 100 g Kieselsäure (Korngröße 100 bis 200 μπι, spezifische Oberfläche 37 m²/g, mittlerer Porendurchmesser 120 nm, Porenvolumen 0,95 ml/g) wurden mit einer Lösung aus 150 ml Methylenchlorid, 60 ml

so destilliertem Styrol, 20 ml Vinyltriäthoxysilan und 0,5 g Azobis-isobutyi onitril imprägniert Du Methylenchlorid wurde bei Raumtemperatur und Atmosphäreniiruck bis zur Gewichtskonstanz verjagt und die imprägnierte Kieselsäure 6 h auf 120° C erhitzt Dann wurde die Kieselsäure in 300 ml Xylol 6 h zum Sieden erhitzt, abgeschleudert mit Aceton gewaschen und bei 80° C getrocknet

50 g dieser modifizierten Kiselsäure suspendiert in 500 ml Chloroform wurden tropfenweise mit 50 g

HSO₃Cl gelöst in 50 ml Chloroform versetzt Dabei

entwickelte sich Chlorwasserstoff. Nach beendeter

Zugabe wurde das Gemisch gerührt und 4 η auf 50° C

erhitzt.

Nach dem Abschleudern wurde mit Wasser neutral

₆; gewaschen, darauf mit Aceton gewaschen und im Vakuum bei 80⁰C getrocknet; man erhielt ein lonenaustauscherharz mit funktionellen Gruppen —SOjH und folzenden Merkmalen:

Kohlenstoff

Schwefel

gebundenes Polymerisat

Austauscherkapazität

4 Gew.-%
l,4Gew.-%
2,8 mg/m^J
0,43 mÄqJg

Beispiel I
Behandlung einer Albuminlösung

10 g Austauscherharz A wurden in eine 1 cm weite Säule gegeben, komprimiert gehalten und mit einer 0,01-m Phosphatpufferlösung auf pH-Wert 6.5 äquilibriert.

Darauf ließ man eine I gew.-% ige Albuminlösung in der gleichen Pufferlösung in einer Menge von 180 ml/h bis zur Sättigung der Säule perkolieren; dies entsprach etwa 200 ml Lösung. Das Harz wurde dann mit 100 mi der gleichen Pufferlösung gewaschen.

Das fixierte Albumin wurde mit einer 1-m NaCI-Lösung im gleichen Puffer eluierf; das F.lnens wurde· mit einer Geschwindigkeit von 180 ml/h aufgegeben. 45 ml Lösung wurden benötigt, um das Albumin in Form einer 33gew.-%igen Lösung zurückzugewinnen.

Hieraus ergab sich, daß der Ionenaustauscher eine Kapazität bezüglich A'.bumin von 150 mg/g hatte und daß mit seiner Hilfe die Albuminlösung konzentriert werden konnte.

Der Arbeitsgang wurde 30maI wiederholt, ohne Anzeichen von Quellen oder Altern des Austauscherharzes.

Beispiel 2

Beispiel I wurde mit einer 0,2gew.-%igen Albuminlösung wiederholt.

Es wurden die gleichen Ergebnisse erzielt, d. h. man erhielt die gleiche Konzentration an Albumin unabhängig von der Konzentration der Ausgangslösung, die behandelt wurde.

Beispiel 3

Beispiel 1 wurde wiederholt, als Eluens jedoch eine 0,05-m Citratpufferlftsung mit pH-Wert 6,5 verwendet Man erhielt 59 ml 2,5gew.-%ige Albuminlösung.

Dieses Bcis^ic! icigi, üaB uie Beschaffenheit der ais Eluens verwendeten Pufferlösung die Konzentration des Eluats beeinflußt

Beispiel 4

Eine Albuminlösung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 behandelt, jedoch unter Einsatz von 41 g Austauscherharz A in einer 1 cm weiten Kolonne und mit einer Aufgabegeschwindigkeit des Eluens von 80 ml/h.

Die Albuminkonzentration in der erhaltenen Lösung (Eluat) betrug 7 Gew.-%. Dies zeigt, daß die Konzentration im Eluat durch Erhöhen der Nutzhöhe in der Säule und durch Verringern der Elutionsgeschwindigkeit erhöht wird.

Beispiel 5
Abtrennung von y-Gobulin

10 g Austauscherharz B wurden in eine 1 cm weite Säule gegeben, komprimiert gehalten und mit 0,1 n-Salzsäure und anschließend mit 0,02-m Phosphatpufferlösung von pH-Wert 65 äquilibriert

Anschließend HeB man 20 ml einer lgew.-%igen Lösung von von Fettstoffen befreitem und Iyophilisiertem Humanserum in der gleichen Phosphatpufferlösung mit einer Geschwindigkeit von 100 ml/h perkolieren Dann wurde das Austauscherharz mit 50 ml der gleichen Phosphatpufferlösung gewaschen.

Die auslaufende Lösung enthielt das in der Ausgangs-ι lösung enthaltene y-Globulin elektrophoretisch rein.

Die anderen in der Ausgangslösung enthaltenen Proteine; «-Globuline, ^-Globuline und Albumin, waren an das Austauscherharz gebunden, sie wurden mit einer 3-m NaCI-Lösung im gleichen Phosphatpuffer eluiert.
ίο Wurden zum Eluieren Pufferlösungen mit zunehmender Ionenstärke eingesetzt durch Erhöhen der NaCl-Konzentration, so erhielt man an «-Globulinen, /7-Globulinen und Albumin angereicherte Lösungen.

Beispiel 6
Extraktion von Proteinen

IO g AnUaiiseherharz C. wurden in eine I cm weite Säule gegeben, darin komprimiert und mit nacheinander 0,1 η-Salzsäure und 0,01-m Phosphatpufferlösung von pH-Wert 7,5 äquilibriert.

30 ml einer 1gew.-%igen Lösung aus ultrafiltriertem Milchserumpulver enthaltend 75 Gew.% Proteine in r> der gleichen Phosphatpufferlösung wurde mit einer Geschwindigkeit von 80 ml/h perkoliert. Anschließend wurde das Austauscherharz mit 100 ml der gleichen Phosprntpufferlösung gewaschen.

Die auslaufenden Lösungen enthielten die in der in Ausgangslösung vorhandenen Fettstoffe und die Lactose.

Die Proteine, Lactalbumine, Lsctoglobuline, Serumalbumin und ein kleiner Teil der Immunoglobuline aus der Ausgangslösung waren an das Austauscherharz gebun-J-, den und wurden mit 0,5-m Mac-Ilvaine-Pufferlösung von pH-Wert 4 eluiert und gereinigt.

Beispiel 7
jo Extraktion von Proteinen

20 g Austauscherharz A, jedoch mit einer Korngrö-UCIiVCi leitung von 2GC bis jvG μιη, wurden κι eine 2,5 cm weite Säule gegeben und komprimiert bzw. festgepackt gehalten. Das Austauscherharz wurde mit nacheinander 0,1 η-Salzsäure und 0,01-m »Tris-HCI« Pufferlösung von pH-Wert 7 äquilibriert

600 ml einer Lösung aus 300 ml gleiche Pufferlösung und 300 ml von Fettstoffen befreites Milchserum mit 0,5

so Gew.-% löslichen Proteinen wurde mit einer Geschwindigkeit von 300 ml/h perkoliert und das Austai'-cherharz anschließend mit 100 ml der gleichen Pufferlösung gewaschen.
Die aus der Sttule ablaufenden Lösungen enthielten die in der Ausgangslösung vorhandene Lactose. Die Proteine, Lactalbumine, Lactoglobuline, Senimalbumin und ein kleiner Teil der Immunoglobuline aus der Ausgangslösung war an das Austauscherharz gebunden und wurden mit einer 0,1 -m Gtrat-Natronlauge Pufferlösung von pH-Wert 7 eluiert Das Eluat enthielt die Gesamtmenge der vorher gebundenen Proteine in einer Konzentration von 4 Gew.-%.

Mit Hilfe dieses Arbeitsganges wurde ein Gemisch aus reinen Proteinen, frei von Lactose, als gegenüber der Ausgangslösung wesentlich starker konzentrierte Lösung erhalten.

Nach 30 aufeinanderfolgenden Arbeitsgängen wurde keinerlei Altern des Austauscherharzes beobachtet

Beispiel 8
Behandlung einer Pepsinlösung

3 g Austauscherharz A wurden in eine 1 cm weite ί Säule gegeben und mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Darauf wurden 150 ml einer Lösung aus rohem Pepsin mit 20 Pepsineinheiten/ml in einer Geschwindigkeit von 100 ml/h perkoliert und das Austauscherharz anschließend mit 20 ml destilliertem in Wasser gewaschen.

Die aus der Kolonne ablaufende Lösung und das Waschwasser zeigten überhaupt keine Aktivität; das gesamte Pepsin war an das Austauscherharz gebunden. Die Begleitstoffe blieben in Lösung, wie sich durch r, Messungen am Feststoffextrakt zeigte.

Das gebundene Pepsin wurde dann durch Perkolieren einer 1-in NaCI-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 100 ml/h eluiert.

16 ml Lösung wurden benötigt, um das Pepsin als >n Lösung mit 170 Pepsineinheiten/ml zurückzugewinnen. Dies zeigt die starke Konzentrierung gegenüber der Ausgangslösung.

Das Austauscherharz wurde nach Waschen mit 50 ml destilliertem Wasser erneut einge^tzt Nach 10 aufeinanderfolgenden Arbeitsgängen wurde keinerlei Altern festgestellt.

JO

Beispiel 9
Behandlung einer Lysozymlösung

10 g Austauscherharz D wurden in eine 1 cm weite Säule gegeben und komprimiert gehalten; darauf wurde das Austauscherharz in die Ammoniumform (NH₄ ⁺) gebracht durch Perkolieren von 21 wäßriger 0,5-m « Ammoniumacetatlösung, gepuffert auf pH-Wert 8,2.

Das Harz wurde dann mit 100 ml Tris-maleinsäurepuffer 0,02-m äquilibriert

Darauf ließ man eine lgew.-%ige Lösung aus Lysozym in der gleichen Pufferlösung mit einer Geschwindigkeit von 180 ml/h bis zur Sättigung der Säule perkolieren; dies entsprach etwa 200 ml Lösung.

Hue 14or»» «i

repuffer, pH 8,2, gewaschen.

Das gebundene Lysozym wurde darauf durch Perkolieren einer 1-m NaCI-Lösung in der gleichen Pufferlösung mit einer Geschwindigkeit von 180 ml/h eluiert 50 ml Lösung wurden benötigt, um das Lysozym in Form einer 2,5gew.-%igen Lösung zurückzugewinnen.

Hieraus ergab sich, daß der Austauscher eine Kapazität für Lysozym von 125 mg/g besaß und es ermöglichte, die Lysozymlösung zu konzentrieren.

Beispiel 10
Extraktion von Hämoglobin

55

10 g Austauscherharz E wurden in eine 1 cm weite Säule gegeben und mit 0,02-m Phosphatpufferlösung auf pH 6,5 äquilibriert Darauf wurden 500 m! einer eo 0,2gew.-%igen Hämoglobinlösung in dem gleichen Puffer mit einer Geschwindigkeit von 100 ml/h perkoliert. Das Hämoglobin wurde an dem Austauscherharz adsorbiert bzw. fixiert. Die ablaufende farblose Lösung enthielt kein Hämoglobin mehr und war somit gereinigt. Das adsorbierte Hämoglobin wurde mit einer 0,5-m Ammoniumcarbonatlösung eluiert und die Säule anschließend mit 300 ml 0,1 η-Natronlauge und mit 50 ml 1 η-Salzsäure gewaschen, bevor sie erneut eingesetzt wurde.

Beispiel Il
Behandlung von Milchserum

In eine erste 2,5 cm weite Säule (Nr. 1) wurden 20 g Austauscherharz A und in eine zweite 2,5 cm weite Säule (Nr. 2) 10 g Austauscherharz D gegeben. Die beiden Säulen wurden in Reihe (hintereinander) angeordnet und die Austauscherharze mit 500 ml Wasser gewaschen.

500 ml Milchserum, eingestellt auf pH 7,5 durch Zugabe von 0,1 η-Natronlauge, wurden filtriert, um die Feststoffe zu entfernen und dann durch Säule Nr. 1 und Säule Nr. 2 mit einer Geschwindigkeit von 300 ml/h perkoliert Der Test der Proteinfällung mit Trichloressigsäure zeigte, daß das aus der zweiten Säule ablaufende Milchserum kein Protein mehr enthielt. Die Austauscherharze in den beiden Säulen wurden mit 100 ml Wasser gewaschen.

Die in der Ausgangslösung vorhandenen Proteine: Lactalbumine, Lactoglobuline, Serumalbumin und ein sehr kleiner Teil der Immunoglobuline wurden vom Austauscherharz der Säule Nr. 1 Fixiert und dann wie in Beispiel 7 beschrieben eluiert

Auf dem Austauscherharz der Säule Nr. 2 wurden im wesentlichen die vom Austauscherharz der Säule Nr. 1 nicht zurückgehaltenen Immunoglobuline fixiert Sie wurden mit einer 1-m Ammoniumcarbonatlösung eluiert Das Eluat enthielt die Immunoglobuline, die etwa 16 Gew.-% der gesamten in der Ausgangslösung vorhandenen Proteine ausmachten, in einer Konzentration von etwa 3 Gew.-%.

Die beiden Säulen wurden dann mit 500 ml Wasser

folgenden Arbeitsgängen wurde keinerlei Altern der Austauscherharze beobachtet

Beispiel 12
Extraktion der Proteine aus Bier

60 g Austauscherharz D wurden in eine 2,5 cm weite Säule gegeben und mit 250 ml Wasser gewaschen.

3 J nicht geklärtes Bier wurden mit einer Geschwindigkeit von 100 ml/h perkoliert Das aus der Säule ablaufende Bier ergab keine Fällung mehr bei Zugabe von Picrinsäure und hatte alle Merkmale eines geklärten Biers.

Die am Austauscherharz fixierten Produkte waren im wesentlichen Proteine und wurden mit 400 ml 0,1 η-Salzsäure eluiert

Vor erneutem Gebrauch wurde das Austauscherharz mit 250 ml Wasser gewaschen.

Claims

Patentanspruch:

Verwendung eines Austauscherharzes, das aus Titanoxid, Tonerde oder Kieselsäure als poröses Trägermaterial mit Korngröße 4 μΐη bis 5 mm, spezifischer Oberfläche 5 bis 150 m²/g, Porendurchmesser 50 bis 250 um, Porenvolumen 0,4 bis 2 ml/g und einem Überzug in einer Menge von weniger als 15 mg/m² aus vernetzten! Polymerisat mit Anionenaustauschergruppen wie tertiäre Amino- oder quaternäre Ammoniumsalzgruppen oder mit Säuregruppen als Kationenaustauschergruppen besteht und eine Austauscherkapazität < 2 mÄqVg aufweist, zum Auftrennen von Proteinen.