DE2650815A1 - Verfahren zur herstellung von mit enzymen gekuppelten ultrafiltrationsmembranen - Google Patents
Verfahren zur herstellung von mit enzymen gekuppelten ultrafiltrationsmembranenInfo
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Description
PATENTANWALT DR. HANS-GUNTHER EGGERT1 DIPLOMCHEMIKER
2 6 5!- J ο Ί b
6 KÖLN 51, OBERLÄNDER UFER 90
Köln,den 5.November 1976
Nr. 187/Eg/Ax
Dr. Harry P. Gregor, 15o Lakeview Avenue, Leonia,
New Jersey o76o5, USA
Verfahren zur Herstellung von mit Enzymen gekuppelten ültrafiltrationsmembranen
Die Erfindung betrifft die Herstellung einer Klasse von Membranen oder Filtern, an die Enzyme und andere Moleküle
mit biologischer Aktivität durch chemische Bindungen gebunden sind. Das Verfahren zur Aktivierung der
Porenflächen der Membran (falls diese erforderlich ist) und/oder das Kupplungsverfahren werden unter Aufrechterhaltung
eines Druckgradienten durch die Membran durchgeführt. Ebenso kann dieses System eingesetzt werden,
indem das zu behandelnde Substrat unter Druck durch die Membranporen getrieben wird. Diese enzymgekuppelten
Ultrafiltrationsmembranen (nachstehend als ECUF-Membranen bezeichnet) können grundsätzlich bei allen Verfahren,
bei denen Enzyme verwendet werden, insbesondere in Kombination mit Ultrafiltrationsverfahren verwendet werden.
Enzyme werden bei üblichen Verfahren in Mikrobienzellen
und anderen Zellen oder als unreine oder reine lösliche Enzympräparate verwendet. In den letzten Jahren werden
Enzyme in unlöslichen Gelen eingeschlossen oder chemisch an lösliche Polyelektrolyte oder unlösliche Oberflächen
oder innerhalb von Gelen von Cellulose, Glas und anderen Substanzen gebunden. Ferner wurden ganze Zellen in ähnlicher
Weise stabilisiert. Es wurde gefunden, daß in dieser Weise stabilisierte Enzyme häufig insofern günstig
veränderte Eigenschaften aufweisen, als ihre wirk-
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samen pH-Bereiche verändert oder erweitert werden und ihre chemische Stabilität in Bezug auf chemischen Abbau
(z.B. zu Harnstoff) und thermischen Abbau verbessert ist, so daß sie im Prinzip im Gegensatz zu der
Anwendung üblicher Fermentationsverfahren für längere Zeiträume verwendet werden können. Alle diese Vorteile
sind bekannt und werden in verschiedenen Veröffentlichungen und Büchern, insbesondere in "Immobilized
Enzymes" von O.R.Zaborsky, CRC Press, Cleveland, Ohio, 19 74, genannt.
Alle diese enzymatisehen Systeme und Verfahren können
durch die Wertungsziffer (Figure of Merit = FOM) eines
Enzymreaktors gekennzeichnet werden, d.h. durch die aus Enzym bestehende Gewichts- oder Volumenfraktion des
Reaktors multipliziert mit dem Verhältnis der Aktivität des gleichen nativen Enzyms in Lösung bei vergleichbaren
pH-Werten und Temperaturen. Die FOM ist proportional der molaren Substratmenge, die pro Zeiteinheit bei
gegebenem Reaktorgewicht oder -volumen umgewandelt wird.
Bei dem bisher angewendeten üblichen Verfahren werden Enzyme an kugelförmige Gelteilchen von Agarose, Dextran
oder aus porösem Glas gekuppelt oder gebunden. Diese Teilchen sind gewöhnlich sehr klein und haben einen
Durchmesser von etwa 20 bis 100 u, um die Diffusionsgeschwindigkeit
so weit wie möglich zu verringern. Die Gelteilchen der meisten Polymerisate sind sehr weich,
weil sie weitgehend aus Wasser bestehen. Bis etwa 95% Wasser kann im ungekuppelten Zustand vorliegen. Gelteilchen
aus Glas und anderen anorganischen Materialien sind nicht weich, jedoch enthalten sie im allgemeinen
nicht einen so großen Porenraum.
Das übliche Kupplungsverfahren besteht darin, daß man die Gelperlen mit einem oder mehreren aktivierenden
Chemikalien umsetzt, überschüssige aktivierende Chemi-
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kalien durch Spülen der Perlen während einer genügenden Zeit entfernt, die Perlen in die Enzymlösung taucht,
wodurch das Enzym in die Perlen diffundiert und die Kupplung stattfindet, und anschließend das nicht umgesetzte
Enzym durch Spülen aus den Perlen entfernt. Zum Gebrauch werden die Perlen mit der Substratlösung aufgeschwemmt.
Häufiger werden sie jedoch in eine Kolonne gefüllt, durch die das Substrat geleitet wird. Durch
die Feinheit der Perlen ergibt sich eine geringe Durchdringbarkeit der Säule für Flüssigkeiten. Wenn mit hohem
Druck gearbeitet wird, um die Durchsatzgeschwindigkeit zu steigern, können Deformierung und/oder teilweise
Zerstörung der Perlen eintreten. Es können Filter verwendet werden, um die Perlen von der Lösung abzutrennen,
oder die Perlen können dicht gemacht werden, damit in der Wirbelschicht gearbeitet werden kann, jedoch erfordert
dies umfangreichere und kostspielige Apparaturen und/oder eine geringere Beladung oder einen geringeren
Gewichts- oder Volumenanteil des Systems,der aus Enzym besteht.
Es ist möglich, die Außenflächen von Teilchen, Fasern oder Folien zu umhüllen, um das Enzym dort für das
Substrat aus der Lösung leicht zugänglich zu machen und hierdurch die zur Diffusion erforderliche Zeit zu verkürzen,
jedoch ist die Beladung mit Enzym sehr gering, weil eine dünne monomolekulare Enzymschicht selbst auf
einer rauhen Oberfläche keine große Enzymmenge enthält.
Wenn ferner Enzyme auf physikalischem Wege in Gele gekuppelt oder in ihnen eingeschlossen werden, ist das
Ausmaß der Kupplung auf Grund der naturgegebenen regellosen Art des Prozesses nicht gleichmäßig, so daß einige
Enzymmoleküle sicherlich weniger als andere gekuppelt oder eingeschlossen sind und gewöhnlich eine Auslaugung
oder ein Verlust von Enzym aus der Säule oder aus der Aufschwemmung der Perlen eintritt.
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Aus diesen Gründen handelt es sich bei der angegebenen FOM häufig um den Wert, der 3% Beladung und 3% Aktivi-
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tat oder FOM = 9 χ 10 entspricht. Einige Forscher geben zwar höhere Beladungen an, jedoch tritt gewöhnlich ein Aktivitätsverlust ein, so daß eine FOM von 10 als hoch angesehen wird. Es ist zu betonen, daß die FOM ein Prozessparameter ist. Er gibt die Gesamtaktivität oder Umsatzhöhe eines Reaktors unter den Betriebsbedingungen und nicht die Aktivität an, die erreicht werden könnte, wenn die Diffusion nicht geschwindigkeitsbestimmend wäre. Bei allen Systemen außer den oberflächenbeschichteten Systemen ist nämlich die Diffusion fast immer sowohl bei den Aktivierungs-Kupplungsprozessen als auch bei den Anwendungsprozessen geschwindigkeitsbestimmend.
tat oder FOM = 9 χ 10 entspricht. Einige Forscher geben zwar höhere Beladungen an, jedoch tritt gewöhnlich ein Aktivitätsverlust ein, so daß eine FOM von 10 als hoch angesehen wird. Es ist zu betonen, daß die FOM ein Prozessparameter ist. Er gibt die Gesamtaktivität oder Umsatzhöhe eines Reaktors unter den Betriebsbedingungen und nicht die Aktivität an, die erreicht werden könnte, wenn die Diffusion nicht geschwindigkeitsbestimmend wäre. Bei allen Systemen außer den oberflächenbeschichteten Systemen ist nämlich die Diffusion fast immer sowohl bei den Aktivierungs-Kupplungsprozessen als auch bei den Anwendungsprozessen geschwindigkeitsbestimmend.
Die Erfindung stellt sich demgemäß die Aufgabe, gekuppelte Enzymsysteme, die sich für die verschiedensten
Anwendungen, d.h. für praktisch alle Anwendungen eignen, für die stabilisierte Enzymsysteme bisher verwendet
wurden, verfügbar zu machen.
Diese und andere Aufgaben werden gemäß der Erfindung gelöst, gemäß der eine homoporöse Matrixmembran mit
einer Porosität und einem Porendurchmesser, die für die später auftretenden speziellen Enzymbedingungen geeignet
sind, aktiviert und dann an ein Enzym unter einem solchen Druck gekuppelt wird, daß die maximale Betriebskapazität
des Reaktors erreicht wird.
Die Membranen, die für die Zwecke der Erfindung verwendet werden können, können von jedem beliebigen Typ sein,
obwohl Cellulosemembranen sich als besonders wirksam erwiesen.
Die Matrixmembran oder das Filter muß Eigenschaften aufweisen,
die mit der Verwendung der Matrix oder des Filters im Einklang sind. Die Matrixmembran muß eine
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genügende Porosität aufweisen, um die Substanz oder Substanzen mit biologischer Aktivität aus einer umgebenden
Lösungs- oder Suspensionsphase in sie einführen zu können. Sie muß genügend mechanische Festigkeit aufweisen
(oder mechanisch abgestützt werden können), um den Druckgradienten, die während der Verarbeitung und
unter den Gebrauchsbedingungen auf sie zur Einwirkung kommen, widerstehen zu können. Außerdem muß sie eine
sehr große Zahl von kleinen Poren aufweisen, damit sie eine große effektive Oberfläche hat, die schließlich
mit den Enzymen ausgekleidet wird. Vorteilhaft liegt die Größe der Poren von ungefähr dem Dreifachen bis
zum Fünffachen Enzymdurchmesser. Kleine Poren können entweder die Enzyme nicht aufnehmen, oder nach dem
Eintritt eines einzelnen Enzyms blockiert und/oder schädigt es andere Enzyme, die eintreten könnten.
Größere Poren können Enzyme aufnehmen, jedoch ist die relative Größe der Porenoberfläche pro Masseneinheit der
Membran weit geringer als bei Poren im bevorzugten Größenbereich. Die genaue Porengröße hängt somit von
der Größe des zu kuppelnden Enzyms ab. Die meisten Enzyme haben ein Molekulargewicht im Bereich von etwa
10.000 bis 1.000.000 und einen Durchmesser von etwa 5 bis 75 Ä, so daß Membranen mit Poren von etwa 15 bis
200 A bevorzugt werden. Die hier genannten Porendurch— messer werden gemäß den Ferry-Faxen-Gleichungen gemessen,
die von H.Kawabe und Mitarbeitern in J.Colloid and Interface Science 21 (1966) 79 beschrieben werden,
d.h. Moleküle von unterschiedlicher Größe können durch die Membran diffundieren, und aus der Diffusionsgeschwindigkeit
wird der effektive mittlere Porendurch— messer berechnet.
Um das System hinsichtlich der Membran oder Filtermatrix zu optimieren, werden möglichst einheitliche Poren
bevorzugt, damit die verfügbare Porenoberfläche pro
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Volumeneinheit so groß wie möglich ist. Hierzu sind die Herstellungsverfahren, die allgemein von W.J.Elford
(Proc. Roy. Soc. Ser.B, Band 106 (1930) 216) beschrieben
werden, gut geeignet, bei denen man eine Folie aus einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemiscn gießt, einen
Teil des Lösungsmittels verdampfen läßt, damit das Polymergel erstarrt, und es dann koaguliert, um eine
Membran mit der gewünschten Porosität zu bilden.
Die Porenoberflächen der Matrixmembran oder der Folie
können bereits aktive oder reaktionsfähige Gruppen zur Bindung an Enzyme enthalten, oder sie können in bekannter
Weise behandelt werden, um solche Gruppen zu bilden. Diese Aktivierungsprozesse werden vorteilhaft unter
Druckbedingungen durchgeführt, insbesondere wenn instabile Substituenten oder Nebenprodukte auftreten, weil
die Verweilzeit der Reaktionsteilnehmer in der Membran oder im Filter nach Belieben geregelt werden kann. Die
Anwendung schneller Verdrängungsprozesse ist ein besonderes Merkmal der Erfindung. Beispielsweise werden hervorragende
Systeme erhalten, wenn nach dem Aktivieren einer Membran aus regenerierter Cellulose mit Cyanbromid
bei pH 11 der überschüssige Reaktant schnell mit Wasser herausgewaschen und die Enzymlösung im wesentlichen unmittelbar
anschließend in die Poren der Folie gepreßt wird. Wenn diese Lehren befolgt werden, werden aus Gründen,
die noch nicht völlig geklärt sind, Systeme mit sehr hoher Aktivität erhalten. Zwar kann Wasser das als
Aktivator verwendete Cyanbromid zersetzen, und die Enzyme können bei pH 11 instabil sein, jedoch läßt die
Geschwindigkeit der Verarbeitung, insbesondere auf Grund der Anwendung von Druck, es nicht zu, daß Zersetzung
des Cyanbromids und/oder des Enzyms in einem wesentlichen Ausmaß stattfindet, bevor das Enzym an die Membran gebunden
ist und die Bedingungen eine Zersetzung nicht mehr begünstigen.
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Ein beliebiger Überdruck kann angewendet werden, um den Durchgang der aktivierenden Flüssigkeit und/oder des
Enzyms durch die Membran zu beschleunigen, jedoch werden mit einem Druck von wenigstens etwa 0,7 atü, insbesondere
etwa 2,1 bis 8,4 atü, besonders gute Ergebnisse erhalten. Anstatt pneumatisch oder hydraulisch kann der
Druck oder das Potential von beliebiger elektrischer Natur, d.h. wie bei der bekannten Erscheinung der Elektroosmose
und/oder Elektrophorese sein, bei der ein elektrisches Potential an eine Membran oder ein Filter
gelegt wird und Kombinationen der Aktivierungs- und Kupplungsoperationen und Anwendungsoperationen in dieser
Weise durchgeführt werden. Beispielsweise ergibt bei der Kupplung von Chymotrypsin nach Aktivierung mit Cyanbromid
ein elektrischer Strom, der einen Strom der Lösung durch die Membran erzeugt, der mit dem auf einen
2
Druckgradienten von 4,9 kg/cm zurückzuführenden Strom vergleichbar ist, ein System, das nahezu die gleiche enzymat'ische Aktivität hat wie ein System, das unter 4,9 kg/cm^ gebildet worden ist.
Druckgradienten von 4,9 kg/cm zurückzuführenden Strom vergleichbar ist, ein System, das nahezu die gleiche enzymat'ische Aktivität hat wie ein System, das unter 4,9 kg/cm^ gebildet worden ist.
Die Membranen, die gemäß der Erfindung aktiviert und mit Enzymen gekuppelt werden, können in beliebiger physikalischer
Form, z.B. als FlMchengebilde, Röhrchen, feine Hohlfasern u.dgl. vorliegen. Nach der Herstellung in der
beschriebenen Weise hatte beispielsweise Cellulose mit daran gebundenem Chymotrypsin eine FOM bis 0,15 entsprechend
einer Gewichtsbeladung von 20% und einer Aktivität von 75%. Vergleichbare Ergebnisse wurden mit
ß-Gallactosidase von E.coli erhalten, und die Lehren der
Erfindung sind auf eine Unmenge von Enzymen und anderen biologischen Substanzen anwendbar. Diese FOM-Werte betragen
häufig das 100-fache der Werte für die bekannten enzymatischen Reaktoren, und die Reaktionsgeschwindigkeiten
mit Substraten sind häufig höher als die Geschwindigkeit in Lösung. Dies bedeutet, daß die "Umsatzge-
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schwindigkeit" ("turn-over") bei solchen Enzymen höher ist, und daß Substratlösungen, die zu stark verdünnt
sind, um in wirksamer Weise in üblichen Reaktoren behandelt zu werden, mit Hilfe der Systeme gemäß der Erfindung
wirksam behandelt werden können.
Wie bereits erwähnt, haben die gemäß der Erfindung hergestellten Systeme u.a. den Vorteil, daß sie bei niedrigen
Substratkonzentrationen einen enzymatischen Umsatz aufweisen, der größer und häufig um ein Mehrfaches
größer ist als der Umsatz, der unter vergleichbaren Bedingungen mit dem nativen Enzym erreicht wird. Die
Gründe hierfür sind keinesweg geklärt, jedoch sind die Effekte Realität. Das Vorhandensein dieser Effekte kann
nachgewiesen werden durch Messen der Umsätze bei konstantem pH-Wert, konstanter Temperatur und auch bei
konstantem Druck in dem Bereich, in dem Druckänderungen wenig Einfluß auf die Geschwindigkeiten haben, jedoch
bei verschiedenen Substratkonzentrationen. Bei einer unter Druck mit CNBr durchgeführten Aktivierung und
Kupplung von Chymotrypsin (CT) bei 4,9 atü wird unter Anwendung des bekannten BTEE (Benzoyltyrosinäthylester)-Hydrolysentests
von Hummel (Can.J.Biochem.Physiol. 37 (1959)1393) eine Umsatzgeschwindigkeit von 27 uMol/Min.
mg von 34 ml Enzym erzielt, wenn die Substratkonzentra-
tion hoch bei 5,2 χ 10~4 Mol, d.h. auf einer Höhe liegt,
bei der die Substratkonzentration nicht mehr geschwindigkeitsbestimmend ist. Diese Umsatzgeschwindigkeit entspricht
75% der maximalen Geschwindigkeit (V ) der gleichen Menge von nativem Enzym bei der gleichen Konzentration.
Wenn jedoch die Substratkonzentration niedrig
—4
ist und bei 0,2 χ 10 Mol liegt, wobei die Geschwindigkeit linear mit der Substratkonzentration steigt, wird
bei den nach den Lehren der Erfindung hergestellten Systemen ein Umsatz von 12 uMol/Min.mg im Vergleich zu
einem Umsatz von 0,15 uMol/Min.mg beim nativen Enzym
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erreicht. Diese 80-fache Steigerung der Umsatzgeschwin— digkeit stellt einen wesentlichen Vorteil dieser neuen
Systeme dar. Dies bedeutet beispielsweise, daß dieses Enzymsystem zur Behandlung von stark verdünnten Lösungen
verwendet werden kann und eine höhere FOM als mit dem nativen Enzym erzielt wird.
Es ist wichtig, daß die Lehren der Erfindung in einer Weise angewendet werden, die der zu behandelnden Substanz
mit biologischer Aktivität angepasst ist. Beispielsweise dürfen während der Prozesse der Kupplung
und/oder Anwendung keine zu hohen Drücke gebraucht werden, weil nachteilige Wirkungen die Folge sein können.
Beispielsweise werden empfindliche Enzyme, z.B. die ß-Galactosidasen, irreversibel denaturiert, wenn
die Kupplung bei einem zu hohen Druck durchgeführt wird. Es wird angenommen, daß Abbau durch Scherwirkung unter
diesen Bedingungen stattfindet. Ebenso können bei Verwendung gewisser Substrate mit Membranen, deren Porenstruktur
zu fein ist, die gekuppelten Enzyme geschädigt oder zerstört werden. Beispielsweise kann, wenn eine
Proteinlösung, z.B. eine Caseinlösung, durch eine Cellulosemembran
gepreßt wird, die Poren von etwa 80 8 Durchmesser aufweist und mit CT gekuppelt ist, die Enzymaktivität
irreversibel verringert werden. Kurz gesagt, die Lehren der Erfindung müssen im Zusammenhang mit dem
Wissen des Fachmanns auf dem Gebiet der Biochemie angewendet werden.
Die Verwendung der Membranen oder Filter gemäß der Erfindung kann erheblich erleichtert werden, wenn die
Substratlösung vorher einer Ultrafiltration durch Membranen unterworfen wird, die Substanzen entfernen, die
eine solche Größe oder Natur haben, daß sie die enzymgekuppelten Systeme gemäß der Erfindung verstopfen,
verschmutzen oder zerstören. Die nicht verschmutzenden Ultrafiltrationsmembranen mit feststehendem Durchsatz
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(of fixed-charge character), wie sie in der US-PS 3 808 305 beschrieben werden, sind in dieser Hinsicht
besonders vorteilhaft. Wenn beispielsweise) die Lactose in einer Lösung von Molke oder Magermilch gespalten
werden soll, bewirkt die Ultrafiltration die Entfernung der vorhandenen kolloidalen Verunreinigungen, die das
für diesen Zweck verwendete empfindliche ß-Galactosidase-Enzym schädigen können. Der Anwendungsbereich der
Systeme gemäß der Erfindung wird somit durch eine vorherige Ultrafiltration durch Membranen mit entsprechenden
Eigenschaften erweitert.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen verstehen sich die Teile
als Gewichtsteile, falls nicht anders angegeben. Die hier gebrauchten Begriffe und gewisse angewendete Verfahren
sind die gleichen, wie sie in der US-PS 3 808 beschrieben werden.
Eine Matrixmembran wurde aus einer 15%igen Lösung von
Celluloseacetat (Eastman) (39,4% Acetyl, Viskosität 45) in einem Gemisch von Dimethylformamid und Aceton
(Volumenverhältnis 1:3,25) bei Raumtemperatur auf einer Glasplatte mit einer auf 300 u eingestellten Rakel
gegossen. Das Lösungsmittel ließ man 3 Minuten an der Luft abdampfen, worauf die Folie zur Verhinderung von
wesentlicher "Hautbildung" eine Stunde in einem geschlossenen Behälter gehalten und dann durch Einwirkung
von Wasserdampf im geschlossenen Behälter für 15 Minuten koaguliert wurde, worauf sie 2 Minuten in Wasser von
Raumtemperatur und dann eine Stunde in Eiswasser getaucht wurde. Das Celluloseacetat wurde durch übliche
Hydrolyse in einem Puffer bei pH 9,9 für 24 Stunden bei 65°C zu Cellulose regeneriert. Die endgültigen
Folien hatten im nassen Zustand eine Dicke von 30u, einen Wassergehalt von 80-87% und eine hydraulische
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Durchlässigkeit oder Permeabilität (HP) von 0,001 bis 0,002 cm/Sek.Atm. Diese Folien wurden mit einer Lösung
von 40 mg CNBr in 100 ml Wasser bei pH 11 (mit NaOH-) aktiviert, die bei 4,9 atü du^ch die Folien gepreßt
wurde. Überschüssiges CNBr wurde durch Spülen mit Wasser für 1 Minute entfernt. Die Behandlung wurde mit 0,1-molarem
NaHCO3 wiederum bei 4,9 atü wiederholt, worauf die Folien unmittelbar mit einer Lösung von 40 mg
Chymotrypsin (Sigma Chem.Co., 3 χ aus 4 χ kristallisiertem CT kristallisiert, durch Dialyse salzfrei gemacht
und gefriergetrocknet) in 100 ml 0,1-molarem NaHCO- bei 4°C ebenfalls bei 4,9 atü behandelt, worauf
die Membran 24 Stunden bei 4°C im Ablauf inkubiert und dann mit destilliertem Wasser gewaschen wurde. Die
fertige Membran enthielt 241 mg Enzym/g getrocknete Membran, d.h. sie hatte eine Beladung von 24%. Sie behielt
ihre ursprüngliche HP und hatte nunmehr eine Dicke von 33 u bei einem Wassergehalt von 73-80%. Die
Membranen wurden bei 4°C in destilliertem Wasser aufbewahrt. Die Aktivität dieser Membran wurde nach der
Hummel-Methode unter Verwendung von 0,00107 Mol BTEE bestimmt, wobei das Substrat durch die in eine Millipore-Zelle
eingespannte Membran bei 25°C unter einem mit
ο Stickstoff ausgeübten Druck von 7 kg/cm getrieben und
die Bestimmung im austretenden Ablauf vorgenommen wurde. Es wurde gefunden, daß unter diesen Bedingungen die
gemessene Aktivität (bestimmt auf der Grundlage des pro Zeiteinheit umgewandelten Substrats) 75% der mit dem
gleichen Substrat unter üblichen Bedingungen gemessenen Aktivität der gleichen Menge an nativem Enzym betrug.
Dieses System hatte somit eine FOM von 0,24 χ 0,75 oder 0,18. Weitere Daten und Eigenschaften von Systemen, die
aus den gleichen Cellulosemembranen unter Anwendung verschiedener Kombinationen von Drücken während der Herstellung
und Substratdrücken hergestellt worden waren,
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sind in der auf die Beispiele folgenden Tabelle genannt.
Die gleiche Matrix-Cellophanmembran wie in Beispiel 1 wurde in eine aus 4 Kammern bestehende Zelle eingespannt,
die an den beiden Enden Elektrodenräume enthielt, die von den beiden mittleren Räumen durch handelsübliche
Kationenaustauschermembranen (DK-I, Hersteller Asahi Chemical Industries) getrennt waren. Die Matrixmembran
trennte die beiden mittleren Räume. Einer der beiden mittleren Räume der Zelle enthielt eine CT-Lösung
in 0,001-molarem KCl bei pH 8,7 mit einer Enzymkonzentration
von 2 mg/ml. Ein elektrischer Strom wurde so angelegt, daß der Spannungsgradient durch die Membranen
20 V/cm entsprach. Die Enzymlösung wurde durch die Membran mit einer Geschwindigkeit gepreßt, die derjenigen
bei einem Druck von 4,9 atü entsprach. Die Enzymmembran wurde dann aus der Zelle entfernt, 24 Stunden bei 4°C
auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise inkubiert und dann bis zum Gebrauch gelagert. Dieses System zeigte
eine Enzymbeladung von 20% und eine Aktivität, die 70% der Aktivität des nativen Enzyms entsprach, wenn es mit
BTEE wie in Beispiel 1 in der Druckzelle bei einem Substratdruck von 7 atü getestet wurde.
Eine Membran wurde aus Celluloseacetat auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise gegossen, jedoch 30 Minuten
im geschlossenen Behälter gehalten. Dann wurde Wasser in die Kammer bis unter die abgestützte Membran eingeführt,
ohne daß das Wasser die Folie berührte. Dieser Zustand wurde 30 Minuten aufrecht erhalten. Die Membran
wurde dann schnell mit fein zerstäubtem Wasser besprüht, bis sie nass war, und dann eine Stunde in Eiswasser gelegt,
bis sie vollständig koaguliert war. Nach der Hydrolyse hatte sie eine Dicke von 29 u, einen Wassergehalt
von 77% und eine HP von 0,01 bis O,08 cm/Sek.Atm.
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^ 265U815 Ab
Die Folie wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise,
jedoch bei 1,05 atü mit CNBr unter Verwendung von lOO ml der CNBr-Lösung aktiviert, dann schnell mit
Wasser und anschließend mit kalter sauerstofffreier Lösung von 20 mg ß-Galactosidase (Worthington, E.coli
K12, gereinigt) in 50 ml ebenfalls sauerstofffreiem 0,1-molarem Phosphatpuffer bei 1,05 atü gewaschen.
Alle Arbeitsgänge wurden schnell durchgeführt. Die Membran
wurde dann über Nacht bei 4°C im Ablauf aus der Kupplungsreaktion gehalten. Sie wurde dann erneut in
die Zelle eingespannt, worauf eine auf pH 7,5 gepufferte, sauerstofffreie 0,8%ige Lactoselösung bei 2,1 atü durch
die Membran gepreßt und der Ablauf nach der üblichen Glucostat-Methode auf Glucose analysiert wurde. Das gekuppelte
Enzym hatte die 30-fache Aktivität des nativen Enzyms, und seine Beladung von 50% ergab eine FOM von
Es wird angenommen, daß die über 100% liegende Aktivität auf eine selektive Kupplung des reinen Enzyms aus
dem unreinen Gemisch des nativen Enzyms zurückzuführen ist.
Die in Beispiel 3 beschriebene Membran wurde zur Behandlung von Lactose aus Magermilch verwendet. Frische
Magermilch wurde mit verdünntem NaOH und Zinkchlorid behandelt und zur Entfernung aller Milchfeststoffe
zentrifugiert und dann bei 37°C unter Druck durch die Membran geführt. Die mit Hilfe der Glucostat-Analyse
ermittelte Aktivität betrug 80% der Aktivität für reine Lactose.
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265Ü815
Einfluß des Drucks der Aktivierung und Kupplung bei Chymotrypsin, das an Cellulose gekuppelt 1st.
druck, atü druck, atü Protein, des Sub- ~
mg/g strats,
Aktivierungs- Kupplungs- Gebundenes Druck Aktivität,
des
str<
str<
0 215 0 1,0
0,7 2,0
3.5 9,0 5,6 19,0
7 28,0
8,4 40,0
0,7 0,7 205 0 2,0
0,7 4,0
3,5 15,5
5.6 26,5 7 38,0
8.4 42,5
2,1 2,1 243 0 3,0
0,7 7,0
3.5 22,5
5.6 32,0 7 45,5
8.4 50,5
3,5 3,5 224 0 4,0
0,7 9,0
3.5 30,0
5.6 47,5 7 58,5
8,4 62,5
4,9 4,9 241 0 7,0
0,7 14,0
3.5 53,0
5.6 70,0 7 74,5
8,4 74,5
709849/0621
Aktivierungs- Kupplungs- Gebunde- Druck Aktivität druck, atü druck nes Protein des Sub- %
atü mg/g strats
atü
6,3 6,3
7,7 7,7
0 | 6,0 |
0,7 | 13,5 |
3,5 | 53,0 |
5,6 | 69,0 |
7 | 72,0 |
8,4 | 74,5 |
0 | 5,0 |
0,7 | 10,0 |
3,5 | 47,5 |
5,6 | 63,0 |
7 | 70,0 |
8,4 | 70,0 |
0 3,5 220 8,4 23,0
3,5 0 160 8,4 50,0
709849/0621
Claims (6)
1) Verfahren zur Herstellung von mit Enzymen gekuppelten Ultrafiltrationsmembranen, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Lösung von Chymotrypsin oder ß-Galactosidase unter einem Druck von wenigstens
etwa 0,7 atü durch eine poröse, aus Cellulose bestehende Ultrafiltrationsmembran preßt, die an
verschiedenen Stellen, die mit dem Enzym reaktionsfähig sind, mit Cyanbromid aktiviert worden ist, und
hierdurch das Enzym an die Membran bindet.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Membran aktiviert, indem man ein Aktivierungsmittel
unter einem Druck von wenigstens etwa 2,1 atü durch die Membran preßt.
3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Membranen verwendet, deren Poren eine
mittlere Größe haben, die etwa dem 3- bis 5-fachen Durchmesser des Enzyms entspricht.
4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die aktivierte Membran herstellt, indem
man ein Aktivierungsmittel unter einem Druck von etwa 4,9 bis 8,4 atü durch die Membran preßt, und
das Enzym unter einem Druck von etwa 2,1 bis 8,4 atü durch die Membran preßt.
5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung eines unreinen Enzyms verwendet,
wobei die aktivierte Membran das Enzym selektiv aus seiner Lösung extrahiert, so daß das Enzym
gleichzeitig mit seiner Kupplung konzentriert wird.
6) Mit einem Enzym gekuppelte Cellulosemembranen für die Ultrafiltration, dadurch gekennzeichnet, daß die
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ORIGINAL INSPECTED
Oberflächen ihrer Poren mit Chymotrypsin oder ß-Galactosidase als Enzym ausgekleidet sind und die
Poren eine mittlere Größe haben, die etwa dem 3- bis 5—fachen Durchmesser des Enzyms entspricht und etwa
15 bis 200 8 beträgt.
/ &) Membranen nach Anspruch ,?', dadurch gekennzeichnet,
daß sie eine Wertungsziffer (Figure of Merit) von mehr als etwa 20 haben.
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